本发明涉及畜类生物制药
技术领域：
，具体地说，本发明涉及一种新型佐剂cpg-odn猪链球菌2+9型二价灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
：猪链球菌(streptococcussuis，ss)是一种重要的人畜共患病病原，是链球菌属，可致急性死亡、急性败血症、脑膜炎等。ss呈世界性流行，对养猪行业和公共卫生安全造成重大的威胁。按荚膜抗原的特性，目前分为35个血清型(1-34型和1/2型)，其中1型、2型(1/2型)、7型、9型的致病力最强。几年来猪链球2型病在我国广泛存在并流行，成为当前危害我国养猪业的主要疾病之一，也给公共卫生安全带来了极大危害。同时也发现猪链球菌9型(ss9)致病呈上升趋势，发病率高，饲料报酬降低，给行业造成巨大经济损失。目前市售商品疫苗主要有猪链球2型、猪链球7型和马链球菌兽疫亚种，所以现有疫苗不能对流行的猪链球菌9型有效预防。现有的市售商品疫苗主要为灭活全菌疫苗和减毒活疫苗，其保护作用基于机体抗体的体液免疫。需要多次免疫才能诱导和提供有效的保护效果。灭活疫苗在不能有效激活细胞免疫是的现有疫苗的效果也大打折扣。非甲基化cpg序列的寡聚脱氧核苷酸(cpg-odn)具有激活免疫细胞、增强机体的特异性和非特异性免疫效应。cpg-odn具有较强的免疫刺激特性，在免疫系统中发挥不同功能作用：包括b细胞的增殖，巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和自然杀伤性细胞的活化。这些细胞的活化也诱导不同细胞因子包括ifn-α，ifn-β，ifn-γ，il-6，il-12，gm-csf和tnf-α的产生。因此，迫切需要开发一种的能够同时激发细胞免疫和体液免疫的安全、有效、长效猪链球菌2型和9型疫苗解决上述问题。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明旨在提供及一种新型佐剂cpg-odn猪链球菌2+9型二价灭活疫苗及其制备方法，具体的说，我国主要流行的猪链球菌血清型为2型和9型，而且猪链球菌9型(ss9)致病呈上升趋势，现有的疫苗已经不能提供完全的保护，所以本发明所提供的以猪链球菌流行菌株2型和9型相匹配的疫苗能够同时对猪链球菌2型和9型提供保护，降低猪链球菌2型和9型引起的发病率和死亡率。另一方面，免疫佐剂指那些同抗原一起或预先注入机体内能增强机体对抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。链球菌疫苗常用的佐剂有油佐剂和蜂胶佐剂，本发明采用佐剂cpg-odn，能够同时激发细胞免疫和体液免疫，使得猪链球菌2型和9型疫苗能够提供更好的保护力。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种新型佐剂cpg-odn猪链球菌2+9型二价灭活疫苗的制备方法，所述制备方法包括：s1选取一株猪链球菌2型菌株s840，选取一株猪链球菌9型菌株s172进行繁殖制备生产菌株；s2将所述猪链球菌2型菌株、所述猪链球菌9型菌株划线接种于鲜血平皿中37℃培养18-24h；s2.1然后从所述鲜血平皿挑取单菌落到5ml含5％血清tsb液体培养基，37℃培养8-9h；s2.2最后按2％菌种量接种含5％血清tsb液体培养基，37℃培养6h；s3将步骤2.2所培养的菌液在4℃，7500转离心15分钟得到浓缩菌体，再用灭菌生理盐水调整浓度，制成所需浓缩的抗原液；s4向所述浓缩的抗原液中，按总量加入0.3％的甲醛溶液，37℃灭活24h；s5将灭活后所述浓缩抗原液按照猪链球菌2型菌株和猪链球菌9型菌株抗原液1：1配比混合，然后再将混合抗原液和cpg-odn增效剂1：1配比，得到猪链球菌二价灭活疫苗。一种由新型佐剂cpg-odn猪链球菌2+9型二价灭活疫苗制备方法获得的疫苗，包括抗原与佐剂，其中所述抗原包括猪链球菌2型菌株、猪链球菌9型菌株的灭活浓缩抗原液。需要说明的是，灭活前所述浓缩抗原液中猪链球菌2型菌株含菌数不少于1*109cfu/ml，猪链球菌9型菌株含菌数不少于1*1010cfu/ml。本发明有益效果在于：1、目前用于猪链球菌病免疫预防的疫苗主要以猪链球2菌型、猪链球7菌型和马链球菌兽疫亚种等为抗原制备的灭活疫苗或弱毒疫苗，上述对于猪链球菌9型没有交叉保护，本发明研制的猪链球菌2型和9型疫苗能够对目前国内流行的猪链球菌病有较好的保护。2、本发明采用一种新型佐剂cpg-odn，能够同时激发细胞免疫和体液免疫，使得猪链球菌2型和9型疫苗能够提供更好的保护力。具体实施方式以下将对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。本发明为一种新型佐剂cpg-odn猪链球菌2+9型二价灭活疫苗的制备方法，所述制备方法包括：s1选取一株猪链球菌2型菌株s840，选取一株猪链球菌9型菌株s172进行繁殖制备生产菌株；s2将所述猪链球菌2型菌株、所述猪链球菌9型菌株划线接种于鲜血平皿中37℃培养18-24h；s2.1然后从所述鲜血平皿挑取单菌落到5ml含5％血清tsb液体培养基，37℃培养8-9h；s2.2最后按2％菌种量接种含5％血清tsb液体培养基，37℃培养6h；s3将步骤2.2所培养的菌液在4℃，7500转离心15分钟得到浓缩菌体，再用灭菌生理盐水调整浓度，制成所需浓缩的抗原液；s4向所述浓缩的抗原液中，按总量加入0.3％的甲醛溶液，37℃灭活24h；s5将灭活后所述浓缩抗原液按照猪链球菌2型菌株和猪链球菌9型菌株抗原液1：1配比混合，然后再将混合抗原液和cpg增效剂1：1配比，得到猪链球菌二价灭活疫苗。(1)疫苗的无菌检验：取本发明获得的疫苗，同时用tsa和tsb培养基进行无菌检验，应无菌生长。(2)疫苗的安全检验：取本发明获得的疫苗，肌肉注射健康易感的30-40日龄仔猪5头，每头2ml连续观察7天，每天测量体温，结果疫苗注射前后体温无明显差别，7天内全部成活。如表1所示：表1疫苗注射前后体温变化仔猪编号0d1d2d3d4d5d6d7d29439.239.539.640.039.339.239.239.030639.439.84039.339.639.239.039.231139.339.639.740.039.539.339.138.931739.540.139.439.139.539.439.639.331838.539.239.138.839.138.839.239.0(3)疫苗的效力试验：用健康易感的30-40日龄仔猪10头作为免疫攻毒组，每头肌肉注射2ml制得的猪链球菌2+9型二价灭活疫苗，免疫14天后二免，每头2ml。二免后14天，随机分成2组，每组5头，分别用5*108cfu/ml猪链球菌2型菌株s840和1*109cfu/ml猪链球菌9型菌株s172静脉注射攻毒，另外设置6头作为不免疫攻毒组，分成两组，每组3组，分别用5*108cfu/ml猪链球菌2型菌株s840和1*109cfu/ml猪链球菌9型菌株s172静脉注射，攻毒后观察2周内临床症状和死亡数。如表2所示：表2猪链球菌2+9型二价灭活疫苗的效力试验结果一种由新型佐剂cpg-odn猪链球菌2+9型二价灭活疫苗制备方法获得的疫苗，包括抗原与佐剂，其中所述抗原包括猪链球菌2型菌株、猪链球菌9型菌株的灭活浓缩抗原液。灭活前所述浓缩抗原液中猪链球菌2型菌株含菌数不少于1*109cfu/ml，猪链球菌9型菌株含菌数不少于1*1010cfu/ml。对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。当前第1页12