一种用于增强核酸疫苗免疫效果的脂质纳米颗粒及其制备方法与流程

本发明涉及药物载体技术领域，尤其是涉及一种用于增强核酸疫苗免疫效果的脂质纳米颗粒及其制备方法。

背景技术：

mrna是生命活动的关键元素，mrna可转录dna的遗传密码并表达生成相应蛋白。因此在生命活动中处于中心地位。有研究证明直接将mrna导入细胞内即可通过翻译作用生成相应蛋白质，因此mrna具备在活细胞内表达抗原蛋白并刺激产生特异性免疫反应的能力，能够用于新型疫苗的开发。以mrna作为疫苗相比传统技术具备以下几个优势：1.mrna直接在体内活细胞内表达完整的抗原蛋白，相比全病毒疫苗其特异性更高效果更好。2.mrna疫苗将生产抗原蛋白的工厂搬到了体内，利用体内活细胞表达抗原，相比重组疫苗更接近真实抗原蛋白质的构象，同时省去了体外蛋白质生产的复杂工艺，因此更容易实现。但是以mrna作为疫苗的活性成分具有循环时间短、易被降解和难以进入靶细胞的缺点，因此如何实现核酸药物，尤其是以mrna作为活性物质的药物在体内高效递送是有待解决的问题。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种脂质纳米颗粒，该脂质纳米颗粒具有对核酸的包封率高，粒径分布较窄的优点。

本发明的第二目的在于提供一种包含上述脂质纳米颗粒的核酸疫苗及其制备方法。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种脂质纳米颗粒，按照摩尔百分比计包括25～75％可质子化阳离子脂质、5～20％阴离子脂质、0～50％结构脂质和1～5％表面活性剂。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述脂质纳米颗粒在制备药物中的应用。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种核酸疫苗，该核酸疫苗以上述脂质纳米颗粒作为递送制剂。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述核酸疫苗的制备方法，包括将配方量的可质子化阳离子脂质、阴离子脂质、结构脂质、表面活性剂和核酸混合，得到所述核酸疫苗。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的脂质纳米颗粒主要由可质子化阳离子脂质、阴离子脂质、结构脂质和表面活性剂组成，通过合理的配比各组分和添加带有负电荷的阴离子脂质成分，使制备得到的脂质纳米颗粒带有较高负电荷，相比不含有阴离子脂质成分的脂质纳米颗粒包封率明显提高，粒径分布更好，更加能够满足体内递送的需求。在小鼠免疫实验中相比不含有阴离子脂质成分的脂质纳米颗粒体现出更高的药效，大大提升了mrna在体内的递送效率。将该脂质纳米颗粒应用于制备核酸药物，能够使药物活性成分递送至靶细胞的效率更高，不易被降解。

本发明提供的核酸疫苗，以上述脂质纳米颗粒作为递送制剂，将核酸递送至体内产生抗原蛋白，具有较好的免疫原性，使用极小剂量能达到足够的保护效果，在有效性方面优于现有的核酸疫苗。本发明提供的核酸疫苗的制备方法操作简单，无需特殊设备，无需经表达系统表达蛋白以及复杂的纯化工艺，就可以生产出免疫原性较高的疫苗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例2和对比例2制备得到的脂质纳米颗粒的粒径分布；

图2为实施例9中不同rvgmrna在hek293细胞中的表达量；

图3为将实施例1、实施例2和实施例3的核酸疫苗一次免疫14天后g蛋白中和抗体od读数。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种脂质纳米颗粒，该脂质纳米颗粒按照摩尔百分比计包括25～75％可质子化阳离子脂质、5～20％阴离子脂质、0～50％结构脂质和1～5％表面活性剂。在该配方中可质子化阳离子脂质能够有效凝聚核酸形成纳米结构，研究表明可质子化阳离子脂质成分含量与纳米颗粒在体内的递送效率直接相关。纳米颗粒中包含1-5％的带有聚乙二醇的脂质成分有利于稳定纳米颗粒，防止颗粒聚集，同时延长纳米颗粒在体内的半衰期提高药物递送效率。此外我们通过在脂质成分中加入了带有负电荷的阴离子脂质成分，使制备得到的脂质纳米颗粒带有较高负电荷。相比不含有阴离子脂质成分的脂质纳米颗粒包封率明显提高，粒径分布更好，更加能够满足体内递送的需求。在小鼠免疫实验中相比不含有阴离子脂质成分的脂质纳米颗粒体现出更高的药效，大大提升了mrna在体内的递送效率。

按照摩尔百分比计，脂质纳米颗粒包括阴离子脂质5～20％，例如可以为但不限于为5％、7％、10％、15％或20％，优选包括7～10％；所述阴离子脂质优选包括dopg和/或dops。dopg是1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol)，中文名称为二油酰磷脂酰甘油；dops是1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine，中文名称为二油酰基磷脂酰丝氨酸。可选地，阴离子脂质包括dopg和dops；可选地，阴离子脂质包括dopg；更优选的实施方式是以dops作为阴离子脂质，可以得到粒径分布更窄的脂质纳米颗粒。

按照摩尔百分比计，脂质纳米颗粒包括可质子化阳离子脂质25～75％，例如可以为但不限于为25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％，优选包括40～50％；可质子化阳离子脂质优选包括dlin-mc3-dma、dlin-kc2-dma、dodma、c12-200和dlindma中的至少一种；可选地，可质子化阳离子脂质包括dlin-mc3-dma、dlin-kc2-dma、dodma、c12-200或dlindma；可选地，可质子化阳离子脂质包括dlin-kc2-dma和dodma，可选地，可质子化阳离子脂质包括dodma、c12-200和dlindma，优选包括dlin-mc3-dma。

按照摩尔百分比计，脂质纳米颗粒包括结构脂质0～50％，例如可以为但不限于为0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％，其中0％表示所述脂质纳米颗粒中可以不添加结构脂质；结构性脂质如胆固醇对纳米颗粒的形成及核酸的包裹也起到重要作用，40～50％的胆固醇含量最利于脂质纳米颗粒的形成。结构脂质优选包括胆固醇、胆固醇酯、固醇类激素、固醇类维生素和胆汁酸中的至少一种；可选地，结构脂质包括胆固醇、胆固醇酯、固醇类激素、固醇类维生素或胆汁酸；可选地，结构脂质包括胆固醇和胆固醇酯；可选地，结构脂质包括固醇类激素和固醇类维生素；结构脂质优选包括胆固醇。

按照摩尔百分比计，脂质纳米颗粒包括表面活性剂1～5％，例如可以为但不限于为1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％，优选包括1～3％。所述表面活性剂包括peg-dmg、peg-dspe和peg-胆固醇中的至少一种；可选地，表面活性剂包括peg-dmg、peg-dspe或peg-胆固醇；可选地，表面活性剂包括peg-dmg和peg-dspe；可选地，表面活性剂包括peg-dspe和peg-胆固醇；优选包括peg-dmg。peg-dmg指的是聚乙二醇(peg)修饰的1,2二肉豆蔻酸甘油酯，peg-dspe指的是聚乙二醇(peg)修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，peg-胆固醇的是聚乙二醇(peg)修饰的胆固醇。其中用于修饰dmg、dspe和胆固醇的peg的长度分别独立的为2000或5000，优选为2000。

在一些优选的实施方式中，如下配比的脂质纳米颗粒粒径分布更窄，包封率更高，效果更佳，按照摩尔百分比计包括40～50％可质子化阳离子脂质、7～10％阴离子脂质、40～50％胆固醇和1～3％peg-dmg；所述阴离子脂质为dopg或dops。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述脂质纳米颗粒在制备药物中的应用。本发明提供的脂质纳米颗粒可作为递送制剂，用于递送药物活性成分。本发明提供的脂质纳米颗粒递送核酸类的药物活性成分效果较佳，因此优选用于制备核酸药物。所述核酸药物的实例包括编码抗原的rna和/或dna作为活性物质的核酸疫苗、sirna类药物和基因编辑类药物等。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种核酸疫苗，该核酸疫苗以上述脂质纳米颗粒作为递送制剂，将核酸递送至体内产生抗原蛋白，使用极小剂量能达到足够的保护效果，具有较好的免疫原性，在有效性方面优于现有的核酸疫苗。核酸疫苗中脂质纳米颗粒和核酸的质量比优选为(10～30)：1，例如可以为但不限于为10:1、15:1、20:1、25:1或30:1。

在一些优选的实施方式中，所述核酸疫苗的活性成分包括mrna，mrna的核苷酸序列除去含有编码抗原的区域外，优选还可以包括如下(a)～(d)中的至少一种：

(a)5’-帽结构；(b)5’-utr；所述5’-utr的长度优选为8～150个碱基，更优选为15～100个碱基；所述5’-utr优选为dnah2的5’-utr，dnah2的5’-utr序列如seqidno.4所示；或优选包括kozak序列，kozak序列优选如seqidno.3所示；(c)3’-聚腺苷酸序列；所述3’-聚腺苷酸序列优选包括60～120个a，更优选包括80～100个a，进一步优选为100个a；(d)3’-utr；所述3’-utr优选为β-珠蛋白3’-utr序列或血红蛋白hba23’-utr序列；所述血红蛋白hba23’-utr序列优选如seqidno.5所示。

一些mrna的实例：可选地，mrna含有编码抗原的区域，例如orf，还含有5’-帽结构、5’-utr和3’-聚腺苷酸序列；可选地，5’-utr、编码抗原的区域、3’-聚腺苷酸序列和3’-utr；可选地，5’-帽结构、5’-utr、编码抗原的区域、3’-聚腺苷酸序列和3’-utr。

在一些可选的实施方式中，所述mrna含有经过修饰的核苷酸和/或未经修饰的核苷酸，修饰的核苷酸可选地包括utp和/或ctp，修饰的核苷酸的位置包括但不限于编码区、5’-utr区、3’-utr区和帽子区中至少一种。修饰可选地包括l-核苷修饰和/或2’-o-甲基化修饰；修饰可选地还可以为将mrna中的utp替换为pseudo-utp。在一些实施例中，所述核酸疫苗为狂犬病疫苗。目前狂犬病疫苗主要为vero细胞灭活疫苗，该种疫苗的生产过程仍存在例如细胞大规模悬浮培养技术和病毒的扩大生产等技术难点。以编码狂犬病病毒抗原的mrna作为活性成分，以上述脂质纳米颗粒作为递送制剂的核酸疫苗免疫原性好，且无需经蛋白表达和纯化等复杂的操作，在安全性和有效性方面优于现有的兽用狂犬病疫苗技术。其中编码狂犬病病毒抗原的mrna优选编码狂犬病毒g蛋白的rvgmrna，rvgmrna经脂质纳米颗粒递送后，能在体内产生抗原蛋白(狂犬病病毒g蛋白)，使机体产生免疫应答。

在一些优选的实施方式中对rvgmrna的密码子进行优化，通过对密码子的偏好性进行调整，提高rvgmrna在哺乳动物中的表达量。转录rvgmrna的核苷酸序列优选如seqidno.1所示，rvgmrna的序列优选如seqidno.2所示，上述序列的rvgmrna来自中国特有的狂犬病毒株糖蛋白，核苷酸编码子经过优化，更适合在哺乳动物，尤其是人中表达。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供一种上述核酸疫苗的制备方法，包括将配方量的可质子化阳离子脂质、阴离子脂质、结构脂质、表面活性剂和核酸混合，得到所述核酸疫苗。该制备方法操作简单，无需特殊设备，无需经表达系统表达蛋白以及复杂的纯化工艺，就可以生产出免疫原性较高的疫苗。

在一些优选的实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：

(a)将核酸溶于缓冲液中，得到水相；水相中核酸的浓度优选为0.05～0.5g/ml，缓冲液优选包括pbs或柠檬酸盐缓冲液。

(b)按照配方量将可质子化阳离子脂质、阴离子脂质、结构脂质和表面活性剂溶解于有机溶剂，得到有机相，有机相中可质子化阳离子脂质、阴离子脂质、结构脂质和表面活性剂的总浓度为5～7mg/ml；有机溶剂可选地包括无水乙醇、四氢呋喃、丙酮或dmso，优选为无水乙醇。

(c)将所述水相和所述有机相混合后，去除体系中的有机相后得到所述核酸疫苗；水相和有机相优选按照体积比1：(2～4)混合；混合优选采用微流控设备混合，利用微流控设备混合时流速控制为6-24ml/min，更优选为12ml/min。其中去除体系中的有机相包括先用缓冲液将所述混合体系稀释50～100倍，然后浓缩至体系中的mrna的浓度为50～150μg/ml，优选稀释后先使用切向流过滤去除体系中的有机相，再浓缩。

在一些优选的实施方式中，所述制备方法还包括将核酸疫苗冻干成冻干剂，以延长产品的有效期。在一些优选的实施方式中，冻干体系还包括冻干保护剂，以避免冻干过程中破坏脂质纳米颗粒的结构。在冻干时，冻干体系中包含20～80mg/ml的核酸以及配方量的脂质纳米颗粒。其中冻干保护剂优选包括蔗糖，实验发现蔗糖能够显著降低反复冻融对脂质纳米颗粒结构的破坏，以蔗糖作为冻干剂能够使脂质纳米颗粒对核酸的包封率基本不变。蔗糖的用量优选为占所述冻干体系的5～20％(w/v)，优选为10％(w/v)。冻干时冻干体系的总体积优选0.4～0.6ml，优选0.5ml。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例1

本实施例提供了一种核酸疫苗，利用脂质纳米颗粒包裹如seqidno.2所示的rvgmrna，其中脂质纳米颗粒按照摩尔百分比计包括dlin-mc3-dma50％、dopg10％、胆固醇38.5％和peg-dmg1.5％。

制备方法如下：

(a)将rvgmrna溶解于ph4的柠檬酸盐缓冲液，将浓度调整为0.1mg/ml，得到水相。

(b)按照配方量将dlin-mc3-dma、dopg、胆固醇和peg-dmg按照配方量溶解于无水乙醇，将有机相中的脂质成分的浓度调整至6mg/ml，得到有机相。

(c)将步骤(a)的水相和步骤(b)的有机相按照1:3的体积比，使用微流控设备，按照12ml/min的流速混合，混合液立刻用ph7.4的pbs溶液稀释100倍，并使用切向流过滤(tff)除去溶液中乙醇成分，然后浓缩至体系中的mrna的浓度为100μg/ml，得到包裹rvgmrna的脂质纳米颗粒。

实施例2

本实施例提供了一种核酸疫苗，利用脂质纳米颗粒包裹如seqidno.2所示的rvgmrna，其中脂质纳米颗粒按照摩尔百分比计包括dlin-mc3-dma50％、dops10％、胆固醇38.5％和peg-dmg1.5％。制备方法如下：

(a)将rvgmrna溶解于ph4的柠檬酸盐缓冲液，将浓度调整为0.1mg/ml，得到水相。

(b)按照配方量将dlin-mc3-dma、dops、胆固醇和peg-dmg按照配方量溶解于无水乙醇，将有机相中的脂质成分的浓度调整至6mg/ml，得到有机相。

(c)将步骤(a)的水相和步骤(b)的有机相按照1:3的体积比，使用微流控设备，按照12ml/min的流速混合，混合液立刻用ph7.4的pbs溶液稀释100倍，并使用切向流过滤(tff)除去溶液中乙醇成分，然后浓缩至体系中的mrna的浓度为100μg/ml，得到包裹rvgmrna的脂质纳米颗粒。

实施例3

本实施例提供了一种核酸疫苗，与实施例的区别在于，脂质纳米颗粒按照摩尔百分比计包括dlin-mc3-dma50％、dops7％、胆固醇40％和peg-dspe3％。

实施例4

本实施例提供了一种核酸疫苗，与实施例的区别在于，脂质纳米颗粒按照摩尔百分比计包括dlin-mc3-dma40％、dops7％、胆固醇50％和peg-dspe3％。

实施例5

本实施例提供了一种核酸疫苗，与实施例1的区别在于，脂质纳米颗粒按照摩尔百分比计包括dlin-mc3-dma75％、dops20％和peg-dspe5％。

实施例6

本实施例提供了一种核酸疫苗，与实施例1的区别在于，脂质纳米颗粒按照摩尔百分比计包括dlin-mc3-dma25％、dops20％、胆固醇50％和peg-dspe5％。

实施例7

本实施例提供了一种核酸疫苗，与实施例1的区别在于，脂质纳米颗粒按照摩尔百分比计包括dlin-mc3-dma44％、dops5％、胆固醇50％和peg-dspe1％。

实施例8

本实施例提供了一种核酸疫苗，与实施例2的区别在于，可质子化阳离子脂质为dodma，表面活性剂为peg-dspe，结构脂质为胆固醇酯。

实施例9

本实施例中的rvgmrna的序列优化方案如表1所示：

表1

rvg-amrna由5’端至3’端依次为dnah25’utr、天然序列、hba23’utr和polya序列以及后续元件，其中天然序列指的是ctn-1毒株的编码g蛋白的开放阅读框核苷酸，其序列如seqidno.6所示；polya序列以及后续元件包括64个聚腺苷酸、36个聚胞苷酸和组蛋白茎环结构，参考curevec狂犬病毒mrna疫苗专利(cn105517569a)。

rvg-bmrna和rvg-cmrna与rvg-amrna的区别在于orf部分改用了优化后的序列(分别对应表1中的“优化orf-1”和“优化orf-2”)，这3个orf最终翻译出来的蛋白序列一致，为ctn-1毒株的g蛋白，具体为seqidno.7所示。

rvg-dmrna和rvg-amrna的区别在于使用100个聚腺苷酸来代替polya序列以及后续元件。rvg-dmrna的序列如seqidno.2所示。

体外转录rvgmrna的方法如下：hek293细胞的铺板，细胞密度为4×10⁵个细胞/ml，当细胞融合度约为80％进行转染。每孔转染2gmrna，使用转染试剂lipofectaminemessagermax(thermofisherscientific)转染，按照染试剂产品说明书进行转染操作。转染24h后使用狂犬病毒g蛋白抗体进行免疫标记，使用流式细胞仪检测g蛋白表达量。阴性对照为荧光素mrna(lucmrna)，结果如图2所示。从图2可以看出，rvg-dmrna转染组中hek293细胞中g蛋白表达量最高，其次为rvg-bmrna和rvg-cmrna转染细胞组，说明优化orf密码子可以提高蛋白表达量，以及使用100个聚腺苷酸来代替polya序列以及后续元件也可以提高g蛋白的表达量。

对比例1

利用脂质纳米颗粒包裹如seqidno.2所示的rvgmrna，其中脂质纳米颗粒按照摩尔百分比计包括dlin-mc3-dma50％、dspc10％、胆固醇38.5％和peg-dmg1.5％。其中dspc为二硬脂酰基磷脂酰胆碱，是一种中性脂质。

制备方法如下：

(a)将rvgmrna溶解于ph4的柠檬酸盐缓冲液，将浓度调整为0.1mg/ml，得到水相。

(b)按照配方量将dlin-mc3-dma、dspc、胆固醇和peg-dmg按照配方量溶解于无水乙醇，将有机相中的脂质成分的浓度调整至6mg/ml，得到有机相。

(c)将步骤(a)的水相和步骤(b)的有机相按照1:3的体积比，使用微流控设备，按照12ml/min的流速混合，混合液立刻用ph7.4的pbs溶液稀释100倍，并使用切向流过滤(tff)除去溶液中乙醇成分，然后浓缩至体系中的mrna的浓度为100μg/ml，得到包裹rvgmrna的脂质纳米颗粒。

对比例2

利用脂质纳米颗粒包裹如seqidno.2所示的rvgmrna，其中脂质纳米颗粒按照摩尔百分比计包括dlin-mc3-dma50％、dspc7％、胆固醇40％和peg-dmg3％。其中dspc为二硬脂酰基磷脂酰胆碱，是一种中性脂质。制备方法同对比例1。

效果例1

使用动态光散射仪检测检测粒径、pdi和电位；使用ribogreen检测包封率，实施例1～8和对比例1～2的检测结果如表2所示。

表2

从效果例1的结果可以看出，加入阴离子脂质能够使得所得脂质纳米颗粒粒径分布更窄(pdi较小)，有效降低了大颗粒数量，更加符合体内递送的要求。其中加入dops可以显著提高mrna在脂质纳米颗粒中的包封率，使得制剂稳定性更好，因此使用dops制备lnp制剂更加利于mrna在体内递送。实施例2和对比例2制备得到的脂质纳米颗粒的粒径分布如图1所示。

效果例2

小鼠免疫实验，核酸疫苗分别选取实施例2的核酸疫苗和对比例2的核酸疫苗，每只小鼠按照5μg的给药量注射；以及以阳离子脂质体作为seqidno.2所示的rvgmrna的递送制剂，阳离子脂质体制剂使用相应商品化试剂用作阳性对照所用商品化试剂为lipofectamine2000，制备时参考相关产品说明书，将mrna利用optimem稀释至0.1mg/ml，再按照lipofectamine2000/mrna(v/w)＝2:1的比例准备lipofectamine2000试剂并利用optimem将其体积稀释到与mrna稀释液相同的体积，缓慢将二者混合并于室温静置15min即可用于小鼠给药实验，每只小鼠按照5μg的给药量注射，注射体积为100μl/只。商品化疫苗为灭活全病毒疫苗(瑞比克)作为阳性对照(≥10^6.3faid50/ml，给药体积为100μl/只)，鱼精蛋白制剂参考现有技术中鱼精蛋白递送mrna的方法制备得到(鱼精蛋白/mrna(w/w)＝2:1，每只小鼠按照5μg的给药量注射，注射体积为100μl/只。)，阴性对照为等体积生理盐水注射液。以上各种疫苗制剂一次给药后14天检测小鼠血清狂犬病毒中和抗体滴度结果如下表3所示：

表3

从表3的结果可以看出，单次注射后含有阴离子(10％dops)的诱导产生的中和抗体滴度高于其他实验组，同时实验发现鱼精蛋白制剂在该给药剂量下无法诱导产生有效中和抗体，说明本发明技术优于现有技术。

效果例3

将实施例1、实施例2和实施例3的核酸疫苗免疫小鼠，每只小鼠给药量为5μg，通过小鼠下肢肌肉注射免疫。实验设置等体积生理盐水注射组为阴性对照，同时平行比较了dspc,dopg及dops三种配方制备所得lnp核酸疫苗制剂的免疫效果。由于此前实验确定含有7％dspc的核酸疫苗制剂免疫效果优于含有10％dspc的制剂，因此该实验选用含7％dspc的制剂，另外两个实验组所用制剂均含10％的dops或dopg。实验通过检测免疫后小鼠血清中狂犬病毒中和抗体的含量来评价。参考狂犬病毒疫苗标准，在一次免疫后第14天抽取小鼠血清，利用elisa检测血清中和抗体含量，该elisa法是使用全病毒作为抗原捕获抗狂犬病毒抗体，其读数与实际中和抗体滴度相关性需通过实验建立。我们此前研究对比该elisa法与第三方狂犬病毒中和抗体检测结果后，确定elisa读数超过0.14即可视为免疫达标。结果如图3所示，图3为一次免疫14天后g蛋白中和抗体od读数。结果显示实施例1、实施例2和实施例3的核酸疫苗均可超过免疫达标线，其中实施例2能够显著提升免疫效果，能够达到更强更高的保护效果，说明含有dops的脂质纳米颗粒作为递送mrna的递送制剂，具有更好的免疫效果。

效果例4

以蔗糖为冻干保护剂冻干实施例2的核酸疫苗，蔗糖浓度和冷冻温度如表4所示：

如表4所示，为了核酸疫苗能够实现长期保存，利用蔗糖作为冷冻保护剂，使脂质纳米颗粒包裹的mrna制剂能够在低温下冷冻保存，提高了其稳定性。脂质纳米颗粒稳定性最大的难点在于冷冻过程会对脂质纳米颗粒质量造成影响。所以含有脂质纳米颗粒的制剂在反复冻融后其理化性质及会比之前样本有一定差异。实施例2制备得到脂质纳米颗粒粒径为82nm，包封率为89.5％，并且加入10％蔗糖能够在不同冷冻条件下最大限度降低脂质纳米颗粒粒径及包封率的变化。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

sequencelisting

<110>珠海丽凡达生物技术有限公司

<120>一种用于增强核酸疫苗免疫效果的脂质纳米颗粒及其制备方法

<160>7

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1575

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgattcctcaggctctgctgttcgtcccactgctggtcttcccactgtgcttcggcaag60

ttccccatctacactattcctgacaaactgggcccttggtccccaatcgacatccaccac120

ctgtcctgtcccaacaatctggtggtggaggacgagggctgtaccaatctgagcggcttc180

tcctacatggagctgaaggtgggctacatctccgccatcaaggtgaacggcttcacatgt240

accggcgtggtgacagaggccgagacatacaccaacttcgtgggctatgtgaccacaacc300

ttcaagcggaagcacttcagaccaacccctgatgcctgtcggtccgcctataactggaag360

atggccggcgacccacggtatgaggagagcctgcacaacccataccccgattaccactgg420

ctgaggacagtgaagacaaccaaggagtccgtggtaatcatctctccaagcgtggccgat480

ctggacccatacgataagtccctgcacagcagagtgttcccccgcggcaagtgttctggc540

atcacagtgagctccgcctattgctctaccaaccacgactacaccatctggatgcctgag600

aatccaagactgggcacctcctgtgacatctttaccaactctcggggcaagagagcctcc660

aagggctccaagacatgtggcttcgtggacgagagaggcctgtataagtccctgaagggc720

gcctgcaagctgaagctgtgcggcgtgctgggcctgaggctgatggacggcacctgggtg780

gccatccagacatccaacgagaccaagtggtgccctcctgatcagctggtgaacctgcac840

gactttcacagcgacgagatcgagcacctggtggtggaggagctggtgaagaagagagag900

gagtgcctggatgccctggagtccatcatgaccaccaagagcgtgtcctttagacggctg960

agccacctgagaaagctggtgcccggctttggcaaggcctacaccatcttcaacaagaca1020

ctgatggaggccgatgcccactacaagtccgtgagaacctggaacgagatcatccctagc1080

aagggctgtctgagggtgggcggcagatgtcaccctcacgtgaatggcgtgttctttaat1140

ggcatcatcctgggcccagatggccacgtgctgatcccagagatgcagtcctctctgctg1200

cagcagcacatggagctgctggagtctagcgtgatccctctgatgcacccactggccgat1260

ccaagcacagtgttcaaggacggcgacgaggtggaggactttgtggaggtgcacctgcca1320

gatgtgcacaagcaggtgtccggcgtggatctgggcctgccaaattggggcaaggacgtg1380

ctgatgggcgccggcgtgctgaccgccctgatgctgatgatcttcctgatgacctgctgt1440

agacggacaaatagagccgagagcatccagcactccctgggcgagacaggccggaaggtg1500

tctgtgaccagccagagtggacgagtgatctcctcatgggaatcctacaaaagcggcggc1560

gagaccaaactgtga1575

<210>2

<211>1843

<212>rna

<213>人工序列

<400>2

gggagacccaagcuggcuagcguuuaaacuuaagcuugguaccgagcucggauccacuag60

uccagugugguggaauucgggagaaagcuuaccaugauuccucaggcucugcuguucguc120

ccacugcuggucuucccacugugcuucggcaaguuccccaucuacacuauuccugacaaa180

cugggcccuugguccccaaucgacauccaccaccuguccugucccaacaaucugguggug240

gaggacgagggcuguaccaaucugagcggcuucuccuacauggagcugaaggugggcuac300

aucuccgccaucaaggugaacggcuucacauguaccggcguggugacagaggccgagaca360

uacaccaacuucgugggcuaugugaccacaaccuucaagcggaagcacuucagaccaacc420

ccugaugccugucgguccgccuauaacuggaagauggccggcgacccacgguaugaggag480

agccugcacaacccauaccccgauuaccacuggcugaggacagugaagacaaccaaggag540

uccgugguaaucaucucuccaagcguggccgaucuggacccauacgauaagucccugcac600

agcagaguguucccccgcggcaaguguucuggcaucacagugagcuccgccuauugcucu660

accaaccacgacuacaccaucuggaugccugagaauccaagacugggcaccuccugugac720

aucuuuaccaacucucggggcaagagagccuccaagggcuccaagacauguggcuucgug780

gacgagagaggccuguauaagucccugaagggcgccugcaagcugaagcugugcggcgug840

cugggccugaggcugauggacggcaccuggguggccauccagacauccaacgagaccaag900

uggugcccuccugaucagcuggugaaccugcacgacuuucacagcgacgagaucgagcac960

cuggugguggaggagcuggugaagaagagagaggagugccuggaugcccuggaguccauc1020

augaccaccaagagcguguccuuuagacggcugagccaccugagaaagcuggugcccggc1080

uuuggcaaggccuacaccaucuucaacaagacacugauggaggccgaugcccacuacaag1140

uccgugagaaccuggaacgagaucaucccuagcaagggcugucugagggugggcggcaga1200

ugucacccucacgugaauggcguguucuuuaauggcaucauccugggcccagauggccac1260

gugcugaucccagagaugcaguccucucugcugcagcagcacauggagcugcuggagucu1320

agcgugaucccucugaugcacccacuggccgauccaagcacaguguucaaggacggcgac1380

gagguggaggacuuuguggaggugcaccugccagaugugcacaagcagguguccggcgug1440

gaucugggccugccaaauuggggcaaggacgugcugaugggcgccggcgugcugaccgcc1500

cugaugcugaugaucuuccugaugaccugcuguagacggacaaauagagccgagagcauc1560

cagcacucccugggcgagacaggccggaaggugucugugaccagccagaguggacgagug1620

aucuccucaugggaauccuacaaaagcggcggcgagaccaaacugugaggacuaguuaua1680

agacugacuagcccgaugggccucccaacgggcccuccuccccuccuugcaccgagauua1740

auaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1800

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaau1843

<210>3

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ggctagcgccgccacc16

<210>4

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gagacccaagctggctagcgggagaaagcttacc34

<210>5

<211>109

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gctggagcctcggtagccgttcctcctgcccgctgggcctcccaacgggccctcctcccc60

tccttgcaccggcccttcctggtctttgaataaagtctgagtgggcagc109

<210>6

<211>1575

<212>dna

<213>狂犬病病毒（rabiesvirus）

<400>6

atgattcctcaagctctgttgtttgtacctcttctggtttttccattgtgtttcgggaaa60

ttccccatttacacgataccagacaaactcggcccctggagtcccatcgatatacatcac120

ctcagctgtccgaacaatctggttgtggaggacgaaggatgtaccaatctgtcaggattc180

tcatacatggagcttaaagtaggatatatttcggccataaaggtgaacgggttcacttgt240

acgggtgtggtaacggaagcagaaacctacactaactttgtcggttatgtcaccaccacg300

tttaagagaaagcacttccgaccaacaccggatgcatgcagatcagcatacaattggaag360

atggcaggtgaccccagatatgaagagtctctgcacaatccctatcctgattatcattgg420

ctccggactgtaaaaaccaccaaagagtctgttgttatcatatctccaagtgtggcagac480

ttagacccgtacgataaatcacttcattcgagagtttttcctagaggaaaatgctcagga540

ataacggtgtcttctgcctactgctctaccaaccatgattataccatctggatgcctgaa600

aatcctagactggggacctcttgtgatattttcaccaacagcagagggaagagagcatcc660

aaagggagcaagacctgtggatttgtggatgagagaggcttgtacaaatctctaaaagga720

gcatgcaaactgaagctgtgtggagttcttggacttaggcttatggacggaacctgggtc780

gcgattcagacatcaaacgagaccaagtggtgccctcctgatcaactagtgaatctacat840

gactttcattcagatgagattgaacatcttgttgtggaggagttggttaagaagagggag900

gagtgtctagatgcactggagtccatcatgaccaccaagtccgtgagtttcagacgtctc960

agtcacttgaggaagcttgtgcctggatttggaaaagcatacaccatattcaacaagacc1020

ttaatggaggctgatgctcactacaaatcggtccgaacttggaatgagatcatcccctcg1080

aaagggtgtttaagagtcggggggagatgtcatcctcatgtgaacggagtatttttcaat1140

ggtatcatcctaggccctgacggccatgtcttaatcccggaaatgcagtcatccctcctc1200

cagcagcatatggagttgttggaatcctcggtcatccccttaatgcatcccttggcagat1260

ccatcaacggtttttaaagatggtgacgaggtggaggattttgttgaggttcaccttcca1320

gatgtgcataagcaggtctcaggggttgatctcggtctcccaaactgggggaaggatgtg1380

ttgatgggcgcaggcgttttgacggcactgatgttgatgattttcctaatgacgtgttgc1440

cgaaggactaatagagcagaatcaatacaacacagtcttggagagacagggaggaaagtg1500

tcggtgacctcccaaagcgggagggtcatatcttcatgggagtcatataaaagcggaggt1560

gagaccaagctgtaa1575

<210>7

<211>524

<212>prt

<213>狂犬病病毒（rabiesvirus）

<400>7

metileproglnalaleuleuphevalproleuleuvalpheproleu

151015

cyspheglylyspheproiletyrthrileproasplysleuglypro

202530

trpserproileaspilehishisleusercysproasnasnleuval

354045

valgluaspgluglycysthrasnleuserglyphesertyrmetglu

505560

leulysvalglytyrileseralailelysvalasnglyphethrcys

65707580

thrglyvalvalthrglualagluthrtyrthrasnphevalglytyr

859095

valthrthrthrphelysarglyshispheargprothrproaspala

100105110

cysargseralatyrasntrplysmetalaglyaspproargtyrglu

115120125

gluserleuhisasnprotyrproasptyrhistrpleuargthrval

130135140

lysthrthrlysgluservalvalileileserproservalalaasp

145150155160

leuaspprotyrasplysserleuhisserargvalpheproarggly

165170175

lyscysserglyilethrvalserseralatyrcysserthrasnhis

180185190

asptyrthriletrpmetprogluasnproargleuglythrsercys

195200205

aspilephethrasnserargglylysargalaserlysglyserlys

210215220

thrcysglyphevalaspgluargglyleutyrlysserleulysgly

225230235240

alacyslysleulysleucysglyvalleuglyleuargleumetasp

245250255

glythrtrpvalalaileglnthrserasngluthrlystrpcyspro

260265270

proaspglnleuvalasnleuhisaspphehisseraspgluileglu

275280285

hisleuvalvalglugluleuvallyslysarggluglucysleuasp

290295300

alaleugluserilemetthrthrlysservalserpheargargleu

305310315320

serhisleuarglysleuvalproglypheglylysalatyrthrile

325330335

pheasnlysthrleumetglualaaspalahistyrlysservalarg

340345350

thrtrpasngluileileproserlysglycysleuargvalglygly

355360365

argcyshisprohisvalasnglyvalphepheasnglyileileleu

370375380

glyproaspglyhisvalleuileproglumetglnserserleuleu

385390395400

glnglnhismetgluleuleugluserservalileproleumethis

405410415

proleualaaspproserthrvalphelysaspglyaspgluvalglu

420425430

aspphevalgluvalhisleuproaspvalhislysglnvalsergly

435440445

valaspleuglyleuproasntrpglylysaspvalleumetglyala

450455460

glyvalleuthralaleumetleumetilepheleumetthrcyscys

465470475480

argargthrasnargalagluserileglnhisserleuglygluthr

485490495

glyarglysvalservalthrserglnserglyargvalileserser

500505510

trpglusertyrlysserglyglygluthrlysleu

515520