超声神经调节技术的制作方法

本文公开的主题涉及神经调节，并且更具体地涉及利用从能量源施加的能量来调节生理反应的技术。

背景技术：

神经调节已被用于治疗多种临床病情。例如，沿脊髓各个部位的电刺激已用于治疗慢性背痛。此类治疗可以通过可植入装置来执行，该可植入装置定期产生电能，该电能被施加到组织上以激活某些神经纤维，进而可能导致疼痛感降低。在脊髓刺激的情况下，刺激电极通常位于硬膜外腔中，尽管脉冲发生器可以定位成稍微远离电极，例如在腹部或臀区域，但是通过导线连接到电极。在其它实施方式中，深脑刺激可用于刺激大脑的特定区域以治疗运动障碍，并且刺激位置可通过神经成像来引导。此种中枢神经系统刺激通常针对局部神经或脑细胞功能，并由传递电脉冲并位于靶神经处或附近的电极介导。然而，将电极定位在靶神经处或附近具有挑战性。例如，此类技术可能涉及通过外科手术放置传递能量的电极。此外，通过神经调节靶向特定组织具有挑战性。位于特定靶神经处或附近的电极通过触发神经纤维中的动作电位来介导神经调节，进而导致神经递质在神经突触处释放并与下一条神经进行突触通讯。这种传播可能会导致比预期相对更大或更分散的生理效应，因为目前植入电极的实现同时刺激了许多神经或轴突。由于神经通路复杂且相互联系，因此更具针对性的调节作用可能在临床上更有用。

技术实现要素：

下面概括了范围与原始要求保护的主题相对应的某些实施方式。这些实施方式不旨在限制要求保护的主题的范围，而是这些实施方式仅旨在提供可能实施方式的简要概述。实际上，本发明可以涵盖可以与以下阐述的实施方式相似或不同的多种形式。

在一个实施方式中，提供了一种调节系统，其包括被配置为将能量施加到受试者的目标区域的能量施加装置，所述目标区域为包含神经元细胞和相应(respective，各自，各个)的非神经元细胞之间的突触的器官的子区域；和控制器，该控制器被配置为：在空间上选择(spatiallyselect，空间选择，空间地选择)所述目标区域；将所述能量聚焦在所述目标区域(regionofinterest，感兴趣区域)上；和可调节地控制经由所述能量施加装置将能量重复施加到所述目标区域以在预定时间内诱导所述突触的子集的重复优先激活，所述子集位于所述目标区域中，以在重复施加能量后引起一种或多种目标分子的持续变化。

在另一实施方式中，提供了一种调节系统，其包括被配置为将能量施加到受试者的目标区域的能量施加装置，所述目标区域为包含神经元细胞和相应的非神经元细胞之间的突触的器官的子区域；和控制器，该控制器被配置为：在空间上选择所述目标区域；将所述能量聚焦在所述目标区域上；和重复控制经由所述能量施加装置将能量施加到所述目标区域以在预定时间内诱导所述突触的子集的优先激活，所述子集位于所述目标区域内，以在重复施加能量后引起一种或多种目标分子的持续变化。

在另一实施方式中，提供了一种在受试者中治疗糖尿病的系统，包括被配置为将超声波剂量方案(ultrasounddoseregimen)施加到内脏器官的超声波能量施加装置；和适于控制所述超声波能量施加装置施加超声波剂量方案的控制器，其中所述超声波剂量方案包含在该超声波剂量方案的时间窗口内的单独的时间点(separatetimepoint，不同时间点)施加的多个能量剂量。

在另一实施方式中，提供了一种调节系统，包括被配置为将能量施加到受试者的目标区域的能量施加装置，所述目标区域为包含神经元细胞和相应的非神经元细胞之间的突触的器官的子区域；和控制器，该控制器被配置为：在空间上选择所述目标区域；将所述能量聚焦在所述目标区域上；和重复控制经由所述能量施加装置将能量施加到所述目标区域以将低占空比(duty-cycle，频宽比)能量剂量方案施加至所述目标区域，其中低占空比剂量方案包含由至少4小时的可调断开期间间隔开的多个电刺激，其中所述断开期间至少部分地由控制器接收的反馈来确定。

在另一实施方式中，提供了一种治疗患有代谢失调的受试者的方法，包括将超声波剂量方案施加到患有代谢失调的受试者的内脏器官以治疗所述代谢失调，其中所述超声波剂量方案包含在单独的时间点施加的多个超声波能量剂量。

附图说明

当参考附图阅读以下详细描述时，将更好地理解本发明的这些和其它特征、方面和优点，其中，在整个附图中，相同的字符代表相同的部件，其中：

图1是根据本公开实施方式的使用脉冲发生器的神经调节系统的示意图；

图2是根据本公开实施方式的神经调节系统的框图；

图3是根据本公开实施方式的运行中的超声波能量施加装置的示意图；

图4a是根据本公开实施方式的脾脏的超声可视化，其可用作空间信息以聚焦于脾脏中的目标区域；

图4b是根据本公开实施方式的肝脏的超声可视化，其可以用作空间信息以聚焦于肝脏中的目标区域；

图5是根据本公开实施方式的神经调节技术的流程图；

图6是配置为体外装置并包括超声换能器的能量施加装置的示意图；

图7是配置成施加高强度聚焦超声的能量施加装置和脉冲发生器的示意图；

图8是可以与图7的系统结合使用的能量施加装置的示例；

图9是用于达到目标生理结果的超声能量施加用实验设置的示意图；

图10是超声能量施加的实验时间线；

图11显示了施加的超声能量脉冲的脉冲特性；

图12示出了水听器测量设置；

图13显示了x-y平面中超声压力场的示例；

图14显示了lps注射的实验工作流程，用于生成炎症和/或高血糖/高胰岛素血症和超声治疗的模型；

图15a是宽迷走神经刺激的示意图；

图15b是基于靶器官的周围神经调节的示意图；

图16a是向大鼠脾脏施加超声能量的实验时间线；

图16b显示了在向大鼠脾脏施加不同超声能量水平时的脾脏去甲肾上腺素、乙酰胆碱和tnf-α，所施加的超声能量水平显示为超声波压力mpa；

图16c显示了与图16b相同条件下tnf-α的循环浓度；

图16d显示了与图16b相同条件下的脾脏il-1α浓度；

图16e显示了相对于对照，诱导的脾脏tnfα浓度变化的响应时间；

图16f显示了大鼠脾脏的2d超声图像，其用于聚焦超声刺激以在空间上选择脾靶；

图16g显示了一项研究的时间线，该研究设计用于测量刺激对胆碱能抗炎途径激活作用的持续时间；

图16h显示了保护性超声治疗后脾脏tnf-α的浓度；

图16i显示了由脾脏超声调节引起的活化/磷酸化的激酶的浓度；

图16j显示了示例性超声猝发持续时间以及使用替代超声刺激参数对超声刺激的脾脏(lps注射后)中去甲肾上腺素(ne)、乙酰胆碱(ach)和组织坏死因子α(tnf-α)浓度的影响；

图16k显示了示例性超声载波频率以及使用替代超声刺激参数对超声刺激的脾脏(lps注射后)中去甲肾上腺素(ne)、乙酰胆碱(ach)和组织坏死因子α(tnf-α)浓度的影响；

图17a显示了与标准电极或基于植入物的迷走神经刺激(vns)相比，脾脏超声调节对脾脏tnf-α的影响，并且存在多种抑制剂；

图17b显示了在有和没有btx或外科迷走神经切断术作用的情况下超声刺激lps治疗的啮齿动物后，α-金环蛇毒素对(左)去甲肾上腺素(ne)和(右)tnf-α的脾脏浓度的影响；

图17c显示了比较vns(在多种刺激强度和频率下)与脾脏超声刺激(在0.83mpa下)对心率的影响的数据；

图17d显示的数据确认了先前观察到的vns对减轻lps诱导的高血糖的副作用且在使用脾脏超声刺激时没有这种副作用；

图18a是用于聚焦超声刺激的大鼠肝脏的2d超声图像；

图18b显示了肝脏超声刺激对lps诱导的高血糖的影响；

图18c显示了与胰岛素敏感性和肝脏中胰岛素介导的以及非胰岛素依赖的葡萄糖摄取相关的多种分子的相对浓度(与无超声刺激相比)的测量，和与代谢功能有关的下丘脑标志物的变化；

图18d显示了cfos免疫组织化学图像(左)，和示出lps对照和超声刺激的样品中激活的神经元数量的数据(右)；

图18e显示了其它免疫组织化学图像，所述图像显示了lps对照(上)与超声刺激的样品(下)中脑干中的cfos表达；

图18f显示了激活图(超过spgr体积；左)和脑图谱(超过spbr体积；右)之间的示例mri叠加；

图18g显示了下丘脑左右室旁核(pvn)中adc增加的图；

图19显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的循环葡萄糖；

图20显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的循环甘油三酸酯；

图21显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的循环胰高血糖素；

图22显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的循环胰岛素；

图23显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的循环瘦素；

图24显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的循环去甲肾上腺素；

图25显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的下丘脑胰岛素受体底物1(irs-1)；

图26显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的下丘脑磷酸化-akt；

图27显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的下丘脑glut4；

图28显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的下丘脑去甲肾上腺素；

图29显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的下丘脑葡萄糖6-磷酸；

图30显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的下丘脑胰高血糖素样肽(glp-1)；

图31显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的下丘脑γ-氨基丁酸(gaba)；

图32显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的下丘脑脑源性神经营养因子(bdnf)；

图33显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的下丘脑神经肽y(npy)；

图34显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的肝irs-1；

图35显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的肝磷酸化-akt；

图36显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的肝葡萄糖转运蛋白2(glut2)；

图37显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的肝去甲肾上腺素；

图38显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的肝葡萄糖6-磷酸；

图39显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的肝glp-1；

图40显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的胰腺胰高血糖素；

图41显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的胰腺胰岛素；

图42显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的胰腺瘦素；

图43显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的胰腺irs-1；

图44显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的胰腺glut2；

图45显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的胰腺磷酸化-akt；和

图46显示了zucker大鼠模型中治疗后的持续作用。

具体实施方式

下面将描述一个或多个具体实施方式。为了提供对这些实施方式的简洁描述，说明书中并未描述实际实施方式的所有特征。应当理解的是，在任何此类实际实施方式的开发中(如在任何工程或设计项目中)，为了实现开发人员的特定目标，必须做出许多特定于实施方式的决策，例如遵守与系统有关和与业务有关的约束，这可能因不同实施方式而不同。此外，应当理解的是，这种开发工作可能是复杂且耗时的，但是对于受益于本公开的普通技术人员而言，这仍然将是设计、制造和生产的例行工作。

本文给出的任何示例或说明均不得以任何方式视为对其使用任何一个或多个术语的约束、限制或明确限定。相反，这些示例或说明应被视为是针对各种特定实施方式进行描述的，并且仅作为说明性的。本领域的普通技术人员将理解，与这些示例或说明一起使用的任何一个或多个术语，将涵盖可以或可以不与其一起给出或在说明书中其它地方给出的其它实施方式，并且所有此类实施方式均意图包括在该一个或多个术语的范围内。指定此类非限制性示例和说明的语言包括但不限于：“例如(forexample)”，“例如(forinstance)”，“诸如(suchas)”，“例如(e.g.)”，“包括(including)”和“在一个(一种)实施方式中”。

本文提供了基于目标靶区域的直接和集中刺激的神经调节技术。所述目标靶区域可以是体内具有与非神经元细胞或液体形成突触的多种类型的轴突末端的任何组织或结构。在一个例子中，所述目标区域可以在器官或结构中，例如肝脏、胰腺或胃肠组织。目标区域的神经调节允许将能量有限且非烧蚀地施加到目标靶区域而不会使能量施加到所述目标区域之外。能量施加可能会在目标区域之外触发作用，例如在含有目标区域的器官中以及在不含目标区域的其它器官和结构中。然而，在不将能量直接施加到目标区域之外的区域的情况下，可以实现目标区域之外的这些作用。因此，可以通过局部能量施加来实现全身作用。如本文所提供的，全身作用也可以通过间歇和非连续能量施加来实现。此外，可以在施加能量数小时和数天后实现所述作用。

在某些实施方式中，如本文提供的神经调节可以用作治疗慢性病症以改变进展，并且在某些实施方式中，用于逆转慢性病症的影响。在一个实施方式中，被诊断患有疾病的患者可能需要进行神经调节治疗。治疗后，患者可以已达到与健康患者相关的临床基准。例如，糖尿病患者的血糖和/或胰岛素水平可能超出正常范围。治疗后，患者的血糖和/或胰岛素水平可在正常范围内。在另一示例中，免疫反应异常的患者在治疗后可以恢复正常免疫反应的特征，包括改变的免疫细胞群和/或改变的淋巴引流。

对目标靶区域的神经调节可产生持续超过治疗时间的治疗结果。神经调节可改变患者的疾病状态，以达到持久的结果。例如，在定义的时间段内对目标靶区域重复施加能量的治疗可产生疾病症状的持续改善。在一个实施方式中，所述改善是相对于未治疗的患者或接受常规疗法治疗的患者而言的。所述预定时间段可以是数小时或数天的时间窗口，期间进行治疗。此外，所述治疗可包括在预定时间段内的一个或多个单独的能量施加事件。

本文还提供了可用于治疗葡萄糖代谢和相关病症并可改变疾病进展的技术。在一个实施方式中，在一个或多个目标区域的肝脏调节可用于治疗糖尿病(即1型或2型糖尿病)、高血糖、败血症、创伤、感染、糖尿病相关性痴呆、肥胖、或其它饮食或代谢异常。在一个例子中，神经调节可用于促进体重减轻、控制食欲、治疗恶病质或增加食欲。例如，直接胰腺刺激可导致食欲增加，而直接肝脏刺激可导致npy降低，进而促进饱腹感信号。本文提供的神经调节可以相对于治疗前状态改变糖调节设定点，以在治疗后数天、数周和/或数月内获得持久的治疗效果。在一个例子中，糖尿病患者中的神经调节可在治疗窗口(例如数小时或数天)期间使循环葡萄糖相对于基线(在神经调节之前)发生初步降低。但是，在治疗结束后，尽管循环葡萄糖在治疗后的时间内可能增加，但这种增加可稳定在一个新的设定点，该设定点明显低于治疗前的设定点。所述新的设定点可以处于与临床益处相关的水平。

如本文所提供的，本文所提供的神经调节治疗可涉及在预定的治疗时间内重复地且单独地将能量施加到相同的目标区域。例如，可以在目标区域(例如肝门)每天进行一次神经调节，因此该每天一次治疗可以根据预设的调节参数进行，例如连续两天或更多天。

本技术涉及通过能量源施加能量来调节组织中轴突末端的突触。例如，这些可以包括突触前轴突末端和突触后非神经元细胞之间形成的轴突细胞外突触。另外，尽管在轴突细胞外突触的背景下讨论了某些公开的实施方式，但是应该理解，轴突末端可以形成轴突分泌、轴突突触、轴突体或轴突细胞外突触，并且附加地或替代地，如本文所提供的，这些突触类型被预期被选择性地调节。此外，某些轴突末端可能终止于间质液或体液中，它们也可能经历由于调节作用引起的神经递质释放。可以调节所公开的突触以改变突触中的活性，例如从突触前轴突末端释放神经递质。反过来，改变的活性可导致局部效应和/或非局部(例如全身性)效应。本技术允许能量以靶向方式聚焦在包括某些轴突末端的组织体积上，以优先直接激活靶向轴突末端，从而实现期望的结果。以这种方式，在目标区域内的靶向轴突末端被激活，而在某些实施方式中，相同器官或组织结构中但不在目标区域内的轴突末端不被激活。因为器官和组织结构可能包括不同类型的轴突末端，这些轴突末端与不同类型的突触后非神经元细胞形成突触，因此可以选择包括轴突末端的目标区域，当激活所述轴突末端时，可以产生所需的目标生理结果。因此，基于突触前神经元类型、突触后细胞类型或两者，该调节可靶向特定类型的轴突末端。

例如，在一个实施方式中，轴突末端的类型可以是与驻留的(即组织驻留的或非循环的)肝脏、胰腺或胃肠组织细胞形成轴突细胞外突触的轴突末端。也就是说，轴突细胞外突触形成在轴突末端与非神经元细胞或间质液或体液之间的连接处。因此，能量的施加导致目标区域中代谢功能的调节。然而，应该理解的是，基于轴突末端类型的群体以及轴突细胞外突触的突触前神经元类型和突触后细胞(例如免疫细胞、淋巴细胞、粘膜细胞、肌肉细胞等)的特性，可以实现不同的目标生理效应。因此，向受试者的组织中的目标区域施加能量，可以激活目标区域内的轴突末端及其相关的轴突细胞外突触，而目标区域之外的未靶向的轴突末端(以及相关的突触)则可不受影响。但是，由于调节可能导致全身性效应，因此，由于目标区域内轴突末端的激活，目标区域之外的未靶向轴突末端可能经历某些全身性变化。如本文所提供的，优先激活或直接激活可以指目标区域内经历能量直接施加的细胞或结构。也就是说，轴突末端、轴突细胞外突触和/或突触后非神经元细胞或间质液或体液直接经历本文提供的施加的能量。

人类神经系统是神经细胞或神经元的复杂网络，位于大脑和脊髓的中央，并且位于身体各种神经的外围。神经元具有细胞体、树突和轴突。神经是服务于身体特定部位的一组神经元。神经可能含有数百个神经元至数十万个神经元。神经通常同时包含传入和传出神经元。传入神经元向中枢神经系统传递信号，且传出神经元向周围传递信号。一个位置的一组神经元细胞体称为神经节。通过神经元和神经传导在神经(例如通过刺激，这可以是固有的也可以是外部施加的)中产生的电信号。神经元在邻近接收细胞的突触(连接)处释放神经递质，以允许电信号的连续和调节。在外围，突触传递经常发生在神经节。

神经元的电信号称为动作电位。当细胞膜上的电压电位超过某个阈值时，将启动动作电位。然后，该动作电位沿神经元的长度传播。神经的动作电位很复杂，并且代表其中单个神经元的动作电位之和。神经元的轴突末端与接收细胞之间的连接称为突触。动作电位沿着神经元的轴突行进至其轴突末端，即为形成神经纤维的突触前末端或突触末端的轴突神经分支的远端末端。动作电位的电脉冲触发含有神经递质的囊泡迁移到突触前轴突末端的突触前膜，并最终将神经递质释放到突触间隙(例如突触前和突触后细胞之间形成的空间)或轴突细胞外空间中。到达突触末端以将动作电位的电信号转换为神经递质释放的化学信号的突触是化学突触。化学突触可以与电突触形成对比，在电气突触中，流入突触前轴突末端的离子电流可以跨过两个细胞膜的屏障并进入突触后细胞。

动作电位的生理效应是通过离子横跨细胞膜的移动来介导的。神经元通过离子泵主动维持静息膜电位，所述离子泵促进诸如na⁺、k⁺和cl^-等离子通过神经元膜的运动。不同类型的神经元可维持不同的静息电位，例如-75mv至-55mv。通过离子的流入产生动作电位，即电荷移动以在膜电位上产生大偏差，这与跨膜电压暂时升高相关，例如膜电位升高到30-60mv。可以响应于突触前(例如上游)神经元的神经递质释放而启动单个神经元中的动作电位，这又导致突触后细胞上的受体结合以及事件级联，导致离子流入和膜去极化，从而产生通过神经传播的动作电位。

突触可能位于两个神经元之间的连接处，这允许动作电位沿神经纤维传播。但是，轴突末端也可能在神经元和非神经元细胞之间的连接处形成突触，或者可能终止于间质液或体液。突触类型的例子是在神经免疫连接点与免疫细胞的突触、与器官内的驻留感觉细胞的突触、或与腺细胞的突触。神经递质释放到突触间隙中并与突触后细胞的突触后膜中的受体结合导致下游效应，该效应取决于突触前神经元的性质和释放的特定神经递质以及突触后细胞的性质，例如突触后细胞可用受体的类型。另外，动作电位可以是兴奋性的或抑制性的。兴奋性突触后动作电位是使突触后神经元更有可能激发或释放后续动作电位的突触后电位，而抑制性突触后动作电位是使突触后神经元较不可能激发或释放后续动作电位的突触后电位。此外，多个神经元可以协同工作以协同释放神经递质，从而触发下游动作电位或抑制下游动作电位。

神经调节是一种将来自外部能源的能量施加到神经系统某些区域以激活或增强神经或神经功能和/或阻断或降低神经或神经功能的技术。在某些神经调节技术中，在靶神经处或附近应用一个或多个电极，并通过神经携带施加的能量(例如作为动作电位)，以在能量施加部位下游的区域中引起生理反应。但是，由于神经系统很复杂，因此很难预测给定能量施加部位的生理反应的范围和最终终点。

虽然对中枢神经系统(即脑组织)进行超声调节的策略已证明对神经活动的成功调节，但对周围神经进行调节的尝试却滞后了。例如，中枢神经系统(cns)的超声调节涉及刺激大脑皮层区域，该区域富含突触结构，而尝试超声刺激周围神经却靶向了较少或缺乏突触结构的神经干。

在本技术中，外周神经的调节涉及靶向一个或多个外周轴突末端以继而影响血糖水平和/或影响葡萄糖调节途径和/或胰岛素产生途径。在本技术中，将重复的能量脉冲施加至包含轴突末端的受试者的内部组织，所述轴突末端包括轴突细胞外突触或与其它细胞类型、间质液或体液的神经元连接，例如在神经元细胞和非神经元细胞之间的突触处，从而向突触施加能量导致突触前轴突末端的激活和/或突触后细胞的激活，从而导致目标生理结果。在一个例子中，轴突末端的刺激释放神经递质/神经肽，或在邻近的非神经元细胞(例如分泌性细胞或其它细胞)附近诱导改变的神经递质释放，并调节细胞活性。此外，通过这种调节，无需直接刺激就可以实现其它组织结构或器官的调节。在一个实施方式中，直接将能量施加到器官的相对较小区域(例如，体积小于总器官体积的25％)可能会导致刺激投射到大脑不同区域(例如下丘脑)中的传入投射神经元的动作电位。然而，在没有直接大脑刺激富含突触的区域的情况下，就可以实现此结果。直接的大脑刺激可导致其它途径的意外激活，从而可能干扰或淹没所需的生理结果。此外，直接大脑刺激可能涉及侵入性程序。因此，本技术允许以与直接脑刺激或电周围神经刺激相比更具靶向性且更具特异性的方式对脑活动或器官内活动进行粒状激活。

本技术的益处包括在组织的目标区域处的局部调节，以实现改变一种或多种目标分子的浓度的效果。此外，所述局部调节可涉及直接激活组织的相对较小区域(例如小于总组织体积的25％)以实现这些效果。以这种方式，总施加的能量相对较小，以实现所需的生理结果。在某些实施方式中，施加的能量可能来自非侵入性体外能量源(例如超声能量源、机械振动器)。例如，聚焦的能量探头可以通过受试者的皮肤施加能量，并聚焦在内部组织的目标区域上。此类实施方式在没有侵入性程序或没有可能与其它类型的程序或疗法相关的副作用的情况下实现了所需的生理结果。

本文提供了用于神经调节的技术，其中将来自能量源(例如外部或体外能量源)的能量施加到轴突末端，其施加方式是使得能量施加的焦点部位(例如轴突末端)处的神经递质释放是响应于该能量施加而不是响应于动作电位而触发的。即，直接向轴突末端施加能量代替了动作电位，以促进神经递质释放到与非神经元细胞的神经元连接处(即突触)。将能量直接施加到轴突末端进一步诱导神经递质从突触内的轴突末端(例如轴突细胞外突触)释放到邻近的非神经细胞附近。在一个实施方式中，能量源是体外能量源，诸如超声能量源或机械振动器。以这种方式，可以直接在能量聚焦部位实现非侵入性且靶向性的神经调节，而不是通过在上游部位的调节来实现，在上游部位的调节反过来会触发激活下游靶标的动作电位。

在某些实施方式中，靶组织是难以使用电刺激技术接近的内部组织或器官。预期的组织靶包括胃肠(gi)组织(胃、肠)、肌肉组织(心脏、平滑和骨骼)、上皮组织(表皮、器官/gi衬里)、结缔组织、腺组织(外分泌/内分泌)等。在一个例子中，在神经肌肉连接处聚焦施加能量可促进神经肌肉连接处的神经递质释放，而无上游动作电位。预期的调节靶可以包括负责控制胰岛素释放的胰腺部分或负责葡萄糖调节的肝脏部分。

对目标靶区域的神经调节可能会改变生理过程，从而中断、减少或增强受试者中的一种或多种生理途径，从而产生所需的生理结果。此外，因为局部能量施加可能导致全身性变化，因此可以以不同的方式并且在体内的不同位置改变不同的生理途径，以引起由特定受试者的靶向神经调节引起的和其特征性的受试者中生理变化的总体特征概况。虽然这些变化较复杂，但本神经调节技术提供了一种或多种可测量的靶向生理结果，其对于受治疗的受试者而言，是神经调节的结果，并且其在未将能量施加到目标靶区域或无其它干预措施的情况下是不能获得的。另外，虽然其它类型的干预措施(例如药物治疗)可能会产生由神经调节引起的生理变化的子集，在某些实施方式中，由于神经调节而诱导的生理变化的概况可能是目标靶区域的神经调节(及其相关的调节参数)所特有的，并且可能因患者而异。

本文讨论的神经调节技术可用于引起目标分子的浓度变化(例如增加、降低)和/或目标分子的特性变化的生理结果。也就是说，选择性调节一种或多种目标分子(例如第一目标分子、第二目标分子等)可以是指由于将能量施加到一种或多种组织(例如第一组织、第二组织等)中的一个或多个目标区域(例如第一目标区域、第二目标区域等)而调节或影响分子的浓度(循环、组织)或特性(共价修饰)。目标分子的调节可以包括分子特性的改变(诸如蛋白质的表达、分泌、转运)，以及直接活性改变，其基于源自能量施加本身的或由于直接影响离子通道的分子而导致的离子通道效应。目标分子的调节还可以指维持分子的期望浓度，使得不会由于神经调节而发生预期的浓度变化或浓度波动。目标分子的调节可以是指引起分子特性的变化，例如酶介导的共价修饰(磷酸化、乙酰化、核糖基化等的变化)。也就是说，应当理解的是，目标分子的选择性调节可以指分子浓度和/或分子特性。所述目标分子可以是生物分子，诸如糖类(单糖、多糖)、脂质、核酸(dna、rna)或蛋白质中的一种或多种。在某些实施方式中，所述目标分子可以是信号分子，诸如激素(胺激素、肽激素或类固醇激素)。

所公开的神经调节技术可以与神经调节系统结合使用。图1是系统10的示意图，其用于响应于能量施加而进行神经调节，以实现神经递质释放和/或激活突触的成分(例如突触前细胞、突触后细胞)。所描绘的系统包括耦接到能量施加装置12(例如超声换能器)的脉冲发生器14。能量施加装置12被配置为例如经由引线或无线连接接收能量脉冲，该能量脉冲在使用中被定向到受试者的内部组织或器官的目标区域，这继而导致目标生理结果。在某些实施方式中，脉冲发生器14和/或能量施加装置12可以被植入在生物相容性部位(例如腹部)，并且一根或多根引线在内部将能量施加装置12和脉冲发生器14耦接。例如，能量施加装置12可以是mems换能器，例如电容微机械超声换能器。

在某些实施方式中，能量施加装置12和/或脉冲发生器14可以例如与控制器16无线通信，该控制器16又可以向脉冲发生器14提供指令。在其它实施方式中，脉冲发生器14可以是体外设备，例如，可以操作以从受试者身体外部的位置经皮或以非侵入性方式施加能量，并且在某些实施方式中，可以被集成在控制器16内。在其中脉冲发生器14是体外的实施方式中，能量施加装置12可以由看护者操作并且定位在受试者的皮肤上或上方的点处，使得能量脉冲经皮传递到期望的内部组织。一旦定位成将能量脉冲施加到期望的部位，系统10就可以启动神经调节以实现目标生理结果或临床效应。

在某些实施方式中，系统10可以包括评估装置20，该评估装置20耦接到控制器16并且评估指示是否已经实现了调节的目标生理结果的特性。在一个实施方式中，目标生理结果可以是局部的。例如，调节可以导致局部组织或功能改变，诸如组织结构改变、某些分子浓度的局部改变、组织移位、流体运动增加等。

调节可导致全身性或非局部性变化，并且目标生理结果可能与循环分子浓度的变化或组织特性的变化相关，该组织不包括被直接施加能量的目标区域。在一个例子中，所述位移可以是期望调节的代理测量，并且低于预期位移值的位移测量可导致调节参数的修改，直到引起预期位移值为止。因此，在一些实施方式中，评估装置20可以被配置为评估浓度变化。在一些实施方式中，评估装置20可以是被配置为评估器官大小和/或位置的变化的成像装置。尽管分开示出了系统10的所描绘的元件，但应当理解的是，一些或所有元件可以彼此组合。此外，一些或所有元件可以以有线或无线方式彼此通信。

基于所述评估，可以改变控制器16的调节参数。例如，如果所需的调节与在定义的时间窗口(例如能量施加程序开始后的5分钟、30分钟)或相对于程序开始时的基线的浓度(一种或多种分子的循环浓度或组织浓度)的变化相关联，则可以期望改变调节参数，诸如脉冲频率或其它参数，其又可以由操作员或通过自动反馈回路提供给控制器16，以定义或调整脉冲发生器14的能量施加参数或调节参数。

如本文提供的系统10可以根据各种调节参数提供能量脉冲。例如，调节参数可以包括从连续到间歇的各种刺激时间模式。通过间歇性刺激，在信号接通时间内以一定频率在一段时间内传递能量。信号接通时间之后是没有能量递送的一段时间，称为信号断开时间。调节参数还可以包括刺激施加的频率和持续时间。施加频率可以是连续的，也可以在例如一天或一周内的各种时间段递送。治疗持续时间可以持续各种时间期间，包括但不限于几分钟到几小时。在某些实施方式中，具有指定刺激模式的治疗持续时间可以持续一小时，以例如72小时为间隔重复。在某些实施方式中，可以较高的频率(例如每三个小时)进行一次较短持续时间(例如30分钟)的治疗。可以根据调节参数(诸如治疗持续时间和频率)来调节控制能量的施加，以实现所需的结果。

图2是系统10的某些组件的框图。如本文提供的，用于神经调节的系统10可以包括脉冲发生器14，该脉冲发生器14适于产生多个能量脉冲以施加到受试者的组织上。脉冲发生器14可以是独立的，或者可以集成到外部装置中，诸如控制器16。控制器16包括用于控制所述装置的处理器30。软件代码或指令存储在控制器16的存储器32中，以供处理器30执行以控制所述装置的各组件。控制器16和/或脉冲发生器14可以经由一根或多根引线33或无线地连接至能量施加装置12。

控制器16还包括具有输入/输出电路34和显示器36的用户界面，其适于允许临床医生向调节程序提供选择输入或调节参数。每个调节程序可包括一组或多组调节参数，包括脉冲幅度、脉冲宽度、脉冲频率等。脉冲发生器14响应于来自控制器装置16的控制信号来修改其内部参数，以改变通过引线33传输到应用能量施加装置12的受试者的能量脉冲的刺激特性。可以采用任何合适类型的脉冲发生电路，包括但不限于恒定电流、恒定电压、多独立电流或电压源等。施加的能量是电流幅度和脉冲宽度持续时间的函数。控制器16允许通过在特定时间改变调节参数和/或启动能量施加或在特定时间取消/抑制能量施加来可调地控制能量。在一个实施方式中，能量施加装置的可调控制是基于有关受试者中一种或多种分子(例如循环分子)浓度的信息。如果该信息来自评估装置20，则反馈回路可以驱动可调控制。例如，如果由评估装置20测量的循环葡萄糖浓度高于预定阈值或范围，控制器16可以启动向目标区域(例如肝脏)的能量施加或以与减少循环葡萄糖的调节参数启动能量施加。可以通过漂移到预定(例如期望)阈值以上或预定范围之外的葡萄糖浓度来触发能量施加的启动。在另一个实施方式中，可调控制可以是如下形式：当能量的初始施加未在预定时间框架(例如1小时、2小时、4小时、1天)内导致目标生理结果(例如目标分子的浓度)内的预期变化时，改变调节参数。

在一个实施方式中，存储器32存储操作员可选择的不同操作模式。例如，存储的操作模式可以包括用于执行与特定治疗部位(例如肝脏、胰腺、胃肠道、脾脏中的目标区域)相关的一组调节参数的指令。不同的部位可以具有不同的关联调节参数。代替使操作员手动输入模式，控制器16可以被配置为基于选择来执行适当的指令。在另一实施方式中，存储器32存储用于不同类型的治疗的操作模式。例如，激活可以与相对于压制或阻断组织功能的相关性刺激压力或频率范围不同的刺激压力或频率范围有关。在具体的示例中，当能量施加装置是超声换能器时，时间平均功率(时间平均强度)和峰值正压为1mw/cm²–30,000mw/cm²(时间平均强度)和0.1mpa至7mpa(峰值压力)。在一个例子中，时间平均强度在目标区域内小于35w/cm²，以避免与热损伤和烧蚀/空化有关的水平。在另一具体示例中，当能量施加装置为机械致动器时，振动幅度在0.1至10mm的范围内。所选择的频率可以取决于能量施加的模式，例如超声或机械致动器。

在另一实施方式中，存储器32存储校准或设置模式，其允许调整或修改调节参数以获得期望的结果。在一个例子中，刺激从较低的能量参数开始，并且自动地或在收到操作员的输入后逐步增加。以这种方式，操作员可以在改变调节参数时实现对诱导效应的调谐。

该系统还可以包括成像装置，其有助于聚焦能量施加装置12。在一个实施方式中，成像装置可以与能量施加装置12集成在一起或与之相同，从而可以应用不同的超声参数(频率、孔径或能量)来选择(例如空间选择)目标区域并将能量聚焦到选定的目标区域以靶向和随后的神经调节。在另一实施方式中，存储器32存储用于空间上选择器官或组织结构内的目标区域的一种或多种靶向或聚焦模式。空间选择可以包括选择器官的子区域以识别对应于目标区域的器官的体积。空间选择可以依赖于本文提供的图像数据。基于空间选择，能量施加装置12可以聚焦在与目标区域相对应的所选体积上。例如，能量施加装置12可以被配置成首先以靶向模式操作以施加靶向模式能量，该靶向模式能量用于捕获要用于识别目标区域的图像数据。靶向模式能量未达到和/或未应用适合优先激活的调节参数。然而，一旦识别出目标区域，则控制器16可根据与优先激活相关联的调节参数以治疗模式操作。

控制器16还可被配置为接收与目标生理结果有关的输入作为对调节参数的选择的输入。例如，当成像模式用于评估组织特性时，控制器16可以被配置为接收计算出的所述特性的指数或参数。基于所述指数或参数是高于还是低于预定阈值，可以修改调节参数。在一个实施方式中，该参数可以是受影响组织的组织位移的量度或受影响组织的深度的量度。其它参数可包括评估一种或多种目标分子的浓度(例如，评估浓度相对于阈值或基线/对照的变化、变化率、确定浓度是否在所需范围内中的一个或多个)。另外，能量施加装置12(例如超声换能器)可以在控制器16的控制下操作，以a)获取可用于在空间上选择靶组织内目标区域的组织的图像数据，b)将调节能量施加于所述目标区域和c)获取图像以确定已发生目标生理结果(例如通过位移测量)。在此种实施方式中，成像装置、评估装置20和能量施加装置12可以是同一装置。

在另一实施方式中，所需的调节参数集也可以由控制器16存储。以这种方式，可以确定受试者特异性参数。此外，可以随着时间的推移评估此类参数的有效性。如果特定的参数集随着时间的推移效果较差，则受试者可能发展对激活的途径不敏感。如果系统10包括评估装置20，则评估装置20可以向控制器16提供反馈。在某些实施方式中，可以从用户或评估装置20接收指示目标生理结果的特征的反馈。控制器16可以被配置为使能量施加装置根据调节参数施加能量并且基于反馈来动态地调整调节参数。例如，基于反馈，处理器16可以实时地并且响应于来自评估装置20的反馈而自动地改变调节参数(例如超声束或机械振动的频率、幅度或脉冲宽度)。

在一个例子中，本技术可用于治疗患有代谢异常的受试者。本技术还可以用于在患有葡萄糖调节异常的受试者中调节血糖水平。因此，本技术可用于促进目标分子的内稳态或促进一种或多种目标分子(例如葡萄糖、胰岛素、胰高血糖素或其组合)的所需循环浓度或浓度范围。在一个实施方式中，本技术可用于控制循环(即血液)葡萄糖水平。在一个实施方式中，以下阈值可用于将血糖水平维持在正常范围内的动态平衡中：

禁食：

低于50mg/dl(2.8mmol/l)：胰岛素休克

50-70mg/dl(2.8-3.9mmol/l)：低血糖/低血糖症

70-110mg/dl(3.9-6.1mmol/l)：正常

110-125mg/dl(6.1-6.9mmol/l)：升高/受损(糖尿病前期)

125(7mmol/l)：糖尿病

非禁食(餐后约2小时)：

70-140mg/dl：正常

140-199mg/dl(8-11mmol/l)：升高的或“边界线”/糖尿病前期

高于200mg/dl：(11mmol/l)：糖尿病

例如，所述技术可用于将循环葡萄糖浓度维持在约200mg/dl之下和/或在约70mg/dl之上。所述技术可用于将葡萄糖维持在约4-8mmol/l或约70-150mg/dl的范围内。所述技术可用于维持受试者(例如患者)的正常血糖范围，其中正常血糖范围可以是基于患者个体因素(诸如体重、年龄、临床病史)的个体化范围。因此，可以基于目标分子的所需最终浓度实时调整对一个或多个目标区域的能量施加，并且可以基于来自评估装置20的输入在反馈回路中调整对一个或多个目标区域的能量施加。例如，如果评估装置20是循环葡萄糖监测器或血糖监测器，则实时葡萄糖测量值可以用作控制器16的输入。

在另一实施方式中，本技术可用于诱导生理变化的特征概况。例如，所述特征概况可以包括由于能量施加而在组织和/或血液中浓度增加的一组目标分子以及由于能量施加而在组织和/或备注中浓度降低的另一组目标分子。所述特征概况可以包含不因能量施加而改变的一组分子。所述特征概况可以定义与期望的生理结果相关的并发变化。例如，该概况可以包括循环葡萄糖降低和循环胰岛素增加。

图3是一个具体示例，其中能量施加装置12包括能够将能量施加到靶组织43的超声换能器42，作为非限制性示例，该靶组织43被示出为肝脏。能量施加装置12可以包括用于控制超声换能器42的控制电路。处理器30的控制电路可以与能量施加装置12集成在一起(例如通过集成控制器16)，或者可以是单独的组件。超声换能器42还可被配置为获取图像数据以辅助空间选择所需或靶目标区域并将施加的能量聚焦在靶组织或结构的目标区域上。

期望的靶组织43可以是内部组织或器官，其包括轴突末端46和非神经元细胞48的突触。可以通过将能量直接施加到聚焦在靶组织43的目标区域44上的超声换能器42的聚焦区域内的轴突末端来刺激突触，以使分子释放到突触空间49中。在所描述的实施方式中，轴突末端46与肝细胞形成突触，神经递质47的释放和/或离子通道活性的变化又引起下游效应，诸如激活葡萄糖代谢。可以选择目标区域以包括某种类型的轴突末端46，诸如特定神经元类型的轴突末端46和/或与某种类型的非神经元细胞形成突触的轴突末端46。因此，可以选择目标区域44以对应于具有期望的轴突末端46(和相关的非神经元细胞48)的靶组织43的一部分。可以选择能量施加，以优先触发一种或多种分子(例如神经递质)从突触中的神经释放，或通过直接能量转导(即非神经元细胞内的机械转导或电压激活蛋白)直接激活非神经元细胞本身，或引起神经细胞和非神经元细胞内的激活，从而引起所需的生理效应。可以将目标区域选择为神经进入器官的部位。在一个实施方式中，肝刺激或调节可指肝门处或附近的目标区域44的调节。

能量可以聚焦或基本上集中在目标区域44上并且仅聚集于内部组织43的一部分，例如小于组织43总体积的约50％、25％、10％或5％。在一个实施方式中，可以将能量施加到靶组织43中的两个或更多个目标区域44，并且所述两个或更多个目标区域44的总体积小于组织43总体积的约90％、50％、25％、10％或5％。在一个实施方式中，能量仅施加至组织43总体积的约1％-50％，仅施加至组织43总体积的约1％-25％，仅施加至组织43总体积的约1％-10％，或仅施加至组织43总体积的约1％-5％。在某些实施方式中，只有靶组织43的目标区域44中的轴突末端46将直接接收所施加的能量并释放神经递质，而在目标区域44外部的未受刺激的轴突末端不接收大量能量并因此没有以相同的方式被激活/刺激。在一些实施方式中，在直接接收能量的组织部分中的轴突末端46将诱导改变的神经递质释放。以这种方式，可以以粒状方式靶向组织子区域以进行神经调节，例如可以选择一个或多个子区域。在一些实施方式中，可以选择能量施加参数，以诱导直接接收能量的组织内部中神经或非神经元成分的优先激活，从而诱导所需的组合生理效应。在某些实施方式中，可以将能量聚焦或集中在低于约25mm³的体积内。在某些实施方式中，可以将能量聚焦或集中在约0.5mm³-50mm³的体积内。能量施加装置12的尺寸/配置可影响用于在目标区域44内聚焦或集中能量的焦体积和焦深度。能量施加的焦体积可以由能量施加装置12的焦点场限定。

如本文所提供的，能量可以基本上仅施加到一个或多个目标区域44上，以靶向的方式优先激活突触以实现目标生理结果，而基本上没有以一般或非特异性的方式施加在整个组织43上。因此，组织43中仅多个不同类型的轴突末端46的子集暴露于直接能量施加。图4是脾脏中的血流图像(通过多普勒超声获得)，可以用作空间信息以在空间上选择靶向器官的目标区域。例如，可以在空间上选择含有血管、神经或其它解剖标志的器官内的目标区域，并将其用于识别具有特定轴突末端和突触的区域。在一个实施方式中，通过识别脾动脉并在空间上选择靠近或平行于脾动脉的区域来选择目标区域。可以基于子器官组织功能、血管和神经支配来细分器官结构，并且可以选择轴突末端的子集以包括在直接施加能量的目标区域中。其它轴突末端可不在目标区域内，并且可以不暴露于直接施加的能量下。可以基于包括但不限于历史或实验数据(例如显示特定位置与期望或目标生理结果相关联的数据)的因素，来选择要包括在目标区域中的单个或多个轴突末端。在另一实施方式中，轴突末端及其邻近组织或结构的位置可用于从轴突末端的总集合中选择单个轴突末端以进行优先激活。替代地或附加地，系统10可以将能量施加到各个轴突末端，直到实现期望的目标生理效应为止。应当理解的是，脾脏图像仅作为示例。所公开的使用可视化神经的空间信息选择轴突末端以通过将能量直接施加到目标区域以优先激活，可以与其它器官或结构(例如肝脏、胰腺、胃肠组织)结合使用。

所公开的技术可以用于神经调节效应的评估，其继而可以用作选择或修改神经调节参数的输入或反馈。所公开的技术可以使用组织状况或功能的直接评估作为目标生理结果。该评估可以在神经调节之前(即基线评估)、期间和/或之后进行。

评估技术可以包括功能磁共振成像、扩散张量磁共振成像、正发射断层扫描或声学监测、热监测中的至少一种。评估技术还可以包括蛋白质和/或标志物浓度评估。系统可以接收来自评估技术的图像以进行自动或手动评估。基于图像数据，还可以修改调节参数。例如，器官尺寸或位移的变化可用作局部神经递质浓度的标志物，和用作局部细胞暴露于表型调节神经递质的替代标志物，并有效地用作预测对葡萄糖代谢途径影响的标志物。局部浓度可以指能量施加的焦点场内的浓度。

附加地或替代地，系统可以评估组织中的一种或多种分子或血液中循环的一种或多种分子的存在或浓度。组织中的浓度可以称为局部浓度或驻留浓度。可以通过细针抽吸术获取组织，并且可以通过本领域普通技术人员已知的任何合适技术来进行目标分子(例如代谢分子、代谢途径的标志物、肽递质、儿茶酚胺)的存在或水平的评估。

在其它实施方式中，目标生理结果可包括但不限于组织移位、组织大小变化、一种或多种分子的浓度变化(局部、非局部或循环浓度)、基因或标志物表达、传入活性和细胞迁移等方面的变化。例如，能量施加到组织可能会导致组织移位(例如肝脏移位)。通过评估组织位移(例如通过成像)，可以估计其它效应。例如，一定的位移可能是分子浓度的特定变化的特征。在一个例子中，根据经验数据，5％的肝脏移位可能指示循环葡萄糖浓度的期望降低或与之相关联。在另一例子中，可以通过将参考图像数据(向组织施加能量之前的组织图像)与治疗后图像数据(向组织施加能量之后获取的组织图像)进行比较，以确定位移参数，从而确定组织的位移。所述参数可以是组织的最大或平均位移值。如果位移参数大于阈值位移，则能量的施加可被评估为可能导致所需的目标生理结果。

图5是用于刺激靶组织的目的区域的方法50的流程图。在方法50中，在空间上选择目标区域52。在步骤54，将能量施加装置定位以便能量脉冲聚焦在所需的目标区域上，并且在步骤56，脉冲发生器向靶组织的目标区域施加多个能量脉冲，以优先激活靶组织中突触的子集，例如刺激轴突末端释放神经递质和/或诱导改变的神经递质释放和/或在非神经元细胞(在突触内)诱导改变的活性，从而在步骤58产生如本文所提供的目标生理结果。在某些实施方式中，该方法可以包括评估刺激效果的步骤。例如，可以使用组织功能或状况的状态的一种或多种直接或间接评估。基于所评估的组织功能，可以修改(例如动态地或可调整地控制)一个或多个能量脉冲的调节参数，以实现目标生理结果。

在一个实施方式中，可以在施加能量脉冲之前和之后进行评估，以评估由于调节导致的葡萄糖浓度变化。如果葡萄糖浓度高于或低于阈值，则可以对调节参数进行适当的修改。例如，如果葡萄糖浓度具有所需的生理结果，则在神经调节过程中施加的能量可能会退回到支持所需结果的最低水平。如果所述特性相对于阈值的变化与葡萄糖浓度的变化不足有关，则可以改变某些调节参数，包括但不限于调节幅度或频率、脉冲形状、刺激模式和/或刺激位置。

另外，所评估的特征或状况可以是值或指数，例如流速、浓度、细胞群体或其任意组合，这又可以通过合适的技术进行分析。例如，超过阈值的相对变化可以用于确定调节参数是否被修改。可以通过测量的临床结果来评估期望的调节，例如存在或不存在组织结构尺寸增加(例如淋巴结大小)或一种或多种释放分子的浓度变化(例如相对于神经调节之前的基线浓度)。在一个实施方式中，所需的调节可能涉及浓度增加到超过阈值，例如相对于基线浓度增加超过约50％、100％、200％、400％、1000％。对于阻断治疗，评估可能涉及追踪分子浓度随时间的降低，例如目标分子降低至少10％、20％、30％、50％或75％。另外，对于某些受试者，所需的阻断治疗可能涉及在可能倾向于增加分子浓度的其它临床事件的背景下保持相对稳定的特定分子浓度。也就是说，所需的阻断可能会阻断潜在的增加。可以在从治疗开始的特定时间窗内，例如在约5分钟内、约30分钟内，测量增加或减少或其它诱导的和可测量的效果。在某些实施方式中，如果确定需要神经调节，则神经调节的变化是停止施加能量脉冲的指令。在另一实施方式中，如果不需要神经调节，则改变神经调节的一个或多个参数。例如，调节参数的变化可以是脉冲重复频率的增加，诸如频率逐步增加10-100hz并且评估所需的特性，直到实现所需的神经调节。在其它实施方式中，可以改变脉冲宽度。在其它实施方式中，可以同时、并行或串联更变改两个或多个参数。如果在多个参数改变后不希望进行神经调节，则可以改变能量施加的焦点(即部位)。

能量施加装置12可以被配置为体外非侵入性装置或内部装置，例如微创装置。如上所述，能量施加装置12可以是体外非侵入性超声换能器或机械致动器。例如，图6示出了被配置为包括超声换能器74的手持超声探头的能量施加装置12的实施方式。然而，应当理解的是，还考虑了其它非侵入性实施方式，包括将超声换能器探头配置、粘附或放置在解剖靶上的其它方法。此外，除了手持式配置之外，能量施加装置12可以包括响应于控制器16的指令的转向机构。该转向机构可以将能量施加装置12定向或引导向靶组织43(或结构)，然后控制器16可以将能量施加聚焦在目标区域44上。

实施例

图7是系统10的框图，该系统10包括被配置为施加高强度聚焦超声(hifu)的能量施加装置12和脉冲发生器14。在一个实施方式中，系统10包括例如包括函数发生器80、功率放大器82和匹配网络84的脉冲发生器。在一个如本文所提供的用于产生实验结果的实施方式中，脉冲发生器包括一个1.1mhz高强度聚焦超声(hifu)换能器(sonicconceptsh106)、匹配网络(例如sonicconcepts)、rf功率放大器(eni350l)和函数发生器(agilent33120a)。在所示的示例中，70-mm直径的hifu换能器具有一个球面，该球面的曲率半径为65mm，中间有一个20-mm直径的孔，可将成像换能器插入该孔中。换能器的焦深度为65mm。数值模拟的压力曲线在半振幅处的全宽度横向为1.8mm且深度方向为12mm。hifu换能器12通过填充有脱气水的6cm高的塑料锥体与动物受试者耦合。图8是可以与图7的系统10结合使用的能量施加装置，其包括布置在单个能量施加装置12中的hifu换能器74a和成像超声换能器74b，如本文所提供的，其可以例如通过控制器16来控制以施加能量并成像靶组织。

图9示出了用于执行如本文所提供的某些脾脏调节实验的实验设置。尽管所描绘的实施方式示出了脾脏靶组织43，但应当理解的是，实验设置的某些要素在不同的靶组织43之间可以是共同的。例如，能量施加装置12可以根据控制器16设置的参数进行操作，以将能量施加到靶组织43中的目标区域。如本文所讨论的，靶组织可以是脾脏、肝脏、胰腺、胃肠组织等。虽然所描绘的实验设置被设出为带有40wrf放大器，但这仅是举例，可以使用其它放大器(例如线性放大器)。在某些设置中，将大鼠头插入鸟笼线圈中。

图10示出了用于执行本文所提供的某些调节实验的超声能量施加的实验时间线。在所描绘的实施方式中，在脂多糖注射之前和之后，超声波施加进行了1分钟。脂多糖(lps)是细菌膜分子，可引起强烈的免疫或炎症反应。将来自大肠杆菌0111:b4(sigma–aldrich)的lps用于在幼稚成年spraguedawley(sd)大鼠中产生明显的炎症和代谢功能异常状态(例如高血糖和胰岛素耐性)。通过腹膜内(ip)注射将lps施用于动物(10mg/kg)，导致tnf、循环葡萄糖和胰岛素浓度显著升高；这些浓度在4小时内达到峰值，但与对照相比在注射后长达8小时内仍保持升高。超声处理后的一段时间内处死动物以进行器官采集和加工。尽管以示例的方式示出的时间段是1小时，但是应当理解，在其它实施方式中，评估诱导变化的时间段可以是可变的。

函数发生器80产生脉冲正弦波形，如图11所示。该脉冲正弦波形由rf功率放大器放大，并发送到hifu换能器的匹配网络。在动物实验中可以调整三个超声参数：脉冲幅度，脉冲长度和脉冲重复频率。脉冲幅度范围为0.5v峰值至62v峰值。使用三种脉冲长度：18.2us，136.4us和363.6us。在一个实施方式中，脉冲重复频率(1/t)为2khz。处理时间为1分钟。超声调节参数是示例性的。在一个实施方式中，以具有在约0.1mhz至约5mhz范围内的超声换能器频率的超声刺激提供调节，并且所述超声刺激具有在约0.1hz至约10khz范围内的超声频率脉冲重复频率。超声能量的每个脉冲的超声循环可以在约1至约1000的范围内。在一个实施方式中，脉冲中心频率为1.1mhz，脉冲重复周期为0.5ms(对应于2000hz的脉冲重复频率)；改变脉冲幅度和脉冲长度。表1总结了hifu超声参数。

使用ondacorp.制造的hifu水听器(hna-0400)在脱气水中进行压力测量。hifu换能器是由100周期正弦波形驱动。通过焦斑扫描水听器，该焦斑在x-y平面上的网格大小为0.1mm，且沿z轴的步长为0.2mm。图12显示了水听器的设置，且图13a显示了扫描结果。将峰值正(负)压定义为换能器焦点在x-y平面上的最大正(负)压。输入电压足够低，以消除非线性影响。因此，峰值正压力值与峰值负压力值相同。为了估计满工作电压下的峰值压力，在发生空化并进行曲线拟合之前，在多种不同驱动电压下测量了峰值压力。计算的峰值压力示于表1。

器官特异性神经调节的超声靶向

在神经调节开始之前，使用gevivide9超声系统和11l探头进行超声扫描。在动物皮肤上标记出目标区域。将hifu换能器放置于标记的区域上。还使用较小的成像探头(3s)进行了另一次超声扫描，该探头位于hifu换能器的开口中。3s探头的成像光束与hifu光束对准。因此，可以使用靶器官的图像(在超声扫描仪上可视化)来确认hifu光束已靶向目标区域。

动物协议

在进行实验之前，将8至12周龄成年雄性sprague–dawley大鼠(250–300g；charlesriverlaboratories)在25℃下以12-h明/暗周期饲养并适应1周。可随意喝水和吃普通啮齿动物食物。将8周龄肥胖的zucker大鼠(charlesriverlaboratories)在25℃下以12-h明/暗周期饲养并且根据供应商维持的条件进食高热量饮食(purina#5008)，以促进胰岛素耐性和高血糖症的发展。可随意喝水和吃普通啮齿动物食物。

将内毒素(来自大肠杆菌的lps，0111:b4；sigma–aldrich)用于在幼稚成年spraguedawley大鼠中产生明显的炎症和代谢功能异常状态(例如高血糖和高胰岛素血症)。通过腹膜内(ip)注射向动物施用lps(10mg/kg；rosa-ballinaspnas,2008)，导致tnf、循环葡萄糖和循环胰岛素浓度显著升高，其在4小时峰值达到，但与对照组相比，在注射后长达8小时仍然升高。在60分别后(用于功率研究)以及在lps施用后的第30、60、120、240或480分钟(用于持续时间和动力学研究)采集脾脏、肝脏、下丘脑、海马和血液样品。将脾脏和肝脏样品在pbs溶液中匀浆，该pbs溶液含有磷酸酶(0.2mm苯甲基磺酰氟，5ug/ml抑肽酶，1mm苄脒，1mm原钒酸钠和2um斑蝥素)和蛋白酶(根据rochediagnostics，1ul至20mg组织)抑制剂。将0.2g组织/mlpbs溶液的目标最终浓度应用于所有样品。血液样品与抗凝剂(二钠)edta一起保存，以防止样本凝结。通过elisa测定分析样品中细胞因子(bio-plexpro；bio-rad)、tnf(lifespan)和乙酰胆碱(lifespan)浓度的变化。使用hplc检测或elisa(rockymountaindiagnostic)分析评估儿茶酚胺浓度。

检查了lps对血糖和胰岛素水平的影响。lps注射后0、60、90、120、150、180和240分钟从尾静脉采集血样以测量葡萄糖和胰岛素水平。通过onetouchelite血糖仪(lifescan；johnson&johnson)测量循环血糖浓度。使用elisa试剂盒(crystalchem,chicago,il)测定从血液获得的血浆中的胰岛素浓度，以确定lps和随后的超声刺激对全身胰岛素耐性的影响。信号转导的变化通过评估肝脏、肌肉、心脏和下丘脑组织样品中的生物标志物来测量，所述生物标志物包括p38、p7056k、akt、gsk3b、c-src、nf-κβ、socs3、irs-1、npy和pomc。由超声刺激引起的诱导变化可能包括胰岛素介导的葡萄糖摄取以及与代谢活性的抑制/活跃相关联的相关分子的变化。

用于超声神经调节的协议可以如下：

可以用2-4％的异氟烷麻醉动物

可将动物俯卧在水循环暖垫上，以防止手术过程中体温过高。

在刺激之前，可以用一次性剃刀和动物削毛器剃光用于超声刺激的目标靶区域(目标神经)上方的区域。

可以使用诊断成像超声以在空间上选择所述目标区域。

肝脏：肝门静脉的多普勒识别指示的肝门。

脾脏：通过诊断超声对脾脏进行视觉识别。可以沿着所识别的脾轴维持刺激的位置。

可以使用永久标志物标记该区域以用于后续识别。

可以将fus超声探头或logiqe9探头放置在先前由诊断超声识别的指定目标区域。

然后使用不超过单个1分钟脉冲的单个刺激的总持续时间执行超声脉冲。能量永远不会达到与热损伤和烧蚀/空化相关的水平(烧蚀/空化为35w/cm²)。也就是说，在某些实施方式中，目标区域中的时间平均强度低于35w/cm²。

然后可以腹腔注射lps(10mg/kg(用于急性/动力学研究)。替代地，对于作用持续时间，lps可以不在此处注入，而是可以在随后的指定时间点注入。

可以施加第二个1分钟的超声刺激。

然后可以让动物在麻醉下温育以进行急性(1小时)和动力学(lps后至多3小时内的变化)研究。之后将动物解麻并采集组织、血液样品。

对于效果持续时间的研究，不是在超声刺激时注射lps，而是在应用超声刺激后的指定时间点注射lps(例如0.5、1、2、4或8小时)。之后，将动物放入麻醉药容纳室中并进行监测，直到安乐死和组织/流体收集。

可以从腹膜腔的底部开始切出切口，该切口向上延伸并一直延伸到胸膜腔。可以快速取出器官并且在pbs溶液中匀浆，该pbs溶液含有磷酸酶(0.2mm苯甲基磺酰氟，5ug/ml抑肽酶，1mm苄脒，1mm原钒酸钠和2um斑蝥素)和蛋白酶(按照rochediagnostics，1ul至20mg组织)抑制剂。将0.2g组织/mlpbs溶液的目标最终浓度应用于所有样品中。将血液样品与抗凝剂(二钠)edta一起保存，以防止样品凝结。然后将样品储存在-80℃下直至分析。通过elisa测定分析样品中细胞因子(bio-plexpro；bio-rad)、tnf(lifespan/abcam/thermofisher)和乙酰胆碱(lifespan)浓度的变化。使用hplc检测或elisa(rockymountaindiagnostic)分析评估了儿茶酚胺浓度。

基于电极的迷走神经刺激对照实验协议

用2％异氟烷麻醉雄性sprague-dawley大鼠。沿颈部切开一条切口，露出斜方肌、胸锁乳突肌和咬肌的颈侧部，以进行钝器解剖，露出左颈迷走神经。将微电极沿着暴露的颈迷走神经的主干放置。在acqknowledge软件(biopacsystems)的控制下，使用biopacmp150模块产生电刺激(5v，30hz，2ms；5v，5hz，2ms；1v，5hz，2ms)。在腹腔注射10mg/kglps前后，大鼠进行3分钟的迷走神经刺激。lps注射60分钟后对大鼠实施安乐死，获取脾脏和血液样品以测定tnf。在进行假手术的大鼠中，迷走神经被暴露，但未被触摸或操纵。

hplc分析

无需预处理即可将血清样品直接注入仪器。首先将组织匀浆物用0.1m高氯酸匀浆并离心15分钟，然后分离上清液，并将样品注入hplc(dhir&kulkarni,2007)。

通过高效液相色谱仪(hplc)使用内置紫外线探测器分析儿茶酚胺(去甲肾上腺素/肾上腺素)。在该分析中使用的测试柱为supelcodiscoveryc18(15cmx4.6mmi.d.,5um粒径)。双相流动相由[a]乙腈:[b]50mmkh2po4组成，设定为ph3(用磷酸)。然后将溶液用100mg/ledta和200mg/l1-辛烷磺酸进行缓冲。流动相混合物的终浓度设置为5:95，a:b。使用1ml/min的流速提高总峰分离度，同时将色谱柱保持在恒定的20℃，以最大程度地减少由于利用的流动相的粘度而造成的色谱柱压实。uv检测器保持在254nm，该波长已知可捕获儿茶酚胺的吸收，包括：去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺。

超声调节的分子信号通路的化学抑制

为了进一步研究机械与直接神经刺激的影响(和轴突细胞外突触的神经与非神经成分的优先调节)，在进行上述超声刺激程序之前，src抑制剂(直接机械感受器的共同标志物)或pi3k抑制剂(神经信号转导的共同标志物)。

组织提取和石蜡块转化：

立即将组织(鼠脑)放入固定剂中，并在4℃下在10％福尔马林中固定～24小时。

使用以下协议处理组织(在每次温育期间使用真空和压力)：

a.70％乙醇，37℃，40min

b.80％乙醇，37℃，40min

c.95％乙醇，37℃，40min

d.95％乙醇，37℃，40min

e.100％乙醇，37℃，40min

f.100％乙醇，37℃，40min

g.二甲苯，37℃，40min

h.二甲苯，37℃，40min

i.石蜡，65℃，40min

j.石蜡，65℃，40min

k.石蜡，65℃，40min

l.石蜡，65℃，40min*留在该石蜡中直到准备用于包埋，但是不要超过～12-18小时。

包埋入石蜡块中进行切片，在切片前让块冷却/硬化。将5微米厚的切片漂浮在50℃的水浴上进行收集。使用带正电的载玻片并且尝试将每个载玻片的组织定位在相同的取向上。风干载玻片。在室温下过夜似乎是干燥的最佳选择，但可以将载玻片放在40℃的载玻片加热器上以加快干燥过程，但不要将载玻片在加热器上放置超过1小时。将载玻片保存在4℃下。

ihc处理

在65℃下将福尔马林固定石蜡包埋的(ffpe)组织样品(大鼠大脑)烘烤1小时。用二甲苯对载玻片进行脱蜡处理，通过不断降低的乙醇浓度洗涤将其重新水化，然后进行抗原回收处理。专门开发了用于与ffpe组织多重化的两步抗原回收方法，其允许将具有不同抗原回收条件的抗体一起用于同一样品。然后将样品在具有0.3％tritonx-100的pbs中在环境温度下温育10分钟，然后在室温下，用1×pbs中的10％(wt/体积)驴血清和3％(wt/体积)bsa阻断非特异性结合45分钟。将一次抗体cfos(santacruz-sc52)稀释至最佳浓度(5μg/ml)并且在室温下在pbs/3％(体积/体积)bsa中应用1小时。然后依次在pbs、pbs-tritonx-100和再次pbs中将样品洗涤10分钟，每次洗涤都进行搅拌。在检测二次抗体的情况下，将样品与偶联到cy3或cy5上的一次抗体物种特异性二驴igg一起温育。然后按上述方法洗涤载玻片，并在dapi(10μg/ml)中染色5分钟，再次在pbs中漂洗，然后用抗褪色介质固定以进行图像采集。在荧光olympusix81显微镜上以10x放大倍数采集整个组织图像。

图像处理

应当使用自发荧光去除方法从目标荧光团的信号中表征并分离出ffpe组织的典型特征的自发荧光(af)，其中除染色图像外还获取未染色样品的图像。相对于暴露时间和暗像素值(零曝光时间的像素强度值)将未染色和染色的图像归一化。然后从相应的归一化染色图像中减去每个归一化的自发荧光图像。去除了af的图像与已注册的4',6-二脒基-2-苯吲哚(dapi)图像合并。对刺激和对照样品中相同的目标区域成像，并对图像的cfos表达进行定性评估，以检测神经激活相关基因表达的变化。

脾脏的组织学评估：如上所述，将来自刺激的大鼠和对照大鼠的脾脏加工成石蜡块。按照文献报道的标准协议清除石蜡包埋的切片并进行h&e染色，并在明场olympus扫描仪上进行扫描。定性评估h&e图像的形态差异，并且在刺激和对照样品之间未发现显著差异。

心率监测与分析

使用商业红外血氧仪和生理监测系统(starrlifesciences)按照制造商的说明监测心率(在超声或电极刺激实验期间)。在刺激协议中，将脚夹传感器(由制造商提供)放置在动物的脚垫上。在测量前让动物适应至少5分钟，这是一个足以使动物恢复至正常心率活动和对照组中的生理读数的时间点。在分别用电子微电极或超声探头刺激之前(2分钟记录时间)、期间和之后(2分钟记录时间)记录测量值。

超声诱导激活的扩散功能mri测量

可以使用血液氧合水平依赖性(bold)fmri检测神经元激活；代谢需求增加的大脑区域导致大脑血流量提高、含氧血液供应增加以及梯度回波信号降低。对bold效应的敏感性要求使用快速梯度回波采集；这会在气囊附近的大脑区域(诸如鼻窦和耳道)造成不希望的信号丢失，并阻碍在这些特定大脑区域附近检测到神经元激活。或者，为使在以大场不均匀性为特征的区域中的信号损失最小，可以使用自旋回波(或双自旋回波)扩散加权成像(dwi)。在dwi-fmri中，缓慢扩散的大概是细胞内的水池的体积增加或水扩散(或表观扩散系数(adc))的增加均归因于神经元激活引起的细胞肿胀和膜扩张。

使用图14的范例对十只大鼠进行了脑部mri扫描。其中六只接受了lps注射(如上所述)和超声治疗；其中四个只接受了lps注射。用3％异氟醚麻醉十只sprague-dawley大鼠，仰卧，头插入鸟笼线圈中。腹部区域通过充满凝胶/水的锥体与mr兼容性超声探头(f＝1.47mhz)耦合，所述探头聚焦于肝门(先前含有葡萄糖敏感神经元的肝区)。

使用dotyscientific正交鸟笼线圈在3tgedv扫描仪(waukesha,wi)中进行扫描。扫描从t1采集开始，使用变差梯度回波序列，以0.4/1mm面内/面外空间分辨率，使用10/1475ms的te/tr，总采集时间为3:22分钟。以0.6/1mm面内/面外空间分辨率，使用82/3400ms的te/tr，对于b＝0/b＝1000s/mm2分别使用3/4平均，采集了六块双自旋回波扩散加权成像(dwi)图像(称为正向极性梯度或fpg)，每个块的总采集时间为1:49min。在完成6次注射前dwi采集后，出于失真校正的目的，使用反向的递度方向进行了另一次dwi采集；此采集称为反极性梯度(rpg)采集。lps注射后，进行第一次超声治疗，等待时间为5分钟，和第二次超声治疗，采集了其它6块fpgdwi图像。对于仅注射lps的对照大鼠，lps注射后立即进行了最后6个dwi块。

使用充水锥体耦合到目标区域(例如胃肠组织、胰腺、肝脏等)的mr兼容性1.47mhz聚焦超声换能器进行超声治疗。每次超声治疗持续60秒，在此期间施加脉冲正弦超声波形。脉冲开启时间为150μs，脉冲关闭时间为350μs。大鼠的腹部在成像线圈之外；仰卧动物定位可确保使用耦合凝胶将超声探头通过皮肤轻松耦合至肝脏。将至少为0.5的t1图像和(失真校正的)b＝0dwi图像之间的互相关系数(ccc)用于识别要用于进一步分析的切片。计算治疗前和治疗后图像的表观扩散系数(adc)；将治疗前和治疗后的图像数据汇总在一起进行统计分析。t1图像和大鼠图集之间的严格配准用于确定逐像素t检验表明显著变化的区域。将来自t1和图集图像的配准变换应用于失真校正的dwi和adc图像。

胆碱能抗炎途径

本示例说明了一种非侵入性方法，该方法使用超声能量施加来刺激器官内的特定轴突突出以实现模拟和相关的生理结果。超声首先施加于脾脏，并发现它能刺激与胆碱能抗炎途径(cap)相关的轴突来调节全身细胞因子的浓度。当该途径被化学或机械阻断时，超声诱导的效应被抑制。当改变超声参数时，细胞外神经递质浓度、细胞内激酶活性和cap相关细胞因子受到不同的影响，表明了通过修改超声参数产生所需生理反应的能力。接下来，显示出肝脏超声刺激可调节调整血糖的感觉途径，并且发现这种效应取决于对肝脏内特定解剖部位的刺激。总体而言，这些数据表明，器官内的超声神经调节可以提供一种精确的神经调节方法，该方法有助于刺激器官或组织内神经元的多个小子集，从而影响特定的生理功能，例如调节血糖(通过肝脏神经调节)和全身性细胞因子(通过脾神经调节)。

在周围神经内，个体轴突被紧密捆绑在一起(成簇)并包裹在保护性组织内。这使得难以选择性地刺激终止于特定器官的轴突子集并且唯一地调节该器官内的通信细胞功能。精确的周围神经刺激的临床实施仍然很复杂。图15a显示了迷走神经内投射的传入和传出神经元、示例性受神经支配器官以及用于颈vns的刺激器的大致位置的复杂系统的局部示意图。传出神经元起源于迷走神经的背运动核(dmv)，而传出神经元通过孤束核(nts)进入大脑。导向内脏器官的周围神经既含有传出神经元，又含有传入神经元，这很难通过远端颈vns植入物单独刺激。

图15b是基于靶器官的周围神经调节的描述性示意图，其中使用聚焦脉冲超声优先刺激终止于器官内的轴突子集。本文研究的靶包括与胆碱能抗炎途径相关的脾脏内的轴突末端和与将代谢信息传递给大脑以帮助维持葡萄糖稳态有关的肝脏内的感觉末端。如本文提供的聚焦脉冲超声刺激终止于器官内的轴突子集(图15b)。在本文提供的某些示例中，超声能量聚焦于脾脏内的轴突投射(以通过胆碱能抗炎途径(cap)影响全身性炎症)和肝脏内的轴突投射(以将代谢信息传递至大脑并维持葡萄糖稳态)。

在啮齿动物lps诱导的炎症模型中，在不同的超声刺激参数下，监测了参与cap的每种细胞类型(图16a和b。cap(图15b)由三种主要的细胞类型组成：从脾神经节、中间t细胞和调节循环细胞因子水平的巨噬细胞投射出的突触后末端轴突末端。通过测量cap相关性神经递质和细胞因子(包括去甲肾上腺素(ne)、乙酰胆碱(ach)和肿瘤坏死因子(tnf-α))的脾脏浓度来监测cap对局部超声刺激的反应。

如本文所提供并根据图16a所示的时间线进行超声刺激，以显示相对于对照的诱导的目标生理结果。lps注射前和后给予一分钟的超声刺激；收集样品并测量引起的局部(即组织)变化和全身性神经递质和细胞因子的变化(图16b-e)，以展示超声诱导的cap神经调节对lps模型响应的影响。除图16e以外，所有数据的响应时间均为1小时。然而，应当理解的是，所描绘的响应时间仅是示例性的。即，由于在目标区域的神经调节而引起的变化的诱导可以在一个小时内，并且在一些实施方式中，可能持续数小时或数天。因此，如本文所提供的，由神经调节引起的可测量诱导变化的评估可以在基线(在神经调节时或之前)以及在神经调节之后的一个或多个时间点(以分钟为间隔、以小时为间隔、以天为间隔)进行。作为治疗方案的一部分，可以连续或间歇地监测某些受试者，以评估一种或多种目标分子的浓度(或其它可测量效应，例如器官移位)。

通过将超声换能器放置在靶器官上而不施加超声刺激来执行假手术对照。图16b显示了在幼稚大鼠、假手术对照(接受lps但未接受超声刺激的大鼠)以及接受lps和各种超声刺激压力的动物中测得的cap响应。显示了幼稚动物、假手术对照和超声刺激压力为0.03–1.72mpa的动物中去甲肾上腺素(i)、乙酰胆碱(ii)和tnf-α(iii)的浓度。需要注意的是，(iii)中表示幼稚动物、假手术对照和超声刺激压力的x轴标签适用于所有三张图，幼稚动物中脾脏去甲肾上腺素水平平均为140nmol/l，而lps诱导的炎症使去甲肾上腺素水平降至接近零，这表明在初始炎症时cap信号受到抑制。

如图所示，超声刺激使lps响应朝着幼稚动物中测得的水平减弱(图16b.i.)。与cap信号传导过程一致，超声刺激动物中去甲肾上腺素升高与脾乙酰胆碱升高有关；在0.83mpa的超声压力下，平均乙酰胆碱浓度几乎是假手术动物中发现的三倍(图16b.ii)。图16c显示了与图16b相同条件下tnf-α的循环浓度。需要注意的是，图16c中表示幼稚动物、假手术对照和超声刺激压力的x轴标签也适用于图16b。图16d显示了与图16b相同条件下的脾脏il-1α浓度。与假手术动物相比，脾脏(图16b.iii)和循环tnf-α(图16c)水平均显示降低。对治疗的响应取决于超声压力(在随后的实验中使用0.83mpa)。作为脾脏超声刺激特异性引起cap变化的其它证据，图16d显示超声刺激影响了由tnf-α特异性途径调节的其它蛋白质的浓度，例如白细胞介素1-α(il-1α)。因此，数据表明控制可调整的调节参数(如超声压力)可实现目标分子浓度的靶向控制。通过改变施加到目标区域的超声压力，可以实现期望的生理结果(例如一种或多种目标分子的期望浓度变化)。虽然可以根据患者的情况凭经验确定施加的压力，但在某些实施方式中，使用0.03-1.72mpa的超声刺激压力进行靶向神经调节。如本文所提供的，超声压力可以是如本文所提供的被改变或调整以实现目标生理反应的调节参数。其它可调参数可以是治疗时间表(例如治疗持续时间、治疗之间的间隔以及其它临床事件或通过评估装置进行评估的延迟时间)。

图16f显示了大鼠脾脏的2d超声图像，用于在空间上选择脾靶并将超声刺激聚焦到该脾靶，如箭头所示，指示用于超声刺激的脾的轮廓和靶向焦点(即脾的目标区域)。图16g示出了研究的时间轴的非限制性实施方式，该研究被设计为测量刺激对cap激活的影响的持续时间。在本项研究中，在lps注射之前先施加超声波刺激，并且超声刺激与lps注射之间的延迟时间为0.5到48小时不等。图16h示出了在0.5至48小时的可变延迟时间后的超声治疗(即lps注射之前进行的超声刺激)之后脾脏tnf-α的浓度，其为假手术对照中测量的脾脏tnf-α浓度的百分比(％)值。图16i示出了在使用(阴影条)或未使用(实心条)超声刺激压力为0.13–1.72mpa的超声刺激的情况下，激活的和/或磷酸化的激酶(p38、p70s6k、akt、gsk3b、c-src、nf-kβ、socs3)的浓度。

治疗后1-2小时出现峰值超声介导的响应(图16e)，类似于先前基于植入物的vns研究。另外，当在lps注射之前施加时，可以提供脾超声以实现保护作用(图16g和16h)，也与先前的侵入性vns研究一致。图16h显示，保护作用在治疗后持续了48小时。为了进一步表征保护作用，测定了与lps、cap或tnf-α介导的信号传导相关的特定细胞内激酶的超声激活(图16i)。这些数据表明，超声能强烈地增强一些激酶(例如p38和p70s6k)的激活，并且一些激酶(例如p38)的超声压力依赖性响应与先前观察到的超声压力依赖性大致相关(图16b–d)。

图16j和图16k显示了在使用替代性超声刺激参数(猝发持续时间和载波频率)超声刺激的脾脏(lps注射后)中去甲肾上腺素(ne)、乙酰胆碱(ach)和组织坏死因子α(tnf-α)浓度的数据。与脾脏样品中图16b的0.83mpa数据进行比较的方式显示了数据，其是在使用替代性猝发持续时间(左)或超声载波频率(右)刺激后采集的。

将脾超声调节的效果与标准电极或基于植入物的迷走神经刺激(vns)进行了比较，这是如本文所述进行的。在图17a和17b中，“+”表示存在所指示的事件或抑制剂，而“-”表示不存在所指示的事件或抑制剂。在图17a中，x轴表示在不同条件下(超声与vns以及使用不同的抑制剂)大鼠脾脏的诱导变化，且y轴以百分比变化显示脾脏tnf-α的相对浓度(相对于lps处理的对照)。显示了在使用和未使用pp2(部分选择性src激酶抑制剂)、ly294002(pi3-激酶选择性抑制剂)、pd98059(mek1和mek2选择性mapk选择性抑制剂)和α-金环蛇毒素(btx；cap途径中已知的α7nachr的拮抗剂)的情况下，超声刺激(超声刺激压力为0.83mpa)和vns刺激的所述相对浓度。图17b显示了在对lps治疗的受到和未受到btx或手术迷走神经切断术影响的啮齿动物进行超声刺激后，btx对(左)去甲肾上腺素(ne)和(右)tnf-α的脾脏浓度的影响。图17a显示，侵入性颈vns和非侵入性脾超声刺激对tnf-α产生的影响几乎相当。另外，图17b显示，脾脏注射α-金环蛇毒素(btx；已知的α7nachr拮抗剂)抑制了超声刺激对tnf-α浓度的影响，表明(如同基于vns的cap激活)通过超声的所需cap调节涉及脾脏α7nachr信号传导。与cap模型(图15b)一致，ne浓度未受到btx的影响(即btx通过α7nachr途径阻断了升高的ne的作用)。迷走神经切断术也抑制了通过超声对cap的调节，提供了附加证据表明超声对cap的影响是神经介导的(图17b)。最后，激酶抑制剂pp2(对src激酶有部分选择性)和ly294002(pi3激酶选择性)显示出抑制超声作用，而pd98059(mek1和mek2选择性mapk抑制剂)则无影响(图17a)。这些结果证实了图16i中的结果，其中超声刺激导致pi3(即akt、p70s6k)、c-src和p38-mapk途径内的激酶激活发生了变化，但未影响参与细菌抗原应答的激酶(即nfkb、gsk3b)。此变化可能是通过有靶向神经调节获得的所需特征谱的一部分，并指示了目标生理结果。

通过测量侵入性vns的多种已知副作用来检查聚焦超声刺激的生理特异性。图17c显示的数据比较了vns(在多种刺激强度和频率下)与脾超声刺激(超声刺激压力为0.83mpa)对心率的影响。图17c显示了由颈vns或脾超声刺激引起的心率变化。在1伏和5伏vns强度下(已知会激活cap)，心率显著下降。但是，局部脾超声刺激对心率无影响。

图17d显示的数据证实，先前观察到的vns对lps诱导的高血糖减弱的副作用，且在使用脾超声刺激时没有这种副作用。该图显示了lps对照(没有超声刺激)、或lps注射结合脾超声刺激或颈vns刺激，在lps注射后的5、15、30和60分钟的时间点的相对血糖浓度(与注射前浓度相比)。图17d显示，相对于仅用lps的对照，超声刺激未导致葡萄糖浓度变化，而vns实验则显示出减弱高血糖的副作用。cap靶向vns的这种代谢副作用可能是由于第二(非cap)迷走途径的脱靶vns引起的。此种脱靶效应是与本文提供的靶向外周神经调节相比vns的作用更宽泛且更不具特异性(即靶向性更低)的结果。所提供的靶向神经调节的益处是避免了不良的脱靶效应。精确超声刺激技术还用于研究vns介导的高血糖减少是否与源自代谢感觉神经元的轴突的直接刺激有关。

在一些实施方式中，超声图像可用于引导超声刺激以在空间上选择目标区域以靶向递送超声刺激。如本文所提供的，空间选择(spatialselection)或空间选择(spatiallyselecting)可以包括获得组织或器官(或组织或器官的一部分)的图像，并且基于图像(例如超声图像)，识别器官内的目标区域。在一些实施方式中，组织或器官可能具有用于引导器官内目标区域的选择的解剖特征。在一些实施方式中，作为非限制性示例，这种特征可以包括血管或神经进入器官的部位、器官内的组织类型、器官的内部或边缘或亚器官结构。在某些实施方式中，解剖特征可能包括肝脏肝门、胃肠道亚器官(胃、小肠、大肠)、胰管或脾脏白髓。通过识别图像中的解剖特征，可以选择目标区域以与该解剖特征重叠或包括该解剖特征或者与该解剖特征相邻。在其它实施方式中，可以从目标区域中排除解剖特征。例如，可以选择肠组织而不是胃组织作为目标区域。解剖特征的识别可以通过图像中可见的形态特征(例如在超声图像中可见)或通过用于获得图像的成像模态的结构识别特征来进行。如本文所公开的，系统10可以经配置，以使得能量施加装置12被配置为以成像模式操作以获得图像，并且随后在获得图像并且基于该图像在空间上选择了目标区域之后以能量施加模式操作。

在其它实施方式中，可以通过存在或不存在的一种或多种生物标志物来识别目标区域。可通过对器官或组织染色并获得指示染色的图像以识别包括生物标志物的器官或组织区域来评估此类标志物。在一些实施方式中，可以通过体内染色技术获得生物标志物信息，以实时获得特定于受试者的组织或器官中生物标志物的位置数据。在其它实施方式中，可以通过体外染色技术获得生物标志物信息，以获得一个或多个代表性图像的位置数据，然后将其用于预测受试者组织或器官内生物标志物的位置。在一些实施方式中，选择目标区域以对应于富含特定生物标志物或缺乏特定生物标志物的组织或器官的部分。例如，一种或多种生物标志物可以包括神经元结构的标志物(例如，髓鞘标志物)。

可以基于操作员的输入在空间上选择器官或组织中的目标区域。例如，操作员可以通过直接操纵图像(即在图像上绘制或写入目标区域)或通过提供与目标区域相对应的图像坐标信息来在获得的图像上指定目标区域。在另一实施方式中，可以基于图像数据自动选择目标区域以实现空间选择。在一些实施方式中，空间选择包括将与目标区域有关的数据存储在存储器中并访问该数据。

一旦在空间上选择，系统10被配置为将能量施加到本文所提供的目标区域。例如，如图18a所示，使用大鼠肝脏的2d超声图像来引导超声刺激选择性地聚焦在靶向肝门部位，白色箭头指示肝脏的轮廓且中间箭头指示目标区域。图18a显示，超声图像引导使得能够在空间上选择肝脏的肝门区域，和将超声刺激指向所选的肝门区域，该区域含有葡萄糖敏感神经元，以便进行局部靶向超声神经调节。

图18b提供了在lps诱导的高血糖症动物模型的肝脏的各个区域上选择性施加超声刺激以实现血糖浓度的靶向调节的非限制性示例。图18b的图显示了lps注射后的5、15、30和60分钟时间点的相对血糖浓度(与lps注射前的浓度相比)。在仅接受lps注射而没有超声刺激的组中，观察到lps诱导的高血糖症。数据进一步表明，超声刺激肝的远端叶不会显著影响血糖浓度。相比之下，在肝门上选择性施加超声刺激可用于逆转lps引起的高血糖症并调节血糖浓度。因此，目标区域的部位产生不同的结果，并且对肺叶进行广泛或非靶向的肝治疗将不会获得与靶向肝门区域(使用邻近或包括肝门区的区域)的超声治疗相同的目标效果。如图18b的实施方式中所示，根据图16g中所示的协议，将超声刺激施加于肝脏中的目标区域，提供了针对lps诱导的模型高血糖的防护作用，限制和/或控制了血糖浓度的增加并将该浓度调节至低于餐后浓度。此外，调节可以是解剖学上特异的。图18b显示，将超声刺激指向肝的右叶或左叶会减弱对血糖的超声诱导影响。也就是说，并非肝脏的所有区域都以相同的方式对超声能量施加做出响应。在一些实施方式中，能量施加可以用作保护性治疗，也可以用作在预期的系统性挑战或中断之前施用的治疗。

可以在直接受到超声刺激的部位，即在包括靶向目标区域的器官上，实现对一种或多种目标分子的选择性调节。例如，在目标区域对肝脏进行靶向超声刺激会诱导肝脏组织内信号分子的肝浓度变化。另外，与葡萄糖代谢有关的分子可保持不变(图18c，灰色条)。附加地或可替代地，可以在不直接受到超声刺激的远端部位实现对一种或多种目标分子的选择性调节。例如，图18c显示，在肝脏部位施加超声刺激可用于诱导npy和ne下丘脑浓度的显著变化，进一步诱导指示胰岛素信号传导途径活性增加的离子通道的磷酸化增加，这可能指示了提高的胰岛素敏感性以及提高的葡萄糖利用率。

图18c显示了与胰岛素敏感性和胰岛素介导的以及非胰岛素依赖的葡萄糖摄取相关的多种分子在肝脏中的相对浓度(与没有超声刺激相比)的测量值，和与代谢功能有关的下丘脑标志物的变化。在肝脏中，肾上腺素相对于去甲肾上腺素的变化而下降。肾上腺素可通过驱使肝脏中的储备释放而导致血糖迅速升高。但是，与去甲肾上腺素对骨骼肌和脂肪摄取葡萄糖的影响相反，去甲肾上腺素对肝葡萄糖产生没有显著贡献。下丘脑中去甲肾上腺素增加可说明高胰岛素血症增加(指示胰岛素敏感性降低)和葡萄糖耐受不良/高血糖症。超声刺激可用于选择性地调节或引起未直接受刺激的远端部位的一种或多种目标分子的浓度变化。例如，如图18c所示，当将直接超声刺激施加于肝脏中的部位时，超声刺激可用于调节远端下丘脑部位处诸如去甲肾上腺素(ne)、蛋白激酶b(pakt)、胰岛素受体底物1(irs-1)和神经肽y(npy)等分子的浓度。在某些实施方式中，选择性地将超声刺激施加空间上选定的组织目标区域以实现所需的(即目标)生理结果。该组织可以选自肝脏、胰腺、胃肠道、脾脏等。期望的结果可以是临床相关分子或标志物的浓度的变化。在某些实施方式中，超声诱导的神经调节可通过定义的下丘脑和脑干亚核内即时早期基因cfos的活性依赖性表达程度来量化(分别为图18d和18e)。图18d示出了cfos免疫组织化学图像(左)以及显示lps对照(左)和超声刺激的样品(右)中激活的神经元的百分比的数据。在对照图像中，激活的神经元的百分比为约7.7％，而在受刺激的图像中，受刺激的神经元的百分比为约4.9％。在脑室旁核(pvn)上分割图像和数据。超声刺激后神经活动的减少(由降低的激活的神经元的百分比为代表)进一步佐证(除图18c的数据以外)了肝超声神经调节对全身葡萄糖利用和代谢信号传导的影响。图18e显示了附加免疫组织化学图像，显示了lps对照(上)与超声刺激的样品(下)中脑干中的cfos表达。图像在孤束核(nts)上分割，显示在超声刺激的样品中表达增加。图18f显示了激活图(超过扰相梯度召回回波体积；左)和大脑图谱(超过扰相梯度召回回波体积；右)之间的示例mri叠加。该示例显示下丘脑的左、右室旁核(pvn)中adc均增加(箭头，左图)，与神经元失活一致。图18g以条形图总结了结果。六只大鼠中有三只显示pvn明显失活；对照动物均未显示出这种失活。此外，在u/s治疗的动物中未观察到在未进行u/s治疗的动物中观察到的高血糖症。

表2显示了从在治疗前和治疗后扫描之间经验证的pvnroi中adc值的比较获得的t检验值。

表2

在6只大鼠的3只中看到响应于超声刺激的pvnadc增加与c-fos表达数据基本一致，表明了超声诱导的与下丘脑通讯的lps激活途径的失活。lps+超声小鼠中只有一些表现出这种效应(表s2中的大鼠1、4和5)。

与对照相比，室旁核(pvn)中的cfos阳性(c-fos+；图18d)细胞显著减少，表明了对lps诱导的神经信号的超声诱导调节。这些数据佐证了超声刺激后npy和gaba的浓度显著降低，这是因为弓形核(arc)通过表达npy的神经元根据周围感觉信息改变了到pvn的信号。另外，下丘脑c-fos表达的改变伴随着孤束核内c-fos表达的显著增加(nts；图18e)，指示了超声波通过传入途径的信号传导介导调节。

比较了肝超声刺激前后下丘脑亚核中扩散加权功能磁共振成像(dfmri)图像的表观扩散系数(adc)。响应于超声刺激，pvn内adc增加，证实了化学数据(pomc、npy和ne)和c-fos表达数据，这些数据证明了超声诱导与下丘脑通讯的lps激活途径的失活。这些结果与途径的激活一致，该途径通过npy系统调节lps诱导的对能量代谢的影响及其对输出pvn信号传导的影响。

慢性肝刺激

提供了糖尿病zucker(fa/fa)大鼠模型中肝脏刺激的结果。zucker大鼠是2型糖尿病和/或胰岛素耐性的模型。如本文通常提供的那样，对sd大鼠进行肝脏刺激和标志物分析(即循环和组织)，其中如本文提供的靶向目标区域在大鼠肝门处或附近。通过尾静脉测量评估循环性非末端标志物。图19显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后循环非空腹的葡萄糖。所示的时间段是第55-75天。第56天开始超声治疗。隔离一天后当动物处于糖尿病前状态时开始治疗。超声刺激将循环非空腹血糖水平降低至与非糖尿病大鼠一致的水平。图20显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的循环甘油三酸酯。图21显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的循环胰高血糖素。图22显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的循环胰岛素。图23显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的循环瘦素。图24显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的循环去甲肾上腺素。糖尿病大鼠中的胰岛素可以为约3-10ug/l。正常的非空腹胰岛素水平通为0.8-1.5ug/l。zucker动物是瘦素受体ko，但仍然可以自行制造瘦素。患有脂肪营养不良性糖尿病(瘦素缺乏症)的患者服用瘦素可增强胰岛素响应性并减少高血糖症(通过减少糖异生)。胰高血糖素没有变化，表明胰腺的α细胞缺乏作用。相对于先前的二甲双胍治疗特征，肝脏超声似乎可引起改善的有益变化。例如，二甲双胍治疗通常与循环胰岛素减少无关。相比之下，靶向肝脏超声治疗结果可引起循环葡萄糖、胰岛素和甘油三酸酯的可观察到的变化。不存在去甲肾上腺素的变化表明了源自局部效应的变化。

图25-33显示了肝超声治疗后相对于对照的各种末端下丘脑标志物的浓度。图25显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的下丘脑胰岛素受体底物1(irs-1)。图26显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的下丘脑磷酸化-akt。图27显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的下丘脑glut4。图28显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的下丘脑去甲肾上腺素。图29显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的下丘脑葡萄糖-6-磷酸。图30显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的下丘脑胰高血糖素样肽(glp-1)。图31显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的下丘脑γ-氨基丁酸(gaba)。图32显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的下丘脑脑源性神经营养因子(bdnf)。图33显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的下丘脑神经肽y(npy)。超声刺激的下丘脑中的irs-1、磷酸化-akt和glut4信号传导显著增加，这与先前lps诱导的高血糖模型中的结果一致。肠降血糖素信号传导(glp-1)没有变化，这些化合物通常会增加胰岛素分泌、抑制胰高血糖素并减慢胃排空。与假刺激的糖尿病动物相比，治疗动物中去甲肾上腺素无明显变化。下丘脑中通过葡萄糖激酶将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸可能有助于调节响应于葡萄糖的胰岛素分泌的第一阶段。超声刺激的下丘脑中irs-pi3k-glut4信息传导的显著加与先前lps诱导的高血糖模型中的结果一致。肠降血糖素信号传导(例如glp-1)存在变化。这些化合物通常会增加胰岛素分泌、抑制胰高血糖素并减慢胃排空。与假刺激的糖尿病动物相比，治疗动物中的去甲肾上腺素无明显变化。下丘脑中通过葡萄糖激酶将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸可能有助于调节响应于葡萄糖的胰岛素分泌的第一阶段。超声刺激与抑制性神经递质gaba的显著增加有关。观察到的bdnf升高，加上gaba表达的升高，可以解释观察到的下丘脑npy降低。非糖尿病啮齿动物中的神经元通过增加细胞摄取(通过包括胰岛素依赖性和非依赖性glut转运蛋白的机制)并通过下游机制来响应葡萄糖，该下游机制可包括将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸以进行氧化磷酸化和atp产生，这在该过程中关闭atp敏感的k+通道抑制ge神经元。irs-1亚基或下游介体(例如akt)的独立激活可以充当天然葡萄糖传感机制的“旁路”，这可以解释葡萄糖传感的突然恢复。

图34-39显示了肝超声治疗后相对于对照的各种末端肝标志物的浓度。图34显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的肝irs-1。图35显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的肝磷酸化-akt。图36显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的肝葡萄糖转运蛋白2(glut2)。图37显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的肝去甲肾上腺素。图38显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的肝葡萄糖-6-磷酸。图39显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的肝glp-1。发现肝脏中去甲肾上腺素的显著下降与任何观察的胰岛素介导的葡萄糖摄取、肠降血糖素释放或糖酵解活性的变化无关。

图41-45显示了肝超声治疗后相对于对照的各种末端胰腺标志物的浓度。图40显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的胰腺胰高血糖素。图41显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的胰腺胰岛素。图42显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的胰腺瘦素。图43显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的胰腺irs-1。图44显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的胰腺glut2。图45显示了糖尿病大鼠中肝脏刺激后的胰腺磷酸化-akt。

图46显示了zucker速率模型中重复治疗的结果。大鼠在到达年龄(～8周/56天)时确认有糖尿病前症状。初始治疗组由使用本文提供的参数进行每天一次、每次3个1分钟循环的超声刺激构成。当动物出现糖尿病前症状时在到达时开始治疗，并在停止治疗前持续15天。将动物(灰色圆圈)在观察下维持21天，并跟踪循环葡萄糖和胰岛素的变化。

在糖尿病前期组中停止治疗的同时，使呈现出严峻葡萄糖浓度(≥500mg/dl)的接受假手术超声刺激的那些动物开始超声治疗(每天一次，每次3个1分钟循环)并且在同一21天时间段内监测葡萄糖和胰岛素的变化。结果显示，那些先前接受过超声刺激的动物体内的循环葡萄糖缓慢增加。然而，在超声刺激终止后8天，这些动物中的循环葡萄糖稳定为～400mg/dl。尽管这些值与严重糖尿病相一致，但在年龄相匹配的zucker大鼠中，它们仍然显著低于糖尿病对照。因此，本文提供的重复治疗可以产生调整糖调节设定点的持续效果。

所公开的本文提供的技术采用了神经系统的自然层次结构和组织，从而允许通过简单的非侵入性技术进行精确的神经调节。尽管针对两种特定的神经途径(脾脏中的cap和肝脏中的代谢感觉神经元)进行了展示，但该技术可用于调节其它周围神经回路。

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