靶向肿瘤微环境的嵌合抗原受体的制作方法

相关申请的交叉引用本申请要求以下申请的权益：2018年2月12日提交的美国临时申请号62/629,593；2018年4月16日提交的美国临时申请号62/658,307；2018年4月16日提交的国际专利申请号pct/us2018/027783；以及2018年10月17日提交的美国临时申请号62/746,895；将它们的内容通过引用以其全文并入本文。本文所述的技术涉及免疫疗法。序列表本申请含有以ascii格式电子提交并且特此通过引用以其全文并入的序列表。在2019年2月12日创建的ascii副本命名为51295-013wo2_sequence_listing_2.12.19_st25并且大小为190,819字节。发明背景嵌合抗原受体(car)提供了一种将细胞毒性t细胞应答定向至表达所选靶抗原(最常见的是肿瘤抗原或肿瘤相关抗原)的靶细胞的方式。car是t细胞受体的改型物，其中抗原结合结构域被特异性结合衍生性靶抗原的抗体的抗原结合结构域替代。在例如t细胞(“cart细胞”或“car-t”)上表达的car对在靶细胞表面上的靶抗原的接合促进了对靶细胞的杀伤。技术实现要素：本发明提供了靶向肿瘤微环境的嵌合抗原受体(car)。在一个方面，本发明的特征总体上在于免疫细胞，其经工程化以表达：(a)包含细胞外结构域的嵌合抗原受体(car)多肽，所述细胞外结构域包括结合第一抗原的第一抗原结合结构域和结合第二抗原的第二抗原结合结构域；和(b)双特异性t细胞接合器(bite)，其中所述bite结合靶抗原和t细胞抗原。在一些实施方案中，所述car多肽包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述car多肽进一步包含一个或多个共刺激结构域。在一些实施方案中，所述car包含跨膜结构域、细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。在一些实施方案中，所述第一和第二抗原是胶质母细胞瘤抗原。在进一步的实施方案中，所述第一和第二抗原独立地选自表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)、cd19、cd79b、cd37、前列腺特异性膜抗原(psma)、前列腺干细胞抗原(psca)、白介素-13受体α2(il-13rα2)、肝配蛋白a型受体1(epha1)、人表皮生长因子受体2(her2)、间皮素、细胞表面相关粘蛋白1(muc1)或细胞表面相关粘蛋白16(muc16)。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域包括抗体的抗原结合片段，例如，单结构域抗体或单链可变片段(scfv)。在其他实施方案中，所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域包括所述第一和/或第二抗原的配体。在进一步的实施方案中，所述细胞外结构域在所述第一抗原结合结构域与所述第二抗原结合结构域之间不包括接头。在其他实施方案中，所述第一抗原结合结构域通过接头连接至所述第二抗原结合结构域，例如，其中所述接头包含氨基酸序列seqidno:102、107、108、109或110，或包括与接头seqidno:102、107、108、109或110具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包括铰链/跨膜结构域。在一些实施方案中，所述铰链/跨膜结构域包括免疫球蛋白样蛋白(例如，iga、igd、ige、igg或igm)、cd28、cd8或4-1bb的铰链/跨膜结构域。在特定实施方案中，所述跨膜结构域包括cd8的铰链/跨膜结构域，其任选地包含氨基酸序列seqidno:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72、78或104，或与氨基酸序列seqidno:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72、78或104具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包括tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3θ、cd3ε、cd3η、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b或cd66d的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包括cd3ζ的细胞内信号传导结构域，其任选地包含氨基酸序列seqidno:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74、80或106，或与氨基酸序列seqidno:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74、80或106具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，所述共刺激结构域包括4-1bb、cd27、cd28或ox-40的共刺激结构域。在一些实施方案中，所述共刺激结构域包括4-1bb的共刺激结构域，其任选地包含氨基酸序列seqidno:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73、79或105，或与氨基酸序列seqidno:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73、79或105具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域包括il-13rα2结合结构域。在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域包括egfrviii结合结构域。在一些实施方案中，所述il-13rα2结合结构域包括抗il-13rα2scfv或il-13rα2的配体。在一些实施方案中，il-13rα2的所述配体包括il-13或il-13泽塔因子(zetakine)或其抗原结合片段。在进一步的实施方案中，所述il-13rα2结合结构域包含氨基酸序列seqidno:101，或包含与氨基酸序列seqidno:101具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，所述egfrviii结合结构域包括抗体的抗原结合片段，例如其中所述egfrviii结合结构域包括抗egfrviiiscfv。在一些实施方案中，所述抗egfrviiiscfv包含含有氨基酸序列seqidno:111或113的重链可变结构域(vh)、或含有具有与氨基酸序列seqidno:111或113至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的vh；和/或含有氨基酸序列seqidno:112或114的轻链可变结构域(vl)、或含有与氨基酸序列seqidno:112或114具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％与的具有94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的vl。在特定实施方案中，所述egfrviii结合结构域包含氨基酸序列seqidno:103，或包含与氨基酸序列seqidno:103具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述car多肽包含氨基酸序列seqidno:100，或包含与氨基酸序列seqidno:100具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在另一个方面，本发明的特征在于免疫细胞，其经工程化以表达：(i)car多肽，所述car多肽包含与氨基酸序列seqidno:100具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列；和(ii)bite，其中所述bite结合靶抗原和t细胞抗原。在另一个方面，本发明的特征在于免疫细胞，其经工程化以表达：(i)car多肽，所述car多肽包含氨基酸序列seqidno:100；和(ii)bite，其中所述bite结合靶抗原和t细胞抗原。在任何前述方面的一些实施方案中，所述靶抗原是选自以下各项之一的胶质母细胞瘤相关抗原：egfr、egfrviii、cd19、cd79b、cd37、psma、psca、il-13rα2、epha1、her2、间皮素、muc1或muc16。在一些实施方案中，所述t细胞抗原是cd3。在特定实施方案中，所述靶抗原是egfr并且所述t细胞抗原是cd3。在任何前述方面的一些实施方案中，所述bite包含氨基酸序列seqidno:98或99，或包含与氨基酸序列seqidno:98或99具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在任何前述方面的一些实施方案中，所述免疫细胞是t细胞或自然杀伤(nk)细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是人细胞。在另一个方面，本发明的特征总体上在于多核苷酸，其编码前述方面中任一项的car多肽和bite。在一些实施方案中，所述多核苷酸包括car多肽编码序列和bite编码序列，并且其中所述car多肽编码序列和所述bite编码序列被核糖体跳跃部分分开。在一些实施方案中，所述car多肽和/或所述bite在组成型启动子(例如，延伸因子-1α(ef1α)启动子)下表达。在其他实施方案中，所述car多肽和/或所述bite在诱导型启动子下表达，例如，其中所述诱导型启动子可通过t细胞受体(tcr)或car信号传导，例如激活t细胞核因子(nfat)反应元件诱导。在某些实施方案中，所述car多肽和所述bite各自在组成型启动子下表达。在其他实施方案中，所述car多肽在组成型启动子下表达，而所述bite在诱导型启动子下表达。在进一步的实施方案中，所述多核苷酸进一步包含自杀基因。在还进一步的实施方案中，所述多核苷酸包含编码一个或多个信号序列的序列。在另一个方面，本发明的特征总体上在于载体，其包含前述方面的多核苷酸。在一些实施方案中，所述载体是慢病毒载体。在另一个方面，本发明的特征总体上在于药物组合物，其包含前述方面中任一项的免疫细胞、多核苷酸或载体。在另一个方面，本发明的特征总体上在于在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予前述方面中任一项的免疫细胞、多核苷酸、载体或药物组合物。在一些实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤、肺癌、胰腺癌、淋巴瘤或骨髓瘤，任选地其中所述癌症包含表达由egfr、egfrviii、cd19、cd79b、cd37、psma、psca、il-13rα2、epha1、her2、间皮素、muc1和muc16组成的组中的一种或多种。在一些实施方案中，所述胶质母细胞瘤包括表达由il-13rα2、egfrviii、egfr、her2、间皮素和epha1组成的组中的一种或多种的细胞。在进一步的实施方案中，所述胶质母细胞瘤包括egfrviii表达降低的细胞。在另一个方面，本发明的特征在于免疫细胞，其经工程化以表达：(i)包含egfr结合结构域的car多肽，其中所述car多肽包含氨基酸序列seqidno:117或与氨基酸序列seqidno:117具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列；和(ii)抗garp骆驼科动物，其包含氨基酸序列seqidno:25或与氨基酸序列seqidno:25具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在另一个方面，本发明的特征在于免疫细胞，其经工程化以表达：(i)包含egfrviii结合结构域的car多肽，其中所述car多肽包含氨基酸序列seqidno:115或116或与氨基酸序列seqidno:115或116具有90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列；和(ii)bite，其中所述bite结合egfr和cd3，包含氨基酸序列seqidno:98或99或与氨基酸序列seqidno:98或99具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在另一个方面，本发明的特征在于多核苷酸，其编码前述方面的car多肽和抗garp骆驼科动物。在另一个方面，本发明的特征在于前述方面的car多肽和bite。在前述多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸进一步包含自杀基因。在一些实施方案中，所述多核苷酸进一步包含编码一个或多个信号序列的序列。在另一个方面，本发明的特征总体上在于载体，其包含前述方面中任一项的多核苷酸。在一些实施方案中，所述载体是慢病毒载体。在另一个方面，本发明的特征总体上在于药物组合物，其包含前述方面中任一项的免疫细胞、多核苷酸或载体。在另一个方面，本发明的特征在于在受试者中治疗具有降低的egfrviii表达的胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括向所述受试者给予免疫细胞，所述免疫细胞经工程化以表达：(i)包含细胞外egfrviii结合结构域的car多肽；和(ii)bite，其中所述免疫细胞任选地选自前述方面中任一项的免疫细胞。在一些实施方案中，所述car包含跨膜结构域、细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。在另一个方面，本发明的特征在于在受试者中预防或减少肿瘤微环境中的免疫抑制的方法，所述方法包括向所述受试者给予免疫细胞，所述免疫细胞包含(i)包含细胞外靶标结合结构域的car；和(ii)bite，其中所述免疫细胞任选地选自前述方面中任一项的免疫细胞。在一些实施方案中，所述car包含跨膜结构域、细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。在另一个方面，本发明的特征在于在受试者中预防或减少肿瘤微环境中的t细胞消耗的方法，所述方法包括向所述受试者给予免疫细胞，所述免疫细胞包含(i)包含细胞外靶标结合结构域的car；和(ii)bite，其中所述免疫细胞任选地选自前述方面中任一项的免疫细胞。在一些实施方案中，所述car包含跨膜结构域、细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。在另一个方面，本发明的特征在于在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予免疫细胞，所述免疫细胞包含(i)包含细胞外靶标结合结构域的car；和(ii)bite，其中所述免疫细胞任选地选自前述方面中任一项的免疫细胞。在一些实施方案中，所述car包含跨膜结构域、细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。在一些实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，所述癌症包含表达由egfr、egfrviii、cd19、psma、psca、il-13rα2、epha1、her2、间皮素、muc1和muc16组成的组中的一种或多种的细胞。在一些实施方案中，所述癌症表达异质抗原。此类癌症的例子是胶质母细胞瘤(其表达例如egfr、egfrviii、il-13rα2、her2和/或epha1)。在另一个方面，本发明的特征总体上在于包含异源核酸分子的cart细胞，其中所述异源核酸分子包括：(a)编码car的第一多核苷酸，所述car包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的；和(b)编码治疗剂的第二多核苷酸。在一些实施方案中，所述治疗剂包括抗体试剂，例如单链抗体或单结构域抗体(例如，骆驼科动物抗体)。在进一步的实施方案中，所述抗体试剂包括双特异性抗体试剂，例如bite。在还其他实施方案中，所述治疗剂包括细胞因子。在一些实施方案中，所述car和所述治疗剂作为分开的car和治疗剂分子产生。在一些实施方案中，所述cart细胞在编码所述car的所述第一多核苷酸与编码所述治疗剂的所述第二多核苷酸之间包含核糖体跳跃部分。在一些实施方案中，所述核糖体跳过部分包括2a肽，例如p2a或t2a。在进一步的实施方案中，所述car和所述治疗剂各自是组成型表达的。在一些实施方案中，所述car和所述治疗剂的表达由ef1α启动子驱动。在其他实施方案中，所述治疗剂在诱导型启动子的控制下表达，所述诱导型启动子任选地可通过t细胞受体或car信号传导诱导，例如，其中所述诱导型启动子包括nfat启动子。在还进一步的实施方案中，所述car在组成型启动子的控制下表达，而所述治疗剂在诱导型启动子的控制下表达，所述诱导型启动子任选地可通过t细胞受体或car信号传导诱导。在一些实施方案中，所述car进一步包括一个或多个共刺激结构域。在一些实施方案中，所述car的所述抗原结合结构域包括抗体、单链抗体、单结构域抗体或配体。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包括铰链/跨膜结构域，例如免疫球蛋白样蛋白(例如，iga、igd、ige、igg或igm)、cd28、cd8或4-1bb的铰链/跨膜结构域。在一些实施方案中，所述car的所述跨膜结构域包括cd8铰链/跨膜结构域，其任选地包含seqidno:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72、78和104中的任一种或其变体的序列，或与seqidno:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72、78和104中的任一种具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在进一步的实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包括tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3θ、cd3ε、cd3η、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b或cd66d的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包括cd3ζ细胞内信号传导结构域，其任选地包含seqidno:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74、80和106中的任一种或其变体的序列，或与seqidno:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74、80和106中的任一种具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在还进一步的实施方案中，所述共刺激结构域包括4-1bb、cd27、cd28或ox-40的共刺激结构域。在特定实施方案中，所述共刺激结构域包括4-1bb共刺激结构域，其任选地包含seqidno:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73、79和105中的任一种或其变体的序列，或与seqidno:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73、79和105中的任一种具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，所述car抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原或treg相关抗原。在一些实施方案中，所述骆驼科动物抗体结合肿瘤相关抗原或treg相关抗原。在一些实施方案中，bite结合(i)肿瘤相关抗原或treg相关抗原，和(ii)t细胞抗原。在某些实施方案中，所述肿瘤相关抗原是实体瘤相关抗原，例如egfrviii、egfr、cd19、psma、psca、il-13rα2、epha1、her2、间皮素、muc1或muc16。任选地，所述car抗原结合结构域或治疗剂包含选自seqidno:21、27、33、36、42、45、51、55、57、63、65、103及其变体的序列，或与氨基酸序列seqidno:21、27、33、36、42、45、51、55、57、63、65或103具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在进一步的实施方案中，所述treg相关抗原选自糖蛋白a为主的重复序列(garp)、潜伏期相关肽(lap)、cd25和细胞毒性t淋巴细胞相关抗原-4(ctla-4)。任选地，所述car抗原结合结构域或治疗剂包含选自seqidno:3、9、15、25、71、77及其变体的序列，或与氨基酸序列seqidno:3、9、15、25、71或77具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在另一个方面，本发明的特征在于包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的car多肽；并且所述抗原结合结构域结合treg相关抗原。在一些实施方案中，所述treg相关抗原选自garp、lap、cd25和ctla-4。在一些实施方案中，所述car进一步包括一个或多个共刺激结构域。在某些实施方案中，所述treg相关抗原是garp或lap。在一些实施方案中，所述car的所述抗原结合结构域包含：(a)重链可变结构域(vh)，其包含三个互补决定区cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其中所述cdr-h1包含氨基酸序列seqidno:81，或seqidno:81的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；所述cdr-h2包含氨基酸序列seqidno:82，或seqidno:82的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；并且所述cdr-h3包含氨基酸序列seqidno:83，或seqidno:83的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列，和/或(b)轻链可变结构域(vl)，其包含三个互补决定区cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中所述cdr-l1包含氨基酸序列seqidno:84，或seqidno:84的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；所述cdr-l2包含氨基酸序列seqidno:85，或seqidno:85的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；并且所述cdr-l3包含氨基酸序列seqidno:86，或seqidno:86的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述vh包含氨基酸序列seqidno:87，或与氨基酸序列seqidno:87具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，和/或所述vl包含氨基酸序列seqidno:88或与氨基酸序列seqidno:88具有至少90％的序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在其他实施方案中，所述car的所述抗原结合结构域包含：(a)重链可变结构域(vh)，其包含三个互补决定区cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其中所述cdr-h1包含氨基酸序列seqidno:89，或seqidno:89的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；所述cdr-h2包含氨基酸序列seqidno:90，或seqidno:90的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；并且所述cdr-h3包含氨基酸序列seqidno:91，或seqidno:91的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列，和/或(b)轻链可变结构域(vl)，其包含三个互补决定区cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中所述cdr-l1包含氨基酸序列seqidno:92，或seqidno:92的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；所述cdr-l2包含氨基酸序列seqidno:93，或seqidno:93的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；并且所述cdr-l3包含氨基酸序列seqidno:94，或seqidno:94的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述vh包含氨基酸序列seqidno:95，或与氨基酸序列seqidno:95具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，和/或所述vl包含氨基酸序列seqidno:96或与氨基酸序列seqidno:96具有至少90％的序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述vh在所述vl的n末端。在其他实施方案中，所述vl在所述vh的n末端。在进一步的实施方案中，所述car的所述抗原结合结构域包括scfv或单结构域抗体，其任选地包含选自seqidno:3、9、15、25、71、77及其变体的序列，或与seqidno:3、9、15、25、71和77中的任一种的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包括铰链/跨膜结构域，例如免疫球蛋白样蛋白(例如，iga、igd、ige、igg或igm)、cd28、cd8或4-1bb的铰链/跨膜结构域。在一些实施方案中，所述car的跨膜结构域包括cd8铰链/跨膜结构域，其任选地包含seqidno:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72、78和104中的任一种或其变体的序列，或与seqidno:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72、78和104中的任一种的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在还进一步的实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包括tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3θ、cd3ε、cd3η、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b或cd66d的细胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包括cd3ζ细胞内信号传导结构域，其任选地包含seqidno:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74、80和106中的任一种或其变体的序列，或与seqidno:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74、80和106中的任一种的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，所述共刺激结构域包括4-1bb、cd27、cd28或ox-40的共刺激结构域。在某些实施方案中，所述共刺激结构域包括4-1bb共刺激结构域，其任选地包含seqidno:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73、79和105中的任一种或其变体的序列，或与seqidno:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73、79和105中的任一种的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在另一个方面，本发明的特征在于car多肽，其包含seqidno:26、seqidno:35、seqidno:44、seqidno:53、seqidno:61、seqidno:19、seqidno:1、seqidno:7、seqidno:13、seqidno:69、seqidno:75和seqidno:100中的任一种的氨基酸序列，或包含与seqidno:26、seqidno:35、seqidno:44、seqidno:53、seqidno:61、seqidno:19、seqidno:1、seqidno:7、seqidno:13、seqidno:69、seqidno:75和seqidno:100中的任一种的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在另一个方面，本发明的特征总体上在于核酸分子，其编码前述方面中任一项的(i)car多肽，或(ii)包括所述car多肽和治疗剂的多蛋白。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含自杀基因。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含编码信号序列的序列。在另一个方面，本发明的特征总体上在于载体，其包含前述方面中任一项的核酸分子。在一些实施方案中，所述载体是慢病毒载体。在又另一个方面，本发明的特征总体上在于包括前述方面中任一项的car多肽的多肽，或包括所述car多肽和治疗剂的多蛋白。在还另一个方面，本发明的特征总体上在于免疫细胞，其包含前述方面中任一项的car多肽、核酸分子、载体和/或多肽。在一些实施方案中，所述免疫细胞是t细胞或nk细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是人细胞。在另一个方面，本发明的特征总体上在于药物组合物，其包含前述方面中任一项的一种或多种cart细胞、核酸分子、car多肽、多蛋白或免疫细胞。在还另一个方面，本发明的特征总体上在于治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者给予前述方面中任一项的药物组合物。在一些实施方案中，通过靶向肿瘤微环境降低了全身性毒性。在一些实施方案中，所述癌症的特征在于一种或多种实体瘤的存在。在另外的实施方案中，癌症的特征在于肿瘤浸润性treg。在某些实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤。在另一个方面，本发明的特征在于治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者给予经基因修饰以分泌肿瘤毒性抗体或细胞因子的cart细胞产物，其中通过将所述癌症毒性局部地定向至肿瘤微环境，降低了全身性毒性。在一些实施方案中，所述cart细胞经基因修饰以将针对ctla4、cd25、garp、lap、il-15、csf1r或egfr、egfrviii、cd19、cd79b、cd37、psma、psca、il-13rα2、epha1、her2、间皮素、muc1或muc16的抗体，或双特异性抗体递送至肿瘤微环境。在某些实施方案中，所述双特异性抗体是针对egfr和cd3的bite。在另一个方面，本发明的特征在于向患者的组织或器官递送治疗剂以治疗疾病或病状的方法，所述方法包括向所述患者给予经基因修饰以分泌治疗性抗体、毒素或药剂的cart细胞，其中所述治疗性抗体、毒素或药剂本身将无法进入或穿透所述组织或器官。在一些实施方案中，所述组织或器官在神经系统，例如中枢神经系统，例如大脑中。在一些实施方案中，所述疾病或病状是癌症，例如胶质母细胞瘤、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，所述治疗性抗体是抗egfr或抗egfrviii。在另一个方面，本发明的特征在于在受试者中治疗具有降低的egfrviii表达的胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括向所述受试者给予cart细胞，所述cart细胞经工程化以表达：(i)包含细胞外egfrviii结合结构域的car多肽；和(ii)bite，其中所述cart细胞任选地选自前述方面中任一项的cart细胞。在一些实施方案中，所述car包含跨膜结构域、细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。在另一个方面，本发明的特征在于在受试者中预防或减少肿瘤微环境中的免疫抑制的方法，所述方法包括向所述受试者给予cart细胞，所述cart细胞经工程化以表达：(i)包含细胞外靶标结合结构域的car多肽；和(ii)bite，其中所述cart细胞任选地选自前述方面中任一项的cart细胞。在一些实施方案中，所述car包含跨膜结构域、细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。在进一步的方面，本发明的特征在于在受试者中预防或减少肿瘤微环境中的t细胞消耗的方法，所述方法包括向所述受试者给予cart细胞，所述cart细胞经工程化以表达：(i)包含细胞外靶标结合结构域的car多肽；和(ii)bite，其中所述cart细胞任选地选自前述方面中任一项的cart细胞。在一些实施方案中，所述car包含跨膜结构域、细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。在还另一个方面，本发明的特征在于在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予cart细胞，所述cart细胞经工程化以表达：(i)包含细胞外靶标结合结构域的car多肽；和(ii)bite，其中所述cart细胞任选地选自前述方面中任一项的cart细胞。在一些实施方案中，所述car包含跨膜结构域、细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。在一些实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，所述癌症包含表达egfr、egfrviii、cd19、psma、psca、il-13rα2、epha1、her2、间皮素、muc1和muc16中的一种或多种的细胞。在一些实施方案中，所述癌症表达异质抗原。此类癌症的例子是胶质母细胞瘤(其表达例如egfr、egfrviii、il-13rα2、her2和/或epha1)。定义为了方便起见，下面提供了在说明书、实施例和所附权利要求中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明或从上下文中隐含，否则以下术语和短语包括下面提供的含义。提供这些定义以帮助描述特定的实施方案，并且不旨在限制要求保护的技术，因为所述技术的范围仅由权利要求限制。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与该技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。如果在本领域中术语的用法与本文提供的所述术语的定义之间存在明显差异，则应以本说明书内提供的定义为准。免疫学和分子生物学中常用术语的定义可以在以下文献中找到：merckmanualofdiagnosisandtherapy,第19版,由mercksharp&dohmecorp.出版,2011(isbn978-0-911910-19-3)；roberts.porter等人(编辑),theencyclopediaofmolecularcellbiologyandmolecularmedicine,由blackwellscienceltd.出版,1999-2012(isbn9783527600908)；以及roberta.meyers(编辑),molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference,由vchpublishers,inc.出版,1995(isbn1-56081-569-8)；wernerluttmann的immunology,由elsevier出版,2006；janeway'simmunobiology,kennethmurphy,allanmowat,caseyweaver(编辑),taylor&francislimited,2014(isbn0815345305,9780815345305)；lewin'sgenesxi,由jones&bartlettpublishers出版,2014(isbn-1449659055)；michaelrichardgreen和josephsambrook,molecularcloning:alaboratorymanual,第4版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,美国纽约(2012)(isbn1936113414)；davis等人,basicmethodsinmolecularbiology,elseviersciencepublishing,inc.,美国纽约(2012)(isbn044460149x)；laboratorymethodsinenzymology:dna,jonlorsch(编辑)elsevier,2013(isbn0124199542)；currentprotocolsinmolecularbiology(cpmb),frederickm.ausubel(编辑),johnwileyandsons,2014(isbn047150338x,9780471503385)；currentprotocolsinproteinscience(cpps),johne.coligan(编辑),johnwileyandsons,inc.,2005；以及currentprotocolsinimmunology(cpi)(johne.coligan,adamkruisbeek,davidhmargulies,ethanmshevach,warrenstrobe,(编辑)johnwileyandsons,inc.,2003(isbn0471142735,9780471142737)，所述文献中的每一篇的内容全部通过引用以其全文并入本文。术语“减少(decrease)”、“降低的(reduced)”、“降低(reduction)”、或“抑制”全部在本文中通常用于意指减少了统计学上显著的量。在一些实施方案中，“降低(reduce)”、“降低(reduction)”或“减少(decrease)”、或“抑制”通常意指与参考水平(例如，在不存在给定的治疗或药剂的情况下)相比减少了至少10％，并且可以包括例如减少了至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。如本文所用，“降低”或“抑制”不涵盖与参考水平相比的完全抑制或降低。“完全抑制”是与参考水平相比的100％抑制。在适用情况下，减少可以优选降至如在对于未患有给定障碍的个体正常的范围内可接受的水平。术语“增加的(increased)”、“增加(increase)”、“增强”或“激活”全部在本文中用于意指增加了统计学上显著的量。在一些实施方案中，术语“增加的(increased)”、“增加(increase)”、“增强”或“激活”可以意指与参考水平相比至少10％的增加，例如与参考水平相比至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的增加，或最高并包括100％增加，或10％-100％之间的任何增加，或者与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍增加，或在2倍与10倍之间或更多的任何增加。在标记或症状的情境下，“增加”是这种水平的统计学上显著的增加。如本文所用，“受试者”意指人或动物。通常，动物是脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括例如黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括例如小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔子和仓鼠。家畜和狩猎动物包括例如牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(例如家猫)、犬科物种(例如狗、狐狸、狼)、禽类物种(例如鸡、鸸鹋、鸵鸟)、以及鱼(例如鲑鱼、鲶鱼和大马哈鱼)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些例子。人以外的哺乳动物可以有利地用作代表疾病(例如癌症)的动物模型的受试者。受试者可以是雄性或雌性。受试者可以是这样的受试者，所述受试者先前已被诊断为或被鉴定为遭受或患有需要治疗的病症(尤其例如，胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、白血病或另一种类型的癌症)或与这种病症相关的一种或多种并发症，并且任选地，已经历了针对所述病症或与所述病症相关的一种或多种并发症的治疗。可替代地，受试者还可以是先前未被诊断为患有这种病症或相关并发症的受试者。例如，受试者可以是展现出针对所述病症或与所述病症相关的一种或多种并发症的一种或多种风险因素的受试者，或者是未展现出风险因素的受试者。“需要针对特定病症的治疗的受试者”可以是患有该病症、被诊断为患有该病症或有患上该病症的风险的受试者。“疾病”是动物例如人的健康状态，其中所述动物不能维持内稳态，并且其中如果疾病没有得到改善，则所述动物的健康继续恶化。相比之下，动物中的“障碍”是这样的健康状态，其中所述动物能够维持内稳态，但是其中所述动物的健康状态不如不存在所述障碍时的健康状态有利。如果不治疗，障碍不一定会导致所述动物的健康状态进一步下降。如本文所用，术语“肿瘤抗原”和“癌症抗原”可互换用于指由癌细胞差异表达的抗原，因此可以被利用以靶向癌细胞。癌症抗原是可能潜在地刺激明显肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些是由正常细胞编码的，但不一定由正常细胞表达。这些抗原可以被表征为在正常细胞中通常是沉默的(即，不表达的)那些、仅在某些分化阶段表达的那些以及暂时性表达的那些(如胚胎和胎儿抗原)。其他癌症抗原由突变型细胞基因，如癌基因(例如，激活的ras癌基因)、抑制基因(例如，突变型p53)编码，以及为由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白。还其他癌症抗原也可以由病毒基因(如rna和dna肿瘤病毒上所携带的那些)编码。已经根据多种实体瘤定义了许多肿瘤抗原：通过免疫性定义的mage1、2和3；mart-1/melan-a、gp100、癌胚抗原(cea)、人表皮生长因子受体(her2)、粘蛋白(即muc-1)、前列腺特异性抗原(psa)和前列腺酸性磷酸酶(pap)。此外，已显示病毒蛋白(如由乙型肝炎(hbv)、爱泼斯坦-巴尔(ebv)和人乳头瘤(hpv)编码的一些病毒蛋白)分别在肝细胞癌、淋巴瘤和宫颈癌的发生中是重要的。肿瘤抗原的例子在下面提供，并且包括例如egfr、egfrviii、cd19、psma、b细胞成熟抗原(bcma)、白介素-13受体亚基α-2(il13ra2)等。如本文所用，“treg抗原”或“treg相关抗原”可互换用于指由t调节性(treg)细胞表达的抗原。这些抗原可以任选地被本发明的细胞和方法靶向。treg抗原的例子在下面提供，并且包括例如garp、lap、cd25和ctla-4。如本文所用，术语“嵌合的”是指至少两个或更多个不同的多核苷酸分子的部分的融合产物。在一个实施方案中，术语“嵌合的”是指通过操纵已知元件或其他多核苷酸分子产生的基因表达元件。“双特异性t细胞接合器”、“bite抗体构建体”或“bite”意指各自包括串联连接的单链可变片段(scfv)的多肽。任选地，scfv通过接头(例如，富含甘氨酸的接头)连接。bite的一个scfv结合t细胞受体(tcr)(例如，结合cd3ε亚基)，并且另一个scfv结合靶抗原(例如，肿瘤相关抗原)。在一些实施方案中，“激活”可以是指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的t细胞状态。在一些实施方案中，激活可以是指诱导的细胞因子产生。在其他实施方案中，激活可以是指可检测的效应子功能。最低程度地，如本文所用的“激活的t细胞”是增殖性t细胞。如本文所用，术语“特异性结合(specificbinding)”和“特异性结合(specificallybinds)”是指两个分子、化合物、细胞和/或颗粒之间的物理相互作用，其中与结合非靶标的第三实体相比，第一实体以更大的特异性和亲和力结合第二靶标实体。在一些实施方案中，特异性结合可以是指在相同条件下，第一实体对第二靶标实体的亲和力比对第三非靶标实体的亲和力大至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更多。对给定靶标具有特异性的试剂是在所利用测定的条件下对该靶标展现出特异性结合的试剂。非限制性例子包括识别同源结合配偶体(例如，存在于t细胞上的刺激和/或共刺激分子)蛋白并与其结合的抗体或配体。如本文所用，“刺激配体”是指这样的配体，其当存在于抗原呈递细胞(apc)(例如，巨噬细胞、树突状细胞、b细胞、人工apc等)上时可以与t细胞上的同源结合配偶体(在本文中称为“刺激分子”或“共刺激分子”)特异性结合，从而介导t细胞的初级应答，包括但不限于增殖、激活、免疫应答的启动等。刺激配体在本领域中是众所周知的，并且尤其涵盖负载有肽、抗cd3抗体、超激动剂抗cd28抗体和超激动剂抗cd2抗体的mhci类分子。“刺激分子”(在所述术语用于本文中时)意指t细胞上的分子，所述分子与抗原呈递细胞上存在的同源刺激配体特异性结合。“共刺激配体”(在所述术语用于本文中时)包括apc上的分子，所述分子特异性结合t细胞上的同源共刺激分子，从而提供信号，除了通过例如tcr/cd3复合物与负载有肽的mhc分子的结合提供的初级信号之外，所述信号介导了t细胞应答，包括但不限于增殖、激活、分化等。共刺激配体可以包括但不限于4-1bbl、ox40l、cd7、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、pd-l1、pd-l2、诱导型共刺激配体(icos-l)、细胞间粘附分子(icam)、cd30l、cd40、cd70、cd83、hla-g、mica、micb、hvem、淋巴毒素β受体、3/tr6、ilt3、ilt4、hvem、结合toll样受体的激动剂或抗体以及与b7-h3特异性结合的配体。共刺激配体还可以包括但不限于与t细胞上存在的共刺激分子(如但不限于cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3)特异性结合的抗体，和与cd83特异性结合的配体。“共刺激分子”是指t细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导t细胞的共刺激应答，如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于mhci类分子、btla、toll样受体、cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和cd83。在一个实施方案中，如本文所用的术语“工程化”及其语法等同物可以是指核酸，例如生物体基因组内的核酸的一种或多种人为设计的改变。在另一个实施方案中，工程化可以是指基因的改变、添加和/或缺失。“工程化细胞”可以是指具有添加、缺失和/或改变的基因的细胞。如本文所用的术语“细胞”或“工程化细胞”及其语法等同物可以是指人或非人动物来源的细胞。如本文所用，术语“可操作地连接”是指第一多核苷酸分子(如启动子)与第二可转录的多核苷酸分子(如目的基因)连接，其中多核苷酸分子被排列为使得第一多核苷酸分子影响第二多核苷酸分子的功能。两个多核苷酸分子可以是或可以不是单一连续多核苷酸分子的一部分，并且可以是或可以不是相邻的。例如，如果启动子调节或介导细胞中目的基因的转录，则所述启动子与所述目的基因可操作地连接。在本文所述的各种实施方案中，进一步设想涵盖了所描述的任何特定多肽的变体(天然存在或以其他方式存在)、等位基因、同源物、保守性修饰的变体和/或保守取代变体。至于氨基酸序列，普通技术人员将认识到，核酸、肽、多肽或蛋白质序列中改变所编码序列中的单一氨基酸或小百分比的氨基酸的个别取代、缺失或添加是“保守性修饰变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学上类似的氨基酸取代并且保留多肽的所需活性。此类保守性修饰的变体是除了符合本公开文本的多态性变体、种间同源物和等位基因以外的变体并且不排除它们。给定的氨基酸可以被具有相似生理化学特征的残基替代，例如，用一个脂肪族残基取代另一个(如ile、val、leu或ala彼此间的取代)，或用一个极性残基取代另一个(如在lys与arg之间；glu与asp之间；或gln与asn之间)。其他此类保守取代(例如，具有相似疏水性特征的整个区域的取代)是熟知的。可以在本文所述的任何一种测定中测试包含保守氨基酸取代的多肽，以确认保留了所需活性，例如，天然或参考多肽的配体介导的受体活性和特异性。氨基酸可根据其侧链特性的相似性进行分组(a.l.lehninger,biochemistry,第二版,第73-75页,worthpublishers,纽约(1975))：(1)非极性：ala(a)、val(v)、leu(l)、ile(i)、pro(p)、phe(f)、trp(w)、met(m)；(2)不带电荷的极性：gly(g)、ser(s)、thr(t)、cys(c)、tyr(y)、asn(n)、gln(q)；(3)酸性：asp(d)、glu(e)；(4)碱性：lys(k)、arg(r)、his(h)。可替代地，可以基于共同的侧链特性将天然存在的残基分组：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；(6)芳香族：trp、tyr、phe。非保守取代将使得需要将这些类别之一的成员交换为另一类别。特定的保守取代包括例如：ala变为gly或变为ser；arg变为lys；asn变为gln或变为his；asp变为glu；cys变为ser；gln变为asn；glu变为asp；gly变为ala或变为pro；his变为asn或变为gln；ile变为leu或变为val；leu变为ile或变为val；lys变为arg、变为gln或变为glu；met变为leu、变为tyr或变为ile；phe变为met、变为leu或变为tyr；ser变为thr；thr变为ser；trp变为tyr；tyr变为trp；和/或phe变为val、变为ile或变为leu。在一些实施方案中，本文所述的多肽(或编码这种多肽的核酸)可以是本文所述的氨基酸序列之一的功能片段。如本文所用，“功能片段”是根据本领域已知或下文所述的测定，肽的保留野生型参考多肽的活性的至少50％的片段或区段。功能片段可以包含本文公开的序列的保守取代。在一些实施方案中，本文所述的多肽可以是本文所述的多肽或分子的变体。在一些实施方案中，变体是保守性修饰的变体。例如，可以通过天然核苷酸序列的突变获得保守取代变体。如本文所提及的“变体”是与天然或参考多肽基本上同源的多肽，但是它的氨基酸序列与天然或参考多肽的氨基酸序列由于一个或多个缺失、插入或取代而不同。编码变体多肽的dna序列在与天然或参考dna序列相比时涵盖包含核苷酸的一个或多个添加、缺失或取代的序列，但是所述序列编码保留非变体多肽活性的变体蛋白或其片段。多种基于pcr的位点特异性诱变方法是本领域已知的，并且可以由普通技术人员应用。变体氨基酸或dna序列可以与天然或参考序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多相同。可以确定天然序列与突变体序列之间的同源性程度(同一性百分比)，例如通过使用在万维网上通常用于此目的的可免费获取的计算机程序(例如，blastp或blastn，默认设置)比较这两个序列。天然氨基酸序列的改变可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种来完成。可以通过以下方式例如在特定的基因座处引入突变：合成含有突变体序列的寡核苷酸，所述突变体序列的侧翼是允许与天然序列的片段连接的限制性位点。连接后，所得的重建序列编码具有所需氨基酸插入、取代或缺失的类似物。可替代地，可以采用寡核苷酸指导的位点特异性诱变程序来提供改变的核苷酸序列，所述核苷酸序列具有根据所需的取代、缺失或插入而改变的特定密码子。进行此类改变的技术已经很成熟，并且包括例如由以下文献披露的那些：walder等人(gene42:133,1986)；bauer等人(gene37:73,1985)；craik(biotechniques,1985年1月,12-19)；smith等人(geneticengineering:principlesandmethods,plenumpress,1981)；以及美国专利号4,518,584和4,737,462，将所述文献通过引用以其全文并入本文。不参与维持多肽的正确构象的任何半胱氨酸残基也可以被取代，通常被丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并且防止异常交联。相反，可以将一个或多个半胱氨酸键添加至多肽以改善其稳定性或促进寡聚。如本文所用，术语“dna”定义为脱氧核糖核酸。术语“多核苷酸”在本文中可与“核酸”互换使用，以表示核苷的聚合物。通常，多核苷酸由通过磷酸二酯键连接的天然发现于dna或rna中的核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)构成。然而，所述术语涵盖含有核苷或核苷类似物的分子，所述核苷或核苷类似物含有化学或生物学修饰的碱基、修饰的主链等，无论是否存在于天然存在的核酸中，并且此类分子对于某些应用可能是优选的。在本申请提及多核苷酸的情况下，应理解提供了dna、rna两者，以及在每种情况下提供单链和双链的形式两者(以及每个单链分子的互补物)。如本文所用的“多核苷酸序列”可以是指多核苷酸材料本身和/或指生物化学上表征特定核酸的序列信息(即，用作碱基缩写的一连串字母)。除非另外指明，否则本文呈现的多核苷酸序列以5'至3'方向呈现。如本文所用的术语“多肽”是指氨基酸的聚合物。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。肽是相对较短的多肽，通常长度在约2与60个氨基酸之间。本文所用的多肽通常含有氨基酸，如蛋白质中最常见的20种l-氨基酸。然而，可以使用本领域已知的其他氨基酸和/或氨基酸类似物。多肽中的一个或多个氨基酸可以被修饰，例如通过添加化学实体，如碳水化合物基团，磷酸基团，脂肪酸基团，用于缀合、功能化的接头等。具有与其共价或非共价缔合的非多肽部分的多肽仍被认为是“多肽”。示例性的修饰包括糖基化和棕榈酰化。多肽可以从天然来源中纯化，使用重组dna技术产生或通过化学手段(如常规固相肽合成等)合成。如本文所用的术语“多肽序列”或“氨基酸序列”可以是指多肽材料本身和/或生物化学上表征多肽的序列信息(即，用作氨基酸名称的缩写的一连串字母或三字母代码)。除非另外指明，否则本文呈现的多肽序列以n末端至c末端的方向呈现。在一些实施方案中，编码如本文所述的多肽(例如，car多肽)的核酸由载体包含。在本文所述的一些方面，将编码如本文所述的给定多肽或其任何模块的核酸序列与载体可操作地连接。如本文所用，术语“载体”是指设计用于递送至宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体可以是病毒的或非病毒的。术语“载体”涵盖与适当的控制元件相连时能够复制并且可以将基因序列转移至细胞的任何遗传元件。载体可以包括但不限于克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、人工染色体、病毒、病毒粒子等。如本文所用，术语“表达载体”是指指导rna或多肽从与载体上的转录调节序列连接的序列表达的载体。表达的序列通常但不一定与细胞异源。表达载体可以包含另外的元件，例如，表达载体可以具有两个复制系统，由此使其可以保持在两种生物体中，例如在人类细胞中进行表达并在原核宿主中进行克隆和扩增。术语“表达”是指参与产生rna和蛋白质以及在适当情况下分泌蛋白质的细胞过程，包括(在适用的情况下)但不限于例如转录、转录物加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的rna和通过翻译从基因转录的mrna获得的多肽。术语“基因”意指当与适当的调节序列可操作地连接时在体外或体内转录(dna)为rna的核酸序列。基因可以包括或可以不包括在编码区之前和之后的区域，例如，5'非翻译(5'utr)或“前导”序列和3'utr或“尾随”序列，以及单独编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。如本文所用，术语“病毒载体”是指核酸载体构建体，其包含至少一个病毒来源的元件并且具有被包装到病毒载体颗粒中的能力。病毒载体可以含有编码如本文所述多肽的核酸，以代替非必需病毒基因。可以将载体和/或颗粒用于在体外或体内将核酸转移到细胞中的目的。多种形式的病毒载体是本领域已知的。“重组载体”意指包含能够在体内表达的异源核酸序列或“转基因”的载体。应当理解，在一些实施方案中，本文所述的载体可以与其他合适的组合物和疗法组合。在一些实施方案中，载体是附加型的。合适的附加型载体的使用提供了使目的核苷酸维持在受试者中的高拷贝数染色体外dna中的手段，从而消除了染色体整合的潜在影响。如本文所用，“信号肽”或“信号序列”是指在新合成的蛋白质的n末端处的肽，所述肽用于将初生蛋白质定向至内质网中。在一些实施方案中，信号肽是cd8或igκ信号肽。如本文所用，术语“治疗(treat、treatment、treating)”或“改善”是指治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减慢或阻止与疾病或障碍相关的病症的进展或严重性，例如，胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、急性淋巴细胞白血病或其他癌症、疾病或障碍。术语“治疗”包括减少或减轻病症、疾病或障碍的至少一种不良影响或症状。如果一种或多种症状或临床标记减少，则治疗通常是“有效的”。可替代地，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，与在没有治疗的情况下的预期相比，“治疗”不仅包括症状或标记的改善，还包括停止或至少减缓症状的进展或恶化。有益或希望的临床结果包括但不限于一种或多种症状减轻、疾病的程度减小、疾病状态稳定(即，不恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和、缓解(无论是部分还是完全)、和/或死亡率降低(无论是可检测的还是不可检测的)。疾病的术语“治疗”还包括提供疾病的症状或副作用的解除(包括姑息治疗)。如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂与药学上可接受的载体(例如通常用于制药行业的载体)的组合。短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断范围内，适合用于与人类或动物的组织接触，而不产生过多毒性、刺激、过敏反应或者其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。在任何方面的一些实施方案中，药学上可接受的载体可以是除水以外的载体。在任何方面的一些实施方案中，药学上可接受的载体可以是乳膏、乳液、凝胶、脂质体、纳米颗粒和/或软膏。在任何方面的一些实施方案中，药学上可接受的载体可以是人工的或工程化的载体，例如其中活性成分不会在自然界中被发现的载体。如本文所用，术语“给予”是指将如本文所公开的治疗性或药物组合物通过使所述药剂在所需位点至少部分递送的方法或途径置于受试者体内。包含如本文所公开的药剂的药物组合物可以通过在受试者中产生有效治疗的任何适当途径给予。术语“统计学上显著的”或“显著地”是指统计学显著性，并且通常意指两个标准差(2sd)或更大的差异。除了在操作实施例中以外或者在另外指明的情况下，本文所使用的表示成分的量或反应条件的所有数字应该理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。当与百分比结合使用时，术语“约”可以意指±1％。如本文所用，术语“包含”意指除了所呈现的定义的要素之外还可以存在其他要素。“包含”的使用表示包括而不是限制。术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法及其各自的组分，它们不包括在所述实施方案的该描述中未列举的任何要素。如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需的那些要素。所述术语允许存在实质上不影响所述技术的该实施方案的一个或多个基本和新颖的或功能性特征的附加要素。除非上下文另外明确指明，否则单数术语“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数引用。类似地，除非上下文另外明确指明，否则词语“或”旨在包括“和”。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的那些方法和材料可以用于本公开文本的实践或测试，但下面描述了合适的方法和材料。缩写“例如(e.g.)”源自拉丁文“例如(exempligratia)”，并在本文中用于指示非限制性例子。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(forexample)”是同义的。在任何方面的一些实施方案中，本文所述的本公开文本不涉及克隆人类的过程、用于修饰人类的种系遗传同一性的过程、人胚胎用于工业或商业目的的用途、或可能会使动物受苦却对人或动物没有任何实质性医疗益处的用于修饰动物的遗传同一性的过程，以及由此类过程产生的动物。其他术语定义于本技术的各个方面和实施方案的描述内，如下文所述。本发明具有几个优点。例如，本发明的cart细胞可以用于递送用于癌症治疗的治疗剂。在一个例子中，本发明的cart细胞可以用于将原本有毒的抗体(例如抗ctla4或抗cd25(例如，达克珠单抗(daclizumab)))或其他分子(例如，细胞因子)递送至肿瘤微环境，在此处它们可以有利地使得能够激活周围肿瘤浸润淋巴细胞，提供检查点阻断，并耗尽调节性t细胞(treg)。本发明的cart细胞可以进一步针对treg抗原，以促进treg细胞的靶向。此外，本发明的某些cart细胞可以用于将基因编码的分子(例如抗体或细胞因子)递送至这些分子原本无法到达的身体区域(例如中枢神经系统，包括脑)。在一个例子中，靶向egfrviii的cart细胞可以用于靶向脑肿瘤，并且可以将抗体(例如，针对egfr的抗体，如西妥昔单抗(cetuximab)；也参见下文)递送至肿瘤。本发明由此提供了在肿瘤微环境中的基因编码的treg靶向。此外，本发明提供了对不能到达某些组织的抗体的基因编码递送，并且可以通过扩大抗肿瘤靶标的特异性来增强t细胞疗法的效力。因此，本发明提供了用于癌症的基因修饰的t细胞疗法。从以下具体实施方式、附图以及权利要求中，本发明的其他特征和优点将变得清楚。附图说明图1是示出了cart-egfrviii细胞对人神经胶质瘤靶细胞系u87viii的杀伤随cart-egfrviii:u87viii靶细胞比率变化的图。将未转导细胞与靶细胞一起孵育作为阴性对照。图2a和图2b是一系列生物发光图像，其示出了在人神经胶质瘤的皮下模型中表达egfrviii的肿瘤(u87viii)的位置。图2a示出了用作为阴性对照的未转导细胞治疗的小鼠。图2b示出了在植入后第4天用cart-egfrviii治疗的小鼠(顶行)，其中截至第21天成功治疗(底行)。图3a和图3b是一系列x射线叠加图，其示出了在人神经胶质瘤的颅内模型中表达egfrviii的肿瘤(u87viii)的位置。图3a示出了在第5天(d5；顶行)和d11(底行)用作为阴性对照的未转导(utd)细胞治疗的小鼠。图3b示出了在d5(顶行)和d11(底行)的在植入后第2天用cart-egfrviii治疗的小鼠。图4a和图4b是显微照片，其示出了在输注cart-egfrviii后五天时一名患者中肿瘤组织的免疫组织化学。图4a示出了针对cd3染色的t细胞。图4b示出了cd25+细胞。cd25是il-2受体α链，激活的或调节性t细胞的一种标记。图5a至图5c是荧光显微照片，其定性地展示在体外与人神经胶质瘤细胞共孵育18小时后对cart细胞抗肿瘤活性的treg抑制。图5a示出了cart非特异性细胞与神经胶质瘤细胞的相对浓度。图5b示出了在培养物中没有treg的情况下，cart-egfrviii细胞与神经胶质瘤细胞的相对浓度。图5c示出了在培养物中包含treg的情况下，cart-egfrviii细胞与神经胶质瘤细胞的相对浓度。图5d是示出了作为神经胶质瘤细胞活力的量度的绿色对象汇合(greenobjectconfluence)的定量读出随时间(至多48小时)变化的图。顶线表示图5a所示的结果(神经胶质瘤细胞生长)，底线表示图5b所示的结果(神经胶质瘤细胞杀伤)，并且中间线表示图5c所示的结果(神经胶质瘤细胞对cart杀伤的抗性)。图6a至图6c是流式细胞术图，其示出了在对照t细胞(图6a)、未激活treg(图6b)和激活treg(图6c)上lap(x轴)和garp(y轴)的表达。从leukopak中根据cd4+cd25+cd127-分选treg，并将其在il-2存在下用cd3/cd28珠扩增7天。在第1天，它们被转导以表达gfp。在第7天脱珠后，将扩增的treg静置4天，之后冷冻。解冻后，在过夜静置(未激活)或用抗cd3和抗cd28过夜激活后，针对lap和garp表达对treg进行染色。将来自同一供体的未转导t细胞(cd4+和cd8+)用作表达对照(图6a)。图7a和图7b是对应于图6a至图6c中所示结果的流式细胞术直方图，它们示出了lap(图7a)和garp(图7b)的表达。图8a至图8d是用于靶向treg相关抗原的car构建体的示意图。图8a示出了lap靶向性car构建体，其具有抗lapscfv，其轻链(l)和重链(h)分别沿5'至3'方向排列(cart-lap-l-h)。图8b示出了lap靶向性car构建体，其具有抗lapscfv，其重链(h)和轻链(l)分别沿5'至3'方向排列(cart-lap-h-l)。图8c示出了garp靶向性car构建体，其具有抗garp骆驼科动物抗体结合结构域(cart-garp)。图8d示出了egfr靶向性car构建体，其具有抗garp骆驼科动物抗体。图9a和图9b是示出了靶treg杀伤随cart细胞与靶treg细胞比率变化的图。用gfp转导treg，并且通过监测gfp表达来定量细胞毒性。图9a示出了对激活treg的杀伤，而图9b示出了对未激活treg的杀伤。与cart-lap-l-h相比，cart-lap-h-l在杀伤未激活treg方面更有效。图10a和图10b是示出了在四天内，在cart细胞与treg的1:1比率下，各种抗tregcart细胞(即cart-garp、cart-lap-h-l、cart-lap-l-h或未转导对照细胞)的靶treg杀伤的图。图10a和图10b示出了在两个不同供体中进行的相同实验的结果。图11a至图11d是示出了在共培养3天后，lap靶向性cart细胞的靶treg杀伤随cart细胞与靶treg细胞比率变化的图。图11a和图11b示出了如通过流式细胞术测量的在共培养物中剩余的靶细胞的数量。虚线指示在不含car细胞的对照样品中靶细胞的数量。图11a示出了作为靶细胞的未激活treg，而图11b示出了作为靶细胞的激活treg。图11c和图11d示出了如通过靶细胞的萤光素酶表达测量的细胞毒性百分比。图11c示出了作为靶细胞的未激活treg，而图11d示出了作为靶细胞的激活treg。在图11a至图11d中的每一个中，圆圈表示cart-lap-h-l，正方形表示cart-lap-l-h，并且三角形表示未转导car细胞。图12a和图12b是流式细胞术直方图，其示出了hut78细胞的garp(图12a)和lap(图12b)表达。图13a和图13b是示出了在共培养3天后，lap靶向性cart细胞对靶hut78细胞的杀伤随cart细胞与靶细胞比率变化的图。图13a示出了如通过流式细胞术测量的3天后在培养物中剩余的靶细胞的数量。虚线指示在不含car细胞的对照样品中靶细胞的数量。图13b示出了如通过靶细胞的萤光素酶表达测量的细胞毒性百分比。圆圈表示cart-lap-h-l，正方形表示cart-lap-l-h，并且三角形表示未转导car细胞。图14a和图14b是流式细胞术直方图，其示出了seax细胞的garp(图14a)和lap(图14b)表达。图15a和图15b是示出了如通过靶细胞的萤光素酶表达测量的，在共培养24小时(图15a)和48小时(图15b)之后，garp和lap靶向性cart细胞对靶seax细胞的杀伤随cart细胞与靶细胞比率变化的图。正方形表示cart-garp，向上的三角形表示cart-lap-h-l，向下的三角形表示cart-lap-h-l细胞，并且菱形表示未转导car细胞。图16a至图16c是蛋白质印迹的照片，其示出了从cart-egfr-garpt细胞培养物中获得的上清液的蛋白质组分的存在。图16a和图16b示出了完整的凝胶，包括分子量参考梯。图16c是图16b所示凝胶的底部区域的更长曝光，其中用箭头标识了在10kd与15kd之间的带，这指示了骆驼科动物抗体的存在。图17是编码car和bite的示例性核酸分子car-egfr-bite-(egfr-cd3)的示意图。图18是具有源自西妥昔单抗的抗egfr结构域和源自博纳吐单抗(blinatumomab)的抗cd3结构域的bite的示意图。图19是一组照片，其示出了验证在泳道2中存在bite的蛋白质印迹实验。图20a和图20b是一组流式细胞术图，其示出了由用car-egfr-bite-(egfr-cd3)转导的hek293细胞表达的bite与由k562细胞表达的egfr(图20a)和由jurkat细胞表达的cd3(图20b)的结合。图21a和图21b是一组流式细胞术图，其示出了由用car-egfr-bite-(egfr-cd3)转导的supt1细胞表达的bite与由k562细胞表达的egfr(图21a)和由car-egfr-bite-(egfr-cd3)表达supt1细胞表达的cd3(图21b)的结合。图22a和图22b是一组流式细胞术图，其示出了由用car-egfr-bite-(egfr-cd3)转导的nd4细胞表达的bite与由k562细胞表达的egfr(图22a)和由car-egfr-bite-(egfr-cd3)表达nd4细胞表达的cd3(图22b)的结合。图23是示出了与由用car-egfr-bite-(egfr-cd3)转导的hek293t细胞分泌的bite一起孵育的nd4细胞对u87viii细胞的杀伤随效应细胞(未转导nd4)与靶细胞(u87viii)比率变化的图。正方形表示实验组，其中上清液含有bite，而圆圈表示不含bite的阴性对照。图24是示例性核酸分子的图，所述示例性核酸分子编码在ef1α启动子控制下的car和在nfat启动子控制下的gfp。图25a和图25b是一组流式细胞术图，其示出了用图24的构建体转导的细胞的gfp表达。红色直方图示出了在未刺激细胞中的gfp表达；蓝色直方图示出了在用pma和离子霉素刺激的细胞中的gfp表达；并且橙色直方图示出了在包被有pepviii的细胞中的gfp表达。图26a是编码car和组成型表达的bite的示例性核酸分子gfp-car-egfr-bite-(egfr-cd3)的示意图。图26b是编码car和组成型表达的bite的示例性核酸分子gfp-car-egfr-bite-(cd19-cd3)的示意图。图27a是编码car和诱导表达的bite的示例性核酸分子bite-(cd19-cd3)-car-egfr的示意图。图27b是编码car和诱导表达的bite的示例性核酸分子bite-(cd19-cd3)-car-egfr的示意图。图28示出了car-bite细胞和egfr的结合的共聚焦显微镜检查(生物素-链霉亲和素-fitc)。转导的细胞是红色的(由于mcherry报告基因)。图29a和图29b是一系列图，其示出了car-bite的抗肿瘤活性。图29a显示在靶u87神经胶质瘤细胞存在下由cart-egfrviii.bite-egfr产生ifn-γ和tnf-α。图29b示出了cart-egfrviii.bite-egfr介导的针对u87细胞的特异性裂解，在共培养40h后达到了近100％裂解。图29c是aceatranswell(孔径：1微米)实验的示意图，其中将car.bitet细胞接种在具有utd的顶部孔中，并且将靶肿瘤接种在底部中。图29d是显示含有car.bite的transwell导致u87的选择性裂解，但具有含有utd或car.bite对照的插入物的孔并非如此的图。图30a是体内评价cart-egfrviii.bite-egfr针对颅内u251的抗肿瘤活性的示意图。在第-1天在立体定向辅助下植入肿瘤，之后将1x106个car转导的细胞过继转移至对侧侧脑室中。图30b示出了car-bite在用cart-egfrviii.bite-egfr治疗的小鼠中的体内功效。cart-egfrviii.bite-egfr截至第21天展示出对颅内肿瘤的几乎完全根除。图31示出了胶质母细胞瘤和中枢神经系统(cns)的正常组织中的egfr表达。组织微阵列示出了通过免疫组织化学得到的若干个正常健康的人cns组织(顶部)和胶质母细胞瘤样本(底部)中的egfr表达。有关每个样本的细节可以见于表2。图32a示出了实验设计，其中将u87神经胶质瘤细胞(5×104)的异质群体(30％egfrviii阳性，70％野生型)植入nsg小鼠的侧腹中。图32b示出了egfrviii表达肿瘤生长随时间的生物发光分析。图32c示出了在用单独utd与cart-egfrviii治疗的小鼠中的总体肿瘤生长的卡尺测量(n＝5只小鼠)。图32d示出了在从用utd细胞或cart-egfrviii治疗的小鼠收获的肿瘤上的苏木精和曙红(h&e)染色和针对egfr和egfrviii的免疫组织化学(ihc)(比例尺＝50μm)。图32e显示了异质性egfrviii表达。图33a示出了靶向egfr和cd19的两种bite分泌型抗egfrviiicar构建体的转基因的示意图。图33b示出了转导效率。所有构建体均展示出来自3名正常供体的原代人t细胞的有效转导(平均值+sem)。图33c示出了每个bite的总体scfv取向，所述bite是由柔性甘氨酸-丝氨酸接头桥接的轻链-重链-重链-轻链。图33d示出了bite-egfr和bite-cd19的示意图。图33e示出了对用cart-egfrviii.bite-cd19或cart-egfrviii.bite-egfr转导的hek298t细胞的上清液中的bite的蛋白质印迹分析。图33f示出了流式细胞术直方图，其展示对bite与表达各自靶标的k562细胞的结合的二级his标签检测。将来自转导后10天的cart-egfrviii、cart-egfrviii.bite-cd19和cart-egfrviii.bite-egfr细胞的未浓缩上清液与表达cd19或egfr的k562细胞一起孵育。图33g示出了流式细胞术直方图，其展示bite与原代人t细胞上的cd3的结合。数据反映了对应于以下的用抗his标签抗体染色的培养物：单独utd、与cart-egfrviii.bite-cd19细胞或cart-egfrviii.bite-egfr细胞一起培养的utd。描绘了用来自各自培养物的浓缩上清液(约1000x)染色的utd。图33h显示上清液中bite浓度随时间增加。将未转导t细胞(utd)或用cart-egfrviii.bite-egfr转导的那些细胞与在第0、7和14天收集用于his标签elisa分析的上清液一起培养。一式三份进行测定(描绘了平均值+sem；未配对t检验，*＝p<0.05)。图34a通过流式细胞术示出了相对于未染色细胞，u87和u251细胞系上egfr和egfrviii的表达。图34b示出了未转导(utd)或用cart-egfrviii.bite-cd19或cart-egfrviii.bite-egfr转导并与u87或u251神经胶质瘤细胞系以1:1的e:t共培养18小时的jurkat报告t细胞。激活通过相对发光来反映。图34c示出了当与u87或u251以1:1的e:t共培养过夜时，原代人utd、cart和cart.bite细胞的细胞因子产生。图35示出了cart.bite针对egfr表达肿瘤的抗肿瘤特异性裂解。18小时后，在所指示的e:t比率下，通过基于生物发光的测定得到的utd细胞或cart-egfrviii.bite-egfr细胞针对u87的细胞毒性。图36a和图36b示出了在3:1(hi)和1:1(lo)的e:t下utd和cart细胞针对u87和u251的基于阻抗的细胞毒性测定(图36a)，其还表示为随时间的针对utd归一化的裂解百分比(图36b)。以每15分钟获得的读数记录数据。图36c示出了gbm细胞系上的egfr表达与cart细胞的特异性裂解百分比之间的相关性。通过流式细胞术确定对u251和u87的egfr表达的定量，并绘制为平均荧光强度(mfi)。通过基于阻抗的杀伤测定测量特异性裂解百分比。将效应细胞与靶细胞以1:1的e:t一起孵育24小时。细胞毒性是通过相对于与utd对照一起孵育的靶标，细胞指数的降低来反映。图37a示出了通过流式细胞术对pdx神经球系bt74上的egfr和egfrviii表达的表征。相对于同种型染色(黑色)门控阳性事件(灰色)。图37b示出了utd或用cart-egfrviii.bite-cd19或cart-egfrviii.bite-egfr转导并与bt74以1:1的e:t共培养的报告t细胞。图37c示出了以一式两份针对以3:1的e:t用egfp转导的bt74的细胞毒性评估。记录总绿色图像面积(μm2)作为bt74活力的代表。图37d示出了在4天的过程中来自图37c的神经球的代表性图像(比例尺＝100μm)。图38a示出了实验设计的示意图，其中将5x103个u87viii细胞原位植入nsg小鼠的脑中，并且用静脉内(iv)或脑室内(ivt)cart细胞(1x106个转导细胞)治疗。图38b示出了按递送途径分组，与用utd细胞的治疗相比，通过cart-egfrviii治疗的小鼠的存活图；n＝5只/组。图39a示出了实验设计的示意图，其中将5x105个用cbg-gfp转导的bt74细胞颅内(ic)植入nsg小鼠中，并在植入后第7天通过脑室内(ivt)输注utd细胞、cart-egfrviii.bite-cd19细胞或cart-egfrviii.bite-egfr细胞(1x106个转导细胞)进行治疗。图39b示出了随时间的肿瘤生长；数据表示用相应方案治疗的三只连续小鼠。图39c示出了随时间显示的每组的平均生物发光值(描绘了平均值+sd)。图40a示出了将u251细胞(2×104)原位植入nsg小鼠中并在植入后第5天用脑室内(ivt)未转导t细胞(utd)、cart-egfrviiiv.bite-cd19细胞或cart-egfrviii.bite-egfr细胞治疗。图40b示出了u251肿瘤生长随时间的生物发光成像(n＝5只小鼠)。图40c示出了单独小鼠(左图)和作为平均值(右图)的肿瘤生长(描绘了平均值+sd；未配对t检验，***＝p<0.001)。图40d示出了实验设计。将人皮肤移植到nsg小鼠的背部上并且使其愈合六周。然后通过尾静脉静脉内(iv)给予cart-egfr、cart-egfrviii.bite-cd19或cart-egfrviii.bite-egfr细胞。观察移植物长达两周，之后切除并进行组织病理学分析。图40e示出了在来自用静脉内cart细胞或cart.bite细胞治疗的小鼠的福尔马林固定、石蜡包埋的皮肤样本中，苏木精对比染色和针对cd3(t细胞)和通过末端脱氧核苷酸转移酶dutp缺口末端标记(tunel)鉴定的凋亡细胞的免疫组织化学(ihc)(比例尺＝100μm)。图40f和图40g示出了对用cart-egfr、cart-egfrviii.bite-cd19或cart-egfrviii.bite-egfr治疗的小鼠的皮肤移植物中浸润性cd3+细胞(图40f)和tunel+细胞(图40g)的定量。在40x放大下，在10个连续的高倍视野(hpf)中记录细胞计数。重复实验。条形表示平均值，n＝10(未配对t检验，**＝p<0.01，***＝p<0.001)。图41a示出了描绘bite与t细胞的结合的共焦显微镜检查。将car转导描绘为mcherry阳性细胞。egfr特异性通过结合生物素化egfr的能力来确定，并且也存在重叠区域(比例尺＝10μm)。图41b示出了图41a所示组套的示意图；cart-egfr(顶部)、cart-egfrviii.bite-cd19(中间)和cart-egfrviii.bite-egfr(底部)。图41c示出了与egfr表达肿瘤u87共培养之后，cart细胞和cart.bite细胞(mcherry阳性)以及旁观者t细胞(mcherry阴性)上的cd25和cd69表达。图41d示出了旁观者报告t细胞激活。将utd、cart细胞和cart.bite细胞与报告t细胞和egfr表达肿瘤细胞共培养过夜，随后通过相对发光测量旁观者激活。图41e示出了针对u87的cart细胞和cart.bite细胞培养增殖。将cart细胞和cart.bite细胞与靶细胞共培养，揭示了转导细胞、未转导旁观者细胞和u87。图41f示出了通过计数珠对来自图41e所示培养物的旁观者细胞的流式细胞术定量。图41g示出了用于评估旁观者细胞因子分泌和针对u87的细胞毒性的transwell系统的示意图。将未转导或用cart.bite构建体转导的jurkatt细胞在顶部孔中培养，而将原代人utd细胞和u87靶标置于底部孔中。图41h示出了当与靶标共培养并暴露于来自顶部孔的上清液时旁观者utd细胞的细胞因子产生。图41i示出了基于阻抗的细胞毒性测定，其使用图41g中描绘的transwell系统，测量旁观者细胞针对u87和u87-cd19的活性。图42示出了基于生物发光的细胞毒性测定，其使用transwell系统测量旁观者treg针对u87的活性。将用cart-egfrviii.bite-cd19或cart-egfrviii.bite-egfr转导的t细胞在顶部孔中培养，而将分选的原代人treg(cd4+cd25+cd127dim/-)和u87靶标置于底部孔中。图43a示出了实验设计的示意图，其中将u87神经胶质瘤细胞(5×103)的异质群体(10％egfrviii阳性，90％野生型)原位植入nsg小鼠的脑中。用cbg-luc修饰u87和u87viii细胞，由此使得可以通过生物发光成像来使颅内总肿瘤负荷可视化。在植入后第2天，用未转导t细胞(utd)、cart-egfrviii.bite-cd19细胞或cart-egfrviii.bite-egfr细胞对小鼠进行脑室内治疗。图43b示出了混合型肿瘤生长随时间的生物发光分析(n＝5)。图43c示出了作为平均值示出的肿瘤生长(描绘了平均值+sd；未配对t检验，***＝p<0.001)。图43d示出了分选的cart细胞和cart.bite细胞纯度。示出了细胞分选之前和之后的代表性流式细胞术数据。图43e和43f示出了在所指示的e:t比率下，在18h内utd、分选的cart-egfrviii细胞或分选的cart.bite细胞针对u87、u87-cd19(图41e)或u87viii(图41f)的基于生物发光的细胞毒性测定。图43g示出了分选的转导细胞的增殖测定。使用经辐照的u87、u87viii或u87-cd19刺激效应细胞(箭头)。然后通过单独car(cart-egfrviii.bite-cd19与u87viii)，单独bite(cart-egfrviii.bite-cd19与u87-cd19)或car和bite(cart-egfrviii.bite-egfr和u87viii)刺激utd细胞、分选的cart-egfrviii细胞和分选的cart.bite细胞。一式三份进行测定(描绘了平均值+sem；未配对t检验，***＝p<0.001)。图43h示出了在刺激3周之后，如图41g中概述的t细胞表型。根据t细胞表型通过流式细胞术对细胞进行如下分组：幼稚(tn)ccr7+cd45ro-、中央记忆(tcm)ccr7+cd45ro+、效应记忆(tem)ccr7-cd45ro+和效应(te)ccr7-cd45ro-。饼状图展示了通过单独bite、单独car、或car和bite刺激的cart细胞的表型。图43i示出了通过单独bite、单独car或car和bite刺激12天后的消耗标记(pd-1、tim-3和lag-3)。图44a至图44c是一系列示意图，其示出了示例性嵌合抗原受体(car)，包括靶向两种不同抗原的串联car。图44a示出了示例性抗il-13rα2car构建体的示意图，所述构建体包含ef1α启动子、il-13受体α2配体(如il-13泽塔因子、抗il-13ra2单链可变片段或单结构域抗体)、4-1bb跨膜结构域、4-1bb共刺激结构域、cd3ζ结构域、t2a肽序列和报告基因(mcherry)。图44b示出了示例性抗egfrviiicar构建体的示意图，所述构建体包含ef1α启动子、抗egfrviiiscfv、cd8跨膜结构域、4-1bb共刺激结构域、cd3ζ结构域、t2a肽序列和报告基因(mcherry)。图44c示出了示例性串联抗il-13rα2/抗egfrviiicar构建体的示意图，所述构建体包含ef1α启动子、il-13配体(il-13泽塔因子)、抗egfrviiiscfv、cd8跨膜结构域、4-1bb共刺激结构域、cd3ζ结构域、t2a肽序列和报告基因(mcherry)。图44d示出了图44a至图44c的构建体在没有mcherry的情况下的示意图。图45a是一系列图，其示出了用于评估u87人胶质母细胞瘤细胞和经转导以表达egfrviii的u87细胞(u87viii)中il-13rα2的表达的流式细胞术分析结果。图45b是示出了细胞毒性测定的结果的图，在所述细胞毒性测定中，将胶质母细胞瘤细胞的异质群体(1:1比率的u87细胞:u87viii细胞)与对照未转导t细胞(utd)或用来自图44a至图44c的所指示car构建体转导的t细胞一起孵育。y轴示出了特异性裂解百分比，并且x轴示出了效应物与靶标(e:t)的比率。具体实施方式本发明提供了基于嵌合抗原受体t细胞(“cart细胞”)的疗法的改进方法。通常，改进涉及抗肿瘤疗法中靶向的不同方面，例如对肿瘤微环境的靶向。例如，本文描述免疫细胞，例如经工程化以表达car并分泌治疗剂(如双特异性t细胞接合器(bite))的t细胞。经工程化以分泌bite的cart细胞在本文中称为cart.bite。cart.bite策略允许局部递送治疗药用于例如在中枢神经系统(cns)中的肿瘤，同时降低在全身组织中的不期望活性的风险。此类cart.bite构建体尤其可用于治疗癌症，如胶质母细胞瘤、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、淋巴瘤或骨髓瘤，如本文所述。另外，如下文进一步解释的，我们已经证明，可以用cart细胞靶向调节性t细胞(在本文中也称为“treg”)，所述调节性t细胞在对受试者针对肿瘤的免疫应答的抑制(例如，在肿瘤微环境中)中起作用。因此，本发明提供了cart细胞，其中car针对treg抗原或标记(例如，garp、lap、ctla4或cd25；也参见下文)。在其他例子中，本发明提供了cart细胞，其分泌针对一种或多种treg抗原或标记(例如，garp、lap、ctla4或cd25；也参见下文)的抗体(例如，单链抗体、单结构域抗体(例如，骆驼科动物抗体)或双特异性抗体(例如，双特异性t细胞接合器))。除了靶向treg外，本发明提供了cart细胞和用于将其他治疗剂(例如抗体和相关分子)递送至肿瘤的相关方法。在一个例子中，具有对egfrviii具有特异性的car的cart细胞用于靶向脑肿瘤(例如，胶质母细胞瘤)。此类cart细胞还可以用于向这些肿瘤递送治疗剂，如抗体试剂(例如，单链抗体、单结构域抗体(例如骆驼科动物抗体)或双特异性抗体(例如双特异性t细胞接合器))。这些方法是特别有利的，因为尽管存在抗体通常无法通过的血脑屏障，但是所述方法实际上促进将抗体给予至脑。这些方法以及相关的方法和组合物进一步描述如下。嵌合抗原受体(car)本文所述的技术提供了用于在免疫疗法中使用的改善的嵌合抗原受体(car)。以下讨论了car和各种改善。如本文所用的术语“嵌合抗原受体”或“car”或“多个car”是指工程化t细胞受体，其将配体或抗原特异性移植到t细胞(例如，幼稚t细胞、中央记忆t细胞、效应记忆t细胞或其组合)上。car也被称为人工t细胞受体、嵌合t细胞受体或嵌合免疫受体。car将嵌合细胞外靶标结合结构域(其特异性结合在待靶向用于t细胞应答的细胞表面上表达的靶标(例如多肽))置于构建体上，所述构建体包含t细胞受体分子的跨膜结构域和一个或多个细胞内结构域。在一个实施方案中，嵌合细胞外靶标结合结构域包括抗体的一个或多个抗原结合结构域，所述抗体特异性结合在待靶向用于t细胞应答的细胞表面上表达的抗原。如本领域已知且如本文所公开，car的一个或多个细胞内信号传导结构域的特性可以变化，但是当嵌合靶标/抗原结合结构域结合所靶向细胞表面上的靶标/抗原时，一个或多个嵌合靶标/抗原结合结构域使受体对信号传导激活敏感。关于细胞内信号传导结构域，所谓的“第一代”car包含在抗原结合后仅提供cd3zeta(cd3ζ)信号的那些。所谓的“第二代”car包含提供共刺激(例如cd28或cd137)结构域和激活(cd3ζ)结构域的那些，并且所谓的“第三代”car包含提供多个共刺激(例如，cd28和cd137)结构域和激活结构域(例如，cd3ζ)的那些。在各种实施方案中，选择car以具有对靶标/抗原的高亲和力或亲合力，例如，与天然存在的t细胞受体相比，源自抗体的靶标或抗原结合结构域通常将具有更高的对靶抗原的亲和力和/或亲合力。这种特性与可以针对抗体选择的高特异性相结合，提供了cart细胞的高特异性t细胞靶向。如本文所用，“cart细胞”或“car-t”是指表达car的t细胞。当在t细胞中表达时，car具有利用单克隆抗体的抗原结合特性，以非mhc限制性方式将t细胞特异性和反应性重定向至所选靶标的能力。非mhc限制性抗原识别给予表达car的t细胞不依赖抗原加工而识别抗原的能力，由此绕过肿瘤逃逸的主要机制。如本文所用，术语“细胞外靶标结合结构域”是指在细胞外部发现的足以促进与靶标结合的多肽。细胞外靶标结合结构域将特异性结合其结合配偶体，即靶标。作为非限制性实例，细胞外靶标结合结构域可以包括识别并结合同源结合配偶体蛋白的抗体或抗体试剂或配体的抗原结合结构域。在这个背景下，配体是与蛋白质和/或受体的一部分特异性结合的分子。在本文所述的方法和组合物中有用的配体的同源结合配偶体通常可以在细胞表面上发现。配体:同源配偶体结合可以导致带有配体的受体的改变，或激活生理反应，例如激活信号传导途径。在一个实施方案中，配体对于基因组可以是非天然的。任选地，配体具有跨越至少两个物种的保守功能。抗体试剂在各种实施方案中，本文所述的car包含抗体试剂或其抗原结合结构域作为细胞外靶标结合结构域。如本文所用，术语“抗体试剂”是指包括至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列并且特异性结合给定抗原的多肽。抗体试剂可以包括抗体或含有抗体的抗原结合结构域的多肽。在任何方面的一些实施方案中，抗体试剂可以包括单克隆抗体或含有单克隆抗体的抗原结合结构域的多肽。例如，抗体可以包括重(h)链可变区(本文缩写为vh)和轻(l)链可变区(本文缩写为vl)。在另一个例子中，抗体包含两个重(h)链可变区和两个轻(l)链可变区。术语“抗体试剂”涵盖抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、fab和sfab片段，f(ab')2、fd片段、fv片段、scfv、cdr和结构域抗体(dab)片段(参见例如dewildt等人,eur.j.immunol.26(3):629-639,1996；将其通过引用以其全文并入本文))以及完整抗体。抗体可以具有iga、igg、ige、igd或igm(及其亚型和组合)的结构特征。抗体可以来自任何来源，包括小鼠、兔、猪、大鼠和灵长类动物(人和非人灵长类动物)和灵长类化抗体。抗体还包括抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。可以使用本领域普通技术人员已知的方法，例如从噬菌体展示文库中选择完全人抗体结合结构域。此外，抗体试剂包括单结构域抗体，如骆驼科动物抗体。vh和vl区可以进一步细分为具有高变性的区域，称为“互补决定区”(“cdr”)，其中散布有更保守的区域，称为“框架区”(“fr”)。已经精确限定了框架区和cdr的范围(参见kabat,e.a.等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nih公开号91-3242和chothia等人,j.mol.biol.196:901-917,1987；将所述文献中的每一篇通过引用以其全文并入本文)。每个vh和vl通常由三个cdr和四个fr构成，它们从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。在一个实施方案中，抗体或抗体试剂不是人抗体或抗体试剂(即，抗体或抗体试剂是小鼠的)，但是已被人源化。“人源化抗体或抗体试剂”是指非人抗体或抗体试剂，其已经在蛋白质序列水平上进行修饰以增加其与人中天然产生的抗体或抗体试剂变体的相似性。将抗体人源化的一种方法采用将鼠类或其他非人cdr移植到人抗体框架上。在一个实施方案中，car的细胞外靶标结合结构域包括单链fv(scfv)片段或基本上由其组成，所述单链fv片段是通过经由柔性接头肽将抗体(通常为单克隆抗体)的vh和vl结构域融合而产生的。在各种实施方案中，scfv融合至跨膜结构域并且融合至t细胞受体细胞内信号传导结构域，例如如本文所述的工程化细胞内信号传导结构域。在另一个实施方案中，car的细胞外靶标结合结构域包括骆驼科动物抗体。抗体结合结构域以及对其进行选择和克隆的方式是本领域普通技术人员所熟知的。在一些实施方案中，抗体试剂是抗garp抗体试剂，并且包含序列seqidno:3或25，或包含与序列seqidno:3或25具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的序列。在进一步的实施方案中，抗体试剂是抗garp抗体试剂，并且包括seqidno:81、82、83、84、85和/或86的互补决定区(cdr)，或包含seqidno:81、82、83、84、85和/或86的具有至少1、2或3个氨基酸取代的cdr序列。在进一步的实施方案中，抗garp抗体试剂包括seqidno:87和88的可变重链(vh)和/或可变轻链(vl)，或包含与序列seqidno:87和88具有至少75％、至少具有80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的vh和/或vl序列。vh可以位于vl的n末端，或者vl可以位于vh的n末端。在进一步的实施方案中，抗garp抗体试剂包含序列seqidno:71或77，或包含与序列seqidno:71或77具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的序列。在其他实施方案中，抗体试剂是抗lap抗体试剂，并且包括seqidno:89、90、91、92、93和/或94的互补决定区(cdr)，或包含seqidno:89、90、91、92、93和/或94的具有至少1、2或3个氨基酸取代的cdr序列。在进一步的实施方案中，抗lap抗体试剂包括seqidno:95和96的vh和/或vl，或包含与序列seqidno:87和88具有至少75％、至少具有80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的vh和/或vl序列。vh可以位于vl的n末端，或者vl可以位于vh的n末端。在进一步的实施方案中，抗体试剂是抗lap抗体试剂，并且包含序列seqidno:9或15，或包含与序列seqidno:9或15具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的序列。在其他实施方案中，抗体试剂是抗egfr或抗egfrviii抗体试剂，并且包含序列seqidno:21、27、33、36、42、45、55、57、65或103，或包含与序列seqidno:21、27、33、36、42、45、55、57、65或103具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的序列。在特定实施方案中，抗体试剂是抗egfrviiiscfv。例如，抗egfrviiiscfv包含这样的vh，所述vh对应于氨基酸序列seqidno:111或113；包含氨基酸序列seqidno:111或113；或包含与氨基酸序列seqidno:111或113具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，抗egfrviiiscfv包含这样的vl，所述vl对应于氨基酸序列seqidno:112或114；包含氨基酸序列seqidno:112或114；或包含与氨基酸序列seqidno:112或114具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗egfrviiiscfv对应于序列seqidno:27、36、45、57、65或103；包含序列seqidno:27、36、45、57、65或103，或包含与序列seqidno:27、36、45、57、65或103具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的序列。如下所述，包括包含细胞外靶标结合结构域(包括抗egfrviiiscfv)的car多肽的免疫细胞可以分泌抗egfrbite。在其他实施方案中，抗体试剂是抗cd19抗体试剂，并且包含序列seqidno:51或63，或包含与序列seqidno:51或63具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的序列。在又其他实施方案中，抗体试剂是抗cd3抗体试剂，并且包含序列seqidno:34、43、52、56或64，或包含与序列seqidno:34、43、52、56或64具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的序列。在各种例子中，抗体试剂可以选自c225、3c10、西妥昔单抗和2173。本文所述的任何抗体试剂可以用作car的抗原结合结构域或用作治疗剂。在一个实施方案中，可用于本文所述的技术中的car包含至少两个抗原特异性靶向区、细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在此类实施方案中，两个或更多个抗原特异性靶向区靶向至少两种不同的抗原，并且可以串联排列并被接头序列分开。在另一个实施方案中，car是双特异性car。双特异性car对两种不同的抗原具有特异性。例如，双特异性car可以是靶向il-13rα2和egfrviii的串联car。在一些实施方案中，il-13rα2结合序列包括抗il-13rα2抗体试剂，例如scfv或单结构域抗体(例如骆驼科动物)。在一些实施方案中，il-13rα2结合序列可以包括il-13rα2配体或其抗原结合片段，例如il-13或il-13泽塔因子。在一些实施方案中，il-13泽塔因子对应于序列seqidno:101，或包含序列seqidno:101，或包含与序列seqidno:101具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的序列。在一些实施方案中，egfrviii结合位点可以包括抗egfrviiiscfv。在一些实施方案中，抗egfrviiiscfv包含这样的vh，所述vh对应于序列seqidno:111或113，包含氨基酸序列seqidno:111或113；或包含与氨基酸序列seqidno:111或113具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗egfrviiiscfv包含这样的vl，所述vl对应于氨基酸序列seqidno:112或114，包含氨基酸序列seqidno:112或114，或包含与氨基酸序列seqidno:112或114具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列。vh可以位于vl的n末端，或者vl可以位于vh的n末端。在一些实施方案中，抗egfrviiiscfv对应于序列seqidno:27、36、45、57、65或103，或包含序列seqidno:27、36、45、57、65或103，或包含与序列seqidno:27、36、45、57、65或103具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的序列。il-13rα2结合序列可以位于egfrviii结合序列的n末端，或者egfrviii结合序列可以位于il-13rα2的n末端。il-13rα2结合序列和egfrviii结合序列可以任选地经由接头连接，例如seqidno:102的接头以及本文所述或本领域已知的任何其他接头。靶标/抗原car可以靶向任何细胞表面部分。通常，靶标是可以在希望靶向用于t细胞应答的细胞上差异或优先表达的细胞表面多肽。为了靶向treg，抗体试剂可以靶向例如以下：糖蛋白a为主的重复序列(garp)、潜伏期相关肽(lap)、cd25、ctla-4、icos、tnfr2、gitr、ox40、4-1bb和lag-3。如本文所述，为了靶向肿瘤或癌细胞，可以使抗体结构域靶向例如egfr或egfrviii。靶向为肿瘤特有的肿瘤抗原或肿瘤相关抗原可以提供在避免或至少限制对非肿瘤细胞或组织的附带损害的同时靶向肿瘤细胞的手段。另外的肿瘤抗原、肿瘤相关抗原或其他目的抗原的非限制性例子包括cd19、cd37、bcma(肿瘤坏死因子受体超家族成员17(tnfrsf17)；ncbi基因id：608；ncbi参考序列：np_001183.2和mrna(例如、ncbi参考序列：nm_001192.2))、cea、未成熟层粘连蛋白受体、tag-72、hpve6和e7、bing-4、钙激活的氯离子通道2、细胞周期蛋白b1、9d7、ep-cam、epha3、her2/neu、端粒酶、间皮素、sap-1、存活蛋白、bage家族、cage家族、gage家族、mage家族、sage家族、xage家族、ny-eso-1/lage-1、prame、ssx-2、melan-a/mart-1、gp100/pmel17、酪氨酸酶、trp-1/-2、mc1r、brca1/2、cdk4、mart-2、p53、ras、muc1、tgf-βrii、il-15、il13ra2和csf1r。在一些实施方案中，car的靶标/抗原是egfr、egfrviii、cd19、cd79b、cd37、前列腺特异性膜抗原(psma)、前列腺干细胞抗原(psca)、il-13rα2、epha1、her2、间皮素、muc1或muc16。在其他实施方案中，car的靶标/抗原是lap或garp。在进一步的实施方案中，car是与egfr、egfrviii、cd19、cd79b、cd37、psma、psca、il-13rα2、epha1、her2、间皮素、muc1和muc16中的两个结合的双特异性car。铰链和跨膜结构域如本文所述的每个car包含将细胞外靶标结合结构域连接至细胞内信号传导结构域的跨膜结构域，例如铰链/跨膜结构域。car的结合结构域后面任选地具有一个或多个“铰链结构域”，其在将抗原结合结构域远离效应细胞表面定位以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和激活中起作用。car任选地在结合结构域与跨膜结构域(tm)之间包括一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可以包含天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。适用于本文所述的car的说明性铰链结构域包括源自1型膜蛋白(如cd8(例如cd8α)、cd4、cd28、4-1bb和cd7)的细胞外区域的铰链区，其可能是来自这些分子的野生型铰链区或可以被改变。在一些实施方案中，铰链区源自免疫球蛋白样蛋白(例如，iga、igd、ige、igg或igm)、cd28或cd8的铰链区。在一个实施方案中，铰链结构域包括cd8α铰链区。如本文所用，“跨膜结构域”(tm结构域)是指car中的如下部分，所述部分任选地经由铰链结构域将细胞外结合部分与细胞内部分(例如，共刺激结构域和细胞内信号传导结构域)融合，并且将所述car锚定至免疫效应细胞的质膜上。跨膜结构域通常是car中跨越细胞质膜的疏水性区域。tm结构域可以是跨膜蛋白(例如i型跨膜蛋白或其他跨膜蛋白)的跨膜区或其片段、人工疏水序列或其组合。虽然本文提供了具体例子并用于实施例中，但是其他跨膜结构域对于本领域技术人员而言将是明显的，并且可以与本技术的替代实施方案结合使用。选择的跨膜区或其片段优选不干扰car的预期功能。如关于蛋白质或多肽的跨膜结构域所使用的，“其片段”是指跨膜结构域中足以将蛋白质锚定或附着至细胞表面的部分。在一些例子中，本文所述的car的跨膜结构域或其片段包括选自以下的跨膜结构域的跨膜结构域：t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、kirds2、ox40、cd2、cd27、lfa-1(cd11a、cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、4-1bbl、gitr、cd40、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7ra、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、slamf6(ntb-a、lyl08)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46、nkg2d和/或nkg2c。如本文所用，“铰链/跨膜结构域”是指包括铰链结构域和跨膜结构域两者的结构域。例如，铰链/跨膜结构域可以源自cd8、cd28、cd7或4-1bb的铰链/跨膜结构域。在一个实施方案中，car或其片段的铰链/跨膜结构域源自或包括cd8的铰链/跨膜结构域(例如，seqidno:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72、78、104或其变体中的任何一种)。cd8是优先在细胞毒性t淋巴细胞的细胞表面上发现的抗原。cd8介导免疫系统内的细胞-细胞相互作用，并充当t细胞共受体。cd8由α(cd8α或cd8a)和β(cd8β或cd8b)链组成。已知许多物种的cd8a序列，例如人cd8a(ncbi基因id：925)多肽(例如，ncbi参考序列np_001139345.1)和mrna(例如，ncbi参考序列nm_000002.12)。cd8可以是指人cd8，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。在任何方面的一些实施方案中，例如在兽医应用中，cd8可以是指例如狗、猫、牛、马、猪等的cd8。本领域技术人员容易地鉴定此类物种的人cd8的同系物和/或直系同源物，例如使用ncbi直系同源物搜索功能或针对与参考cd8序列相似的序列搜索给定物种的可用序列数据。在一些实施方案中，cd8铰链和跨膜序列对应于氨基酸序列seqidno:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72、78或104；或包含序列seqidno:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72、78或104；或包含与序列seqidno:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72、78或104具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。共刺激结构域本文所述的每个car任选地包括一个或多个共刺激分子的细胞内结构域，或共刺激结构域。如本文所用，术语“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。共刺激分子是除抗原受体或fc受体以外的细胞表面分子，其提供t淋巴细胞在结合抗原后的有效激活和功能所需的第二信号。共刺激结构域可以是例如4-1bb、cd27、cd28或ox40的共刺激结构域。在一个例子中，可以使用4-1bb细胞内结构域(icd)(参见例如，下文和seqidno:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73、79、105或其变体)。此类共刺激分子的另外的说明性例子包括card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd150(slamf1)、cd152(ctla4)、cd223(lag3)、cd270(hvem)、cd273(pd-l2)、cd274(pd-l1)、cd278(icos)、dap10、lat、nkd2cslp76、trim和zap70。在一个实施方案中，细胞内结构域是4-1bb的细胞内结构域。4-1bb(cd137；tnfrs9)是激活诱导的共刺激分子，并且是免疫应答的重要调节剂。4-1bb是膜受体蛋白(也称为cd137)，其是肿瘤坏死因子(tnf)受体超家族的成员。4-1bb在激活的t淋巴细胞上表达。已知许多物种的4-1bb序列，例如人4-1bb，也称为tnfrsf9(ncbi基因id：3604)和mrna(ncbi参考序列：nm_001561.5)。4-1bb可以是指人4-1bb，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。在任何方面的一些实施方案中，例如在兽医应用中，4-1bb可以是指例如狗、猫、牛、马、猪等的4-1bb。本领域技术人员容易地鉴定此类物种的人4-1bb的同系物和/或直系同源物，例如使用ncbi直系同源物搜索功能或针对与参考4-1bb序列相似的序列搜索给定物种的可用序列数据。在一些实施方案中，细胞内结构域是4-1bb的细胞内结构域。在一个实施方案中，4-1bb细胞内结构域对应于选自seqidno:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73、79或105的氨基酸序列；或包含选自seqidno:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73、79或105的序列；或包含与选自seqidno:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73、79或105的序列的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性。细胞内信号传导结构域如本文所述的car包含细胞内信号传导结构域。“细胞内信号传导结构域”是指car多肽的一部分，所述部分参与将有效car与靶抗原结合的信息转导至免疫效应细胞内部，以引发效应细胞功能，例如激活、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性，包括向car结合的靶细胞释放细胞毒性因子，或在抗原与细胞外car结构域结合后引发的其他细胞应答。在各种例子中，细胞内信号传导结构域来自cd3ζ(参见例如，下文)。在所述技术中特别使用的含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的细胞内信号传导结构域的另外的非限制性例子包括源自tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3θ、cd3δ、cd3η、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。cd3是t细胞共受体，其在同时参与适当的共刺激(例如，共刺激分子的结合)时促进t淋巴细胞激活。cd3复合物由4条不同的链组成；哺乳动物cd3由cd3γ链、cd3δ链和两条cd3ε链组成。这些链与称为t细胞受体(tcr)的分子和cd3ζ缔合，以在t淋巴细胞中生成激活信号。完整的tcr复合物包括tcr、cd3ζ和完整的cd3复合物。在任何方面的一些实施方案中，本文所述的car多肽包含细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含来自cd3zeta(cd3ζ)(包括cd3ζ的变体，如itam突变的cd3ζ)、cd3η或cd3θ的基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam。在任何方面的一些实施方案中，itam包括cd3ζ的三个itam基序(itam3)。在任何方面的一些实施方案中，cd3ζ的三个itam基序没有突变，因此包括天然或野生型序列。在一些实施方案中，cd3ζ序列包含如在本文提供的序列中所示的cd3ζ序列，例如，seqidno:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74、80、106或其变体之一的cd3ζ序列。例如，本文所述的car多肽包含cd3ζ的细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，cd3ζ细胞内信号传导结构域对应于选自seqidno:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74、80或106的氨基酸序列；或包含选自seqidno:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74、80或106的序列；或包含与选自seqidno:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74、80或106的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％序列同一性的序列。如本领域技术人员可以确定的，如本文所述的单独car和其他构建体组分可以彼此一起使用，并且可以在本文所述的各种构建体中换入和换出。这些组分中的每一个可以包含本文中所示的任何相应序列或其变体或由本文中所示的任何相应序列或其变体组成。car和cart细胞的更详细描述可以见于以下文献中：maus等人,blood123:2624-2635,2014；reardon等人,neuro-oncology16:1441-1458,2014；hoyos等人,haematologica97:1622,2012；byrd等人,j.clin.oncol.32:3039-3047,2014；maher等人,cancerres69:4559-4562,2009；和tamada等人,clin.cancerres.18:6436-6445,2012；将所述文献中的每一篇通过引用以其全文并入本文。在一些实施方案中，如本文所述的car多肽包含信号肽。信号肽可以源自具有细胞外结构域或被分泌的任何蛋白质。如本文所述的car多肽可以包括本领域已知的任何信号肽。在一些实施方案中，car多肽包含cd8信号肽，例如如下cd8信号肽：对应于氨基酸序列seqidno:2、8、14、20、70或76，或包含氨基酸序列seqidno:2、8、14、20、70或76，或包含与seqidno:2、8、14、20、70或76具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，本文所述的car多肽可以任选地不包括本文所述的信号肽之一，本文所述的信号肽例如seqidno:2、8、14、20、70或76的cd8信号肽或seqidno:32、41、50、54或62的igκ信号肽。在一个实施方案中，car进一步包括接头结构域。如本文所用，“接头结构域”是指长度为约2至100个氨基酸的寡肽或多肽区域，其将如本文所述的car的任何结构域/区域连接在一起。在一些实施方案中，接头可以包括柔性残基如甘氨酸和丝氨酸或由其构成，使得相邻的蛋白质结构域相对于彼此自由移动。可用于本发明的接头序列的长度可以是2至100个氨基酸、5至50个氨基酸、10至15个氨基酸、15至20个氨基酸或18至20个氨基酸，并且包括本领域已知的任何合适的接头。例如，可用于本发明的接头序列包括但不限于甘氨酸/丝氨酸接头，例如gggsgggsgggs(seqidno:107)和gly4ser(g4s)接头，如(g4s)3(ggggsggggsggggs(seqidno:108))和(g4s)4(ggggsggggsggggsggggs(seqidno:102))；gstsgsgkpgsgegstkg(seqidno:109)的接头序列，如通过whitlow等人,proteineng.6(8):989-95,1993(将其内容通过引用以其全文并入本文)所述；ggssrssssggggsgggg(seqidno:110)的接头序列，如通过andris-widhopf等人,coldspringharb.protoc.2011(9),2011(将其内容通过引用以其全文并入本文)所述；以及具有添加的功能性(例如表位标签或含有cre-lox重组位点的编码序列)的接头序列，如通过sblattero等人,nat.biotechnol.18(1):75-80,2000(将其内容通过引用以其全文并入本文)所述。当希望确保两个相邻的结构域在空间上不会彼此干扰时，可以使用较长的接头。此外，接头可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解接头的例子包括2a接头(例如，p2a和t2a)、2a样接头或其功能等同物及其组合。例如，p2a接头序列可以对应于氨基酸序列seqidno:31、40或49。在各种例子中，使用具有如本文所示序列或其变体的接头。应当理解，在构建体中的特定位置中的特定接头的指示并不意指在那里仅可以使用该接头。而是，如本领域技术人员可以确定的，不同的接头序列(例如，p2a和t2a)可以彼此交换(例如，在本发明的构建体的情境下)。在一个实施方案中，接头区域是源自明脉扁刺蛾β四体病毒(thoseaasignavirus)的t2a。可以在该技术中使用的接头的非限制性例子包括t2a、p2a、e2a、bmcpv2a和bmifv2a。如这些的接头可用于多蛋白(如下文所述的那些)的情境中。例如，它们可用于将多蛋白的car组分与多蛋白的治疗剂(例如，抗体，如scfv、单结构域抗体(例如，骆驼科动物抗体)或双特异性抗体(例如，bite)组分分开(参见下文)。在一些实施方案中，如本文所述的car任选地进一步包括报告分子，例如以允许非侵入性成像(例如，正电子发射断层摄影pet扫描)。在包括报告分子的双特异性car中，第一细胞外结合结构域和第二细胞外结合结构域可以包括不同或相同的报告分子。在双特异性cart细胞中，第一car和第二car可以表达不同或相同的报告分子。在另一个实施方案中，如本文所述的car进一步包括可单独成像或与底物或化学物质(例如9-[4-[18f]氟-3-(羟甲基)丁基]鸟嘌呤([18f]fhbg))组合成像的报告分子(例如潮霉素磷酸转移酶(hph))。在另一个实施方案中，如本文所述的car进一步包括可以使用非侵入性技术容易地成像的纳米颗粒(例如，用64cu2+功能化的金纳米颗粒(gnp))。用于非侵入性成像的cart细胞的标记综述于例如以下文献中：bhatnagar等人,integr.biol.(camb).5(1):231-238,2013，和keu等人,sci.transl.med.18；9(373),2017，将所述文献通过引用以其全文并入本文。gfp和mcherry在本文中显示为可用于对在t细胞(例如，cart细胞)上表达的car进行成像的荧光标签。预期基本上本领域已知的任何荧光蛋白都可以用作用于该目的的荧光标签。对于临床应用，car不需要包括荧光标签或荧光蛋白。因此，在本文提供的特定构建体的每种情况下，可以除去存在于构建体中的任何标记。本发明包括具有或不具有标记的构建体。因此，当本文提及特定构建体时，可以认为具有或不具有任何标记或标签(包括例如组氨酸标签，如hhhhhh(seqidno:97)的组氨酸标签)都包括在本发明内。在一些实施方案中，car多肽序列对应于选自seqidno:1、7、13、69、75、100、115、116或117的序列，包含选自seqidno:1、7、13、69、75、100、115、116或117的序列，或包含与选自seqidno:1、7、13、69、75、100、115、116或117的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的序列，任选地不包括如本文所述的cd8信号肽，或seqidno:21-24、27-30、36-39、45-48、57-60、65-68、71-74、77-80或101-106的组合。如本领域技术人员可以确定的，这些car的各种功能相似或等效的组分可以彼此交换或取代，以及与本领域已知或本文列出的其他相似或功能等效组分交换或取代。通过cart细胞递送的治疗剂如上所述，本发明的cart细胞可以任选地用于将治疗剂，例如抗体试剂或其他治疗性分子(如细胞因子)递送至肿瘤(即，至肿瘤微环境)。在各种实施方案中，治疗剂由与car相同的核酸分子编码，由此促进细胞(例如，t细胞)的转导以表达car和治疗剂(例如抗体试剂或细胞因子)两者。在此类例子中，治疗剂(例如，抗体试剂或细胞因子)可以被表达，例如使得其通过可裂解接头序列(例如2a接头，如p2a或t2a；参见上文)与car(和任选的其他蛋白质，例如标记)分开。治疗剂(例如，抗体试剂或细胞因子)可以在与car相同的启动子的控制下(例如通过ef1α启动子)表达，并且可以是组成型表达的。在其他例子中，治疗剂(例如，抗体试剂或细胞因子)在诱导型启动子(例如在t细胞激活时表达的启动子(例如nfat启动子))的控制下表达。可以使用这种诱导型启动子，例如以确保仅在t细胞激活时，因此仅例如在cart细胞在肿瘤微环境内时才表达抗体，将抗体产生局限于所述肿瘤微环境地点可能是有利的。如本领域所理解的，在本发明内的各种载体设计中，car编码序列可以是在治疗剂(例如，抗体试剂或细胞因子)编码序列的5'或3'。在一些实施方案中，治疗剂包括igκ信号肽，例如如下igκ信号肽：对应于氨基酸序列seqidno:32、41、50、54或62，或包含氨基酸序列seqidno:32、41、50、54或62，或包含与序列seqidno:32、41、50、54或62具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的氨基酸序列。在各种例子中，治疗剂是抗体试剂。在cart细胞内表达的抗体试剂(例如，来自与car相同的核酸分子)可以是如本文所述的单链抗体(例如，scfv)或单结构域抗体(例如，骆驼科动物)。在单链抗体的情况下，轻链(l)和重链(h)可以按顺序(从n末端到c末端)是l-h或h-l，并且任选地可以通过接头(例如，基于甘氨酸的接头)彼此分开。在进一步的例子中，抗体试剂是双特异性抗体，包括例如下文所述的双特异性t细胞接合器(bite)。抗体试剂可以靶向例如肿瘤抗原，如egfr、egfrviii、cd19、il-15、il13ra2、csf1r。例如，抗体试剂是抗egfr或抗egfrviii抗体试剂，并且包含序列seqidno:21、27、33、36、42、45、55、57、或65，或包含与序列seqidno:21、27、33、36、42、45、55、57、或65具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的序列。在另一个例子中，抗体试剂是抗cd19抗体试剂，并且包含序列seqidno:51或63，或包含与序列seqidno:51或63具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的序列。在另一个例子中，抗体试剂是抗cd3抗体试剂，并且包含序列seqidno:34、43、52、56或64，或包含与序列seqidno:34、43、52、56或64具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的序列。在各种其他例子中，抗体试剂可以包括c225、3c10、西妥昔单抗或2173、或其抗原结合片段。在其他例子中，抗体试剂可以靶向例如treg抗原，如ctla-4、cd25、garp、lap。例如，抗体试剂是抗garp抗体试剂，并且包含序列seqidno:3或25，或包含与序列seqidno:3或25具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的序列。在进一步的实施方案中，抗体试剂是抗garp抗体试剂，并且包括seqidno:81、82、83、84、85和/或86的互补决定区(cdr)，或包含seqidno:81、82、83、84、85和/或86的具有至少1、2或3个氨基酸取代的cdr序列。在进一步的实施方案中，抗garp抗体试剂包括seqidno:87和88的vh和/或vl，或包含与序列seqidno:87和88具有至少75％、至少具有80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的vh和/或vl序列。vh可以位于vl的n末端，或者vl可以位于vh的n末端。在进一步的实施方案中，抗garp抗体试剂包含序列seqidno:71或77，或包含与序列seqidno:71或77具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的序列。在另一个例子中，抗体试剂是抗lap抗体试剂，并且包括seqidno:89、90、91、92、93和/或94的互补决定区(cdr)，或包含seqidno:89、90、91、92、93和/或94的具有至少1、2或3个氨基酸取代的cdr序列。在一些实施方案中，抗lap抗体试剂包括seqidno:95和96的vh和/或vl，或包含与序列seqidno:87和88具有至少75％、至少具有80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的vh和/或vl序列。vh可以位于vl的n末端，或者vl可以位于vh的n末端。在进一步的实施方案中，抗体试剂是抗lap抗体试剂，并且包含序列seqidno:9或15，或包含与序列seqidno:9或15具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的序列。在进一步的例子中，抗体试剂可以包括达克珠单抗或其抗原结合片段。抗体试剂也可以靶向本文所述或本领域已知的任何其他抗原。除了任选地递送如本文所述的抗体试剂之外，本发明的cart细胞还可用于递送其他治疗剂，包括但不限于细胞因子和毒素。双特异性t细胞接合器(bite)在一些实施方案中，由如本文所述的cart细胞递送的治疗剂是双特异性t细胞接合器(bite)。此类分子可以通过结合t细胞抗原(例如通过结合cd3)靶向t细胞，以及靶向靶抗原(例如肿瘤抗原)。示例性肿瘤抗原包括egfr、egfrviii、cd19、cd79b、cd37、psma、psca、il-13rα2、epha1、her2、间皮素、muc1或muc16(也参见上文)。bite可以用于增大例如肿瘤微环境中的t细胞应答。bite的两种组分可以任选地通过如本文所述的接头(例如，基于甘氨酸的接头)彼此分开，并且也可以以任一取向连接，例如其中抗cd3组分在抗靶抗原组分的n末端，或反之亦然。bite的抗cd3组分或抗靶抗原组分可以包括本文所述的任何抗体试剂。cart细胞分泌的bite可以例如刺激cart细胞本身，或者通过重定向非特异性旁观者t细胞对抗肿瘤而以旁分泌方式起作用，从而增强cart细胞免疫疗法的抗肿瘤作用。cart细胞介导的bite分泌可以通过将bite分泌定向至肿瘤微环境而允许降低全身性组织中不期望bite活性的风险。下文提供了示例性bite构建体；然而，除本文所述的那些之外的bite也可用于本发明。可用于本文所述的本发明的示例性bite包括例如抗egfrbite，其包括抗egfrscfv和抗cd3scfv(在本文中也称为bite-egfr)。抗egfrscfv可以以vh-vl取向或vl-vh取向排列。在特定实施方案中，抗egfrscfv对应于氨基酸序列seqidno:33、42或55，或包含氨基酸序列seqidno:33、42或55，或包含与氨基酸序列seqidno:33、42或55具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列。另一个示例性bite是抗cd19bite，其包括抗cd19scfv和抗cd3scfv(在本文中也称为bite-cd19)。抗cd19scfv可以以vh-vl取向或vl-vh取向排列。在某些实施方案中，抗cd19scfv对应于氨基酸序列seqidno:51或63，或包含氨基酸序列seqidno:51或63，或包含与氨基酸序列seqidno:51或63具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的任何bite的抗cd3scfv可以以vh-vl取向或vl-vh取向排列，并且可以任选地对应于氨基酸序列seqidno:34、43、52、56或64，或包含氨基酸序列seqidno:34、43、52、56或64，或包含与氨基酸序列seqidno:34、43、52、56或64具有至少75％、至少80％、至少具有85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列。如本文所述的抗egfrbite可以对应于氨基酸序列seqidno:98，或包含氨基酸序列seqidno:98，或包含与氨基酸序列seqidno:98具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列。如本文所述的抗cd19bite可以对应于氨基酸序列seqidno:99，或包含氨基酸序列seqidno:99，或包含与氨基酸序列seqidno:99具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列。任选地，bite可以包括本文所述的信号肽，如igκ信号肽，例如如下igκ信号肽：对应于氨基酸序列seqidno:32、41、50、54或62，或包含氨基酸序列seqidno:32、41、50、54或62，或包含与seqidno:32、41、50、54或62具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，cart细胞包含包括car和治疗剂的多蛋白和/或编码所述多蛋白的核酸。在某些实施方案中，包括car和治疗剂的多蛋白序列对应于选自seqidno:19、26、35、44、53和61的序列，包含选自seqidno:19、26、35、44、53和61的序列，或包含与选自seqidno:19、26、35、44、53和61的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的序列。对于本领域技术人员将清楚的是，可以选择如本文所述的car和相关构建体的其他组分(或其变体)，如igκ信号序列(例如，seqidno:32、41、50、54、62或其变体)、cd8信号序列(例如，seqidno:2、8、14、20、70、76或其变体)和相关序列，用于制备本发明的构建体。编码car的核酸还提供了用于生成cart细胞的编码以下项的核酸构建体和载体：本文所述的(i)car多肽(例如，具有seqidno:1、7、13、69、75或100)或(ii)包括car多肽和治疗剂的多蛋白(例如具有seqidno:19、26、35、44、53或61)。在各种例子中，本发明提供了构建体，所述构建体各自包含待在本发明的cart细胞中表达的多种蛋白质的单独的编码序列。这些单独的编码序列可以通过如本文所述的可裂解接头序列彼此分开。例如，可以将编码病毒2a蛋白(例如，t2a和p2a)的序列置于单独的基因之间，并且在转录时可以指导所生成的多蛋白的裂解。如上所述，本发明的构建体和载体可以包含多种不同序列组合中的任何一种。例如，本发明的构建体或载体可以包含编码一种如本文所述的car的序列，所述car任选地与如本文所述的治疗剂(例如，抗体试剂(例如，单链抗体、单结构域抗体(例如，骆驼科动物)或双特异性抗体(例如，bite))或细胞因子)组合。可以使用检测编码蛋白质的核酸的mrna、dna或基因产物的标准测定来评估如本文所述的cart细胞中蛋白质的有效表达。例如，可以使用rt-pcr、facs、rna印迹、蛋白质印迹、elisa或免疫组织化学。本文所述的蛋白质可以是组成型表达或诱导型表达的。在一些例子中，蛋白质由重组核酸序列编码。例如，本发明提供了载体，其包含编码car的第一多核苷酸序列，其中car包含细胞外结构域，所述细胞外结构域包含结合例如肿瘤抗原或treg相关抗原的抗原结合序列；以及任选地第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码治疗剂(例如，抗体试剂(例如，单链抗体、单结构域抗体(例如骆驼科动物)或双特异性抗体(例如bite))或细胞因子)。在一些实施方案中，第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列各自与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，第一多核苷酸序列与第一启动子可操作地连接，并且第二多核苷酸序列与第二启动子可操作地连接。启动子可以是组成型表达的启动子(例如，ef1α启动子)或诱导型表达的启动子(例如，nfat启动子)。在一些实施方案中，car和治疗剂的表达由相同的启动子，例如组成型表达的启动子(例如，ef1α启动子)驱动。在其他实施方案中，car和治疗剂的表达由不同的启动子驱动。例如，car的表达可以由组成型表达的启动子(例如，ef1α启动子)驱动，而治疗剂的表达可以由诱导性表达的启动子(例如，nfat启动子)驱动。编码car的多核苷酸序列可以位于编码治疗剂的多核苷酸序列的上游，或者编码治疗剂的多核苷酸序列可以位于编码car的多核苷酸序列的上游。此外，本发明的多核苷酸可以包括自杀基因的表达。这样做可以促进药物介导的对所给予细胞的外部控制。例如，通过使用自杀基因，在例如不良事件的情况下，可以从患者耗尽修饰的细胞。在一个例子中，将fk506结合结构域融合至半胱天冬酶9促凋亡分子。使以此方式工程化的t细胞对免疫抑制药他克莫司(tacrolimus)敏感。自杀基因的其他例子是胸苷激酶(tk)、cd20、胸苷酸激酶、截短的前列腺特异性膜抗原(psma)、截短的低亲和力神经生长因子受体(lngfr)、截短的cd19和修饰的fas，它们可以通过给予特定分子(例如，针对tk+细胞的更昔洛韦)或抗体或抗体-药物缀合物而被触发条件性消融。包含编码在本发明的cart细胞中表达的蛋白质的序列的构建体可以包含在载体内。在各种例子中，载体是逆转录病毒载体。逆转录病毒(如慢病毒)为递送编码目的基因或嵌合基因的核酸序列提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的核酸序列插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并递送至细胞，例如在体外或离体进行。逆转录病毒系统是本领域熟知的，并且描述于以下文献中：例如，美国专利号5,219,740；kurth和bannert(2010)“retroviruses:molecularbiology,genomicsandpathogenesis”calsteracademicpress(isbn:978-1-90455-55-4)；以及hu和pathakpharmacologicalreviews200052:493-512；将所述文献通过引用以其全文并入本文。可从origene；马里兰州罗克维尔市购买用于有效dna递送的慢病毒系统。在各种实施方案中，使用本领域已知的载体和方法，通过包含编码蛋白质的核酸的表达载体的转染或电穿孔在t细胞中表达蛋白质。在一些实施方案中，载体是病毒载体或非病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体)、腺病毒载体或腺相关病毒载体。本发明还提供了包含载体的组合物，所述载体包含编码car的第一多核苷酸序列，其中car包含细胞外结构域，所述细胞外结构域包含特异性结合肿瘤抗原或treg相关抗原的序列；以及任选地编码治疗剂的第二多核苷酸序列。在某些实施方案中，当治疗剂是抗体试剂(例如，单链抗体、单结构域抗体(例如，骆驼科动物)或双特异性抗体(例如，bite))时，抗体试剂特异性结合肿瘤抗原或treg相关抗原。细胞和疗法本文所述技术的一个方面涉及哺乳动物细胞，其包含本文所述的任何car多肽(任选地连同另一种治疗剂(例如，抗体试剂(例如，scfv、骆驼科动物抗体或bite)或细胞因子))；或编码本文所述的任何car多肽(任选地连同另一种治疗剂(例如，抗体试剂(例如，scfv、骆驼科动物抗体)或细胞因子))的核酸。在一个实施方案中，哺乳动物细胞包含抗体、抗体试剂、其抗原结合部分、本文所述的任何car、或细胞因子，或编码这种抗体、抗体试剂、其抗原结合部分、本文所述的任何car、或细胞因子的核酸。哺乳动物细胞或组织可以是人、灵长类动物、仓鼠、兔子、啮齿动物、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫来源的，但是可以使用任何其他哺乳动物细胞。在任何方面的优选实施方案中，哺乳动物细胞是人的。在任何方面的一些实施方案中，哺乳动物细胞是免疫细胞。如本文所用，“免疫细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞是造血来源的，并且包括淋巴细胞，如b细胞和t细胞；自然杀伤细胞；髓样细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是t细胞；nk细胞；nkt细胞；淋巴细胞，如b细胞和t细胞；和髓样细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是t细胞。在其他实施方案中，免疫细胞获自患有或被诊断为患有癌症、浆细胞障碍或自身免疫性疾病的个体。分化簇(cd)分子是白细胞上存在的细胞表面标记。随着白细胞的分化和成熟，其cd谱改变。在白细胞变成癌细胞(即淋巴瘤)的情况下，其cd谱对诊断疾病很重要。某些类型的癌症的治疗和预后依赖于确定癌细胞的cd谱。“cdx+”(其中“x”是cd标记)指示癌细胞中存在cd标记，而“cdx-”指示不存在所述标记。本领域技术人员将能够使用标准技术，例如使用免疫荧光检测与cd分子结合的可商购获得的抗体，来评估存在于癌细胞上的cd分子。在一些实施方案中，包含car(如本文所述的cart.bite)的免疫细胞(例如，t细胞)可以用于治疗癌症，例如淋巴瘤、骨髓瘤或实体瘤，例如胶质母细胞瘤、前列腺癌、肺癌或胰腺癌。在一些实施方案中，本文所述的cart.bite(例如，cart-egfrviii.bite-egfr)可以用于治疗具有降低的egfrviii表达的胶质母细胞瘤。在进一步的实施方案中，包含car(如本文所述的cart.bite)的免疫细胞(例如，t细胞)可以用于预防或减少由于例如肿瘤微环境中的treg引起的免疫抑制。此外，此类cart.bite可用于预防或减少肿瘤微环境中的t细胞消耗。包含car(如本文所述的cart.bite)的免疫细胞(例如，t细胞)也可以用于治疗具有异质抗原表达的癌症。例如，cart.bite构建体的car组分可以包括结合由癌症表达的一种抗原的细胞外靶标结合结构域，同时cart.bite构建体的bite成分除了t细胞抗原(例如，cd3)之外可以结合由癌症表达的第二抗原。如本文所用的“癌症”可以是指细胞的过度增殖，所述细胞的独特性状(正常细胞控制的丧失)导致生长失调、缺乏分化、局部组织浸润和转移。示例性癌症包括但不限于胶质母细胞瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤或实体瘤，例如肺癌和胰腺癌。白血病的非限制性例子包括急性髓性白血病(aml)、慢性髓性白血病(cml)、急性淋巴细胞性白血病(all)和慢性淋巴细胞性白血病(cll)。在一个实施方案中，癌症是all或cll。淋巴瘤的非限制性例子包括弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤(sll)、套细胞淋巴瘤(mcl)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、毛细胞白血病(hcl)和t细胞淋巴瘤(例如，外周t细胞淋巴瘤(ptcl)，包括皮肤t细胞淋巴瘤(ctcl)和间变性大细胞淋巴瘤(alcl))。在一个实施方案中，癌症是dlbcl或滤泡性淋巴瘤。实体瘤的非限制性例子包括肾上腺皮质瘤、腺泡状软组织肉瘤、癌、软骨肉瘤、结直肠癌、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、内胚窦瘤、上皮样血管内皮瘤、尤文肉瘤、生殖细胞肿瘤(实体瘤)、骨和软组织巨细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑素瘤、肾瘤、神经母细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤(nrsts)、骨肉瘤、椎旁肉瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤和肾母细胞瘤。实体瘤可以发现于骨、肌肉或器官中，并且可以是肉瘤或癌。设想本文所述的技术的任何方面可以用于治疗所有类型的癌症，包括在本申请中未列出的癌症。如本文所用，术语“肿瘤”是指例如恶性类型或良性类型的细胞或组织的异常生长。如本文所用，“自身免疫性疾病或障碍”的特征在于患者的免疫系统无法区分外来细胞与健康细胞。这会导致患者的免疫系统靶向其健康细胞，造成程序性细胞死亡。自身免疫性疾病或障碍的非限制性例子包括炎性关节炎、1型糖尿病、多发性硬化症、银屑病、炎性肠病、sle和血管炎、过敏性炎症(如过敏性哮喘、特应性皮炎和接触性超敏反应)。自身免疫相关疾病或障碍的其他例子包括以下，但不应解释为仅限于以下：类风湿性关节炎、多发性硬化症(ms)、系统性红斑狼疮、格雷夫斯病(graves'disease)(甲状腺功能亢进)、桥本氏甲状腺炎(甲状腺功能低下)、乳糜泻、克罗恩氏病(crohn'sdisease)和溃疡性结肠炎、格林-巴利综合征(guillain-barresyndrome)、原发性胆道硬化/肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、雷诺氏现象、硬皮病、舍格伦氏综合征(sjogren'ssyndrome)、古德帕斯彻氏综合征(goodpasture'ssyndrome)、韦格纳氏肉芽肿病(wegener'sgranulomatosis)、风湿性多肌痛、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、慢性疲劳综合征(cfs)、银屑病、自身免疫性艾迪生氏病(addison'sdisease)、强直性脊柱炎、急性播散性脑脊髓炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、斜视性眼阵挛-肌阵挛综合征、视神经炎、奥德氏甲状腺炎、天疱疮、恶性贫血、狗多发性关节炎、莱特尔氏综合征(reiter'ssyndrome)、高安氏动脉炎(takayasu'sarteritis)、温热自身免疫性溶血性贫血、韦格纳氏肉芽肿病和纤维肌痛(fm)。在一个实施方案中，获得患者的哺乳动物细胞，所述患者患有免疫系统障碍，所述免疫系统障碍导致免疫系统的异常的低活性，或患有免疫缺陷障碍，所述免疫缺陷障碍妨碍患者抵抗外来因子(即，病毒或细菌细胞)的能力。浆细胞是由b淋巴细胞产生的白细胞，其功能是生成和释放抵抗感染所需的抗体。如本文所用，“浆细胞障碍或疾病”的特征在于浆细胞的异常增殖。异常浆细胞能够“排挤”健康的浆细胞，这导致抵抗外来对象(如病毒或细菌细胞)的能力降低。浆细胞障碍的非限制性例子包括淀粉样变性、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(waldenstrom'smacroglobulinemia)、骨硬化性骨髓瘤(poems综合征)、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(mgus)和浆细胞骨髓瘤。可以将哺乳动物细胞(例如，t细胞)工程化以包含本文所述的任何car多肽(包括如本文所述的与抗体试剂或细胞因子可裂解连接的car多肽)；或编码本文所述的任何car多肽的核酸(以及任选地基因编码的抗体试剂或细胞因子)。可以使用本领域已知的标准技术从受试者获得t细胞。例如，可以从取自供体或患者的外周血中分离出t细胞。可以从哺乳动物中分离出t细胞。优选地，t细胞是从人分离的。在任何方面的一些实施方案中，本文所述的任何car多肽(任选地连同如本文所述的抗体试剂或细胞因子)从慢病毒载体表达。使用感染标准技术将慢病毒载体用于在细胞中表达car多肽(以及任选地还编码抗体试剂或细胞因子)。逆转录病毒(如慢病毒)为递送编码目的基因或嵌合基因的核酸序列提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的核酸序列插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并递送至细胞，例如在体外或离体进行。逆转录病毒系统是本领域熟知的，并且描述于以下文献中：例如，美国专利号5,219,740；kurth和bannert(2010)“retroviruses:molecularbiology,genomicsandpathogenesis”calsteracademicpress(isbn:978-1-90455-55-4)；以及hu等人,pharmacologicalreviews52:493-512,2000；将所述文献通过引用以其全文并入本文。可从origene；马里兰州罗克维尔市购买用于有效dna递送的慢病毒系统。在一些实施方案中，经由包含编码car的核酸的表达载体的转染或电穿孔，使本文所述的任何car的car多肽(和任选的抗体试剂或细胞因子)在哺乳动物细胞中表达。转染或电穿孔方法是本领域已知的。本文所述的任何多肽的car多肽(和任选的抗体试剂或细胞因子)的有效表达可以使用检测编码car(和任选的抗体试剂或细胞因子)的核酸的mrna、dna或基因产物的标准测定来评估，所述标准测定如rt-pcr、facs、rna印迹、蛋白质印迹、elisa或免疫组织化学。在一些实施方案中，本文所述的car多肽(和任选的抗体试剂或细胞因子)是组成型表达的。在其他实施方案中，car多肽是组成型表达的并且任选的抗体试剂或细胞因子是诱导型表达的。在一些实施方案中，本文所述的car多肽(和任选的抗体试剂或细胞因子)由重组核酸序列编码。本文所述的技术的一个方面涉及在有需要的受试者中治疗癌症、浆细胞障碍或自身免疫性疾病的方法，所述方法包括：工程化t细胞以在t细胞表面上包含本文所述的任何car多肽(和任选的抗体试剂或细胞因子)；并且将工程化t细胞给予至受试者。在癌症的情况下，所述方法可以用于治疗所诊断的癌症，预防癌症的复发，或用于辅助设置或新辅助设置中。本文所述的技术的一个方面涉及在有需要的受试者中治疗癌症、浆细胞障碍或自身免疫性疾病的方法，所述方法包括：给予包含本文所述的任何car多肽(和任选的抗体试剂或细胞因子)的任何哺乳动物细胞的细胞。在任何方面的一些实施方案中，在向受试者给予之前，刺激和/或激活工程化car-t细胞。给予在一些实施方案中，本文所述的方法涉及用包含本文所述的任何car多肽(和任选的抗体试剂或细胞因子)或编码本文所述的任何car多肽(和任选的抗体试剂或细胞因子)的核酸的哺乳动物细胞治疗患有或被诊断为患有癌症、浆细胞疾病或障碍、或自身免疫性疾病或障碍的受试者。本文所述的cart细胞包括哺乳动物细胞，其包含本文所述的任何car多肽(和任选的抗体试剂或细胞因子)或编码本文所述的任何car多肽(和任选的抗体试剂或细胞因子)的核酸。如本文所用，“病症”是指癌症、浆细胞疾病或障碍或自身免疫性疾病或障碍。患有病症的受试者可以由医师使用诊断所述病症的现行方法来鉴定。作为病症的特征并帮助诊断的病症症状和/或并发症是本领域熟知的，并且包括但不限于疲劳、持续性感染和持续性出血。可以帮助诊断例如病症的测试包括但不限于血液筛查和骨髓测试，并且对于给定病症是本领域已知的。病症的家族病史或对病症的风险因素的暴露也可以帮助确定受试者是否可能患有所述病症或帮助进行所述病症的诊断。可以将本文所述的组合物给予至患有或被诊断为患有病症的受试者。在一些实施方案中，本文所述的方法包括向受试者给予有效量的本文所述的激活cart细胞，以减轻病症的症状。如本文所用，“减轻病症的症状”是改善任何病症或与病症相关的症状。与等同的未治疗对照相比，如通过任何标准技术所测量，这种减少为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％或更多。用于将本文所述的组合物给予至于受试者的多种手段是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中，本文所述的组合物是全身或局部给予的。在优选的实施方案中，本文所述的组合物是静脉内给予的。在另一个实施方案中，本文所述的组合物在肿瘤位点处给予。如本文所用的术语“有效量”是指减轻疾病或障碍的至少一种或多种症状所需的激活cart细胞的量，并且涉及足以提供所需效果的细胞制剂或组合物的量。因此，术语“治疗有效量”是指，当给予至典型受试者时足以提供特定的抗病症效果的激活cart细胞的量。在各种背景下，如本文所用的有效量还将包括足以延迟疾病症状的发生、改变症状疾病的过程(例如但不限于减缓病症的进展)、或逆转病症的症状的量。因此，规定精确的“有效量”通常是不可行的。然而，对于任何给定的病例，本领域普通技术人员仅使用常规实验就可以确定适当的“有效量”。可以在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序评价有效量、毒性和治疗功效。剂量可以根据所采用的剂型和所利用的给予途径而变化。在毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且可以表示为比率ld50/ed50。展现出大治疗指数的组合物和方法是优选的。最初可以从细胞培养测定估计治疗有效剂量。另外，可以在动物模型中配制剂量以实现循环血浆浓度范围，所述范围包括如在细胞培养中或者在适当的动物模型中确定的ic50(即，实现对症状的半最大抑制的激活cart细胞的浓度)。血浆水平可以例如通过高效液相色谱来测量。尤其可以通过合适的生物测定，例如用于骨髓测试的测定，来监测任何特定剂量的作用。剂量可以由医师确定，并且根据需要加以调整以适应观察到的治疗效果。在本技术的一个方面，本文所述的技术涉及药物组合物，其包含如本文所述的激活cart细胞、和任选的药学上可接受的载体。药物组合物中的活性成分至少包含如本文所述的激活cart细胞。在一些实施方案中，药物组合物的活性成分基本上由如本文所述的激活cart细胞组成。在一些实施方案中，药物组合物的活性成分由如本文所述的激活cart细胞组成。用于基于细胞的治疗性配制品的药学上可接受的载体包括盐水和水性缓冲溶液、林格氏溶液和血清组分(如血清白蛋白、hdl和ldl)。术语如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等在本文中可互换使用。在一些实施方案中，包含如本文所述的激活cart细胞的药物组合物可以是肠胃外剂型。由于肠胃外剂型的给予通常绕过患者对污染物的天然防御，因此除了cart细胞本身之外的组分优选地是无菌的或能够在给予患者之前进行灭菌。肠胃外剂型的例子包括但不限于即用型注射溶液、随时可溶解或悬浮在药学上可接受的注射用媒介物中的无水产品、即用型注射悬浮液、和乳液。这些中的任何一种都可以在给予之前添加到激活cart细胞制剂中。可以用于提供如本文所公开的激活cart细胞的肠胃外剂型的合适媒介物是本领域技术人员熟知的。例子包括但不限于：盐水溶液；葡萄糖溶液；水性媒介物，包括但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液以及乳酸林格氏注射液；可与水混溶的媒介物，如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及非水性媒介物，如但不限于玉米油、棉花籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。剂量“单位剂型”(在所述术语用于本文中时)是指适合一次给予的剂量。举例来说，单位剂型可以是布置在递送装置例如注射器或静脉内滴注袋中的一定量的治疗剂。在一个实施方案中，单位剂型以单次给予的形式给予。在另一个实施方案中，可以同时给予多于一个单位剂型。在一些实施方案中，本文所述的激活cart细胞作为单一疗法给予，即，不将用于病症的另一种治疗并行给予至受试者。包含本文所述的t细胞的药物组合物通常可以以104至109个细胞/kg体重，在一些情况下105至106个细胞/kg体重(包括在那些范围内的所有整数值)的剂量给予。如果需要，t细胞组合物也可以按这些剂量多次给予。可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来给予细胞(参见例如rosenberg等人,neweng.j.med.319:1676,1988)。在某些方面，可能期望将激活cart细胞给予至受试者，然后随后重新抽取血液(或进行单采术)，如本文所述激活来自所述血液的t细胞，并向患者重新输注这些激活和扩增的t细胞。此过程可以每几周进行多次。在某些方面，可以从10cc至400cc的血液抽取物激活t细胞。在某些方面，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液抽取物激活t细胞。给予方式可以包括例如静脉内(i.v.)注射或输注。本文所述的组合物可以经动脉、肿瘤内、结节内或髓内给予至患者。在一些实施方案中，可以将t细胞的组合物直接注射至肿瘤、淋巴结或感染位点中。在一个实施方案中，将本文所述的组合物给予至体腔或体液(例如，腹水、胸膜液、腹膜液或脑脊髓液)中。在特定的示例性方面，受试者可以经历白细胞单采术，其中白细胞被离体收集、富集或耗尽以选择和/或分离目的细胞，例如t细胞。这些t细胞分离物可以通过与人工apc(例如，表达抗cd28和抗cd3cdr的aapc)接触而扩增，并且经过处理使得可以引入本技术的一种或多种car构建体，从而产生cart细胞。有需要的受试者可以随后经历高剂量化学疗法的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在移植之后或与之并行，受试者可以接受扩增的cart细胞的输注。在一个实施方案中，扩增的细胞在手术之前或之后给予。在一些实施方案中，在给予如本文所述的一种或多种cart细胞之前，对受试者进行淋巴细胞清除。在此类实施方案中，淋巴细胞清除可以包括给予美法仑、环磷酰胺(cytoxan)、环磷酰胺(cyclophosphamide)和氟达拉滨中的一种或多种。待给予至患者的上述治疗的剂量将随所治疗病症的确切性质和治疗接受者而变化。可以根据本领域公认的实践针对人类给予进行剂量的缩放。在一些实施方案中，需要单一治疗方案。在其他实施方案中，可以进行一种或多种后续剂量或治疗方案的给予。例如，在每两周一次的治疗持续三个月之后，可以每个月一次重复治疗，持续六个月或一年或更长。在一些实施方案中，在初始治疗后不给予另外的治疗。如本文所述的组合物的剂量可以由医师确定，并且根据需要加以调整以适应观察到的治疗效果。关于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生通常监测受试者以确定治疗何时提供治疗益处，并确定是否药给予进一步的细胞、停止治疗、恢复治疗或对治疗方案做出其他改变。剂量不应大到引起不良副作用，如细胞因子释放综合征。通常，剂量将随患者的年龄、病症和性别而变化，并且可以由本领域技术人员确定。如果发生任何并发症，剂量还可以由个别医师调整。组合疗法如本领域技术人员可以确定为适当的，本文所述的激活cart细胞可以任选地彼此以及与其他已知的药剂和疗法组合使用。在一个例子中，靶向不同treg标记(例如，garp、lap等)的两种或更多种cart细胞可以组合给予。在另一个例子中，靶向不同癌症抗原的两种或更多种cart细胞是组合给予。在进一步的例子中，靶向treg标记(例如，garp、lap等)的一种或多种cart细胞和靶向一种或多种肿瘤抗原的一种或多种cart细胞是组合给予。如本文所用的“组合”给予意指，在受试者受障碍折磨的过程中向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，例如在受试者已经被诊断为患有所述障碍之后且在所述障碍已经被治愈或消除或者由于其他原因终止治疗之前，递送两种或更多种治疗。在一些实施方案中，一种治疗的递送在第二种治疗的递送开始时仍在进行，使得在给予方面存在重叠。这在本文中有时被称为“同时”或“并行递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在每一种情况的一些实施方案中，治疗由于组合给予而更有效。例如，与在不存在第一治疗的情况下给予第二治疗时会看到的相比，第二治疗更有效，例如，使用更少的第二治疗观察到等同作用，或者第二治疗更大程度地减少症状，或者关于第一治疗观察到类似的情况。在一些实施方案中，与在不存在另一种治疗的条件下递送一种治疗的情况下将观察到的相比，递送使得症状或与障碍相关的其他参数减少更多。这两种治疗的作用可以是部分加和性的、完全加和性的或大于加和性的。递送可以使得所递送的第一治疗的作用在递送第二治疗时仍然可以检测到。本文所述的激活cart细胞和至少一种另外的治疗剂可以在相同或分开的组合物中同时给予，或依序给予。对于依序给予，可以首先给予本文所述的car表达细胞，然后可以给予另外的药剂，或者可以反转给予顺序。cart疗法和/或其他治疗剂、程序或方式可以在活跃障碍的阶段期间或在缓解期或较不活跃的疾病的阶段期间给予。cart疗法可以在另一种治疗之前给予、与所述治疗并行给予、在治疗后给予或在障碍缓解期间给予。当组合给予时，激活cart细胞和另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部可以以与每种药剂单独使用(例如，作为单一疗法)的量或剂量相比更高、更低或相同的量或剂量给予。在某些实施方案中，所给予的激活cart细胞、另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的量或剂量比单独使用的每种药剂的量或剂量低(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其他实施例中，得到所需效果(例如，癌症治疗)的激活cart细胞、另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的量或剂量比实现相同治疗效果单独需要的每种药剂的量或剂量低(例如，低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在进一步的实施方案中，在治疗方案中本文所述的激活cart细胞可以与手术、化学疗法、辐射、mtor途径抑制剂、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和fk506)、抗体、或其他免疫清除剂(如campath)、抗cd3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、fr901228、细胞因子或肽疫苗(如izumoto等人,j.neurosurg.108:963-971,2008中描述的那些)组合使用。在一个实施方案中，本文所述的激活cart细胞可以与检查点抑制剂组合使用。示例性的检查点抑制剂包括抗pd-1抑制剂(纳武单抗(nivolumab)、mk-3475、派姆单抗(pembrolizumab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)、amp-224、amp-514)、抗ctla4抑制剂(伊匹单抗(ipilimumab)和曲美目单抗(tremelimumab))、抗pdl1抑制剂(阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelomab)、msb0010718、medi4736和mpdl3280a)和抗tim3抑制剂。在一个实施方案中，本文所述的激活cart细胞可以与化学治疗剂组合使用。示例性化学治疗剂包括蒽环类抗生素(例如，多柔比星(例如脂质体多柔比星))；长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)；烷化剂(例如，环磷酰胺、达卡巴嗪(decarbazine)、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)；免疫细胞抗体(例如，阿仑单抗(alemtuzamab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、利妥昔单抗、托西莫单抗(tositumomab))；抗代谢药(包括，例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨))；mtor抑制剂；tnfr糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白(gitr)激动剂；蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素a、胶霉毒素或硼替佐米)；或免疫调节剂，如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如，来那度胺)。考虑用于在组合疗法中使用的通用化学治疗剂包括阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博来霉素白消安白消安注射液卡培他滨n4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺(或)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷阿糖胞苷脂质体注射剂达卡巴嗪更生霉素(放线菌素d、cosmegan)、盐酸柔红霉素柠檬酸柔红霉素脂质体注射液地塞米松、多西他赛盐酸多柔比星依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他胺替扎他滨(tezacitibine)、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲伊达比星异环磷酰胺伊立替康l-天冬酰胺酶亚叶酸钙、美法仑6-巯基嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌米罗他(mylotarg)、紫杉醇phoenix(钇90/mx-dtpa)、喷司他丁、聚苯丙生20和卡莫司汀植入物柠檬酸他莫昔芬替尼泊苷6-硫代鸟嘌呤、噻替哌、替拉帕明注射用盐酸拓扑替康长春碱长春新碱和长春瑞滨示例性烷基化剂包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)：尿嘧啶氮芥(aminouraciluracilnitrogen)、双氯乙基甲胺(chlormethine)环磷酰胺(revimmunetm)、异环磷酰胺美法仑苯丁酸氮芥哌泊溴烷三乙撑密胺三乙撑硫代磷酰胺、替莫唑胺噻替哌白消安卡莫司汀洛莫司汀链脲佐菌素和达卡巴嗪另外的示例性烷基化剂包括但不限于奥沙利铂替莫唑胺(和)；更生霉素(也称为放线菌素-d，)；美法仑(也称为l-pam、l-沙可来新和苯丙氨酸氮芥，)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(hmm)、)；卡莫司汀苯达莫司汀白消安(和)；卡铂洛莫司汀(也称为ccnu，)；顺铂(也称为cddp、和)；苯丁酸氮芥环磷酰胺(和)；达卡巴嗪(也称为dtic、dic和咪唑甲酰胺、)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(hmm)、)；异环磷酰胺泼尼莫司汀(prednumustine)；丙卡巴肼双氯乙基甲胺(也称为氮芥、盐酸氮芥和盐酸甲氯乙胺、)；链脲佐菌素噻替哌(也称为硫代磷酰胺、tespa和tspa、)；环磷酰胺和盐酸苯达莫司汀示例性mtor抑制剂包括，例如替西罗莫司(temsirolimus)；地磷莫司(ridaforolimus)(正式称为德菲罗莫司(deferolimus)，(1r,2r,45)-4-[(2r)-2[(1r,95,125,15r,16e,18r,19r,21r,235,24e,26e,28z,305,325,35r)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04'9]三十六-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基亚膦酸酯，也称为ap23573和mk8669，并且描述于pct公开号wo03/064383中)；依维莫司(或radool)；雷帕霉素(ay22989，)；simapimod(cas164301-51-3)；emsirolimus、(5-{2,4-双[(35,)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-(i]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(azd8055)；2-氨基-8-[iraw5,-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-jj嘧啶-7(8h)-酮(pf04691502，cas1013101-36-4)；和n2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4h-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-l-精氨酰基甘氨酰基-l-a-天冬氨酰基l-丝氨酸-，内盐(sf1126，cas936487-67-1)和xl765。示例性免疫调节剂包括例如阿福图珠单抗(afutuzumab)(可从获得)；培非司亭(pegfilgrastim)来那度胺(cc-5013，)；沙利度胺actimid(cc4047)；和irx-2(人细胞因子的混合物，包括白介素1、白介素2和干扰素γ，cas951209-71-5，可从irxtherapeutics获得)。示例性蒽环类抗生素包括例如多柔比星(adri和)；博来霉素柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素和盐酸红比霉素，)；柔红霉素脂质体(柠檬酸柔红霉素脂质体，)；米托蒽醌(dhad，)；表柔比星(ellencetm)；伊达比星(idamycin)；丝裂霉素c格尔德霉素(geldanamycin)；除莠霉素(herbimycin)；近灰霉素(ravidomycin)和去乙酰基近灰霉素。示例性长春花生物碱包括例如酒石酸长春瑞滨长春新碱和长春地辛)、长春碱(又称为硫酸长春碱、长春花碱和vlb、和)；和长春瑞滨示例性蛋白酶体抑制剂包括硼替佐米卡非佐米(px-171-007，(5)-4-甲基-n-((5)-1-(((5)-4-甲基-1-((r)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((5,)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)-戊酰胺)；玛丽佐米(npt0052)(npt0052)；柠檬酸艾沙佐米(ixazomib)(mln-9708)；地兰佐米(delanzomib)(cep-18770)；和o-甲基-n-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-l-丝氨酰-o-甲基-n-[(11s')-2-[(2r)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-l-丝氨酰胺(onx-0912)。本领域技术人员可以容易地鉴定使用的化学治疗剂(例如，参见physicians'cancerchemotherapydrugmanual2014,edwardchu,vincentt.devitajr.,jones&bartlettlearning；principlesofcancertherapy,harrison'sprinciplesofinternalmedicine中的第85章,第18版；therapeutictargetingofcancercells:eraofmolecularlytargetedagentsandcancerpharmacology,abeloff'sclinicaloncology中的第28-29页,2013elsevier；和fischerd.s.(编):thecancerchemotherapyhandbook,第4版st.louis,mosby-yearbook,2003)。在一个实施方案中，将本文所述的激活cart细胞与以下组合给予至受试者：降低靶向gitr和/或调节gitr功能的分子的水平和/或活性的分子、减少treg细胞群的分子、mtor抑制剂、gitr激动剂、激酶抑制剂、非受体酪氨酸激酶抑制剂、cdk4抑制剂和/或btk抑制剂。功效激活cart细胞在例如本文所述的病症的治疗中，或本文所述诱导应答(例如，癌细胞的减少)的功效可以由熟练的临床医生确定。然而，如果在根据本文所述的方法治疗后，本文所述病症的一种或多种体征或症状以有益方式改变，其他临床上可接受的症状得到改善或甚至减轻，或者所需反应被诱导，例如程度为至少10％，则治疗被视为“有效治疗”(在所述术语用于本文中时)。例如，可以通过测量根据本文所述方法治疗的病症的标记、指标、症状和/或发病率或任何其他适当的可测量参数来评估功效。根据本文所述方法的治疗可以降低病症的标记或症状的水平，例如降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。还可以通过个体恶化失败(即，疾病的进展停止)(如通过住院或对医学干预的需要来评估)来测量功效。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文所述的。治疗包括对个体或动物(一些非限制性实例包括人或动物)的疾病的任何治疗，并且包括：(1)抑制疾病，例如，预防症状(例如，疼痛或炎症)恶化；或(2)减轻疾病的严重程度，例如，引起症状消退。用于治疗疾病的有效量意指当给予至有需要的受试者时足以导致对该疾病的有效治疗(如该术语在本文中所定义)的量。可以通过评估病症或所需反应的物理指标来确定药剂的功效。通过测量此类参数中的任何一个或任何参数组合来监测给予和/或治疗的功效是完全在本领域技术人员的能力范围之内的。可以在本文所述病症的动物模型中评估给定方法的功效。当使用实验动物模型时，当观察到标记的统计学上显著的改变时证明治疗的功效。整个本申请中引用的所有专利和其他出版物；包括参考文献、已授权的专利、已公布的专利申请和共同未决的专利申请均出于描述和公开的目的通过引用明确地并入本文，例如，在此类出版物中描述的方法可以与本文所述的技术结合使用。提供这些出版物仅仅是因为它们在本申请的提交日期之前披露。就此而言，任何内容都不应被解释为承认诸位发明人由于先前技术或任何其他原因而无权先于此披露。关于日期的所有陈述或关于这些文件内容的表述均基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。本公开文本的实施方案的描述并非旨在穷举或将本公开文本限制为所公开的精确形式。虽然本文出于说明性目的描述了本公开文本的具体实施方案和实施例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开文本的范围内可以进行各种等同性修改。例如，虽然方法步骤或功能以给定的顺序呈现，但是替代实施方案可以以不同的顺序执行功能，或者功能可以基本上并行执行。本文提供的本公开文本的教导可以适当地应用于其他程序或方法。本文所述的各种实施方案可以组合以提供另外的实施方案。如有必要，可以修改本公开文本的各方面，以采用上述参考文献和申请的组合物、功能和概念来提供本公开文本的又进一步的实施方案。此外，由于生物功能等效性考虑，可以在不影响生物或化学作用的种类或量的情况下对蛋白质结构进行一些改变。根据具体实施方式，可以对本公开文本作出这些和其他改变。所有此类修改都旨在包括在所附权利要求的范围内。任何前述实施方案的具体要素可以进行组合或取代其他实施方案中的元素。此外，虽然已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开文本的某些实施方案相关联的优点，但是其他实施方案也可以展现出此类优点，并且并非所有实施方案都必须展现出此类的优点方可落入本公开文本的范围内。通过以下实施例进一步说明本文所述的技术，所述实施例决不应被解释为进一步限制。实施例以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，根据以上提供的一般描述可以实施各种其他实施方案。实施例1.cart细胞介导毒性药物分泌以修改肿瘤微环境并增强cart细胞效力car修饰的t细胞可以用于将原本有毒的抗体递送至肿瘤微环境。在该实施例中，t细胞经基因修饰以分泌抗体或细胞因子，目的是修改肿瘤微环境的抑制性免疫细胞环境。具体地，针对异质表达的抗原的cart细胞可以通过使得能够在肿瘤微环境中激活周围的肿瘤浸润淋巴细胞而使其效力增强。具体的非限制性例子包括：(1)基因编码的抗ctla4car-t细胞介导的分泌。当全身性递送时，抗ctla4检查点阻断可以引起毒性。然而，预期抗ctla4的局部分泌在肿瘤微环境中提供检查点阻断并耗尽调节性t细胞。(2)用于耗尽局部肿瘤微环境中的treg的基因编码的抗cd25(例如，达克珠单抗)。尽管环境不友善且存在血脑屏障，但已经显示cart细胞运输至肿瘤。新的t细胞移入物也浸润肿瘤，但假设这些移入物受到检查点和treg激活的抑制。预期抗cd25的局部分泌耗尽treg。然而，当全身性给予时，给予的达克珠单抗在药理上是毒性的。(3)基因编码的抗egfr(例如，西妥昔单抗)。如果抗原异质表达，则针对安全但异质表达的抗原(例如，egfrviii)的cart细胞不能完全消除肿瘤。然而，其他抗原可以在肿瘤微环境中高水平表达(例如，egfr)。egfr仅在脑内的脑肿瘤中表达，但是它在许多其他上皮组织中表达，这使其成为cart细胞的不安全靶标。然而，可以将针对egfrviii的cart细胞进行工程化以分泌抗egfr，使得只有cart细胞运输至的肿瘤微环境中的组织才暴露于高水平的抗egfr。在抗egfr的情况下，鉴于在其他癌症(如头颈癌和结肠癌)中抗体是全身性使用，因此预期所述抗体没有严重毒性。然而，它不能穿透cns，因此在脑肿瘤中无效。呈针对cns的cart细胞形式的基因编码的抗egfr具有使用t细胞作为媒介物，用于将抗egfr局部递送至cns和脑肿瘤(如胶质母细胞瘤)的能力。因此，以两种不同的形式提供了在肿瘤微环境中的基因编码的treg耗尽。此外，对不能进入某些组织的抗体的基因编码递送可以通过扩大抗肿瘤靶标的特异性来增强t细胞疗法的效力。因此，描述了用于癌症的基因修饰的t细胞疗法。实施例2.工程化cart细胞克服了胶质母细胞瘤中的肿瘤异质性和免疫抑制材料和方法用dynabeads人t激活因子cd3/cd28以3:1的珠与细胞比率刺激从去识别的健康供体获得的白细胞单采术产物中的t细胞，并且在完全rpmi1640培养基中培养。刺激和慢病毒转导后10天，将细胞冷冻并储存以用于功能测定。在基于萤光素酶的20小时测定中测试了cart细胞杀伤靶细胞的能力。通过incucyte活细胞分析使treg抑制可视化。对于体内实验，在对数生长期中收集肿瘤细胞，将其洗涤并加载到50微升hamilton注射器中。使用立体定向框架将针定位于距前囟点右侧2mm并且在冠状缝处的颅骨表面下方4mm处。对于治疗，经由尾静脉向小鼠输注cart细胞(每只小鼠1x106个car转导的t细胞)一次。结果egfrviiicart细胞在体外介导抗肿瘤活性。设计并合成了egfrviiicar，将其用于体外初始测试。该car的体外表征证明，egfrviiicar介导针对人神经胶质瘤u87viii细胞系的显著且特异性细胞毒性(图1；egfrviiicar转导的t细胞强效且特异性地介导针对u87viii人神经胶质瘤细胞系的细胞毒性)。在人gbm异种移植物的皮下模型中观察到了该作用，在所述模型中，甚至已建立的巨块型肿瘤也对cart-egfrviii有反应(图2a和图2b；cart-egfrviii在人神经胶质瘤的皮下模型中治疗egfrviii表达肿瘤(u87viii)。在植入后第4天用cart-egfrviii治疗小鼠(顶行)，其中截至第21天成功治疗(底行)。utd(未转导细胞)充当阴性对照)。egfrviiicart细胞介导针对脑中egfrviii表达肿瘤的抗肿瘤活性。在颅内人神经胶质瘤的鼠类模型中，egfrviiicart细胞减缓了肿瘤的生长并导致存活期延长(图3a和图3b；cart-egfrviii在人神经胶质瘤的颅内模型中减缓了egfrviii表达肿瘤(u87viii)的生长。在植入后第2天用cart-egfrviii治疗小鼠)。尽管消除了肿瘤生长，但效果却不如针对皮下肿瘤所观察到的那些效果明显。对脑肿瘤患者而言，转换cart细胞的一个关键障碍是充分表征的抑制性treg的浸润。cart细胞活性被调节性t细胞抑制。在用cart细胞和靶神经胶质瘤细胞系进行的共培养实验中，注意到在体外调节性t细胞的存在消除了cart细胞的抗肿瘤活性。图5a至图5d定性地(图5a至图5c)和定量地(图5d)展示在体外与人神经胶质瘤细胞共孵育18小时后cart细胞抗肿瘤活性的treg抑制。图6a至图6c示出了从leukopak中根据cd4+cd25+cd127-分选并在il-2存在下用cd3/cd28珠扩增7天的treg。在第1天，它们被转导以表达gfp。在第7天脱珠后，将扩增的treg静置4天，之后冷冻。解冻后，过夜静置(未激活)或用抗cd3和抗cd28过夜激活后，针对lap和garp表达对treg进行染色。将来自同一供体的未转导t细胞(cd4+和cd8+)用作表达对照。抗lapcart细胞在体外杀伤调节性t细胞。如图9a和图9b所示，将cart细胞与从同一供体扩增并转导以表达gfp的分离treg共培养。在杀伤测定之前将treg用抗cd3和抗cd28激活过夜或静置过夜。铺板62,500个treg/孔。以上图中标记的与treg的比率添加car。在300u/mlil-2存在下将细胞培养3天。在第3天运行流动，每个孔中有30,000个事件。细胞毒性百分比计算为与具有treg的未转导t细胞培养物相比，gfp+细胞缺失的百分比。基于这些数据，开发了靶向在treg上发现的表面标记的新颖car构建体。这些cart细胞的总体设计描绘在图8a至图8d中。结论最终目标是在人gbm的临床前鼠类模型中设计、测试和改善cart细胞疗法。本文已证明，cart细胞确实可以在体内介导针对甚至巨块型的已建立肿瘤的特异性和强效作用。另外，显示出调节性t细胞可能在这些免疫应答的抑制中起关键作用。靶向treg的新技术可以提供调节局部免疫环境以增强抗肿瘤功效的方式。实施例3.egfrviii靶向性cart细胞具有egfrviii抗原结合部分的cart细胞(例如，cart-egfrviii细胞)代表了将细胞溶解性细胞特异性靶向肿瘤微环境的有前途的细胞疗法，这部分是因为egfrviii在肿瘤组织上特异性表达，而通常不存在于健康组织中。在该实施例中，在两个动物模型中在体外和体内测试了cart-egfrviii细胞。用dynabeads(人t激活因子cd3/cd28)以3:1的珠与细胞比率刺激从去识别的健康供体获得的白细胞单采术产物中的t细胞，并且在完全rpmi1640培养基中培养。刺激和慢病毒转导后10天，将细胞冷冻并储存以用于功能测定。在体外进行初始测试，以在基于萤光素酶的20小时测定中表征car-egfrviii细胞相对于未转导对照细胞优先杀伤肿瘤细胞的能力，在图1中示出。将人神经胶质瘤细胞系u87viii用作靶细胞。体外表征证明，egfrviiicart细胞介导了针对u87viii细胞的显著且特异性细胞毒性(图1)。对于体内实验，在对数生长期收集u87viii肿瘤细胞，将其洗涤，并且在人胶质母细胞瘤的异种移植模型中皮下给予小鼠(图2a和图2b)，或在人神经胶质瘤模型中颅内给予小鼠(图3a和图3b)。对于颅内给予，使用立体定向框架将50微升hamilton注射器的针定位于距前囟点右侧2mm并且在冠状缝处的颅骨表面下方4mm处。对于治疗，经由尾静脉向小鼠输注cart细胞(每只小鼠1x106个car转导的t细胞)一次。体外观察到的强效抗肿瘤作用反映在人胶质母细胞瘤的体内皮下异种移植模型中(图2a和图2b)。在该模型中，已建立的巨块型肿瘤(顶行)对cart-egfrviii有反应(图2b)，而未转导细胞并不能阻止肿瘤生长(图2a)。在颅内人神经胶质瘤的鼠类模型中，相对于未转导细胞(图3a)，egfrviiicart细胞减缓了肿瘤的生长并导致存活期延长(图3b)。尽管消除了肿瘤生长，但效果却不如针对皮下肿瘤所观察到的那些效果明显。在用cart-egfrviii细胞治疗后在人患者肿瘤组织中观察到了调节性t细胞(treg)的存在(图4a和图4b)。为了确定脑浸润性treg在抑制cart-egfrviii细胞中是否具有功能性作用，进行了体外treg抑制测定，其中在treg存在下将cart-egfrviii细胞和神经胶质瘤细胞孵育18小时。如图5a至图5c所示，通过incycyte活细胞分析获得结果。虽然非特异性car细胞允许神经胶质瘤细胞的增殖(图5a和图5d，顶线)，但cart-egfrviii细胞杀伤神经胶质瘤细胞(图5b和图5d，底线)。然而，在共培养物中添加treg显著降低了cart-egfrviii细胞杀伤靶神经胶质瘤细胞的能力(图5c和图5d，中线)。实施例4.靶向treg相关抗原的cart细胞的设计和表征图6a至图6c、图7a和图7b示出了实验的结果，在所述实验中lap和garp被鉴定为人外周血细胞上的treg相关标记。特别地，在未被离体激活的人treg中，大约27％表达lap，大约4％是呈lap和garp双阳性的(图6b)。一旦使用抗cd3、抗cd8和il-2进行离体激活，大约30％表达lap，并且lap/garp双阳性treg的数量增加到12.3％(图6c)。接下来，设计编码靶向lap和garp的car的car构建体。这些构建体的示意图示于图8a至图8d中。treg靶向性构建体包含两种lap靶向性car(car-lap-l-h(图8a)和car-lap-h-l(图8b)；其中每个抗lapscfv含有反转的重(h)链和轻(l)链的排列)、garp靶向性car构建体(car-garp；图8c)和进一步编码抗garp骆驼科动物抗体的egfr靶向性car构建体(car-egfr-garp；图8d)。每种构建体的转导效率使用流式细胞术通过测量mcherry阳性细胞的百分比来评估并提供在下文。表1.treg靶向性car构建体的转导效率car构建体nd47nd48nd50构建体1car-garp(seqidno:1)68.0％81.0％72.8％构建体2car-lap-h-l(seqidno:7)57.1％79.5％80.4％构建体3car-lap-l-h(seqidno:13)72.2％88.2％90.1％构建体4car-egfr-garp(seqidno:19)n/an/a51.2％为了测试抗lapcart细胞，将cart细胞与从同一供体扩增并转导以表达gfp作为treg标记的分离treg共培养。在杀伤测定之前将treg用抗cd3和抗cd28激活过夜(图9b)或静置过夜(图9a)。铺板62,500个treg/孔。以所指示的与treg的比率添加car。在300u/mlil-2存在下将培养物孵育三天。在第3天通过每孔收集30,000个事件进行流式细胞术。细胞毒性百分比计算为与具有treg的未转导t细胞培养物相比，gfp阳性细胞的减少百分比。与cart-lap-l-h相比，cart-lap-h-l在杀伤未激活treg方面更有效。然后，在两个不同的供体之间的类似treg杀伤测定中，将lap靶向性cart细胞与garp靶向性cart细胞进行比较，所述测定以1:1的cart细胞与treg比率进行4天(图10a和图10b)。图11a和图11b表征lap靶向性cart细胞相对于未转导对照的未激活和激活treg杀伤，依据随cart细胞与treg细胞比率变化的在三天共培养结束时剩余的靶treg数量来进行。图11c和图11d示出了来自同一供体的类似数据，其中细胞毒性通过萤光素酶表达来测量。为了进一步表征抗原表达对lap和garp靶向性cart细胞功能的影响，针对lap和garp抗原表达对永生细胞系进行筛选，并且评估了每种cart细胞的细胞毒性作用。首先，针对garp和lap对表达il-2的皮肤人cd4t细胞淋巴细胞来源的细胞系hut78细胞进行染色(分别为图12a和图12b)，并且确认hut78细胞的lap表达。接下来，通过细胞毒性测定来测量cart-lap-h-l和cart-lap-l-h细胞介导的对hut78细胞的细胞毒性(图13a和图13b)。接下来，针对garp和lap对il-2依赖性人sezary综合征来源的细胞seax进行染色(分别为图14a和图14b)，并且确认了两种抗原的表达。将seax细胞与cart-garp细胞、cart-lap-h-l细胞、cart-lap-l-h细胞和未转导细胞共培养，以定量在24小时(图15a)和48小时(图15b)时cart细胞介导的杀伤。每种cart在24小时时均展现出优异的seax靶细胞杀伤，在48小时时作用更明显。截至48小时，与cart-lap-l-h细胞相比，cart-garp和cart-lap-h-l以更高的效率杀伤靶seax细胞。接下来，通过蛋白质印迹来表征cart-egfr-garp细胞中抗garp骆驼科动物抗体的分泌(图16a至图16c)。从含有cart-egfr-garp细胞的培养物中收集上清液，在还原和非还原条件下进行处理，并且在含有非还原样品的泳道中观察到10与15kd之间的条带的存在(图16c)，从而确认了骆驼科动物抗体的存在。实施例5.分泌bite的cart细胞的设计和表征本文提供的增强肿瘤微环境内cart细胞活性的功效(例如，克服treg的免疫调节)的另一机制是通过分泌免疫调节抗体如bite的cart细胞实现的。不希望受理论的束缚，本发明人发现了，从也编码car的构建体表达免疫调节抗体(例如，bite)可以进一步放大抗肿瘤作用。在图17中示意性示出的一种示例性核酸构建体car-egfr-bite-(egfr-cd3)包含5'可操作地连接至bite编码多核苷酸的car编码多核苷酸。car的特征在于与egfrviii结合的肿瘤抗原结合结构域，其将cart细胞定向至egfrviii阳性肿瘤的微环境。如图18所示，bite在一个结构域上与egfr结合，并且在另一结构域上与cd3结合，这可以(a)进一步增强宿主cart细胞与肿瘤细胞的结合亲合力，或(b)武装邻近(例如，内源性)t细胞抵抗肿瘤。bite的侧翼是可裂解接头p2a和t2a，以使得能够单独分泌bite，同时使car靶向至细胞表面。在图26a和图26b中描绘了其他示例性bite编码car构建体(例如，编码靶向cd19的bite)。通过以下方式来确认cart-egfr-bite-(egfr-cd3)细胞的bite分泌：从含有用car-egfr-bite-(egfr-cd3)转导的supt1细胞的培养物中分离上清液，基于od450计算上清液中bite的浓度，并且进行蛋白质印迹分析。上清液中bite的浓度为0.604ng/ml。蛋白质印迹实验的结果示于图19中。在第二泳道中观察到约50-60kd的条带，这表明上清液中存在bite分子。接下来，通过流式细胞术评估bite分子的结合。用car-egfr-bite-(egfr-cd3)转导hek293t细胞，并且收集含有分泌的bite的上清液并将其与k562细胞(图20a)和jurkat细胞(图20b)一起孵育。如图20a所示，bite结合表达egfr的k562细胞，而不结合表达cd19的k562细胞，从而确认了bite的egfr结合结构域的功能。如图20b所示，相比于与来自未转导hek293t的上清液一起孵育后针对bite的染色，在与来自car-egfr-bite-(egfr-cd3)表达hek293t细胞的上清液一起孵育后，cd3表达jurkat细胞显示出更强的针对bite的染色，这表明bite也功能性结合cd3。使用supt1细胞作为car-egfr-bite-(egfr-cd3)的转导宿主，进行了类似的实验。图21a显示bite结合表达egfr的k562细胞，而不结合表达cd19的k562细胞，从而确认了由转导的supt1细胞表达的bite的egfr结合结构域的功能。为了确认bite与宿主supt1细胞表面上表达的cd3结合，针对bite对经转导supt1细胞进行染色。图21b所示的结果确认了转导的supt1细胞对bite呈染色阳性。还评估了nd4细胞在用car-egfr-bite-(egfr-cd3)转导后分泌功能性bite的能力。图22a显示由转导的nd4细胞分泌的bite结合表达egfr的k562细胞，但不结合表达cd19的k562细胞。如图22b所示，bite与分泌它们的转导的nd4细胞上表达的cd3结合。接下来，在体外表征从经转导cart细胞中分泌的bite的能力。将含有从用car-egfr-bite-(egfr-cd3)转导的hek293t细胞分泌的bite的上清液与不同比率下的未转导nd4细胞和u87viii靶细胞的共培养物一起孵育。如图23所示，当与bite一起孵育时，nd4细胞以剂量依赖性方式，这表明bite与nd4表达的cd3和u87viii表达的egfr结合，结合程度足以诱导nd4细胞的杀伤。为了使得能够在t细胞激活时诱导型表达bite，设计并合成了含有nfat启动子的构建体。如图24所示，nfat启动子在gfp编码多核苷酸之前，并且构建体进一步包含由组成型启动子ef1α驱动的下游car编码多核苷酸。为了确认gfp的诱导型表达，通过facs评估了响应于pma/离子霉素的tcr刺激的gfp表达。如图25a和图25b所示，刺激触发了gfp的表达。该诱导型表达通过与pepviii一起孵育而受到抑制。通过将bite定位在诱导型启动子(如nfat启动子)的下游来设计编码car的诱导型bite构建体，如图27a和图27b所示。实施例6.用于胶质母细胞瘤的cart细胞使用共聚焦显微镜检查，证明了egfr靶向性bite被释放到上清液中，并且经由cd3(效应臂)与经转导(mcherry+)t细胞和旁观者未转导(mcherry-)t细胞两者结合。在该实验中，cart-egfr转导的细胞(mcherry+)有效地结合了生物素化靶抗原(绿色，图28，顶部)；相比之下，分泌非特异性bite的cart-egfrviii并未结合(图28，中间)。car.bite的培养物具有成簇结合的bite(红色/绿色共定位)，而培养物中旁观者未转导t细胞(mcherry-)也结合了生物素化抗原(图28，底部)。接下来，分析响应于抗原刺激的细胞因子产生。在用u87(表达egfr但不表达egfrviii的人恶性神经胶质瘤细胞系)进行体外刺激后，比较了不同car构建体产生ifn-γ和tnf-α的模式。这证明了由bite重定向的t细胞介导的egfr特异性细胞因子产生(图29)。该发现与在acea仪器上进行的细胞毒性测定一致，其中car.bite能够在体外介导针对u87的强效且特异性抗肿瘤功效(图29)。在aceatranswell实验中，证明了这主要是由于旁观者未转导t细胞的重定向所致(图29c和图29d)。使用表达egfr但不表达egfrviii的颅内神经胶质瘤(u251)的体内模型(图30a)，发现脑室内给予cart-egfrviii.bite-egfr也有效地对抗在免疫受损的小鼠脑中植入的肿瘤(图30b)。在该实验中，成功地生成了分泌具有生物学抗肿瘤作用的工程化bite的cart细胞。据我们所知，这是第一次证明这一点。实施例7.材料和方法研究设计这项研究的总体目的是提供寻求组合car和bitet细胞重定向技术的新颖疗法的概念验证。使用若干种肿瘤模型、技术和方法测试car设计和整合的cart.bite构建体两者。这些采用了五种不同的异种模型，包括三种原位脑肿瘤以及移植的人皮肤以有助于毒性评估。通过卡尺和生物发光成像测量肿瘤生长，并且使用三种不同的体外细胞毒性测定。每个实验都使用源自多种正常人供体的t细胞进行了多次。小鼠和细胞系nsg小鼠购自jacksonlaboratory，并且在mgh癌症研究中心在无病原体条件下培育。所有实验均根据机构动物护理与使用委员会(institutionalanimalcareandusecommittee)批准的方案进行。人神经胶质瘤细胞系u87和u251以及野生型亲本k562获自美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)(atcc)，并且维持在如供应商概述的条件下。在一些情况下，通过慢病毒转导将细胞工程化以表达egfr、egfrviii或cd19。在指示的情况下，将细胞系转导以表达叩头虫绿色(cbg)萤光素酶或增强型gfp(egfp)，并且在bdfacsaria上进行分选以获得经转导细胞的克隆群。患者来源的神经球培养物bt74为santoshkesari博士所赠，并且维持在如先前所述的无血清ef20培养基中(pandita等人,geneschromosomescancer.39:29-36,2004)。car的构建合成了两种抗egfrviiicart.bite构建体和三种另外的car构建体(抗egfr、抗egfrviii和抗cd19)，并且将其克隆到在人ef-1α启动子的调节下的第三代慢病毒质粒主链中。所有car和cart.bite构建体均含有与细胞内4-1bb共刺激和cd3ζ信号结构域串联的cd8跨膜结构域。设计了针对野生型egfr和cd19的bite，其中两个序列的侧翼是igκ信号肽和多组氨酸标签(his标签)元件。在适当的位置并入了核糖体跳跃位点。所有构建体还含有编码荧光报告物mcherry的转基因，以有助于评价转导效率。cart细胞产生人t细胞是从根据ind豁免协议购自mgh血库的匿名人健康供体白细胞单采术产物(stemcelltechnologies)纯化的。用对应于各种第二代cart细胞构建体的慢病毒转导细胞。简而言之，将批量人t细胞在第0天使用cd3/cd28dynabeads(lifetechnologies)激活，并且在补充有10％fbs和20iu/ml重组人il-2的具有glutamax和hepes的rpmi1640培养基中培养。在第1天进行细胞的慢病毒转导，并且除非另有说明，否则允许细胞扩增至第10天，并且随后在功能测定之前转移至液氮中储存。对于所有功能测定，使用来自同一供体和扩增的未转导但已培养和激活的t细胞，将cart细胞和cart.bite细胞的转导效率归一化。在某些实验中，在第10天在bdfacsaria上对cart细胞进行分选，以获得经转导的mcherry阳性t细胞的纯群体。t细胞激活和功能测定用不同的car构建体转导jurkat(nfat-萤光素酶)报告细胞(signosis)，之后与肿瘤靶标以1:1的e:t比率共培养24小时。通过将未转导jurkat报告细胞(j)以及伴随的原代人t细胞和肿瘤靶标以1:1:1的j:e:t比率共培养24小时，类似地评估旁观者jurkat激活。然后使用synergyneo2发光微板读数器(biotek)评估萤光素酶活性。还使用luminex阵列(luminexcorp，flexmap3d)根据制造商的说明书分析了来自与肿瘤靶标共培养的应答细胞的无细胞上清液中的细胞因子表达。在评估激活标记cd25和cd69的实验中，将cart细胞和cart.bite细胞与经辐照的u87以1:1的e:t一起孵育。将细胞共培养72小时，然后进行流式细胞术分析。对于分选的转导细胞的增殖测定，将效应物扩增10天，然后根据mcherry阳性事件进行分选。然后使用经辐照的u87、u87viii或u87-cd19刺激细胞。然后通过单独car(cart-egfrviii.bite-cd19和u87viii)、单独bite(cart-egfrviii.bite-cd19和u87-cd19)或car和bite(cart-egfrviii.bite-egfr和u87viii)刺激utd、分选的cart-egfrviii细胞和分选的cart.bite细胞。将效应细胞和靶细胞以1:1的e:t铺板。每7天对细胞进行计数，并以7天的间隔再次铺板并刺激。细胞毒性测定对于单时间点细胞毒性测定，将cart细胞与萤光素酶表达肿瘤靶标以所指定的e:t比率一起孵育18小时。随后使用synergyneo2发光微板读数器(biotek)测量剩余的萤光素酶活性。通过以下等式计算特异性裂解百分比：％＝((单独靶细胞rlu-总rlu)/(仅靶细胞rlu))×100。对于针对粘附细胞系的实时细胞毒性测定，使用xcelligencertcasp仪器(aceabiosciences,inc.)将细胞指数记录为细胞阻抗的量度。使用以下等式计算特异性裂解百分比：％＝((utd的细胞指数-cart细胞的细胞指数))/utd的细胞指数)×100。在使用acea仪器进行的transwell细胞毒性测定中，将用car构建体转导的jurkat报告细胞培养在0.4μmtranswell插入物(aceabiosciences)的顶部孔中。将未转导t细胞与肿瘤靶标以所指示的e:t比率在底部孔中共培养。偶尔，检查由于acea机器出错而从某些孔中获得的伪读数，但它们不会影响对数据的解释。在针对神经球的测试中，通过如通过incucyte活细胞分析记录的总平均绿色面积来测量细胞毒性。将神经球铺板后3天添加效应物以促进神经球形成。以3:1的e:t添加效应细胞并且随时间监测，每10分钟每孔获得4张图像。bite纯化和定量用对应的car构建体转导hek293t细胞，并将其培养直至汇合。收集来自细胞的上清液，并将其在轻轻搅拌下在4℃下与hispurni-nta树脂(thermofisherscientific)一起孵育24-48小时。然后用ni-nta洗涤缓冲液(50mmtrisph8.0，500mmnacl，5％甘油，25mm咪唑)洗涤上清液-树脂混合物。然后在ni-nta洗脱缓冲液(50mmtrisph8.0，500mmnacl，5％甘油，250mm咪唑)中洗脱his标签蛋白。洗脱后，根据制造商的说明，使用slide-a-lyzercassettefloatbuoys(thermofisherscientific)将蛋白质缓冲液交换至pbs中。当指示时，使用amiconultra-15离心过滤装置(emdmillipore)进一步浓缩蛋白质。使用his标签elisa检测试剂盒(genscript)确定无细胞的含bite溶液的蛋白质浓度。简而言之，以2×105个细胞/ml接种bite产生细胞。使细胞生长2周，并且间歇性地收集和分析上清液。在指示的情况下，将样品针对从仅含有utd的孔中获得的平均值进行归一化。蛋白质印迹通过sds-page分离蛋白质样品，并且根据制造商方案，使用novexiblot2硝酸纤维素转移叠层(invitrogen)和iblot2凝胶转移装置(invitrogen)将所述蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上。简而言之，将膜在封闭缓冲液中孵育1小时，所述封闭缓冲液由tbst(santacruzbiotechnology)中的5％脱脂奶粉(bio-rad)组成。将膜在tbst中洗涤一次，并且在4℃下用抗his标签抗体(1:2500，克隆3d5，invitrogen)探测过夜。将膜用tbst洗涤3次，每次5分钟，并且与辣根过氧化物酶缀合的绵羊抗小鼠igg抗体(1:5000，gehealthcare)一起孵育1小时。然后将膜用tbst洗涤3次，每次5分钟，并且用amershameclprime蛋白质印迹检测试剂(gehealthcare)显影。流式细胞术和免疫组织化学在指示的情况下将靶向各自抗原的以下抗体克隆用于流式细胞术分析：egfr(ay13，biolegend)、egfrviii(l8a4，absoluteantibody)、his标签(4e3d10h2/e3，thermofischer)、cd25(2a3，bdbiosciences)、cd69(fn50，biolegend)、ccr7(3d12，bdbioscience)、cd45ro(uchl1，bdbiosciences)、pd-1(eh12287，biolegend)、tim-3(f38-2e2，biolegend)、lag-3(3ds223h，biolegend)。在某些实验中，在用抗his标签抗体进行二次染色之前，将纯化的bite或具有可溶性bite的上清液与靶细胞一起孵育。通常，将细胞在室温下在暗中染色15分钟，并且在具有2％fbs的pbs中洗涤两次，之后进行分析。添加dapi以建立活与死的分离。用于免疫组织化学的抗体克隆包括以下：egfrviii(d6t2q，cellsignaling)和egfr(d38b1，cellsignaling)，在基于edta的抗原修复后，分别以1:200和1:50稀释。福尔马林固定、石蜡包埋的样本是从实验中分离的或以可商购获得的组织微阵列的形式购买的(gl805c，usbiomax；bnc17011a，usbiomax)。显微成像t细胞的共聚焦显微镜检查是在mgh癌症中心分子病理共聚焦核心在zeisslsm710倒置共聚焦显微镜上进行的，并且用fijiisjustimagej软件进行分析。简而言之，将已激活并扩增10天的经转导t细胞用浓度为1μg/ml的生物素化人egfr(acrobiosystems)染色40分钟，然后在冰上与1μg/ml的链霉亲和素(ebioscience)一起孵育15分钟，之后进行显微镜分析。在其他方面，还使用evos细胞成像系统(thermofisherscientific)使细胞培养物可视化。在评估增殖的实验中，将cart细胞和cart.bite细胞与经辐照的表达egfp的u87以1:1的e:t共培养一周。动物模型在对数生长期收获肿瘤细胞，并将其用pbs洗涤两次，之后加载在带有25号针的50μl注射器中。在立体定向框架的辅助下，将肿瘤细胞植入距前囟点右侧2mm处和在距冠状缝处的颅骨表面4mm的深度。肿瘤细胞的数量根据细胞培养物而变化。在侧腹肿瘤或人皮肤毒性的小鼠模型中，通过尾静脉输注以100μl体积全身性输注效应细胞。当脑室内递送时，在距前卤点左侧2mm和前卤点前侧0.3mm处在3mm的深度输注细胞。对于所有实验，将效应细胞群归一化为每次输注含有1×106个细胞。然后，在腹膜内底物注射后，使用amiht光学成像系统(spectralinstruments)通过生物发光发射纵向评价肿瘤进展。对于毒性研究，在知情同意和机构审查委员会批准后，在腹壁成形术期间从健康供体中获得去识别的过量人皮肤。将大约1cm×1cm皮肤样品缝合到nsg小鼠的背部，并且使其愈合至少6周。每天监测植入的皮肤长达2周，之后切除并进行组织学分析。统计学方法所有分析均使用graphpadprism7.0c软件进行。将数据呈现为平均值±标准差(sd)或平均值的标准误差(sem)，统计学上显著的差异通过如在图例中所指示的检验确定。实施例8.针对胶质母细胞瘤(gbm)的egfrviii的cart细胞和cart.bite的设计胶质母细胞瘤(gbm)是最常见的恶性脑肿瘤，并且也是最致命的。gbm的当前治疗包括手术切除、辐射和替莫唑胺化学疗法，所述治疗仅提供递增的益处并且受全身性毒性和对正常脑的损害的限制(imperato等人,annalsofneurology28:818-822,1990)。在2017年，靶向cd19的cart细胞获得了美国食品药品监督管理局(fda)批准用于b细胞恶性肿瘤，并且此后彻底改变了血液系统癌症的治疗(mullard等人,nat.rev.drug.discov.16:699,2017)。在gbm的最近临床研究中已经描述了若干种不同的car(o'rourke等人,sci.transl.med.2017年9月；ahmed等人,jamaoncol.3:1094-1101,2017；brown等人,n.engl.j.med.375:2561-2569,2016)，其中外周注射的car转导的t细胞已定位至脑肿瘤，并且在至少一种情况下，颅内给予的cart细胞介导晚期、多灶性、巨块型疾病的消退(brown等人,同上)。然而，针对gbm的临床反应并非一致或持久的，这在很大程度上是由于这些肿瘤内的异质抗原表达以及在用针对单一靶标的cart细胞治疗后抗原逃逸的出现所致。大约30％的gbm表达egfrviii(wikstrand等人cancerres.57:4130-4140,1997)，同时80％或更多表达egfr(verhaak等人,cancercell17:98-110,2010)。当egfrviii突变在gbm中丧失时，野生型egfr的扩增得以维持(o'rourke等人,sci.transl.med.9,2017；felsberg等人,clin.cancerres.23:6846-6855,2017)。尽管在如皮肤、肺和肠的正常组织中也发现了egfr表达，但在来自健康人中枢神经系统(cns)组织的80个核心样品的分析中未检测到egfr(图31，表2)，这与来自人类蛋白质图谱(humanproteinatlas)的公众可获得的器官特有数据一致(uhlen等人mol.cellproteomics4:1920-1932,2005)。通过产生分泌针对野生型egfr的bite的egfrviii特异性cart细胞(cart-egfrviii.bite-egfr)来利用这种有利的表达模式，并假设该策略可用于安全地增强在egfrviii抗原丧失的gbm模型中的功效。表2.正常cns和gbm组织微阵列的样品名称为了在异种移植模型中重演gbm异质性和复发时抗原逃逸的出现，将具有异质egfrviii表达的肿瘤植入nsg(nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj)小鼠的侧腹中(图32a)。在植入后第2天，通过尾静脉用未转导t细胞(utd)或cart-egfrviii对小鼠进行静脉内(iv)治疗。用叩头虫绿色萤光素酶(cbg-luc)转导egfrviii阳性细胞，以允许通过生物发光成像实时评估肿瘤进展。侧腹植入允许在消除egfrviii阳性细胞后立即伴随进行肿瘤生长的卡尺测量。在该实验中，用萤光素酶转导仅egfrviii表达细胞，使得仅在该细胞群中检测到成像信号。用静脉内(iv)非转导(utd)t细胞治疗的小鼠展示出egfrviii阳性肿瘤的生长，用cart-egfrviii细胞治疗的那些小鼠显示出不同程度的肿瘤生长，这在一些小鼠中反映为生物发光信号被消除(图32b)。然而，在这些小鼠中进展出可触及的、可测量的肿瘤(图32c)。对收获的肿瘤的免疫组织化学(ihc)分析与来自临床试验(o'rourke等人,同上)的发现一致；即，复发性活肿瘤在用cart-egfrviii治疗后同时丧失egfrviii和维持egfr表达(图32d)。因此，开发了cart.bite的概念(图32e)，其具有多抗原靶向的理论优势，并且还具有募集和激活旁观者t细胞的能力(choi等人,proc.natl.acad.sci.usa.110:270-275,2013)，所述旁观者t细胞代表了在用cart-egfrviii治疗的患者的gbm中观察到的细胞浸润的主要组分(o'rourke等人,同上)。常规的cart-egfrviii仅靶向egfrviii阳性肿瘤，而cart.bite细胞具有靶向egfrviii阴性肿瘤的附加能力。此外，分泌的bite还可以将旁观者t细胞针对残留肿瘤细胞重定向。实施例9.用于异质性肿瘤的cart.bite的生成生成了两种cart.bite构建体，二者均基于含有4-1bb和cd3ζ细胞内信号传导结构域的第二代cart-egfrviii主链(图33a)。bite被设计针对野生型egfr或cd19，后者既充当阴性对照，又充当用于推广我们在模型抗原中的发现的概念验证。bite的序列位于igκ信号肽之后，并且之后是多组氨酸标签(his标签)元件，以有助于检测和纯化分泌产物。不分泌bite的对照car由相同的4-1bb和cd3ζ主链以及靶向egfrviii、egfr和cd19的单链可变片段(scfv)组成。mcherry荧光报告基因包含在所有载体中，以有利于评价转导效率。用慢病毒载体实现了将cart.bite载体有效基因转移至原代人t细胞中(图33b)。按照先前所述的一般形式构建bitecdna(choi等人,expertopin.biol.ther.11:843-853,2011)，并入串联翻译的两个scfv，通过柔性甘氨酸-丝氨酸接头桥接(图33c和图33d)。常规地，bite的一个臂被设计成通过结合cd3来接合和激活t细胞，而相对的靶标结合臂针对肿瘤抗原。来自用每种cart.bite载体转导的人胚肾(hek)细胞的上清液证明了bite-egfr和bite-cd19两者均成功翻译和分泌，如通过在大约55kda的预测分子量处的蛋白质印迹证实的(图33e)。在泳道中加载10μg蛋白质，并且进行sds-page并用抗his标签抗体进行印迹。还从经转导原代人t细胞中成功分离出分泌型bite产物；来自这些培养物的上清液结合表达适当同源抗原的k562靶细胞。这被确认是抗原特异性的，因为从cart-egfrviii.bite-cd19和cart-egfrviii.bite细胞分离的bite分别不结合表达egfr和cd19的k562(图33f)。如所预期的，分泌型bite也展示出经由其抗cd3scfv结构域结合t细胞的能力(图33g)。当浓缩来自cart.bite细胞的上清液时，检测被增强，这一发现与使用相同抗cd3scfv克隆(如博纳吐单抗)的bite一致(fajardo等人,cancerres.77:2052-2063)。接下来，使用基于elisa的竞争性免疫测定估算人cart.bite细胞产生的bite的量。虽然utd细胞不产生可检测的分泌性his标记蛋白，但在cart.bite细胞(5×105)的上清液中容易地测量到可溶性bite，并且总bite浓度以大约10pg/d的速率随时间增加(图33h)。如果将其缩放至用于临床研究的估计的靶剂量(例如，大约5×108个转导细胞)(o'rourke等人,同上)，这将以10ng/d的估计速率产生bite分泌。重要的是，已测试了bite-egfr在食蟹猴中的毒性，并且对于70kg患者在大约800μg/d的剂量当量下是安全的(lutterbuese等人,proc.natl.acad.sci.usa107:12065-12610,2010)；据计算，这比在人体中全身性输注cart-egfrviii.bite-egfr细胞将得到的计划bite分泌高5个数量级。用cart细胞和bite进行的免疫疗法在血液恶性肿瘤患者中生成强效的抗肿瘤反应，但在实体瘤如gbm中取得的成功有限。在当前研究中，开发了一种方法，其策略性地将car与bite组合到单一基因修饰的t细胞产物中。已证明该平台可用于解决实体瘤的有效免疫疗法的关键障碍，包括抗原逃逸、免疫抑制和t细胞消耗。实施例10.cart.bite在egfrviii抗原丧失的环境中起作用已经证明了car转导的t细胞可以经工程化以翻译和分泌bite，然后确定cart.bite细胞在介导抗肿瘤免疫应答中的功能能力。首先，在体外生成用候选构建体转导的jurkat报告t细胞，并且评估其针对充分表征的egfrviii阴性、egfr阳性神经胶质瘤细胞系的选择性激活(图34a)。除非另有说明，否则所有测定均一式三份进行(描绘了平均值+sem；未配对t检验，***＝p<0.001)。为了控制通过egfrviii特异性car或经由单独bite的抗cd3scfv进行的脱靶激活，我们使用了用cart-egfrviii.bite-cd19转导的细胞。实际上，在含有utd细胞或分泌bite-cd19的cart细胞的孔中未检测到t细胞激活。相比之下，用cart-egfrviii.bite-egfr转导的t细胞展示出针对gbm的显著选择性激活(图34b)。在使用原代人t细胞的类似实验中，还发现cart-egfrviii.bite-egfr细胞在与神经胶质瘤细胞一起培养时，以bite依赖性、egfr特异性方式产生th1促炎细胞因子ifn-γ和tnf-α(图34c)。接下来，测试了cart.bite引发抗原特异性细胞毒性反应的能力。使用标准生物发光细胞毒性测定，我们证明了cart-egfrviii.bite-egfr细胞对egfr阳性神经胶质瘤具有高度的细胞毒性和特异性(图35)。使用基于阻抗的平台重演了这些结果，所述平台集成了微电子技术以捕获细胞活力随时间的实时评价和动力学。在这些测定中，将靶egfr阳性神经胶质瘤细胞系与效应t细胞一起孵育，并且纵向记录如由细胞指数(即活力)表示的阻抗。针对多种神经胶质瘤细胞系和在变化的效应物与靶标(e:t)比率下，与不可知的cart对照(例如，cart-cd19、cart-egfrviii和cart-egfrviii.bite-cd19)或utd共培养的孔均显示出相似的活力动力学，而发现cart-egfrviii.bite-egfr细胞介导靶细胞活力的快速降低(图36a)。当在若干个时间点显示为细胞毒性百分比时，即使与阳性对照cart-egfr相比，cart.bite细胞对gbm细胞显著更有效(图36b)。该作用与肿瘤细胞上egfr表达的程度相关联，因为具有较高egfr表达的靶标被用cart-egfrviii.bite-egfr或cart-egfr转导的t细胞更有效地裂解(图36c)。患者来源的异种移植物(pdx)是最近gbm中的转化研究的焦点，并被认为接近地再现脑肿瘤的遗传复杂性和标志性生物学特征。重要的是，已明确显示gbmpdx维持生理上相关的egfr拷贝数和扩增水平。在多于11种已建立的gbmpdx神经球的研究中(pandita等人,geneschromosomescancer39:29-36,2004)，只有一种肿瘤含有扩增的egfr和egfrviii两者。鉴于其天然的双重抗原表达，推断该模型(即bt74，前称为gbm6)将是用于cart.bite评价的理想平台。确认了bt74可靠地展示出egfr和egfrviii两者的异质表达(图37a)。突出显示该异质性，用cart-egfrviii.bite-cd19转导的jurkat报告t细胞在bt74存在下被激活，但是其激活程度显著低于用cart-egfrviii.bite-egfr转导的那些，这与car介导的对培养物中egfrviii表达细胞的识别一致(图37b)。因为pdx神经球是非粘附性的且因此不适合基于阻抗进行活力测量，所以通过基于图像的活细胞分析评估抗肿瘤细胞毒性。使用该系统，证明了随时间推移，cart-egfrviii.bite-egfr细胞针对bt74的显著抗肿瘤活性(图37c)。该平台还使得能够对神经球本身进行形态学评价，这再次显示了与分泌bite-cd19的那些或utd对照相比，在含有分泌bite-egfr的cart细胞的孔中的选择性抗肿瘤功效(图37d)。鉴于这些观察结果，设计了预实验以在免疫受损小鼠中评估cart.bite针对原位pdx的活性。发现在治疗脑中的肿瘤时，cart细胞的区域性、脑室内递送是可行的、安全的并且优于全身性递送(图38a和图38b)，这与已报道的文献一致(brown等人,n.engl.j.med.375:2561-2569,2016；priceman等人,clin.cancerres.24:95-105,2018；choi等人,j.clin.neurosci.21:189-190,2014)。当在体内针对bt74进行测试时，脑室内给予cart-egfrviii.bite-egfr导致甚至7天建立的大脑内pdx的持久消退(图39a至图39c)。尽管用cart-egfrviii.bite-cd19细胞治疗的小鼠最终也展示出治疗效果，但这在实验过程中发生地较晚，并且回顾起来，这与bt74在体内随时间传代时可能具有上调egfrviii的能力的报道一致(pandita等人,geneschromosomescancer39:29-36,2004)。实施例11.cart.bite对小鼠的egfrviii阴性肿瘤有效且安全鉴于bt74中egfrviii的表达在小鼠中被证明是可变的，接下来确定cart-egfrviii.bite-egfr的体内功效是否依赖于其同源抗原egfrviii的car识别，或者在不存在car接合的情况下分泌型bite是否足以检测体内可测量的抗肿瘤反应。为了对此进行测试，将人神经胶质瘤细胞(u251)原位植入nsg小鼠中并进行治疗(图40a)。u251被认为是用于测试功效的最严格的神经胶质瘤模型之一，这是鉴于其缺乏egfrviii表达和相对减少的egfr的表面表达(图36c)，以及在体外对由于cart.bite细胞产生的细胞死亡的更大抵抗力(图36a和图36b)。此外，与其他细胞系相比，u251因其能够最接近地反映人gbm在植入小鼠中时的突出病理生物学特征的能力而被特别引用(radaelli等人histol.histopathol.24:879-891,2009)。使用该异种移植模型，我们证明了在注射cart-egfrviii.bite-egfr细胞后，5天建立的神经胶质瘤的持久消退(图40b和图40c)。相反，用表达cart-egfrviii和bite-cd19的细胞治疗的小鼠展示出与接受utd对照的那些小鼠相当的进行性肿瘤负荷。因为分泌型bite-egfr对于介导针对gbm的抗肿瘤功效是必要且足够的，所以即使在不存在egfrviii的情况下，一个潜在的担忧可能是cart.bite也可能在表达野生型egfr的正常人组织中导致明显的中靶脱肿瘤毒性。然而，据假设，鉴于来自经转导t细胞的bite分泌水平非常低(图33h)，与替代性方法(如egfr特异性cart细胞的直接免疫治疗靶向)相比，通过分泌型bite局部靶向egfr可能导致改善的安全性概况。为了对此进行测试，使用了先前公布的皮肤移植物毒性模型(johnson等人,sci.transl.med.7:275ra222,2015)，所述模型使得能够在体内评估针对以内源性水平表达egfr的人组织的免疫应答。选择皮肤移植是为了便于可视化和收获以供分析，同时也因为皮肤病学反应代表了若干种靶向egfr的fda批准疗法的主要副作用(agero等人,j.am.acad.dermatol.55:657-670,2006)。将人皮肤移植到nsg小鼠的背部上，并在用cart细胞疗法治疗之前使其完全愈合(图40d)。将基于西妥昔单抗可变链的cart-egfr细胞充当诱导皮肤毒性的阳性对照，同时使用针对egfrviii但经修饰以分泌cd19bite的cart细胞作为阴性对照，先前已显示所述cart细胞在皮肤移植物实验(johnson等人,同上)和临床试验(o'rourke等人,同上)中是安全的。所有t细胞均静脉内而非颅内递送，以增加对可能起源于cart细胞和分泌型bite在全身性循环中的药代动力学分布的毒性的敏感性。输注后最多两周收集皮肤样品，并且进行组织学检查。用cart-egfr治疗的小鼠在其皮肤移植物的真皮和表皮中展示出强淋巴细胞浸润。通过ihc分析揭示了稳健的cd3+t细胞浸润，以及角质形成细胞凋亡和tunel+细胞的邻近区域，这与皮肤移植物抗宿主病一致(图40e)。相反，这些体征在用cart-egfrviii.bite-egfr细胞治疗的小鼠中不存在，其在10个连续的高倍视野中进行定量时与对照组无明显差异(图40f和图40g)。这些结果表明，存在经设计以分泌低水平bite的car的治疗窗口，并且即使在全身性给予cart.bite细胞时，靶向健康组织上的抗原也可以是安全的。实施例12.cart细胞分泌的bite募集旁观者效应物活性在患者中，gbm肿瘤在基线时被内源性t细胞可变地浸润，并且已经显示这些细胞的存在预示有利的临床结果(lohr等人,clin.cancerres.17:4296-4308,2011)。同样，对接受cart-egfrviii细胞的患者的临床研究证明了在肿瘤床内稳健的旁观者t细胞浸润(o'rourke等人,同上)。然而，还已经显示肿瘤浸润淋巴细胞(til)通常具有肿瘤激动特异性，并且可以识别众多种与癌症完全无关的表位(simoni等人nature557:575-579,2018)。因此，这些未修饰的内源性t细胞可能代表未开发资源，具有被重定向为肿瘤特异性细胞毒性杀伤细胞的潜力(图32e)。在机理上，仍不清楚分泌型bite仅募集经修饰以表达转基因的细胞，还是主要将旁观者t细胞区室重定向，所述重定向在用于研究应用和临床应用的所有cart细胞制剂中偶然存在(图33b)。为了具体地表征分泌型bite与旁观者t细胞之间的相互作用，首先使用共聚焦显微镜检查来使培养中cart细胞和未转导t细胞两者上egfr特异性bite的分布可视化。如前所述，通过mcherry荧光蛋白的表达鉴定经转导细胞(图33a)。此外，使用生物素化的egfr进行抗egfrscfv的灵敏检测，在这种情况下，所述抗egfrscfv可以表达为呈car形式的跨膜蛋白，或表达为bite中与其cd3结合位点相对的未结合臂。除非另有说明，否则所有测定均一式三份进行(描绘了平均值+sem；未配对t检验，***＝p<0.001)。如预期的那样，发现阳性对照cart-egfr细胞成功结合游离的egfr抗原(图41a和图41b；顶部)。相反，用cart-egfrviii.bite-cd19转导的阴性对照t细胞没有通过其car或分泌型bite组分显示出对egfr的特异性迹象(图41a和图41b；中间)。然而，在已经用cart-egfrviii.bite-egfr转导的培养物中，发现egfr特异性bite的证据，其成簇结合，不仅结合经转导mcherry阳性细胞，还结合在旁观者、mcherry阴性、未转导细胞的表面上(图41a和图41b；底部)。接下来，评价了特别是来自旁观者区室的分泌型bite加强针对肿瘤细胞的旁分泌免疫应答的能力。使用对gbm和原代人t细胞的共培养物的流式细胞术分析，发现仅cart-egfrviii.bite-egfr介导mcherry阴性细胞的激活，如通过cd25和cd69的早期诱导所指示(图41c)。如预期的那样，在含有cart-egfr细胞的共培养物中也观察到激活，但这仅限于mcherry阳性群体，而这些培养物中的旁观者细胞保持不变。旁观者t细胞被未转导jurkat报告t细胞替代的另外的实验证明，抗原特异性激活同样仅在分泌bite-egfr的人cart细胞存在下进行(图41d)。重要的是，在测定之前，这些报告细胞没有在bite分子活跃产生期间的条件下进行培养，这在标准cart细胞扩增期间是典型的；因此，旁观者激活可以明确归因于测定期间分泌的bite。还评估了cart.bite可能引起旁观者t细胞功能活性的程度，所述程度通过如增殖、细胞因子分泌和抗肿瘤细胞毒性的参数来测量。已确定，mcherry阳性cart-egfr细胞在培养中遇到其靶抗原后无差别地增殖，但在旁观者t细胞区室内观察到，大部分增殖发生在用cart-egfrviii.bite-egfr转导的培养物中(图41e和图41f)。最后，使用0.4μmtranswell系统，所述系统在基因修饰的细胞与utd效应细胞之间提供了物理屏障，同时允许可溶性bite在腔室之间自由通过(图41g)。该策略消除了与培养中非特异性cart细胞与肿瘤之间的直接细胞-细胞相互作用或意料不到的活性相关的变量。使用该系统，发现由cart.bite细胞产生的bite成功地跨过transwell膜易位，以在存在gbm的情况下介导来自未修饰t细胞的th1细胞因子产生和抗原特异性细胞毒性(图41h和图41i)。这种作用也是可推广的，因为结果在表达cd19的靶细胞的环境下用cart-egfrviii.bite-cd19得到重演。值得注意的是，当utd效应细胞被高纯度、流式细胞术细胞分选的调节性t细胞(treg)替代时，也观察到了抗肿瘤细胞毒性(图42)。这一发现与先前工作一致，所述先前工作证明bite具有经由端粒酶-穿孔素途径将甚至treg转化为抗肿瘤细胞毒性杀伤细胞的能力(choi等人,cancerimmunol.res.1:163,2013)。treg代表gbm患者中高度抑制性细胞群，并且实际上在来自用cart-egfrviii治疗的患者的til中过度表现(o'rourke等人,同上)。因此，这些发现突出显示了cart.bite可以凭之增强抗肿瘤免疫力并减轻肿瘤从t细胞排斥逃逸的另外的机制。实施例13.同时通过car和bite重定向导致有利的t细胞分化和表型在仅在10％的细胞中表达egfrviii的异质性脑肿瘤模型中，注射cart-egfrviii.bite-egfr细胞在所有小鼠中导致完全且持久的反应(图43a至图43c)。在这种环境下，cart.bite细胞将可能被其car和分泌型结合bite两者激活。为了了解同时通过car和bite激活的作用，使用荧光激活细胞分选(facs)以高于97.5％的纯度分离若干种cart细胞培养物的经转导mcherry阳性亚群(图43d)。进行该步骤以在随后的分析中主要排除car阴性旁观者细胞的贡献。使用这种方法，证明了经转导以表达car的t细胞维持通过bite介导的细胞毒性有效裂解靶肿瘤细胞的能力(图43e)。当分别针对表达egfr和cd19的相应靶肿瘤系进行测试时，对于bite-egfr和bite-cd19两者都是如此。此外，与单独car相比时，通过car和bite两者重定向的cart细胞(例如，针对表达egfrviii和egfr二者的u87viii的cart-egfrviii.bite-egfr)产生了相当的细胞毒性活性(图43f)。这些数据提供了早期证据证明，car和bite可能能够一起传导信号，而不一定会产生冲突的起反作用的影响或者一个平台相对于另一个平台的免疫优势。为了进一步表征在car转导的细胞的背景下的bite活性，还比较了每种刺激模式启动和维持t细胞增殖的能力。值得注意的是，虽然bite仅限于经由cd3刺激激活t细胞，但在这种情况下，将cart细胞工程化以表达细胞内cd3ζ以及强效共刺激结构域(如4-1bb)两者。因此，根据设计推测，在测量某些功能参数的测定中，在直接对比(head-to-head)测量时，car可能优于bite。实际上，在用经辐照的靶细胞进行连续抗原刺激后，经历bite刺激的分选的转导细胞的生长在大约12天后趋于稳定，而通过car进行的重复抗原刺激维持对数生长超过一个月(图43g)。有趣的是，当同时通过car和bite激活时，在单独bite的情况下观察到的增殖缺陷几乎被完全消除。t细胞以各种分化状态存在，每种状态具有独特的功能能力。在临床研究中，已经显示bite选择性促进分化良好的效应记忆细胞(tem)的扩增(bargou等人,science321:974-977,2008)；然而，已经使用分化程度较低的干细胞记忆(tscm)或中枢记忆(tcm)亚型实现了cart的优异结果(sadelain等人,nature545:423-431,2017)。这些分化程度较低的表型与增强的扩增和持久性、自我更新的能力以及生成寿命较短的tem的能力相关。因此，假设，在通过每种方式进行连续抗原刺激期间观察到的增殖差异(图43g)也可能导致不同的t细胞分化模式。实际上，与我们的数据以及先前研究一致，经历延长的单独bite刺激的cart细胞优先富集tem细胞，而通过单独car或car和bite激活的那些似乎富集分化程度较低的tcm区室(图43h)。最后，表征指示t细胞消耗的表面标记，所述t细胞消耗是一种状态，特征在于一般低反应性、有限的增殖能力和严重受损的效应子功能。发现通过单独bite刺激上调了与消耗的t细胞相关的若干种免疫检查点抑制剂(例如pd-1、tim-3和lag-3)的表达；然而，当组合car和bite时，朝向t细胞消耗的极化被逆转(图43i)。这些发现确证了先前研究显示的共刺激(尤其通过4-1bb)对减轻cart细胞的消耗的有利作用(long等人,nat.med.21:581-590,2015)，并且还表明可以将这些益处扩展到具有针对其他抗原的bite的组合疗法。我们的发现揭示了对通常被认为是竞争性技术的car和bite如何改为可以用于相互补充的新见解。实施例14.经基因修饰以用串联嵌合抗原受体(car)和分泌型bite的组合靶向多种抗原的免疫细胞异质靶抗原表达和缺乏靶抗原的肿瘤的生长可以限制癌症对使用经工程化以表达car的免疫细胞(例，如t细胞)的免疫疗法的反应。例如，胶质母细胞瘤(gbm)是一种预后极差的癌症，已知其表达可以被靶向以实现有效抗肿瘤免疫力的表面抗原，所述表面抗原包括egfrviii、il13rα2、egfr、her2和肝配蛋白。然而，迄今为止，gbm对针对单一抗原(如egfrviii或il-13rα2)的cart细胞的反应受限，部分是由于抗原逃逸所致。为了解决这个问题，设计了第二代car，其由两个或更多个抗原结合结构域(例如，两个或更多个单链片段可变(scfv)区、两个或更多个配体、或一个或多个scfv与一个或多个配体的组合)构成。这种car具有通过与两种或更多种不同的抗原(例如egfrviii和il-13rα2)接合而被激活的能力。为了进一步增加可通过这种方法实现的反应的宽度并防止经由抗原逃逸导致的肿瘤进展，可以通过工程化免疫细胞以使得也分泌靶向另外的靶标(例如，egfr或her2)的双特异性抗体(例如，bite)来为免疫细胞提供另外的特异性或靶标。设计了针对il-13rα2和egfrviii的串联car构建体，连同针对任一单一抗原的两种对照car一起(图44a至图44c)。所述串联car(构建体12)包含ef1α启动子、il-13配体(il-13泽塔因子)、抗egfrviiiscfv、cd8跨膜结构域、4-1bb共刺激结构域、cd3ζ结构域、t2a肽序列和报告基因(mcherry)。所述构建体可以是多顺反子载体，其例如使用t2a肽或内部核糖体进入位点(ires)进一步编码bite(例如，靶向egfr或her2的bite)。这种多顺反子载体可以例如根据实施例8中所述的方法来设计和/或类似于实施例5和10中所述的构建体。在其他例子中，可以用表达bite的单独载体转导用串联car构建体(如构建体12)转导的car-t细胞。使用u87人胶质母细胞瘤细胞和经转导以表达egfrviii的u87细胞(u87viii)开发了异质胶质母细胞瘤的体外模型。如通过流式细胞术所评估，在u87和u87viii胶质母细胞瘤两者中确认il13rα2的表达(图45a)。接下来，进行未转导t细胞(utd)、抗il-13rα2cart细胞、抗egfrviiicart细胞或串联抗il-13rα2/抗egfrviiicart细胞的细胞毒性测定。如图45b所示，每个cart细胞群都诱导靶细胞群(1:1比率的u87和u87viii胶质母细胞瘤细胞)的细胞毒性，其中在10:1和3:1的效应物:靶标(e:t)比率下，与靶向单一抗原的cart细胞相比，串联抗il-13rα2/抗egfrviiicart细胞显示出最高的特异性裂解功效。概括地说，我们开发了靶向两种或更多种不同抗原(例如，egfrviii和il-13rα2)的串联car，可以将其工程化以分泌靶向另外的抗原(例如，egfr或her2)的双特异性抗体(例如，bite)。该技术可以扩展到靶向其他表面肿瘤抗原的其他串联car或bite，所述其他表面肿瘤抗原例如egfr、egfrviii、cd19、cd79b、cd37、psma、psca、il-13rα2、epha1、her2、间皮素、muc1、muc16或其他。例如，可以将串联car设计为靶向egfr和egfrviii、psma和psca；cd19和cd79b；cd79b和cd37；cd19和cd37；epha1和her2；epha1和间皮素；her2和间皮素、muc1和muc16；以及上述肿瘤抗原的其他组合。实施例15.序列信息抗garpcar-构建体1：cd8信号序列–抗garp–cd8铰链+tm–4-1bb–cd3ζ(seqidno:1)，其包含cd8信号序列(seqidno:1的氨基酸1-21；seqidno:2)；抗garp骆驼科动物(seqidno:1的氨基酸22-128；seqidno:3)；cd8铰链/tm结构域(seqidno:1的氨基酸129-197；seqidno:4)；4-1bbicd(seqidno:1的氨基酸198-239；seqidno:5)；和cd3ζ(seqidno:1的氨基酸240-351；seqidno:6)。malpvtalllplalllhaarpdiqmtqspsslsaslgdrvtitcqasqsissylawyqqkpgqapniliygasrlktgvpsrfsgsgsgtsftltisgleaedagtyycqqyasvpvtfgqgtkvelktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno:1)cd8信号序列(seqidno:1的氨基酸1-21)malpvtalllplalllhaarp(seqidno:2)抗garp骆驼科动物(seqidno:1的氨基酸22-128)diqmtqspsslsaslgdrvtitcqasqsissylawyqqkpgqapniliygasrlktgvpsrfsgsgsgtsftltisgleaedagtyycqqyasvpvtfgqgtkvelk(seqidno:3)cd8铰链/tm结构域(seqidno:1的氨基酸129-197)tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyc(seqidno:4)4-1bbicd(seqidno:1的氨基酸198-239)krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seqidno:5)cd3ζ(seqidno:1的氨基酸240-351)rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno:6)抗lapcar(h-l)-构建体2：cd8信号序列–抗lap–cd8铰链+tm–4-1bb–cd3ζ(seqidno:7)，其包含cd8信号序列(seqidno:7的氨基酸1-21；seqidno:8)、抗lapscfv(h-l)(seqidno:7的氨基酸22-307；seqidno:9)、cd8铰链/tm结构域(seqidno:7的氨基酸308-376；seqidno:10)、4-1bbicd(seqidno:7的氨基酸377-418；seqidno:11)和cd3ζ(seqidno:7的氨基酸419-530；seqidno:12)。malpvtalllplalllhaarpmklwlnwiflvtllndiqcevklvesggglvqpggslslscaasgftftdyymswvrqppgkalewlgfirnkpngytteysasvkgrftisrdnsqsilylqmnvlraedsatyycarytgggyfdywgqgttltvssggggsggggsggggsggggsmmssaqflgllllcfqgtrcdiqmtqttsslsaslgdrltiscrasqdisnylnwyqqkpdgtvklliyytsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqadiatyfcqqgdtlpwtfgggtkleiktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno:7)cd8信号序列(seqidno:1的氨基酸7-21)malpvtalllplalllhaarp(seqidno:8)抗lapscfv(h-l)(seqidno:7的氨基酸22-307)mklwlnwiflvtllndiqcevklvesggglvqpggslslscaasgftftdyymswvrqppgkalewlgfirnkpngytteysasvkgrftisrdnsqsilylqmnvlraedsatyycarytgggyfdywgqgttltvssggggsggggsggggsggggsmmssaqflgllllcfqgtrcdiqmtqttsslsaslgdrltiscrasqdisnylnwyqqkpdgtvklliyytsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqadiatyfcqqgdtlpwtfgggtkleik(seqidno:9)cd8铰链/tm结构域(seqidno:7的氨基酸308-376)tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyc(seqidno:10)4-1bbicd(seqidno:7的氨基酸377-418)krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seqidno:11)cd3ζ(seqidno:7的氨基酸419-530)。rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno:12)抗lapcar(l-h)-构建体3：cd8信号序列–抗lap–cd8铰链+tm–4-1bb–cd3ζ(seqidno:13)，其包含cd8信号(seqidno:13的氨基酸1-21；seqidno:14)、抗lapscfv(l-h)(seqidno:13的氨基酸22-307；seqidno:15)、cd8铰链/tm(seqidno:13的氨基酸308-376；seqidno:16)、4-1bbicd(seqidno:13的氨基酸377-418；seqidno:17)和cd3ζ(seqidno:13的氨基酸419-530；seqidno:18)。malpvtalllplalllhaarpmmssaqflgllllcfqgtrcdiqmtqttsslsaslgdrltiscrasqdisnylnwyqqkpdgtvklliyytsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqadiatyfcqqgdtlpwtfgggtkleikggggsggggsggggsggggsmklwlnwiflvtllndiqcevklvesggglvqpggslslscaasgftftdyymswvrqppgkalewlgfirnkpngytteysasvkgrftisrdnsqsilylqmnvlraedsatyycarytgggyfdywgqgt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ktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssveggsggsggsggsggvddiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkhhhhhh(ef1a启动子)eiqlvqsgaevkkpgeslrisckgsgfniedyyihwvrqmpgkglewmgridpendetkygpifqghvtisadtsintvylqwsslkasdtamyycafrggvywgqgttvtvssggggsggggsggggsggggsdvvmtqspdslavslgeratinckssqslldsdgktylnwlqqkpgqppkrlislvskldsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycwqgthfpgtfgggtkveiktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno:61)(注意：为方便起见，上述两种多肽用单一序列标识符表示，但应理解，car和bite组分可以由于两个分开的启动子而单独产生；参见上文。)igκ信号序列(seqidno:61的氨基酸1-21)metdtlllwvlllwvpgstgd(seqidno:62)抗cd19scfv(seqidno:61的氨基酸22-271)diqltqspaslavslgqratisckasqsvdydgdsylnwyqqipgqppklliydasnlvsgipprfsgsgsgtdftlnihpvekvdaatyhcqqstedpwtfgggtkleikggggsggggsggggsqvqlqqsgaelvrpgssvkisckasgyafssywmnwvkqrpgqglewigqiwpgdgdtnyngkfkgkatltadessstaymqlsslasedsavyfcarretttvgryyyamdywgqgttvtvss(seqidno:63)抗cd3scfv(seqidno:61的氨基酸277-519)diklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssveggsggsggsggsggvddiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelk(seqidno:64)2173(抗egfrviii)scfv(seqidno:61的氨基酸526-771)eiqlvqsgaevkkpgeslrisckgsgfniedyyihwvrqmpgkglewmgridpendetkygpifqghvtisadtsintvylqwsslkasdtamyycafrggvywgqgttvtvssggggsggggsggggsggggsdvvmtqspdslavslgeratinckssqslldsdgktylnwlqqkpgqppkrlislvskldsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycwqgthfpgtfgggtkveik(seqidno:65)cd8铰链/tm(seqidno:61的氨基酸772-840)tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyc(seqidno:66)4-1bbicd(seqidno:61的氨基酸841-882)krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seqidno:67)cd3ζ(seqidno:61的氨基酸883-994)rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno:68)构建体10–cd8信号序列–抗garpscfv(h-l)–cd8铰链/tm–4-1bbicd–cd3ζ(seqidno:69)，其包含cd8信号序列(seqidno:69的氨基酸1-21；seqidno:70)、抗garpscfv(h-l)(seqidno:69的氨基酸22-274；seqidno:71)、cd8铰链/tm(seqidno:69的氨基酸275-343；seqidno:72)、4-1bbicd(seqidno:69的氨基酸344-385；seqidno:73)、cd3ζ(seqidno:69的氨基酸386-497；seqidno:74)。malpvtalllplalllhaarpevqlvqpgaelrnsgasvkvsckasgyrftsyyidwvrqapgqglewmgridpedggtkyaqkfqgrvtftadtststayvelsslrsedtavyycarnewetvvvgdlmyeyeywgqgtqvtvssggggsggggsggggsggggsdiqmtqspsslsaslgdrvtitcqasqsissylawyqqkpgqapniliygasrlktgvpsrfsgsgsgtsftltisgleaedagtyycqqyasvpvtfgqgtkvelktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno:69)cd8信号序列(seqidno:69的氨基酸1-21)malpvtalllplalllhaarp(seqidno:70)抗garpscfv(h-l)(seqidno:69的氨基酸22-274)evqlvqpgaelrnsgasvkvsckasgyrftsyyidwvrqapgqglewmgridpedggtkyaqkfqgrvtftadtststayvelsslrsedtavyycarnewetvvvgdlmyeyeywgqgtqvtvssggggsggggsggggsggggsdiqmtqspsslsaslgdrvtitcqasqsissylawyqqkpgqapniliygasrlktgvpsrfsgsgsgtsftltisgleaedagtyycqqyasvpvtfgqgtkvelk(seqidno:71)cd8铰链/tm(seqidno:69的氨基酸275-343)tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyc(seqidno:72)4-1bbicd(seqidno:69的氨基酸344-385)krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seqidno:73)cd3ζ(seqidno:69的氨基酸386-497)rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno:74)构建体11–cd8信号序列–抗garpscfv(l-h)–cd8铰链/tm–4-1bbicd–cd3ζ(seqidno:75)，其包含cd8信号序列(seqidno:75的氨基酸1-21；seqidno:76)、抗garpscfv(l-h)(seqidno:75的氨基酸22-274；seqidno:77)、cd8铰链/tm(seqidno:75的氨基酸275-343；seqidno:78)、4-1bbicd(seqidno:75的氨基酸344-385；seqidno:79)、cd3ζ(seqidno:75的氨基酸386-497；seqidno:80)。malpvtalllplalllhaarpdiqmtqspsslsaslgdrvtitcqasqsissylawyqqkpgqapniliygasrlktgvpsrfsgsgsgtsftltisgleaedagtyycqqyasvpvtfgqgtkvelkggggsggggsggggsggggsevqlvqpgaelrnsgasvkvsckasgyrftsyyidwvrqapgqglewmgridpedggtkyaqkfqgrvtftadtststayvelsslrsedtavyycarnewetvvvgdlmyeyeywgqgtqvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno:75)cd8信号序列(seqidno:75的氨基酸1-21)malpvtalllplalllhaarp(seqidno:76)抗garpscfv(l-h)(seqidno:75的氨基酸22-274)diqmtqspsslsaslgdrvtitcqasqsissylawyqqkpgqapniliygasrlktgvpsrfsgsgsgtsftltisgleaedagtyycqqyasvpvtfgqgtkvelkggggsggggsggggsggggsevqlvqpgaelrnsgasvkvsckasgyrftsyyidwvrqapgqglewmgridpedggtkyaqkfqgrvtftadtststayvelsslrsedtavyycarnewetvvvgdlmyeyeywgqgtqvtvss(seqidno:77)cd8铰链/tm(seqidno:75的氨基酸275-343)tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyc(seqidno:78)4-1bbicd(seqidno:75的氨基酸344-385)krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seqidno:79)cd3ζ(seqidno:75的氨基酸386-497)rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno:80)表3.构建体10和构建体11的抗garp序列表4.构建体2和构建体3的抗lap序列构建体12(串联car)–il-13泽塔因子–接头–egfrviiiscfv–cd8铰链/tm–4-1bbicd–cd3ζ(seqidno:100)，其包含il-13泽塔因子(seqidno:101(seqidno:100的氨基酸1-112))；接头(seqidno:102(seqidno:100的氨基酸113-132))；egfrviiiscfv(seqidno:103(seqidno:100的氨基酸133-378))；cd8铰链/tm(seqidno:104(seqidno:100的氨基酸379-447))；4-1bbicd(seqidno:105(seqidno:100的氨基酸448-489))；和cd3ζ(seqidno:106(seqidno:100的氨基酸490-601))gpvppstalrylieelvnitqnqkaplcngsmvwsinltagmycaaleslinvsgcsaiektqrmlsgfcphkvsagqfsslhvrdtkievaqfvkdlllhlkklfregrfnggggsggggsggggsggggseiqlvqsgaevkkpgeslrisckgsgfniedyyihwvrqmpgkglewmgridpendetkygpifqghvtisadtsintvylqwsslkasdtamyycafrggvywgqgttvtvssggggsggggsggggsggggsdvvmtqspdslavslgeratinckssqslldsdgktylnwlqqkpgqppkrlislvskldsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycwqgthfpgtfgggtkveiktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno:100)il-13泽塔因子(seqidno:100的氨基酸1-112)gpvppstalrylieelvnitqnqkaplcngsmvwsinltagmycaaleslinvsgcsaiektqrmlsgfcphkvsagqfsslhvrdtkievaqfvkdlllhlkklfregrfn(seqidno:101)接头(seqidno:100的氨基酸113-132)ggggsggggsggggsggggs(seqidno:102)抗egfrviiiscfv(seqidno:100的氨基酸133-378)eiqlvqsgaevkkpgeslrisckgsgfniedyyihwvrqmpgkglewmgridpendetkygpifqghvtisadtsintvylqwsslkasdtamyycafrggvywgqgttvtvssggggsggggsggggsggggsdvvmtqspdslavslgeratinckssqslldsdgktylnwlqqkpgqppkrlislvskldsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycwqgthfpgtfgggtkveik(seqidno:103)cd8铰链/tm(seqidno:100的氨基酸379-447)tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyc(seqidno:104)4-1bbicd(seqidno:100的氨基酸448-489)krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seqidno:105)cd3ζ(seqidno:100的氨基酸490-601)rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno:106)本文所述的其他序列如下：表5.序列可以根据以下编号段落中的任一项定义本文所述的技术的一些实施方案：1.一种免疫细胞，所述免疫细胞经工程化以表达：(a)包含细胞外结构域的嵌合抗原受体(car)多肽，所述细胞外结构域包括结合第一抗原的第一抗原结合结构域和结合第二抗原的第二抗原结合结构域；以及(b)双特异性t细胞接合器(bite)，其中所述bite结合靶抗原和t细胞抗原。2.根据段落1所述的免疫细胞，其中所述car多肽包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。3.根据段落1或2所述的免疫细胞，其中所述car多肽进一步包含一个或多个共刺激结构域。4.根据段落1-3中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一和第二抗原是胶质母细胞瘤抗原。5.根据段落1-4中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一和第二抗原独立地选自表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)、cd19、cd79b、cd37、前列腺特异性膜抗原(psma)、前列腺干细胞抗原(psca)、白介素-13受体α2(il-13rα2)、肝配蛋白a型受体1(epha1)、人表皮生长因子受体2(her2)、间皮素、细胞表面相关粘蛋白1(muc1)或细胞表面相关粘蛋白16(muc16)。6.根据段落1-5中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域包括抗体的抗原结合片段。7.根据段落6所述的免疫细胞，其中所述抗体的抗原结合片段包括单结构域抗体或单链可变片段(scfv)。8.根据段落1-7中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域包括所述第一和/或第二抗原的配体。9.根据段落1-8中任一项所述的免疫细胞，其中所述细胞外结构域在所述第一抗原结合结构域与所述第二抗原结合结构域之间不包含接头。10.根据段落1-8中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域通过接头连接至所述第二抗原结合结构域。11.根据段落10所述的免疫细胞，其中所述接头包含与seqidno:102、107、108、109或110的接头具有至少90％序列同一性的氨基酸。12.根据段落2-11中任一项所述的免疫细胞，其中所述跨膜结构域包括铰链/跨膜结构域。13.根据段落12所述的免疫细胞，其中所述铰链/跨膜结构域包括免疫球蛋白样蛋白、cd28、cd8或4-1bb的铰链/跨膜结构域。14.根据段落12或13所述的免疫细胞，其中所述跨膜结构域包括cd8的铰链/跨膜结构域，其任选地包含氨基酸序列seqidno:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72、78或104，或与氨基酸序列seqidno:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72、78或104具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。15.根据段落2-14中任一项所述的免疫细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包括tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3θ、cd3ε、cd3η、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b或cd66d的细胞内信号传导结构域。16.根据段落15所述的免疫细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包括cd3ζ的细胞内信号传导结构域，其任选地包含氨基酸序列seqidno:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74、80或106，或与氨基酸序列seqidno:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74、80或106具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。17.根据段落3-16中任一项所述的免疫细胞，其中所述共刺激结构域包括4-1bb、cd27、cd28或ox-40的共刺激结构域。18.根据段落17所述的免疫细胞，其中所述共刺激结构域包括4-1bb的共刺激结构域，其任选地包含氨基酸序列seqidno:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73、79或105，或与氨基酸序列seqidno:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73、79或105具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。19.根据段落1-18中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域包括il-13rα2结合结构域。20.根据段落1-19中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二抗原结合结构域包括egfrviii结合结构域。21.根据段落19或20所述的免疫细胞，其中所述il-13rα2结合结构域包括抗il-13rα2scfv或il-13rα2的配体。22.根据段落21所述的免疫细胞，其中il-13rα2的所述配体包括il-13或il-13泽塔因子或其抗原结合片段。23.根据段落19-22中任一项所述的免疫细胞，其中所述il-13rα2结合结构域包含与氨基酸序列seqidno:101具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。24.根据段落23所述的免疫细胞，其中所述il-13rα2结合结构域包含氨基酸序列seqidno:101。25.根据段落20-24中任一项所述的免疫细胞，其中所述egfrviii结合结构域包括抗体的抗原结合片段。26.根据段落20-25中任一项所述的免疫细胞，其中所述egfrviii结合结构域包括抗egfrviiiscfv。27.根据段落26所述的免疫细胞，其中所述抗egfrviiiscfv包含含有与氨基酸序列seqidno:111或113具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(vh)，和/或含有与氨基酸序列seqidno:112或114具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(vl)。28.根据段落27所述的免疫细胞，其中所述vh包含氨基酸序列seqidno:111或113和/或所述vl包含氨基酸序列seqidno:112或114。29.根据段落20-28中任一项所述的免疫细胞，其中所述egfrviii结合结构域包含与氨基酸序列seqidno:103具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。30.根据段落29所述的免疫细胞，其中所述egfrviii结合结构域包含氨基酸序列seqidno:103。31.根据段落1-30中任一项所述的免疫细胞，其中所述car多肽包含与氨基酸序列seqidno:100具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。32.根据段落31所述的免疫细胞，其中所述car多肽包含氨基酸序列seqidno:100。33.一种免疫细胞，所述免疫细胞经工程化以表达：(i)car多肽，其包含与氨基酸序列seqidno:100具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(ii)bite，其中所述bite结合靶抗原和t细胞抗原。34.一种免疫细胞，所述免疫细胞经工程化以表达：(i)car多肽，所述car多肽包含氨基酸序列seqidno:100；以及(ii)bite，其中所述bite结合靶抗原和t细胞抗原。35.根据段落1-34中任一项所述的免疫细胞，其中所述靶抗原是选自以下各项之一的胶质母细胞瘤相关抗原：egfr、egfrviii、cd19、cd79b、cd37、psma、psca、il-13rα2、epha1、her2、间皮素、muc1或muc16。36.根据段落1-35中任一项所述的免疫细胞，其中所述t细胞抗原是cd3。37.根据段落1-36中任一项所述的免疫细胞，其中所述靶抗原是egfr并且所述t细胞抗原是cd3。38.根据段落1-37中任一项所述的免疫细胞，其中所述bite包含与氨基酸序列seqidno:98或99具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。39.根据段落38所述的免疫细胞，其中所述bite包含氨基酸序列seqidno:98或99。40.根据段落1-39中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是t细胞或自然杀伤(nk)细胞。41.根据段落1-40中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是人细胞。42.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据段落1-41中任一项所述的car多肽和bite。43.根据段落42所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含car多肽编码序列和bite编码序列，并且其中所述car多肽编码序列和所述bite编码序列被核糖体跳跃部分分开。44.根据段落42或43所述的多核苷酸，其中所述car多肽和/或所述bite在组成型启动子下表达。45.根据段落44所述的多核苷酸，其中所述组成型启动子包括延伸因子-1α(ef1α)启动子。46.根据段落42或43所述的多核苷酸，其中所述car多肽和/或所述bite在诱导型启动子下表达。47.根据段落46所述的多核苷酸，其中所述诱导型启动子可通过t细胞受体(tcr)或car信号转导诱导。48.根据段落47所述的多核苷酸，其中所述诱导型启动子包含激活t细胞核因子(nfat)反应元件。49.根据段落42或43所述的多核苷酸，其中所述car多肽和所述bite各自在组成型启动子下表达。50.根据段落42或43所述的多核苷酸，其中所述car多肽在组成型启动子下表达，并且所述bite在诱导型启动子下表达。51.根据段落42-50中任一项所述的多核苷酸，其进一步包含自杀基因。52.根据段落42-51中任一项所述的多核苷酸，其进一步包含编码一个或多个信号序列的序列。53.一种载体，所述载体包含根据段落42-52中任一项所述的多核苷酸。54.根据段落53所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。55.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据段落1-41中任一项所述的免疫细胞、根据段落42-52中任一项所述的多核苷酸或根据段落53或54所述的载体。56.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括将根据段落1-41中任一项所述的免疫细胞、根据段落42-52中任一项所述的多核苷酸，根据段落53或54所述的载体或根据段落55所述的药物组合物给予至所述受试者。57.根据段落56所述的方法，其中所述癌症是胶质母细胞瘤、肺癌、胰腺癌、淋巴瘤或骨髓瘤，任选地其中所述癌症包含表达由egfr、egfrviii、cd19、cd79b、cd37、psma、psca、il-13rα2、epha1、her2、间皮素、muc1和muc16组成的组中的一种或多种。58.根据段落57所述的方法，其中所述胶质母细胞瘤包含表达由il-13rα2、egfrviii、egfr、her2、间皮素和epha1组成的组中的一种或多种的细胞。59.根据段落57或58所述的方法，其中所述胶质母细胞瘤包含具有降低的egfrviii表达的细胞。60.一种免疫细胞，所述免疫细胞经工程化以表达：(i)包含egfr结合结构域的car多肽，其中所述car多肽包含与氨基酸序列seqidno:117具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(ii)抗garp骆驼科动物，其包含与氨基酸序列seqidno:25具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。61.一种免疫细胞，所述免疫细胞经工程化以表达：(i)包含egfrviii结合结构域的car多肽，其中所述car多肽包含与氨基酸序列seqidno:115或116具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及(ii)bite，其中所述bite结合至egfr和cd3，所述bite包含与氨基酸序列seqidno:98或99具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。62.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据段落60所述的car多肽和抗garp骆驼科动物。63.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据段落61所述的car多肽和bite。64.根据段落62或63所述的多核苷酸，其进一步包含自杀基因。65.根据段落62-64中任一项所述的多核苷酸，其进一步包含编码一个或多个信号序列的序列。66.一种载体，所述载体包含根据段落62-65中任一项所述的多核苷酸。67.根据段落66所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。68.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据段落60或61所述的免疫细胞、根据段落62-65中任一项所述的多核苷酸或根据段落66或67所述的载体。69.一种在受试者中治疗具有降低的egfrviii表达的胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括向所述受试者给予免疫细胞，所述免疫细胞经工程化以表达：(i)包含细胞外egfrviii结合结构域的car多肽；和(ii)bite，其中所述免疫细胞任选地选自根据段落1-41和61中任一项所述的免疫细胞。70.一种在受试者中预防或减少肿瘤微环境中的免疫抑制的方法，所述方法包括向所述受试者给予免疫细胞，所述免疫细胞包含(i)包含细胞外靶标结合结构域的car；和(ii)bite，其中所述免疫细胞任选地选自根据段落1-41、60和61中任一项所述的免疫细胞。71.一种在受试者中预防或减少肿瘤微环境中的t细胞消耗的方法，所述方法包括向所述受试者给予免疫细胞，所述免疫细胞包含(i)包含细胞外靶标结合结构域的car；和(ii)bite，其中所述免疫细胞任选地选自根据段落1-41、60和61中任一项所述的免疫细胞。72.一种在受试者中治疗具有异质抗原表达的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予免疫细胞，所述免疫细胞包含(i)包含细胞外靶标结合结构域的car；和(ii)bite，其中所述免疫细胞任选地选自根据段落1-41、60和61中任一项所述的免疫细胞。73.根据段落72所述的方法，其中所述癌症是胶质母细胞瘤、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、淋巴瘤或骨髓瘤。74.根据段落72或73所述的方法，其中所述癌症包含表达由egfr、egfrviii、cd19、psma、psca、il-13rα2、epha1、her2、间皮素、muc1和muc16组成的组中的一种或多种的细胞。75.一种cart细胞，所述cart细胞包含异源核酸分子，其中所述异源核酸分子包含：(a)编码car的第一多核苷酸，所述car包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及(b)编码治疗剂的第二多核苷酸。76.根据段落75所述的cart细胞，其中所述治疗剂包括抗体试剂。77.根据段落76所述的cart细胞，其中所述抗体试剂包括单链抗体或单结构域抗体。78.根据段落76所述的cart细胞，其中所述抗体试剂包括双特异性抗体试剂。79.根据段落78所述的cart细胞，其中所述双特异性抗体试剂包括bite。80.根据段落77所述的cart细胞，其中所述单结构域抗体包括骆驼科动物抗体。81.根据段落75所述的cart细胞，其中所述治疗剂包括细胞因子。82.根据段落75-81中任一项所述的cart细胞，其中所述car和所述治疗剂作为分开的car和治疗剂分子产生。83.根据段落82所述的cart细胞，其中所述cart细胞在编码所述car的所述第一多核苷酸与编码所述治疗剂的所述第二多核苷酸之间包含核糖体跳跃部分。84.根据段落83所述的cart细胞，其中所述核糖体跳跃部分包括2a肽。85.根据段落84所述的cart细胞，其中所述2a肽包括p2a或t2a。86.根据段落75-85中任一项所述的cart细胞，其中所述car和所述治疗剂各自组成型表达。87.根据段落75-86中任一项所述的cart细胞，其中所述car和所述治疗剂的表达由ef1α启动子驱动。88.根据段落75-85中任一项所述的cart细胞，其中所述治疗剂在诱导型启动子的控制下表达，所述诱导型启动子任选地可通过t细胞受体或car信号传导诱导。89.根据段落88所述的cart细胞，其中所述诱导型启动子包括nfat启动子。90.根据段落75-89中任一项所述的cart细胞，其中所述car在组成型启动子的控制下表达，而所述治疗剂在诱导型启动子的控制下表达，所述诱导型启动子任选地可通过t细胞受体或car信号传导诱导。91.根据段落75-90中任一项所述的cart细胞，其中所述car进一步包含一个或多个共刺激结构域。92.根据段落75-91中任一项所述的cart细胞，其中所述car的所述抗原结合结构域包括抗体、单链抗体、单结构域抗体或配体。93.根据段落75-92中任一项所述的cart细胞，其中所述跨膜结构域包括铰链/跨膜结构域。94.根据段落93所述的cart细胞，其中所述铰链/跨膜结构域包括免疫球蛋白样蛋白、cd28、cd8或4-1bb的铰链/跨膜结构域。95.根据段落75-94中任一项所述的cart细胞，其中所述car的所述跨膜结构域包括cd8铰链/跨膜结构域，其任选地包含seqidno:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72、78和104中的任一种或其变体的序列。96.根据段落75-95中任一项所述的cart细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包括tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3θ、cd3ε、cd3η、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b或cd66d的细胞内信号传导结构域。97.根据段落75-96中任一项所述的cart细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包括cd3ζ细胞内信号传导结构域，其任选地包含seqidno:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74、80和106中的任一种或其变体的序列。98.根据段落91-97中任一项所述的cart细胞，其中所述共刺激结构域包括4-1bb、cd27、cd28或ox-40的共刺激结构域。99.根据段落91-98中任一项所述的cart细胞，其中所述共刺激结构域包括4-1bb共刺激结构域，其任选地包含seqidno:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73、79和105中的任一种或其变体的序列。100.根据段落75-99中任一项所述的cart细胞，其中所述car抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原或treg相关抗原。101.根据段落80所述的cart细胞，其中所述骆驼科动物抗体结合肿瘤相关抗原或treg相关抗原。102.根据段落79所述的cart细胞，其中所述bite结合(i)肿瘤相关抗原或treg相关抗原，和(ii)t细胞抗原。103.根据段落100-102中任一项所述的cart细胞，其中所述肿瘤相关抗原是实体瘤相关抗原。104.根据段落103所述的cart细胞，其中所述肿瘤相关抗原包括egfrviii、egfr、cd19、psma、psca、il-13rα2、epha1、her2、间皮素、muc1或muc16，并且任选地所述car抗原结合结构域或所述治疗剂包含选自seqidno:21、27、33、36、42、45、51、55、57、63、65、103及其变体的序列。105.根据段落100-102中任一项所述的cart细胞，其中所述treg相关抗原选自糖蛋白a为主的重复序列(garp)、潜伏期相关肽(lap)、cd25和细胞毒性t淋巴细胞相关抗原-4(ctla-4)，并且任选地所述car抗原结合结构域或所述治疗剂包含选自seqidno:3、9、15、25、71、77及其变体的序列。106.一种car多肽，所述car多肽包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；并且所述抗原结合结构域结合treg相关抗原。107.根据段落106所述的car多肽，其中所述treg相关抗原选自garp、lap、cd25和ctla-4。108.根据段落106或107所述的car多肽，其中所述car进一步包含一个或多个共刺激结构域。109.根据段落106-108中任一项所述的car多肽，其中所述treg相关抗原是garp或lap。110.根据段落106-109中任一项所述的car多肽，其中所述car的所述抗原结合结构域包含：(a)重链可变结构域(vh)，其包含三个互补决定区cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其中所述cdr-h1包含氨基酸序列seqidno:81，或seqidno:81的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；所述cdr-h2包含氨基酸序列seqidno:82，或seqidno:82的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；并且所述cdr-h3包含氨基酸序列seqidno:83，或seqidno:83的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列，和/或(b)轻链可变结构域(vl)，其包含三个互补决定区cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中所述cdr-l1包含氨基酸序列seqidno:84，或seqidno:84的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；所述cdr-l2包含氨基酸序列seqidno:85，或seqidno:85的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；并且所述cdr-l3包含氨基酸序列seqidno:86，或seqidno:86的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列。111.根据段落110所述的car多肽，其中所述vh包含氨基酸序列seqidno:87，或与氨基酸序列seqidno:87具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和/或所述vl包含氨基酸序列seqidno:88，或与氨基酸序列seqidno:88具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。112.根据段落106-109中任一项所述的car多肽，其中所述car的所述抗原结合结构域包含：(a)重链可变结构域(vh)，其包含三个互补决定区cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其中所述cdr-h1包含氨基酸序列seqidno:89，或seqidno:89的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；所述cdr-h2包含氨基酸序列seqidno:90，或seqidno:90的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；并且所述cdr-h3包含氨基酸序列seqidno:91，或seqidno:91的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列，和/或(b)轻链可变结构域(vl)，其包含三个互补决定区cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中所述cdr-l1包含氨基酸序列seqidno:92，或seqidno:92的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；所述cdr-l2包含氨基酸序列seqidno:93，或seqidno:93的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；并且所述cdr-l3包含氨基酸序列seqidno:94，或seqidno:94的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列。113.根据段落112所述的car多肽，其中所述vh包含氨基酸序列seqidno:95，或与氨基酸序列seqidno:95具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和/或所述vl包含氨基酸序列seqidno:96，或与氨基酸序列seqidno:96具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。114.根据段落110-113中任一项所述的car多肽，其中所述vh在所述vl的n末端。115.根据段落110-113中任一项所述的car多肽，其中所述vl在所述vh的n末端。116.根据段落106-115中任一项所述的car多肽，其中所述car的所述抗原结合结构域包括scfv或单结构域抗体，其任选地包含选自seqidno:3、9、15、25、71、77及其变体的序列。117.根据段落106-116中任一项所述的car多肽，其中所述跨膜结构域包括铰链/跨膜结构域。118.根据段落117所述的car多肽，其中所述铰链/跨膜结构域包括免疫球蛋白样蛋白、cd28、cd8或4-1bb的铰链/跨膜结构域。119.根据段落106-118中任一项所述的car多肽，其中所述car的所述跨膜结构域包括cd8铰链/跨膜结构域，其任选地包含seqidno:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72、78和104中的任一种或其变体的序列。120.根据段落106-119中任一项所述的car多肽，其中所述细胞内信号传导结构域包括tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3θ、cd3ε、cd3η、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b或cd66d的细胞内信号传导结构域。121.根据段落106-120中任一项所述的car多肽，其中所述细胞内信号传导结构域包括cd3ζ细胞内信号传导结构域，其任选地包含seqidno:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74、80和106中的任一种或其变体的序列。122.根据段落108-121中任一项所述的car多肽，其中所述共刺激结构域包括4-1bb、cd27、cd28或ox-40的共刺激结构域。123.根据段落108-122中任一项所述的car多肽，其中所述共刺激结构域包括4-1bb共刺激结构域，其任选地包含seqidno:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73、79和105中的任一种或其变体的序列。124.一种car多肽，所述car多肽包含与seqidno:26、seqidno:35、seqidno:44、seqidno:53、seqidno:61、seqidno:19、seqidno:1、seqidno:7、seqidno:13、seqidno:69、seqidno:75和seqidno:100中的任一种的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。125.根据段落124所述的car多肽，其包含seqidno:26、seqidno:35、seqidno:44、seqidno:53、seqidno:61、seqidno:19、seqidno:1、seqidno:7、seqidno:13、seqidno:69、seqidno:75和seqidno:100中的任一种的氨基酸序列。126.一种核酸分子，所述核酸分子编码根据段落75-125中任一项所述的(i)car多肽，或(ii)包含所述car多肽和治疗剂的多蛋白。127.根据段落126所述的核酸分子，其进一步包含自杀基因。128.根据段落126或127所述的核酸分子，其进一步包含编码信号序列的序列。129.一种载体，所述载体包含根据段落126-128中任一项所述的核酸分子。130.根据段落129所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。131.一种多肽，所述多肽包括根据段落75-125中任一项所述的car多肽，或包含所述car多肽和治疗剂的多蛋白。132.一种免疫细胞，所述免疫细胞包含根据段落106-125中任一项所述的car多肽、根据段落126-128中任一项所述的核酸分子、根据段落129或130所述的载体和/或根据段落131所述的多肽。133.根据段落132所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是t细胞或nk细胞。134.根据段落132或133所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是人细胞。135.一种药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种根据段落75-134中任一项所述的cart细胞、核酸分子、car多肽、多蛋白或免疫细胞。136.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者给予根据段落135所述的药物组合物。137.根据段落136所述的方法，其中通过靶向肿瘤微环境，降低了全身性毒性。138.根据段落136或137所述的方法，其中所述癌症的特征在于一种或多种实体瘤的存在。139.根据段落136-138中任一项所述的方法，其中所述癌症的特征在于肿瘤浸润性treg。140.根据段落136-139中任一项所述的方法，其中所述癌症是胶质母细胞瘤。141.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者给予经基因修饰以分泌肿瘤毒性抗体或细胞因子的cart细胞产物，其中通过将所述癌症毒性局部地定向至肿瘤微环境，降低了全身性毒性。142.根据段落141所述的方法，其中所述cart细胞经基因修饰以将针对ctla4、cd25、garp、lap、il-15、csf1r或egfr、egfrviii、cd19、cd79b、cd37、psma、psca、il-13rα2、epha1、her2、间皮素、muc1或muc16的抗体，或双特异性抗体递送至所述肿瘤微环境。143.根据段落142所述的方法，其中所述双特异性抗体是针对egfr和cd3的bite。144.一种向患者的组织或器官递送治疗剂以治疗疾病或病状的方法，所述方法包括向所述患者给予经基因修饰以分泌治疗性抗体、毒素或药剂的cart细胞，其中所述治疗性抗体、毒素或药剂本身将无法进入或穿透所述组织或器官。145.根据段落144所述的方法，其中所述组织或器官是在神经系统中。146.根据段落145所述的方法，其中所述神经系统是中枢神经系统。147.根据段落146所述的方法，其中所述中枢神经系统是脑。148.根据段落144-147中任一项所述的方法，其中所述疾病或病状是癌症。149.根据段落148所述的方法，其中所述癌症是胶质母细胞瘤、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、淋巴瘤或骨髓瘤。150.根据段落144-149中任一项所述的方法，其中所述治疗性抗体是抗egfr或抗egfrviii。151.一种在受试者中治疗具有降低的egfrviii表达的胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括向所述受试者给予cart细胞，所述cart细胞经工程化以表达：(i)包含细胞外egfrviii结合结构域的car多肽；和(ii)bite，其中所述cart细胞任选地选自根据段落75-105中任一项所述的cart细胞。152.一种在受试者中预防或减少肿瘤微环境中的免疫抑制的方法，所述方法包括向所述受试者给予cart细胞，所述cart细胞经工程化以表达：(i)包含细胞外靶标结合结构域的car多肽；和(ii)bite，其中所述cart细胞任选地选自根据段落75-105中任一项所述的cart细胞。153.一种在受试者中预防或减少肿瘤微环境中的t细胞消耗的方法，所述方法包括向所述受试者给予cart细胞，所述cart细胞经工程化以表达：(i)包含细胞外靶标结合结构域的car多肽；和(ii)bite，其中所述cart细胞任选地选自根据段落75-105中任一项所述的cart细胞。154.一种在受试者中治疗具有异质抗原表达的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予cart细胞，所述cart细胞经工程化以表达：(i)包含细胞外靶标结合结构域的car多肽；和(ii)bite，其中所述cart细胞任选地选自根据段落75-105中任一项所述的cart细胞。155.根据段落154所述的方法，其中所述癌症是胶质母细胞瘤、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、淋巴瘤或骨髓瘤。156.根据段落154或155所述的方法，其中所述癌症包含表达egfr、egfrviii、cd19、psma、psca、il-13rα2、epha1、her2、间皮素、muc1和muc16中的一种或多种的细胞。可以根据以下另外的编号段落中的任一项定义本文所述的技术的还其他实施方案：1.一种嵌合抗原受体(car)t细胞，所述嵌合抗原受体(car)t细胞包含异源核酸分子，其中所述异源核酸分子包含：(a)编码car的第一多核苷酸，所述car包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及(b)编码治疗剂的第二多核苷酸。2.根据段落1所述的cart细胞，其中所述治疗剂包括抗体试剂。3.根据段落2所述的cart细胞，其中所述抗体试剂包括单链抗体或单结构域抗体。4.根据段落2或3所述的cart细胞，其中所述抗体试剂包括双特异性抗体试剂。5.根据段落4所述的cart细胞，其中所述双特异性抗体试剂包括双特异性t细胞接合器(bite)。6.根据段落3所述的cart细胞，其中所述单结构域抗体包括骆驼科动物抗体。7.根据段落1所述的cart细胞，其中所述治疗剂包括细胞因子。8.根据段落1至7中任一项所述的cart细胞，其中所述car和所述治疗剂以多蛋白形式产生，所述多蛋白被裂解以生成分开的car和治疗剂分子。9.根据段落8所述的cart细胞，其中所述多蛋白在所述car与所述治疗剂之间包含可裂解部分。10.根据段落9所述的cart细胞，其中所述可裂解部分包括2a肽。11.根据段落10所述的cart细胞，其中所述2a肽包括p2a或t2a。12.根据段落1至11中任一项所述的cart细胞，其中所述car和所述治疗剂各自组成型表达。13.根据段落1至12中任一项所述的cart细胞，其中所述car和所述治疗剂的表达由延伸因子-1α(ef1α)启动子驱动。14.根据段落1至11中任一项所述的cart细胞，其中所述治疗剂在诱导型启动子的控制下表达，所述诱导型启动子任选地可通过t细胞受体或car信号传导诱导。15.根据段落14所述的cart细胞，其中所述诱导型启动子包括nfat启动子。16.根据段落1至11中任一项所述的cart细胞，其中所述car在组成型启动子的控制下表达，而所述治疗剂在诱导型启动子的控制下表达，所述诱导型启动子任选地可通过t细胞受体或car信号传导诱导。17.根据段落1至16中任一项所述的cart细胞，其中所述car进一步包含一个或多个共刺激结构域。18.根据段落1至17中任一项所述的cart细胞，其中所述car的所述抗原结合结构域包括抗体、单链抗体、单结构域抗体或配体。19.根据段落1至18中任一项所述的cart细胞，其中所述car的所述跨膜结构域包括cd8铰链/跨膜结构域，其任选地包含seqidno:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72和78中的任一种或其变体的序列。20.根据段落1至19中任一项所述的cart细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包括cd3ζ细胞内信号传导结构域，其任选地包含seqidno:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74和80中的任一种或其变体的序列。21.根据段落1至20中任一项所述的cart细胞，所述cart细胞包含4-1bb共刺激结构域，其任选地包含seqidno:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73和79中的任一种或其变体的序列。22.根据段落1-21中任一项所述的cart细胞，其中所述car抗原结合结构域或所述治疗剂在所述治疗剂包括抗体试剂时结合肿瘤相关抗原。23.根据段落22所述的cart细胞，其中所述car抗原结合结构域或所述治疗剂所结合的所述肿瘤相关抗原是实体瘤相关抗原。24.根据段落22或23所述的cart细胞，其中所述car抗原结合结构域或所述治疗剂所结合的所述肿瘤相关抗原包括表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)、表皮生长因子受体(egfr)、cd19、前列腺特异性膜抗原(psma)或il-13受体α2(il-13rα2)，并且任选地所述car抗原结合结构域或所述治疗剂包含选自seqidno:21、27、33、36、42、45、51、55、57、63、65及其变体的序列。25.根据段落1至21中任一项所述的cart细胞，其中所述car抗原结合结构域或所述治疗剂在所述治疗剂包括抗体试剂时结合treg相关抗原。26.根据段落25所述的cart细胞，其中所述car抗原结合结构域或所述治疗剂所结合的所述treg相关抗原选自糖蛋白a为主的重复序列(garp)、潜伏期相关肽(lap)、cd25和细胞毒性t淋巴细胞相关抗原-4(ctla-4)，并且任选地所述car抗原结合结构域或所述治疗剂包含选自seqidno:3、9、15、25、71、77及其变体的序列。27.一种cart细胞，所述cart细胞包含编码car的多核苷酸，其中所述car包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；并且所述抗原结合结构域结合treg相关抗原。28.根据段落27所述的cart细胞，其中所述treg相关抗原选自garp、lap、cd25和ctla-4。29.根据段落27或28所述的cart细胞，其中所述car进一步包含一个或多个共刺激结构域。30.根据段落27-29中任一项所述的cart细胞，其中所述treg相关抗原是garp。31.根据段落27-30中任一项所述的cart细胞，其中所述car的所述抗原结合结构域包含：(a)重链可变结构域(vh)，其包含三个互补决定区cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其中所述cdr-h1包含氨基酸序列seqidno:81，或seqidno:81的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；所述cdr-h2包含氨基酸序列seqidno:82，或seqidno:82的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；并且所述cdr-h3包含氨基酸序列seqidno:83，或seqidno:83的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列，以及(b)轻链可变结构域(vl)，其包含三个互补决定区cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中所述cdr-l1包含氨基酸序列seqidno:84，或seqidno:84的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；所述cdr-l2包含氨基酸序列seqidno:85，或seqidno:85的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；并且所述cdr-l3包含氨基酸序列seqidno:86，或seqidno:86的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列。32.根据段落31所述的cart细胞，其中所述vh包含氨基酸序列seqidno:87，或与氨基酸序列seqidno:87具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；并且所述vl包含氨基酸序列seqidno:88，或与氨基酸序列seqidno:88具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。33.根据段落31或32所述的cart细胞，其中所述vh在所述vl的n末端。34.根据段落31或32所述的cart细胞，其中所述vl在所述vh的n末端。35.根据段落27至34中任一项所述的cart细胞，其中所述car的所述抗原结合结构域包括scfv或单结构域抗体，其任选地包含选自seqidno:3、9、15、25、71、77及其变体的序列。36.一种cart细胞，所述cart细胞包含异源核酸分子，所述异源核酸分子编码与seqidno:26、seqidno:35、seqidno:44、seqidno:53、seqidno:61、seqidno:19、seqidno:1、seqidno:7、seqidno:13、seqidno:69和seqidno:75中的任一种的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。37.根据段落36所述的cart细胞，其包含异源核酸分子，所述异源核酸分子编码seqidno:26、seqidno:35、seqidno:44、seqidno:53、seqidno:61、seqidno:19、seqidno:1、seqidno:7、seqidno:13、seqidno:69和seqidno:75中的任一种的氨基酸序列。38.一种核酸分子，所述核酸分子编码根据段落1-37中任一项所述的(i)car多肽，或(ii)包含所述car多肽和治疗剂的多蛋白。39.一种多肽，所述多肽包括根据段落1至37中任一项所述的car多肽，或包含所述car多肽和治疗剂的多蛋白。40.一种药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种根据段落1至39中任一项所述的cart细胞、核酸分子、car多肽或多蛋白。41.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者给予包含一种或多种根据段落1至37中任一项所述的cart细胞的药物组合物或根据段落40所述的药物组合物。42.根据段落41所述的方法，其中通过靶向肿瘤微环境，降低了全身性毒性。43.根据段落41或42所述的方法，其中所述癌症的特征在于一种或多种实体瘤的存在。44.根据段落41至43中任一项所述的方法，其中所述癌症的特征在于肿瘤浸润性treg。45.根据段落41至44中任一项所述的方法，其中所述癌症是胶质母细胞瘤。46.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者给予经基因修饰以分泌肿瘤毒性抗体或细胞因子的cart细胞产物，其中通过将所述癌症毒性局部地定向至肿瘤微环境，降低了全身性毒性。47.根据段落46所述的方法，其中所述cart细胞经基因修饰以将针对ctla4、cd25、garp、lap、il15、csf1r或egfr的抗体，或双特异性抗体递送至所述肿瘤微环境。48.根据段落47所述的方法，其中所述双特异性抗体针对egfr和cd3。49.一种向患者的组织或器官递送治疗剂以治疗疾病或病状的方法，所述方法包括向所述患者给予经基因修饰以分泌治疗性抗体、毒素或药剂的cart细胞，其中所述治疗性抗体、毒素或药剂本身将无法进入或穿透所述组织或器官。50.根据段落49所述的方法，其中所述组织或器官是在神经系统中。51.根据段落50所述的方法，其中所述神经系统是中枢神经系统。52.根据段落51所述的方法，其中所述中枢神经系统是脑。53.根据段落49至52中任一项所述的方法，其中所述疾病或病状是胶质母细胞瘤。54.根据段落49-53所述的方法，其中所述治疗性抗体是抗egfr或抗egfrviii。55.一种cart细胞，所述cart细胞包含编码car的多核苷酸，其中所述car包含细胞外garp结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，并且其中所述garp结合结构域包含：(a)重链可变结构域(vh)，其包含三个互补决定区cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其中所述cdr-h1包含氨基酸序列seqidno:81，或seqidno:81的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；所述cdr-h2包含氨基酸序列seqidno:82，或seqidno:82的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；并且所述cdr-h3包含氨基酸序列seqidno:83，或seqidno:83的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列，以及(b)轻链可变结构域(vl)，其包含三个互补决定区cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中所述cdr-l1包含氨基酸序列seqidno:84，或seqidno:84的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；所述cdr-l2包含氨基酸序列seqidno:85，或seqidno:85的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；并且所述cdr-l3包含氨基酸序列seqidno:86，或seqidno:86的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列。56.根据段落55所述的cart细胞，其中所述vh包含氨基酸序列seqidno:87，或与氨基酸序列seqidno:87具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；并且所述vl包含氨基酸序列seqidno:88，或与氨基酸序列seqidno:88具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。57.根据段落55或56所述的cart细胞，其中所述vh在所述vl的n末端。58.根据段落55或56所述的cart细胞，其中所述vl在所述vh的n末端。59.根据段落55-58中任一项所述的cart细胞，其中所述garp结合结构域包含氨基酸序列seqidno:71或77，或与氨基酸序列seqidno:71或77具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。60.根据段落55-59中任一项所述的cart细胞，其中所述car进一步包含一个或多个共刺激结构域。61.根据段落55-60中任一项所述的cart细胞，其中所述car的所述跨膜结构域包括铰链/跨膜结构域。62.根据段落61中任一项所述的cart细胞，其中所述铰链/跨膜结构域包括cd4、cd28、cd7或cd8铰链/跨膜结构域。63.根据段落62所述的cart细胞，其中所述铰链/跨膜结构域包括seqidno:72或78的cd8铰链/跨膜结构域。64.根据段落55-63中任一项所述的cart细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包括tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3θ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b或cd66d的细胞内信号传导结构域。65.根据段落64所述的cart细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包括seqidno:74或80的cd3ζ细胞内信号传导结构域。66.根据段落55-65中任一项所述的cart细胞，其中所述共刺激结构域包括card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、icam、cd83、ox40、4-1bb、cd150、ctla4、lag3、cd270、pd-l2、pd-l1、icos、dap10、lat、nkd2cslp76、trim或zap70的共刺激结构域。67.根据段落66所述的cart细胞，其中所述共刺激结构域包括seqidno:73或79的4-1bb共刺激结构域。68.根据段落55-67中任一项所述的cart细胞，其中所述多核苷酸编码包含与氨基酸序列seqidno:69或75具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的car，或其中所述多核苷酸编码包含与氨基酸序列seqidno:71-74或77-80的组合具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的car。69.根据段落68所述的cart细胞，其中所述多核苷酸编码包含氨基酸序列seqidno:69或75的car，或其中所述多核苷酸编码包含氨基酸序列seqidno:71-74或77-80的组合的car。70.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据段落55-69中任一项所述的cart细胞。71.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括将根据段落55-69中任一项所述的cart细胞或根据段落70所述的药物组合物给予至所述患者。72.根据段落71所述的方法，其中通过靶向肿瘤微环境，降低了全身性毒性。73.根据段落71或72所述的方法，其中所述癌症的特征在于一种或多种实体瘤的存在。74.根据段落71-73中任一项所述的方法，其中所述癌症的特征在于肿瘤浸润性treg。75.根据段落71-74中任一项所述的方法，其中所述癌症是胶质母细胞瘤。76.根据段落1-26中任一项所述的cart细胞，其中所述异源核酸分子进一步包含自杀基因。77.根据段落27-35中任一项所述的cart细胞，其中所述多核苷酸进一步包含自杀基因。78.根据段落36或37所述的cart细胞，其中所述异源核酸分子进一步包含自杀基因。79.根据段落38所述的核酸分子，其进一步包含自杀基因。80.根据段落55-69中任一项所述的cart细胞，其中所述多核苷酸进一步包含自杀基因。81.一种cart细胞，所述cart细胞包含编码car的多核苷酸，其中所述car包含细胞外lap结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，并且其中所述lap结合结构域包含：(a)重链可变结构域(vh)，其包含三个互补决定区cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其中所述cdr-h1包含氨基酸序列seqidno:89，或seqidno:89的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；所述cdr-h2包含氨基酸序列seqidno:90，或seqidno:90的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；并且所述cdr-h3包含氨基酸序列seqidno:91，或seqidno:91的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列，以及(b)轻链可变结构域(vl)，其包含三个互补决定区cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中所述cdr-l1包含氨基酸序列seqidno:92，或seqidno:92的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；所述cdr-l2包含氨基酸序列seqidno:93，或seqidno:93的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列；并且所述cdr-l3包含氨基酸序列seqidno:94，或seqidno:94的具有不超过1、2或3个氨基酸取代的氨基酸序列，并且其中所述car不包含seqidno:7、9、13、15、95和96中的一种或多种，或其中所述car不包含seqidno:9-12或15-18的组合。82.根据段落81所述的cart细胞，其中所述vh不包含seqidno:95，和/或所述vl不包含seqidno:96。83.根据段落81或82所述的cart细胞，其中所述lap结合结构域不包含seqidno:9或15。84.根据段落81-83中任一项所述的cart细胞，其中所述多核苷酸不编码seqidno:7或13的car。85.根据段落81-84中任一项所述的cart细胞，其中所述car不包含seqidno:9-12或15-18的组合的氨基酸序列。86.根据段落81-85中任一项所述的cart细胞，其中所述car进一步包含一个或多个共刺激结构域。87.根据段落81-86中任一项所述的cart细胞，其中所述car的所述跨膜结构域包括铰链/跨膜结构域。88.根据段落87所述的cart细胞，其中所述铰链/跨膜结构域包括cd4、cd28、cd7或cd8铰链/跨膜结构域。89.根据段落81-88中任一项所述的cart细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包括tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3θ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b或cd66d的细胞内信号传导结构域。90.根据段落81-89中任一项所述的cart细胞，其中所述共刺激结构域包括card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、icam、cd83、ox40、4-1bb、cd150、ctla4、lag3、cd270、pd-l2、pd-l1、icos、dap10、lat、nkd2cslp76、trim或zap70的共刺激结构域。91.根据段落81-90中任一项所述的cart细胞，其中所述多核苷酸进一步包含自杀基因。92.一种药物，所述药物包含根据段落81-91中任一项所述的cart细胞。93.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括将根据段落81-91中任一项所述的cart细胞或根据段落92所述的药物组合物给予至所述患者。94.根据段落93所述的方法，其中通过靶向肿瘤微环境，降低了全身性毒性。95.根据段落93或94所述的方法，其中所述癌症的特征在于一种或多种实体瘤的存在。96.根据段落93-95中任一项所述的方法，其中所述癌症的特征在于肿瘤浸润性treg。97.根据段落93-96中任一项所述的方法，其中所述癌症是胶质母细胞瘤。以下权利要求仅意在代表性的，并不限制所公开发明的范围。在至少一方面，我们要求保护：序列表<110>综合医院公司<120>靶向肿瘤微环境的嵌合抗原受体<130>51295-013wo2<150>us62/746,895<151>2018-10-17<150>us62/658,307<151>2018-04-16<150>pct/us18/27783<151>2018-04-16<150>us62/629,593<151>2018-02-12<160>117<170>patentin3.5版<210>1<211>351<212>prt<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>1metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu151015hisalaalaargproaspileglnmetthrglnserproserserleu202530seralaserleuglyaspargvalthrilethrcysglnalasergln354045serilesersertyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnala505560proasnileleuiletyrglyalaserargleulysthrglyvalpro65707580serargpheserglyserglyserglythrserphethrleuthrile859095serglyleuglualagluaspalaglythrtyrtyrcysglnglntyr100105110alaservalprovalthrpheglyglnglythrlysvalgluleulys115120125thrthrthrproalaproargproprothrproalaprothrileala130135140serglnproleuserleuargproglualacysargproalaalagly145150155160glyalavalhisthrargglyleuaspphealacysaspiletyrile165170175trpalaproleualaglythrcysglyvalleuleuleuserleuval180185190ilethrleutyrcyslysargglyarglyslysleuleutyrilephe195200205lysglnprophemetargprovalglnthrthrglnglugluaspgly210215220cyssercysargpheproglugluglugluglyglycysgluleuarg225230235240vallyspheserargseralaaspalaproalatyrglnglnglygln245250255asnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyrasp260265270valleuasplysargargglyargaspproglumetglyglylyspro275280285argarglysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlysasp290295300lysmetalaglualatyrsergluileglymetlysglygluargarg305310315320argglylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathr325330335lysaspthrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg340345350<210>2<211>21<212>prt<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>2metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu151015hisalaalaargpro20<210>3<211>107<212>prt<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>3aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaserleugly151015aspargvalthrilethrcysglnalaserglnserilesersertyr202530leualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproasnileleuile354045tyrglyalaserargleulysthrglyvalproserargphesergly505560serglyserglythrserphethrleuthrileserglyleugluala65707580gluaspalaglythrtyrtyrcysglnglntyralaservalproval859095thrpheglyglnglythrlysvalgluleulys100105<210>4<211>69<212>prt<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>4thrthrthrproalaproargproprothrproalaprothrileala151015serglnproleuserleuargproglualacysargproalaalagly202530glyalavalhisthrargglyleuaspphealacysaspiletyrile354045trpalaproleualaglythrcysglyvalleuleuleuserleuval505560ilethrleutyrcys65<210>5<211>42<212>prt<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>5lysa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