治疗癌症和自身免疫性疾病的试剂和方法与流程

治疗癌症和自身免疫性疾病的试剂和方法1.交叉引用2.本申请要求2019年7月10日提交的美国临时专利申请序列号62/696142的优先权，其通过引用以其全文并入本文。3.政府资助的声明4.本发明在美国国立卫生研究院颁发的拨款号ai123131的政府资助下进行。美国政府享有本发明的一定权利。
背景技术：
：：5.t细胞免疫反应受到共刺激和共抑制分子的严格控制。共刺激分子有助于发展对癌症和外来病原体的免疫反应，而共抑制分子对于外周耐受性至关重要，以避免自身免疫、gvhd和移植排斥。技术实现要素：6.在一个方面，本公开提供了用于治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用抗体，该抗体选择性地结合到选自cd300c、btn5(红细胞膜相关蛋白)、tapbpl(抗原处理(tap)结合蛋白样蛋白)、skint8(选择和维持上皮内t细胞8蛋白)和/或cd300f的蛋白质，其量对治疗癌症有效。在多种实施方案中，抗体选择性地结合到cd300c、btn5、tapbpl、skint8和/或cd300f的细胞外结构域(ecd)。在另一些实施方案中，抗体选择性地结合到cd300c、btn5、tapbpl、skint8和/或cd300f的igv结构域。7.在另一个方面，本公开提供了一种分离的抗人cd300c抗体或其片段，其包含1、2、3、4、5或全部6个选自以下的互补决定区(cdr)：8.重链cdr1(h-cdr1)，其包含与氨基酸序列iygmn(seqidno:10)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；9.重链cdr2(h-cdr2)，其包含与氨基酸序列wintyt(seqidno:11)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；10.重链cdr3(h-cdr3)，其包含与氨基酸序列arsrfay(seqidno:12)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；11.轻链cdr1(l-cdr1)，其包含与氨基酸序列kasqnvgtnva(seqidno:13)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；12.轻链cdr2(l-cdr2)，其包含与氨基酸序列sasyrys(seqidno:14)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；和13.轻链cdr3(l-cdr3)，其包含与氨基酸序列qqynsyplt(seqidno:15)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。14.在一个实施方案中，分离的抗人cd300c抗体或其片段包含(a)重链，其包含沿seqidno:16的氨基酸序列的全长具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；15.和/或16.(b)轻链，其包含沿seqidno:17的氨基酸序列的全长具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。17.在另一个方面，本公开提供了一种分离的抗人tapbpl抗体或其片段，其包含1、2、3、4、5或全部6个选自以下的互补决定区(cdr)：18.重链cdr1(h-cdr1)，其包含与氨基酸序列gyfwh(seqidno:18)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；19.重链cdr2(h-cdr2)，其包含与氨基酸序列yisysgttnynpslkn(seqidno:19)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；20.重链cdr3(h-cdr3)，其包含与氨基酸序列ddwdwfay(seqidno:20)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；21.轻链cdr1(l-cdr1)，其包含与氨基酸序列sasssvnymh(seqidno:21)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；22.轻链cdr2(l-cdr2)，其包含与氨基酸序列dtsklas(seqidno:22)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；和23.轻链cdr3(l-cdr3)，其包含与氨基酸序列fqgsgyplt(seqidno:23)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。24.在一个实施方案中，分离的抗人tapbpl抗体或其片段包含重链，其包含沿seqidno:24的氨基酸序列的全长具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；25.和/或26.(b)轻链，其包含沿seqidno:25的氨基酸序列的全长具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。27.在多种实施方案中，该抗体包含单克隆抗体或其片段；该抗体包含人源化抗体或其片段；该抗体或其片段进一步包含可检测的标签；和/或该分离的抗体或其片段进一步包含与该抗体或其片段缀合的治疗剂，包括但不限于化学治疗剂。28.在一个方面，本公开提供了一种用于治疗自身免疫性病症的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效治疗自身免疫性病症的量的以下中的一种或多种：29.(a)来自选自cd300c、btn5、tapbpl、skint8和cd300f的蛋白质的igv结构域；和/或30.(b)包含启动子的表达载体，该启动子可操作地连接到编码蛋白质的核酸序列，该蛋白质选自cd300c、btn5、tapbpl、skint8和cd300f。在一个实施方案中，自身免疫性疾病选自多发性硬化症、i型糖尿病、关节炎(包括但不限于类风湿关节炎)、系统性红斑狼疮、克罗恩病、硬皮病、结节病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性心肌炎、皮肌炎、格雷夫斯病、干燥综合征和白癜风以及其他自身免疫性疾病。在另一个实施方案中，该方法进一步包括向所述受试者施用有效量的免疫调节剂以刺激t细胞功能，包括但不限于抗cd3抗体。31.在另一方面，本公开提供了一种融合分子，其包含32.(a)第一多肽，其包含来自选自cd300c、btn5、tapbpl、skint8和cd300f的蛋白质的igv结构域；和33.(b)异源分子。34.在一个实施方案中，第一多肽不包括cd300c、btn5、tapbpl、skint8或cd300f除ecm结构域之外的任何部分。在另一个实施方案中，异源分子包含第二多肽，其选自免疫球蛋白或其片段的恒定区(包括但不限于ch1、ch2和/或ch3；和来自免疫球蛋白的fc区域，包括但不限于天然igg1、igg2或igg4)。在另一个实施方案中，异源分子包括感兴趣的有机分子。35.在另一方面，本公开提供了编码融合分子的核酸，其中异源分子为第二多肽或本公开的抗体。在另一些方面，本公开提供了包含可操作地连接到启动子的核酸的表达载体，以及包含核酸和/或表达载体的重组宿主细胞。附图说明36.图1.hcd300c-ig蛋白在体外对小鼠和人t细胞增殖和活化的影响。(a,b)从c57bl/6小鼠的脾脏中分离出t细胞，并用(a,b)板结合的抗cd3抗体(1μg/ml)和(b)抗cd28抗体(0.5g/ml)在分级剂量的hcd300c-ig蛋白(800、1600和3200ng/ml)或等摩尔量的对照ig蛋白存在下培养3天。通过[3h]胸苷掺入测量细胞增殖。(c-f)用cfse标记小鼠脾细胞，并用抗cd3抗体(1μg/ml)和分级剂量的hcd300c-ig蛋白(1600和3200ng/ml)或等摩尔量的对照ig蛋白培养3天。用抗cd4和cd8抗体对细胞进行染色，并通过cd4+和cd8+t细胞分析cfse水平。(c,e)代表性流式细胞谱，和(d,f)cfselo增殖cd4+和cd8+t细胞的统计分析。(g-j)小鼠脾细胞用抗cd3抗体和分级剂量的hcd300c-ig蛋白或对照ig蛋白如(c)所述培养24小时。然后通过cd4+和cd8+t细胞分析细胞的cd69表达。(g,i)代表性流式细胞谱，和(h,j)cd4+或cd8+t细胞中cd69+细胞的统计分析。(k)将纯化的人cd3+t细胞用板结合的抗人cd3抗体(1μg/ml)在分级剂量的hcd300c-ig蛋白(1500和3000ng/ml)或对照ig蛋白存在下培养3天。通过[3h]胸苷掺入测量细胞增殖。(l,m)将纯化的人cd3+t细胞用板结合的抗人cd3抗体(1μg/ml)在分级剂量的hcd300c-ig蛋白(1600和3200ng/ml)或对照ig蛋白存在下培养1天。然后通过cd4+和cd8+t细胞分析细胞的人cd69表达。数据合并自3个独立实验，并表示为平均值±sd。*与对照ig相比p<0.05。[0037]图2.mcd300c-ig蛋白在体外对小鼠t细胞增殖和活化的影响。(a,b)从c57bl/6小鼠的脾脏中分离出cd3+t细胞，并用(a,b)板结合的抗cd3抗体(1μg/ml)和(b)抗cd28抗体(0.5μg/ml)在分级剂量的mcd300c2-ig蛋白(800、1600和3200ng/ml)或等摩尔量的对照ig蛋白存在下培养3天。通过[3h]胸苷掺入测量细胞增殖。(c-f)用cfse标记小鼠脾细胞，并用抗cd3抗体(1μg/ml)和分级剂量的mcd300c2-ig蛋白或对照ig蛋白如(a)所述培养。然后用抗cd4和cd8抗体对细胞进行染色，并通过cd4+和cd8+t细胞分析cfse水平。(c,e)cd4+或cd8+t细胞的cfse分布的代表性流式细胞术分析。(d,f)cfselo增殖cd4+和cd8+t细胞的统计分析。(g-q)将小鼠脾细胞用(g-q)抗cd3抗体和(i,l)抗cd28抗体在分级剂量的mcd300c2-ig或对照ig蛋白存在下如(a,b)所述培养。24小时后分析细胞的(g-l)cd69的表达，72小时后分析(m-q)cd44和cd62l的表达。(g,j,m)代表性流式细胞谱，和(h,i,k,l,n-q)cd69+、cd44lowcd62lhi原初和cd44hicd62llow效应记忆cd4和cd8t细胞的百分比的统计分析。数据合并自3个独立实验，并表示为平均值±sd。*与对照ig相比p<0.05。[0038]图3.mcd300c2抑制t细胞产生细胞因子。如图3a所示，将纯化的鼠t细胞用板结合的抗cd3抗体(1μg/ml)在分级剂量的mcd300c2-ig蛋白或对照ig蛋白存在下培养3天。通过elisa试剂盒测量上清液中ifnγ、tnfα、il-2、il-17a和il-10的水平。数据合并自3个独立实验，并表示为平均值±sd。*与对照ig相比p<0.05。[0039]图4.免疫细胞上mcd300c2表达的分析。新鲜收获来自c57bl/6小鼠的脾细胞，并用于静息免疫细胞。为了启动t细胞活化，将脾细胞与抗cd3(1μg/ml)和抗cd28(0.5μg/ml)抗体孵育3天。对于活化的b细胞、dc、单核细胞和巨噬细胞，将脾细胞与lps(10μg/ml)孵育3天。用抗mcd300c2抗体(ab)(开放直方图)或同种型ab(阴影直方图)，以及抗cd4、cd8、b220、cd11c、cd11b或f4/80ab对静息和活化的免疫细胞进行染色，以鉴定免疫细胞。(a)代表性流式细胞谱和(b)示出静息和活化的免疫细胞上mcd300c2表达的统计分析。(b)数据合并自3个独立实验，并表示为活化细胞与静息细胞上mcd300c2表达的相对荧光强度(rfi)。*与同种型ab相比p<0.05。**与静息细胞相比p<0.05。(c)使用抗hcd300cab通过免疫组织化学来免疫组织化学分析正常和肿瘤人组织中的hcd300c表达。数据代表3个独立实验。[0040]图5.推定的mcd300c2反受体的表达模式。(a,b)收获或产生鼠静息和活化的免疫细胞，如图5a所示。用生物素化的mcd300c2-ig(开放直方图)或对照ig(阴影直方图)，随后是链霉亲和素-pe对细胞进行染色。通过流式细胞术测定mcd300c2与其在免疫细胞上的推定受体的结合。(a)代表性流式细胞谱和(b)示出mcd300c2-ig或对照ig与静息和活化的免疫细胞的结合的统计分析。(b)数据表示为mcd300c2-ig与对照ig的细胞结合的相对荧光强度(rfi)。数据合并自3个独立实验。(a,b)*与对照ig相比p<0.05。**与静息细胞相比p<0.05。(c,d)用含有小鼠cd28、ctla-4、pd-1、btla或icos基因的表达载体转染hek-293细胞。用(c)分别抗cd28、ctla-4、pd-1、btla或icos蛋白的抗体(开放直方图)或同种型ab(阴影直方图)，或(d)生物素化mcd300c2-ig(开放直方图)或对照ig蛋白(阴影直方图)对转染的细胞进行染色，并通过流式细胞术分析。示出(a,d)mcd300c-ig或对照ig，或(c)指示的抗体与(a)静息和活化的免疫细胞，或(c,d)转染的hek-293细胞的结合的代表性流式细胞谱。[0041]图6.hcd300c-ig改善小鼠的gvhd。在第0天对致死剂量照射的balb/c接受者i.v.注射来自c57bl/6小鼠的5x106个bm和2.5x106个脾细胞，并且每3天i.p.注射20μghcd300c-ig或对照ig持续6次。(a-c)监测接受者的(a)存活率、(b)体重变化，和(c)临床gvhd。(d,e)在单独的实验中，将从第0天到第12天每隔3天给予20μghcd300c-ig或对照ig的接受者在bmt后2周安乐死。(d,e)分析肝脏、si和肺的组织学损伤。(d)代表性显微照片(放大倍数为x200)，和(e)组织病理学得分的平均值±sd。(f-m)hcd300c-ig在体内抑制响应于同种抗原的t细胞增殖和活化。对致死剂量照射的balb/c小鼠i.v.注射来自c57bl/6小鼠的5x106个bm、10x106个脾细胞。在第0天对接受者i.v.注射，并且在第2天i.p.注射20μghcd300c-ig或对照ig。在移植后第4天，通过流式细胞术检测(f-i)ki67+、(j,k)cd44hi和(l,m)cd62llo细胞在供体t细胞(h2b+cd4+或h2b+cd8+)中的百分比。示出了(f,h,j,l)代表性流式细胞谱和(g,i,k,m)统计数据。(j,l)虚线：对照ig；实线：hcd300c。示出了来自2个独立实验的合并数据；其中每个实验每组5-6只小鼠。*与对照ig治疗的小鼠相比p<0.05。[0042]图7：hcd300c-ig减轻小鼠的自身免疫性疾病eae和cia。(a)用200μg在cfa中乳化的mog35-55和500ng纯化的百日咳杆菌毒素免疫c57bl/6小鼠。每周3次对小鼠i.p.注射25μghcd300c-ig或对照ig蛋白持续5周。监测eae发展。(b)在第0天对dba/1小鼠s.c.注射cii在cfa中的乳剂。在第14天，小鼠将接受cii/ifa乳剂的加强注射。当出现cia症状时(第48天)，每3天一次对小鼠i.p.注射25μghcd300c-ig或对照ig持续6次。随时间推移测量了cia临床得分。示出了平均临床得分。[0043]图8.在体内施用抗hcd300cmab抑制黑色素瘤和结肠癌的局部生长。(a-e)对balb/c小鼠s.c.注射2x105个ct-26结肠癌细胞，随后每周3次将抗hcd300cmab或同种型抗体对照注射到肿瘤注射部位中。随时间推移测量了肿瘤大小。(a)示出了指示时间点的平均肿瘤体积(mm3)+s.d.。(b-e)在研究结束时，将小鼠安乐死并切除结肠肿瘤。通过流式细胞术分析来自肿瘤的单细胞悬液中(b,c)cd4+和(d,e)cd8+t细胞的百分比。(f)对c57bl/6小鼠s.c.注射1x105个b16f10黑色素瘤细胞，随后一周三次瘤内注射抗hcd300cmab或同种型抗体对照。随时间推移测量了肿瘤大小。[0044]图9.tapbpl蛋白的表达模式。(a,b)免疫细胞上tapbpl蛋白表达的分析。新鲜收获来自c57bl/6小鼠的脾细胞，并分析静息免疫细胞上的tapbpl蛋白表达。为了获得活化的t细胞，将脾细胞与抗cd3(1μg/ml)和抗cd28(0.5μg/ml)抗体孵育3天。为了获得活化的b细胞、dc、单核细胞和巨噬细胞，将脾细胞与lps(10μg/ml)孵育3天。用抗tapbpl或同种型抗体(ab)，以及抗cd4、cd8、cd11b、f4/80、cd11c、b220或cd19对静息和活化的免疫细胞进行染色，以鉴定免疫细胞。(a)代表性流式细胞谱和(b)示出静息和活化的免疫细胞上tapbpl蛋白表达的统计分析。(c)使用抗tapbpl或同种型ab通过免疫组织化学测定正常和肿瘤人组织中的tapbpl蛋白表达。(d)通过流式细胞术分析神经-2a、lewis肺、p388、ct26和b16癌细胞系上的tapbpl蛋白表达。数据代表3个独立实验。(b)*与同种型ab相比p<0.05。**与静息细胞相比p<0.05。[0045]图10.htapbpl-ig蛋白在体外对t细胞增殖的影响。(a,b)通过磁分离从c57bl/6小鼠的脾细胞中纯化t细胞。将细胞在预涂覆有(a)抗cd3抗体(1μg/ml)或(b)抗cd3(1μg/ml)和抗cd28(0.5μg/ml)抗体的板上，在分级剂量的htapbpl-ig(10和15μg/ml)或等摩尔量的对照ig(3.75和5.63μg/ml)存在下培养3天。在收获前12小时将[3h]胸苷(1μci/孔)添加到培养基中。通过[3h]胸苷掺入测量t细胞增殖。(c-e)用cfse标记脾细胞，并在预涂覆有抗cd3抗体和htapbpl-ig或对照ig的96孔板中培养3天，如图3a所示。通过cd4+和cd8+t细胞分析细胞的cfse水平。(c)cd4+和cd8+t细胞的cfse分布的代表性流式细胞术分析，以及(d,e)(d)cd4和(e)cd8t细胞增殖的统计分析。(f)将纯化的人t细胞用板结合的抗人cd3抗体(1μg/ml)在分级剂量的htapbpl-ig(1.5和3μg/ml)或对照ig蛋白(1.5和3μg/ml)存在下培养3天。通过[3h]胸苷掺入测量细胞增殖。数据表示为平均值±sd，并且代表3个独立实验。*与对照ig相比p<0.05。[0046]图11.htapbpl-ig蛋白在体外对t细胞活化的影响。将来自c57bl/6小鼠的脾细胞用(a,b,e,f,i,j)抗cd3抗体(1μg/ml)或(c,d,g,h,k,l)抗cd3(1μg/ml)和抗cd28(0.5μg/ml)抗体在分级剂量的htapbpl-ig(10和15μg/ml)或等摩尔量的对照ig(3.75和5.63μg/ml)存在下对于(a-d)培养1天或对于(e-l)培养3天。分析细胞中cd4和cd8t细胞中(a-d)cd69+，(e-i,k)cd44hicd62llo和(e,g,i-l)cd44locd62lhi细胞的百分比。cd4和cd8t细胞中cd69+、cd44hicd62llo和cd44locd62lhi细胞的百分比的(a,c,e,g,i,k)代表性流式细胞术和(b,d,f,h,j,l)统计分析。数据表示为平均值±sd，并且代表3个独立实验。*与对照ig相比p<0.05。[0047]图12：htapbpl-ig减轻小鼠的自身免疫性疾病eae。用200μg在cfa中乳化的mog35-55和500ng纯化的百日咳杆菌毒素免疫c57bl/6小鼠。(a)从第0天，每周3次对小鼠i.p.注射25μghtapbpl-ig或对照ig蛋白。平均临床得分。(b-o)当出现eae症状时，每周3次对小鼠i.p.注射25μghtapbpl-ig或对照ig蛋白。(b)平均临床得分(c-o)在研究结束时，收获脾脏并分析(c和d)cd4+t细胞，(e和f)cd4+cd25+foxp3+tregs，(g和h)cd4+t细胞的cd69表达，以及(i,j)cd4+cd44hicd62llo效应子记忆和cd4+cd44locd62lhi原初t细胞。(k-n)分析cns浸润性(k和l)cd4+t细胞和(m和n)cd4+cd25+foxp3+tregs。(o)用分级剂量的mog35-55培养脾细胞72小时。在收获前12小时将[3h]胸苷(1μci/孔)添加到培养基中。通过[3h]胸苷掺入测量t细胞增殖。数据表示为平均值±sd，并且代表3个独立实验，其中n＝8/组。*与对照ig相比p<0.05。[0048]图13.抗htapbplmab在体内抑制肿瘤生长。(a)抗htapbplmab(克隆54)在体外中和htapbpl-ig对t细胞的增殖抑制作用。(b-h)对dba/2j小鼠s.c.注射1×105个p388白细胞细胞，随后每周3次注射抗htapbplmab(100μg)或对照ig(100μg)。(b)随时间推移测量了肿瘤大小。示出了指示时间点的平均肿瘤直径(mm3)+s.d.。(c-h)在研究结束时，收获肿瘤。通过流式细胞术分析肿瘤的单细胞悬液中(c,d)cd4+t细胞，(e,f)cd8+t细胞和(g和h)cd4+cd25+foxp3+tregs的百分比。数据表示为平均值±sd，并且代表具有相似结果的2个独立实验。*与同种型抗体相比p<0.05。[0049]图14.组织和免疫细胞中skint8mrna的表达模式。(a)从c57bl/6小鼠的指示组织中分离出rna。通过rt-pcr测定skint8mrna的表达。将gapdh用作上样对照。(b)从脾细胞中磁分离cd4+和cd8+t细胞、b220+b细胞、cd11b+单核细胞、f4/80+巨噬细胞和cd11c+dc。(c)为了活化t细胞，将纯化的cd4+或cd8+t细胞与抗cd3(1μg/ml)和抗cd28(0.5μg/ml)抗体孵育3天。为了活化b细胞、单核细胞、巨噬细胞或dc，将纯化的免疫细胞与lps(10μg/ml)孵育3天。从(b)静息和(c)活化的免疫细胞中分离rna。通过rt-pcr测定skint8mrna的表达。(d)通过qrt-pcr测定skint8mrna的表达。将每列均用gapdh归一化。*与静息细胞相比p<0.05。数据代表3个独立实验。[0050]图15.skint8推定受体的表达模式。(a,b)从c57bl/6小鼠收获脾细胞。为了获得活化的t细胞，将脾细胞与抗cd3(1μg/ml)和抗cd28(0.5μg/ml)抗体孵育3天。为了获得活化的b细胞、单核细胞和dc，将脾细胞与lps(10μg/ml)孵育3天。用生物素化skint8-ig或对照ig，随后是链霉亲和素pe，以及抗cd4、cd8、b220、cd11b或cd11c抗体对新鲜收获和活化的免疫细胞进行染色，以鉴定免疫细胞。(a)代表性流式细胞谱和(b)示出skint8-ig或对照ig与新鲜收获和活化的免疫细胞的结合的统计分析。(b)数据表示为skint8-ig与对照ig的细胞结合的相对荧光强度(rfi)。(c)用含有鼠pd-1、cd28、btla、ctla-4或icos基因的表达载体转染hek-293细胞，并筛选稳定表达每种基因的细胞。用分别抗pd-1、cd28、btla、ctla-4或icos蛋白的抗体(开放直方图)或同种型ab(阴影直方图)对转染的细胞进行染色。示出每种受体的表达的代表性流式细胞谱。(d)用生物素化skint8-ig或对照ig，随后是链霉亲和素pe对pd-1、cd28、btla、ctla-4或icos基因转染的hek-293细胞进行染色。示出skint8-ig(开放直方图)或对照ig蛋白(阴影直方图)与转染的细胞的结合的代表性流式细胞谱。数据代表3个独立实验。[0051]图16.skint8-ig蛋白在体外对t细胞增殖和活化的影响。(a)通过磁分离从c57bl/6小鼠的脾细胞中纯化t细胞。将细胞在预涂覆有(a)抗cd3抗体(1μg/ml)和分级剂量的skint8-ig(1840、3728、7456ng/ml)或等摩尔量的对照ig(990、1980、3960ng/ml)蛋白或(b)抗cd3(1μg/ml)和抗cd28(0.5μg/ml)抗体的板上，在skint8-ig或等摩尔量的对照ig存在下培养3天。在收获前12小时将[3h]胸苷(1μci/孔)添加到培养基中。通过[3h]胸苷掺入测量t细胞增殖。(c-e)用cfse标记脾细胞，并在指示剂量的skint8-ig或对照ig存在下，在抗cd3抗体预涂覆的96孔板中培养3天。通过cd4+和cd8+t细胞分析细胞的cfse水平。(c)cd4+和cd8+t细胞的cfse分布的代表性流式细胞术分析，以及(d,e)t细胞增殖的统计分析。(f,g)将纯化的cd4+或cd8+t细胞用抗cd3抗体和分级剂量的skint8-ig或等摩尔量的对照ig蛋白培养3天。通过[3h]胸苷掺入测量t细胞增殖，如(a)所述。(h-l)将脾细胞用(h,i)抗cd3抗体或(j-l)抗cd3和抗cd28抗体在skint8-ig或对照ig存在下培养。24小时后分析细胞的cd69的表达。(h,j)代表性流式细胞谱，和(i,k,l)cd4+或cd8+t细胞中cd69+细胞的百分比的统计分析。数据表示为平均值±sd，并且代表3个独立实验。*与对照ig相比p<0.05。[0052]图17.skint8-ig蛋白在体外对由t细胞产生细胞因子的影响。将纯化的鼠t细胞用板结合的(a-c)抗cd3抗体(1μg/ml)在skint8-ig(3728ng/ml)或等摩尔量的对照ig(1980ng/ml)存在下，或者(d,e)抗cd3(1μg/ml)和抗cd28(0.5μg/ml)抗体在skint8-ig(6μg/ml)或等摩尔量的对照ig存在下培养3天。(a)通过elisa试剂盒测量上清液中ifnγ和tnfα的水平(pg/ml)。(b-e)收获前4小时用豆蔻酰佛波醇乙酯和离子霉素刺激t细胞，并且然后用抗cd4、ifnγ和tnfα的抗体进行染色。通过流式细胞术测定cd4+t细胞中细胞因子阳性细胞的百分比。(b,d)代表性流式细胞谱，和(c,e)cd4+t细胞中细胞因子的百分比的统计分析。数据表示为平均值±sd，并且代表3个独立实验。*与对照ig相比p<0.05。[0053]图18.skint8-ig减轻小鼠的eae。用200μg在cfa中乳化的mog35-55和500ng纯化的百日咳杆菌毒素免疫c57bl/6小鼠。从第0天，每周3次对小鼠i.p.注射25μgskint8-ig或对照ig蛋白。监测eae发展。(a)平均临床得分，(b-e)在免疫后35天，收获脾脏并分析(b,c)cd4t细胞的cd69表达和(d,e)cd44locd62lhi原初和cd44hicd62llo效应子记忆cd4t细胞。(f-s)在单独的实验中，在(f-i,n)eae的初免时间(第10天)或(j-m,o,p-s)峰值时间(第22天)处死eae小鼠组。检查(f,g,j,k)脾脏中cd4+t细胞的百分比，和(h,i,l,m)cd4+t细胞中cd4+cd25+foxp3+tregs的百分比。(n,o)将脾cd4+t细胞用mog(20μg/ml)在体外刺激三天；通过elisa分析上清液中所指示细胞因子的产生。分析(p-s)cns浸润性(p,q)cd4+t细胞和(r,s)cd4+cd25+foxp3+tregs。数据合并自2个独立实验(分别对于skint8-ig或对照ig组，n＝8)。*与对照ig治疗的小鼠相比p<0.05。[0054]图19.btn5蛋白的表达模式。(a)免疫细胞上mbtn5蛋白表达的分析。新鲜收获来自c57bl/6小鼠的脾细胞，并分析静息免疫细胞上的mbtn5蛋白表达。为了获得活化的b细胞、dc、单核细胞和巨噬细胞，将脾细胞与lps(10μg/ml)孵育3天。为了获得活化的t细胞，将脾细胞与抗cd3抗体(1μg/ml)和抗cd28抗体(0.5μg/ml)孵育3天。用抗btn5或同种型抗体，以及抗cd4、cd8、b220、cd11c或cd11b抗体对静息和活化的免疫细胞进行染色，以鉴定免疫细胞。示出静息和活化的免疫细胞上mbtn5蛋白的表达的代表性流式细胞谱。通过免疫组织化学(b,c)测定人(b)正常和(c)癌组织中的hbtn5蛋白表达。(d)通过流式细胞术分析神经-2a、lewis肺、p388、k562、ct26和b16肿瘤细胞系上的btn5蛋白表达。数据代表3个独立实验。[0055]图20.mbtn5推定受体的表达模式。(a)新鲜收获来自c57bl/6小鼠的脾细胞，并分析静息免疫细胞。对于t细胞活化，将脾细胞与抗cd3(1μg/ml)和抗cd28(0.5μg/ml)抗体孵育3天。对于b细胞、dc和单核细胞的活化，将脾细胞与lps(10μg/ml)孵育3天。用抗cd4、cd8、b220、cd11c或cd11b抗体和生物素化mbtn5-ig或对照ig，随后是链霉亲和素pe对静息和活性免疫细胞进行染色。示出mbtn5-ig或对照ig与静息和活化的免疫细胞的结合的代表性流式细胞谱。(b,c)用含有鼠pd-1、cd28、btla、ctla-4或icos基因的表达载体转染hek-293细胞。用(b)分别抗pd-1、cd28、btla、ctla-4或icos蛋白的抗体，(c)生物素化的mbtn5-ig或对照ig，随后是链霉亲和素-pe对转染的细胞进行染色。示出(b)这些抗体或(c)mbtn5-ig与转染的细胞的结合的代表性流式细胞谱。代表3次独立实验。[0056]图21.mbtn5-ig蛋白在体外对鼠t细胞增殖和活化的影响。(a)通过磁分离从c57bl/6小鼠的脾细胞中纯化t细胞。将细胞在预涂覆有抗cd3抗体(1μg/ml)和指示剂量的mbtn5-ig或对照ig的板上培养3天。在收获前12小时将[3h]胸苷(1μci/孔)添加到培养基中。通过[3h]胸苷掺入测量t细胞增殖。结果表示为每分钟计数(cpm)。(b-d)用cfse标记来自c57bl/6小鼠的脾细胞，并在预涂覆有抗cd3抗体和指示剂量的mbtn5-ig或对照ig的96孔板中培养3天。通过cd4+和cd8+t细胞分析细胞的cfse水平。(b)cd4+和cd8+t细胞的cfse分布的代表性流式细胞术分析，以及(c,d)增殖cd4和cd8t细胞的百分比的统计分析。(e-k)在mbtn5-ig或对照ig(1728ng/ml)存在下用抗cd3抗体培养脾细胞。24小时后分析细胞的(e,f)cd69的表达，(g-k)72小时后分析cd44和cd62l的表达。(f)cd69+，(h,i)cd44locd62lhi原初cd4和cd8t细胞和(j,k)cd44hicd62llo有效记忆cd4和cd8t细胞的(e,g)代表性流式细胞术和(f,h-k)统计分析。数据表示为平均值±sd，并且代表3个独立实验。*与对照ig相比p<0.05。[0057]图22.hbtn5-ig蛋白在体外对鼠和人t细胞的影响。(a)从c57bl/6小鼠的脾细胞纯化t细胞，并在预涂覆有抗cd3抗体(1μg/ml)和指示剂量的hbtn5-ig或对照ig的板上培养3天。在收获前12小时将[3h]胸苷(1μci/孔)添加到培养基中，并通过[3h]胸苷掺入测量t细胞增殖。(b-d)用cfse标记鼠脾细胞，并在预涂覆有抗cd3抗体和指示剂量的hbtn5-ig或对照ig的96孔板中培养3天。通过cd4+和cd8+t细胞分析细胞的cfse水平。(b)cd4+和cd8+t细胞的cfse分布的代表性流式细胞术分析，以及(c,d)cd4+和cd8+t细胞增殖的统计分析。(e)将纯化的人t细胞用板结合的抗人cd3抗体(1μg/ml)在指示剂量的hbtn5-ig蛋白或对照ig蛋白存在下培养3天。通过[3h]胸苷掺入测量细胞增殖。(f)hbtn5-ig蛋白抑制t细胞产生细胞因子。将纯化的鼠t细胞用板结合的抗cd3抗体(1μg/ml)在6.4μg/mlhbtn5-ig蛋白或对照ig蛋白存在下培养3天。通过elisa试剂盒测量上清液中ifnγ、tnfα、il-2和il-10的水平。数据表示为平均值±sd，并且代表3个独立实验。*与对照ig相比p<0.05。[0058]图23.hbtn5在体外对巨噬细胞功能和分化以及在体内对肿瘤生长的影响。(a,b)巨噬细胞由c57bl/6小鼠的bm产生。用cfse标记k562癌细胞，并用巨噬细胞在抗hbtn5或对照抗体(10μg/ml)存在下培养2小时。(a)代表性流式细胞谱和(b)示出f4/80+巨噬细胞中cfse+细胞的百分比的统计数据。(c,d)在hbtn5或对照ig(5或10μg/ml)存在下，诱导m0巨噬细胞分化为m2。(c)代表性流式细胞谱和(d)示出f4/80+细胞中cd206himhciilom2巨噬细胞的百分比的统计数据。(e)用含有全长hbtn5基因的表达载体转染ct-26结肠癌细胞，并筛选稳定表达btn5的癌细胞。示出细胞表面上的hbtn5蛋白表达的代表性流式细胞谱。(f-h)对balb/c小鼠s.c.注射2x105个hbtn5转染的ct-26细胞。当肿瘤可触知时，从肿瘤接种后第10-28天，每周两次对小鼠瘤内注射抗hbtn5或对照多克隆抗体(25μl)。(f)示出了指示时间点的平均肿瘤体积(mm3)+s.d.。(g,h)在ct26细胞接种后30天，将小鼠安乐死并切除肿瘤。通过流式细胞术分析来自肿瘤的单细胞悬液的(g)cd4+和cd8+t细胞；和(h)m2巨噬细胞。*与对照组相比p<0.05。数据代表2个独立的实验，其中每组4-6只小鼠。[0059]图24：hbtn5-ig减轻小鼠的自身免疫性疾病eae。用200μg在cfa中乳化的mog35-55和500ng纯化的百日咳杆菌毒素免疫c57bl/6小鼠。每周3次对小鼠i.p.注射25μg/mlhbtn5-ig或对照ig蛋白持续5周。监测eae发展42天。示出了(a)平均临床得分，和(b)无疾病小鼠比例的卡普兰-迈耶图。(c-p)在免疫后42天，收获脊髓和脾脏。(c,d)用h&e、lfb和bsi对脊髓的组织切片进行染色。示出了(c)代表性染色组织切片(放大倍数为200×)，和(d)组织学得分。(e-h)分析脾细胞的cd44locd62lhi原初、cd44hicd62llo有效记忆和cd44hicd62lhi中央记忆(g)cd4和(h)cd8t细胞；(i,j)cd4+cd25+foxp3+tregs；和(k,l)精氨酸酶+和cd206himhclom2，以及cd206lomhchim1巨噬细胞。(m,n)用cfse标记脾细胞，并在体外用不同剂量的pmog35-55刺激脾细胞。3天后分析cfse稀释，以确定cd4+和cd8+t细胞增殖反应。(o,p)将脾细胞用pmog35-55在体外刺激3天。通过流式细胞术分析细胞中产生细胞因子的细胞的百分比。数据表示为平均值±sd，并且代表3个独立实验。*与对照ig治疗的小鼠相比p<0.05。[0060]图25：hbtn5-ig治疗改善小鼠的t1d。以2天间隔对22周龄的磁性nod小鼠i.p.注射30μghbtn5-ig或对照ig蛋白持续3周。在第30周，将小鼠安乐死。(a)用苏木精和曙红(h&e)对胰腺进行染色。代表性切片(200x)。(b-g)分析脾脏的(b-e)t细胞和(f,g)巨噬细胞亚群。(b-e)cd44locd62lhi原初、cd44hicd62llo有效记忆和cd44hicd62lhi中央记忆cd4和cd8t细胞，以及(f,g)cd206himhclom2和cd206lomhchim1巨噬细胞的(b,d,f)代表性流式细胞谱和(c,e,g)统计分析。数据表示为平均值±sd，并且代表每组2个独立实验。*与对照ig治疗的小鼠相比p<0.05。[0061]图26.抗hbtn-5mab在体外增强巨噬细胞介导的癌细胞的吞噬作用。巨噬细胞由c57bl/6小鼠的bm产生。用cfse标记k562癌细胞，并用巨噬细胞在抗hbtn5mab(克隆d4和d16)存在下培养2小时。(a)代表性流式细胞谱(抗hbtn5mab：开放直方图；对照mab：阴影直方图)和(b)f4/80+巨噬细胞中cfse+细胞的百分比的统计数据。数据表示为平均值±sd，并且合并自3个独立实验。*与对照mab相比p<0.05。[0062]图27.cd300f-ig蛋白在体外抑制淋巴细胞增殖。(k)将来自c57bl/6小鼠的脾细胞用板结合的抗cd3抗体(1μg/ml)在分级剂量的cd300f-ig蛋白(800、1600和3200ng/ml)或等摩尔量的对照ig蛋白存在下培养3天。通过[3h]胸苷掺入测量细胞增殖。数据表示为平均值±sd，并且代表3个独立实验。[0063]图28.cd300f-ig蛋白在体外抑制t细胞增殖。用cfse标记来自c57bl/6小鼠的脾细胞，并用抗cd3抗体(1μg/ml)在分级剂量的cd300f-ig蛋白(800、1600和3200ng/ml)或等摩尔量的对照ig蛋白存在下培养3天。用抗cd4和cd8抗体对细胞进行染色，并通过cd4+和cd8+t细胞分析cfse水平。(a,c)代表性流式细胞谱，和(b,d)cfselo增殖(a,b)cd4+和(c,d)cd8+t细胞的统计分析。(b,d)数据表示为平均值±sd，并且代表3个独立实验。[0064]图29.cd300f-ig蛋白在体外抑制t细胞活化。将来自c57bl/6小鼠的脾细胞用板结合的抗cd3抗体(1μg/ml)或抗cd3抗体(1μg/ml)和(b)抗cd28抗体(0.5μg/ml)在分级剂量的cd300f-ig蛋白(800、1600和3200ng/ml)或等摩尔量的对照ig蛋白存在下培养。24小时后，分析细胞的(a,b)cd4+和(c,d)cd8+t细胞的cd69表达。(b,d)数据表示为平均值±sd，并且代表3个独立实验。具体实施方式[0065]如本文所用且除非另有说明，否则不使用数量词修饰时意指“一个”、“至少一个”或“一个或多个”。除非上下文另有要求，否则本文所用的术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。[0066]除非上下文清楚地另外要求，否则在整个说明书和权利要求中，词语“包括”、“包含”等应在包含性的意义上解释，而不是在排他性或穷举的意义上；也就是说，在“包含但不限于”的意义上解释。使用单数或复数的词还分别包括复数或单数。另外，词语“本文”、“以上”和“以下”以及类似含义的词语在本申请中使用时，应指本申请作为一个整体，而不是本申请的任何特定部分。[0067]如本文所用，氨基酸残基缩写如下：丙氨酸(ala；a)、天冬酰胺(asn；n)、天冬氨酸(asp；d)、精氨酸(arg；r)、半胱氨酸(cys；c)；谷氨酸(glu；e)、谷氨酰胺(gln；q)、甘氨酸(gly；g)；组氨酸(his；h)、异亮氨酸(ile；i)、亮氨酸(leu；l)、赖氨酸(lys；k)、蛋氨酸(met；m)、苯丙氨酸(phe；f)、脯氨酸(pro；p)、丝氨酸(ser；s)、苏氨酸(thr；t)、色氨酸(trp；w)、酪氨酸(tyr；y)和缬氨酸(val；v)。[0068]本发明任何方面的所有实施方案均可以组合使用，除非上下文明确另有规定。[0069]在第一个方面，本公开提供了用于治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用抗体，该抗体选择性地结合到选自cd300c、btn5(红细胞膜相关蛋白)、tapbpl(抗原处理(tap)结合蛋白样蛋白)、skint8(选择和维持上皮内t细胞8蛋白)和/或cd300f的蛋白质，其量对治疗癌症有效。这些方法可以用于治疗任何合适的癌症。在各种非限制性实施方案中，癌症可以选自乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、白血病、神经母细胞瘤、肝癌、淋巴瘤、宫颈癌、卵巢癌、胃癌和食道癌等。[0070]肿瘤进展往往伴随着深刻的免疫抑制，其干扰有效的抗肿瘤反应和肿瘤消除。相比之下，当免疫系统主动靶向并破坏自身组织时，就会出现移植物抗宿主病(gvhd)和自身免疫性疾病，诸如1型糖尿病(t1d)、关节炎(包括但不限于类风湿性关节炎(ra))和多发性硬化症(ms)。为了引出对癌症和感染的保护性免疫，并防止过度活跃的免疫系统，免疫反应需要由免疫细胞刺激和抑制分子严格控制。许多癌症通过产生抑制分子抑制t细胞功能来保护自身免受免疫系统的影响。[0071]如本文实施例中所公开，发明人已将cd300c、btn5、tapbpl、skint8和cd300f鉴定为用于治疗癌症的靶标，以及用于治疗自身免疫性疾病的治疗剂。[0072]如本文所用，术语“治疗”意指逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止正在治疗的病症的症状或病状的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或减轻病状的至少一种不良作用或症状。如果一种或多种症状减少，则治疗通常是“有效的”。可替代地，如果病状的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”可以不仅包括症状的改善，还包括与在没有治疗的情况下预期症状的进展或恶化的停止或减缓。有益或期望的临床结果包括但不限于与没有治疗的情况下的预期相比，减轻一个或多个症状，缩小缺陷的程度，稳定(即不恶化)肿瘤、恶性肿瘤或自身免疫性疾病的状态；延缓或减缓肿瘤生长和/或转移或自身免疫性疾病影响，以及延长寿命。[0073]如本文所用，术语“施用”是指通过被认为适当的方法或途径将治疗剂置于受试者体内。治疗剂可以通过在受试者中产生有效治疗的任何适当的途径施用，包括以含有常规的药学上可接受的载体、佐剂和媒介物的剂量单位制剂的口服、胃肠外、通过吸入喷雾、直肠或局部。如本文所用的术语肠胃外包括皮下、静脉内、动脉内、肌内、胸骨内、腱内、脊柱内、颅内、胸内、输注技术或腹膜内。可以调整剂量方案以提供最佳所期望反应(例如，治疗反应)。合适的剂量范围可以例如是0.1ug/kg-100mg/kg体重；可替代地，其可以是0.5ug/kg至50mg/kg；1ug/kg至25mg/kg，或5ug/kg至10mg/kg体重。治疗剂可以在单次推注中递送，或者可以如由主治医师所确定多于一次(例如，2、3、4、5或更多次)进行施用。[0074]如本文所用，短语“有效量”等是指在治疗癌症或自身免疫性疾病方面提供治疗益处的量。确定治疗有效量完全在本领域技术人员的能力范围内。一般来讲，治疗有效量可以随受试者的病史、年龄、病状、性别以及受试者的病情严重程度和类型以及其他药物活性剂的施用而变化。[0075]如本文所用，术语“抗体”是指具有至少一个抗原结合结构域的结合蛋白，并且包括单克隆抗体片段和/或其变体，包括重组多肽、融合蛋白和免疫缀合物。因此，术语“抗体”、“抗体片段”和“抗体变体”在本文中可互换使用。本发明抗体片段的实例包括但不限于由vl、vh、cl和chi结构域组成的fab片段；由vh和chi结构域组成的fc片段；由vl和vh组成的fv片段；由vh结构域组成的dab片段；分离的cdr区；f(ab′)2，包含两个连接的fab片段的二价片段；以及单链fv分子(scfv)。本文提供的抗体可以从任何物种产生，其包括但不限于小鼠、大鼠、兔、灵长类动物、美洲驼和人。这些抗体可以是嵌合、人源化或完整的人抗体。在一个具体实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在其他具体实施方案中，该抗体可以是本文公开和要求保护的抗cd300c和/或抗tapbpl抗体。[0076]如本文所用，选择性结合或特异性结合意指特异性地结合到其靶抗原的抗体不会被非相似的竞争者替换，并优先地识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的其靶抗原。对本文所述的靶抗原具有选择性的抗体及其片段以比任何其他靶标更大的亲和力(即，更低的结合亲和力kd值)结合靶抗原。在非限制性实施方案中，这些抗体及其片段或变体可以对靶抗原具有在约0.01nm至约500nm、约0.02nm至约250nm、约0.02至约200nm、约0.05至约100nm、约0.05至约50nm范围内的结合亲和力kd值。这些抗体及其片段可以对靶抗原具有约500nm、约250nm、约200nm、约150nm、约100nm、约75nm、约50nm、约25nm、约10nm、约5nm、约1nm、约500pm、约250pm、约100pm、约50pm或约10pm的结合亲和力kd值。这些抗体及其片段可以对靶抗原具有约100nm或更小、约75nm或更小、约50nm或更小、约10nm或更小、约1nm或更小、约500pm或更小或者约100pm或更小的结合亲和力kd值。[0077]在一个实施方案中，抗体选择性地结合到cd300c的细胞外结构域(ecd)，包括但不限于氨基酸残基21-138内的人cd300c的ecd。在另一个实施方案中，抗体选择性地结合到cd300c的igv结构域，包括但不限于氨基酸残基20-135内的人cd300c的igv结构域。示例性cd300c序列如下所示：[0078]小鼠cd300c2氨基酸序列(ecm区：22-187，igv：24-116)；预测igv结构域从aa20-28至aa112-140：[0079][0080]人cd300c氨基酸序列(ecm区：21-183，igv：22-128)；预测igv结构域从aa20-28至aa114-135：[0081][0082]在一个实施方案中，该抗体选择性地结合到btn5的细胞外结构域，包括但不限于氨基酸残基30-155内的人btn5的ecd。在另一个实施方案中，该抗体选择性结合到btn5的igv结构域，包括但不限于氨基酸残基17-150内的人btn的igv结构域。示例性btn5序列如下所示：[0083]小鼠btn5氨基酸序列(信号肽：1-47；ecm区：48-271，igv：49-165)；预测igv结构域从氨基酸(aa)49-68至aa151-170。[0084][0085]人btn5氨基酸序列(ecm30-155，igv：30-144)；预测igv结构域从aa17-45至aa143-150：[0086][0087]在一个实施方案中，抗体选择性地结合到tapbpl的细胞外结构域，包括但不限于氨基酸残基19-405内的人tapbpl的ecd。在另一个实施方案中，该抗体选择性结合到tapbpl的igv结构域，包括但不限于氨基酸残基181-300内的人tapbpl的igv结构域。示例性tapbpl序列如下所示：[0088]小鼠tapbpl氨基酸序列(ecm区：21-412，igv：196-305)；预测igv结构域从aa196-210至aa301-306。[0089][0090]人tapbpl氨基酸序列(ecm区：19-405，igv：198-300)；预测igv结构域从aa181-198至aa297-300：[0091][0092]在一个实施方案中，该抗体选择性结合到skint8的细胞外结构域，包括但不限于氨基酸残基26-233内的小鼠skint8的ecd。在另一个实施方案中，该抗体选择性结合到skint8的igv结构域，包括但不限于氨基酸残基18-142内的小鼠skint8的ecd。示例性skint8序列如下所示：[0093]小鼠skint8氨基酸序列(ecm区：26-233，igv：29-140)；预测igv结构域从aa18-35至aa140-142：[0094][0095]在一个实施方案中，该抗体选择性结合到cd300f的细胞外结构域，包括但不限于氨基酸残基20-155内的人cd300f的ecd。在另一个实施方案中，该抗体选择性结合到cd300f的igv结构域，包括但不限于氨基酸残基2-140内的人cd300f的igv结构域。示例性cd300f序列如下所示：[0096]人cd300f氨基酸序列(ecm区：20-155，igv：24-125)；预测igv结构域从aa2-25至aa125-140：[0097][0098]在另一个方面，本公开提供了分离的抗人cd300c抗体或其抗原结合片段，其包含1、2、3、4、5或全部6个选自以下的互补决定区(cdr)：[0099]重链cdr1(h-cdr1)，其包含与氨基酸序列iygmn(seqidno:10)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；[0100]重链cdr2(h-cdr2)，其包含与氨基酸序列wintyt(seqidno:11)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；[0101]重链cdr3(h-cdr3)，其包含与氨基酸序列arsrfay(seqidno:12)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；[0102]轻链cdr1(l-cdr1)，其包含与氨基酸序列kasqnvgtnva(seqidno:13)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；[0103]轻链cdr2(l-cdr2)，其包含与氨基酸序列sasyrys(seqidno:14)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；和[0104]轻链cdr3(l-cdr3)，其包含与氨基酸序列qqynsyplt(seqidno:15)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。[0105]如以下的实施例所示，公开的抗体是第一批被证明具有中和cd300c对t细胞抑制作用能力的抗体。这些抗体的序列已被确定，包括本文公开的互补决定区(cdr)。如本领域技术人员所理解的，cdr是抗原结合选择性的关键因素，并且因此抗体氨基酸序列的其他区域可以被显著修饰。在另一个实施方案中，抗人cd300c抗体或其抗原结合片段包含：[0106](a)重链，其包含沿seqidno:16的氨基酸序列的全长具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列[0107][0108]no:16；cdr被加亮)；和/或[0109](b)轻链，其包含沿seqidno:17的氨基酸序列的全长具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。[0110][0111]cdr被加亮)。[0112]在一个实施方案中，与参考序列相比的变异性仅存在于cdr之外。[0113]在另一个方面，本公开提供了分离的抗人tapbpl抗体或其抗原结合片段，其包含1、2、3、4、5或全部6个选自以下的互补决定区(cdr)：[0114]重链cdr1(h-cdr1)，其包含与氨基酸序列gyfwh(seqidno:18)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；[0115]重链cdr2(h-cdr2)，其包含与氨基酸序列yisysgttnynpslkn(seqidno:19)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；[0116]重链cdr3(h-cdr3)，其包含与氨基酸序列ddwdwfay(seqidno:20)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；[0117]轻链cdr1(l-cdr1)，其包含与氨基酸序列sasssvnymh(seqidno:21)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；[0118]轻链cdr2(l-cdr2)，其包含与氨基酸序列dtsklas(seqidno:22)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；和[0119]轻链cdr3(l-cdr3)，其包含与氨基酸序列fqgsgyplt(seqidno:23)至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。[0120]如以下的实施例所示，公开的抗体是第一批被证明具有中和tapbpl对t细胞抑制作用能力的抗体。这些抗体的序列已被确定，包括本文公开的互补决定区(cdr)。在另一个实施方案中，抗人tapbpl抗体或其抗原结合片段包含：[0121](a)重链，其包含沿seqidno:24的氨基酸序列的全长具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：[0122][0123]idno:24；cdr被加亮)；和/或[0124](b)轻链，其包含沿seqidno:25的氨基酸序列的全长具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。[0125][0126]cdr被加亮)。[0127]在一个实施方案中，与参考序列相比的变异性仅存在于cdr之外。[0128]在这些方面的一个具体实施方案中，该抗体可以是单克隆抗体或其抗原结合片段，和/或可以是人源化抗体或其抗原结合片段。[0129]在一些实施方案中，这些抗体及其片段(在本公开的组合物或方法中)缀合至一种或多种药剂，该一种或多种药剂选自包括另外的治疗剂(诸如化学治疗剂)的组。“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括烷基化剂，诸如塞替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐，诸如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯(尤其是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素(bryostatin)；凯利他汀(callystatin)；cc-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物kw-2189和cb1-tm1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；潘卡他汀(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如卡里奇霉素，尤其是卡里奇霉素γ1i和卡里奇霉素ωi1)(参见例如agnew,chem.intl.ed.engl.[英文版国际化学反应],33:183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素a；二膦酸盐(bisphosphonate)，诸如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素c(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素d(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧-l-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉并-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(诸如丝裂霉素c)、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸盐(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺剂，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinicacid)；醋葡内酯(aceglaone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地佛法明(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；依利醋铵(elliptiniumacetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；洛尼代宁(lonidamine)；美登木素生物碱，诸如美登素和安丝菌素(ansamitocin))；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(jhsnaturalproducts,eugene,oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2′,2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素(trichothecene)(尤其是t-2毒素、verracurina、杆孢菌素a和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“ara-c”)；环磷酰胺；紫杉烷(taxoid)，例如紫杉醇、无氢化蓖麻油白蛋白工程化纳米颗粒紫杉醇制剂(americanpharmaceuticalpartners,schaumberg,ill.)和多西他赛；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞宾(vinorelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；cpt-11；拓扑异构酶抑制剂rfs2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类维生素a，诸如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。定义中还包括蛋白酶体抑制剂，诸如硼替佐米(velcade)、bcl-2抑制剂、iap拮抗剂(例如斯smac模拟物/xiap和ciap抑制剂，诸如某些肽、吡啶化合物，诸如(s)--n-{6-苯并[1,3]二氧杂-5-基-1-[5-(4-氟-苯甲酰基)-吡啶-3-基甲基-l]-2-氧代-1,2-二氢-吡啶-3-基}-2-甲基氨基-丙酰胺，xiap反义)、hdac抑制剂(hdaci)和激酶抑制剂(索拉非尼)。[0130]在另一些实施方案中，这些抗体及其片段连接到可检测的标记，诸如放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和/或生物素。[0131]在一些实施方案中，该药剂和/或可检测的标记直接缀合到这些抗体或其片段。在另一些实施方案中，该药剂和/或可检测的标记经由接头缀合到这些抗体或其片段。合适的接头包括但不限于本文公开的氨基酸和多肽接头。接头可以是可裂解的或不可裂解的。[0132]在另一方面，本公开提供了用于治疗自身免疫性病症的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效治疗自身免疫性病症的量的以下中的一种或多种：[0133](a)来自蛋白质的igv结构域，该蛋白质选自cd300c、btn5(红细胞膜相关蛋白)、tapbpl(抗原处理(tap)结合蛋白样蛋白)、skint8(选择和维持上皮内t细胞8蛋白)和cd300f；和/或[0134](b)包含启动子的表达载体，该启动子可操作地连接到编码蛋白质的核酸序列，该蛋白质选自cd300c、btn5(红细胞膜相关蛋白)、tapbpl(抗原处理(tap)结合蛋白样蛋白)、skint8(选择和维持上皮内t细胞8蛋白)和/或cd300f。[0135]在一个实施方案中，igv结构域包含来自cd300c的igv结构域。在另一个实施方案中，igv结构域包含人cd300c的氨基酸28-114。在另一个实施方案中，igv结构域包含人cd300c的氨基酸22-128。在一个实施方案中，该方法包括给受试者施用包含人cd300c的残基21-183的多肽或编码人cd300c的残基21-183的表达载体。示例性cd300c序列为seqidno:1-2。在另一个实施方案中，该方法包括给受试者施用包含氨基酸序列的多肽或编码该氨基酸序列的表达载体，该氨基酸序列沿seqidno:26的氨基酸序列的全长具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。[0136]人cd300c-ig融合蛋白氨基酸序列(hcd300c：小写，ig：大写)：[0137][0138]在一个实施方案中，igv结构域包括来自btn5的igv结构域。在另一个实施方案中，igv结构域包含人btn5的氨基酸45-143。在另一个实施方案中，igv结构域包含人btn5的氨基酸30-144。在一个实施方能中，该方法包括给受试者施用包含人btn5的残基30-155的多肽或包含启动子的表达载体，该启动子可操作地连接到编码包含人btn5的残基30-155的多肽的核酸序列。示例性btn5氨基酸序列在seqidno:3-4中提供。在另一个实施方案中，该方法包括给受试者施用包含氨基酸序列的多肽或编码该氨基酸序列的表达载体，该氨基酸序列沿seqidno:27的氨基酸序列的全长具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。[0139]人btn5-ig融合蛋白氨基酸序列(hbtn5：小写，ig：大写)：[0140][0141]在一个实施方案中，igv结构域包括来自tapbpl的igv结构域。在另一个实施方案中，igv结构域包含人tapbpl的氨基酸198-297。在另一个实施方案中，igv结构域包含人tapbpl的氨基酸198-300。在一个实施方案中，该方法包括给受试者施用包含人tapbpl的残基19-405的多肽或编码人tapbpl的残基19-405的表达载体。示例性tapbpl氨基酸序列在seqidno:5-6中提供。在另一个实施方案中，该方法包括给受试者施用包含氨基酸序列的多肽或编码该氨基酸序列的表达载体，该氨基酸序列沿seqidno:28的氨基酸序列的全长具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。[0142]人tapbpl-ig融合蛋白氨基酸序列(htapbpl：小写，ig：大写)：[0143][0144]在一个实施方案中，igv结构域包括来自skint8的igv结构域。在另一个实施方案中，igv结构域包含skint8的氨基酸35-140。在另一个实施方案中，igv结构域包含skint8的氨基酸29-140。在一个实施方案中，该方法包括给受试者施用包含skint8的残基26-233的多肽或编码skint8的残基26-233的表达载体。示例性skint8氨基酸序列在seqidno:7中提供。在另一个实施方案中，该方法包括给受试者施用包含氨基酸序列的多肽或编码该氨基酸序列的表达载体，该氨基酸序列沿seqidno:29的氨基酸序列的全长具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性[0145]小鼠skint8-ig融合蛋白氨基酸序列(小鼠skint8：小写，ig：大写)：[0146][0147]在一个实施方案中，igv结构域包含来自cd300f的igv结构域。在另一个实施方案中，igv结构域包含人cd300f的氨基酸2-140。在另一个实施方案中，igv结构域包含人cd300f的氨基酸24-125。在一个实施方案中，该方法包括给受试者施用包含人cd300f的残基20-155的多肽或编码人cd300f的残基20-155的表达载体。示例性cd300f氨基酸序列在seqidno:8中提供。在另一个实施方案中，该方法包括给受试者施用包含氨基酸序列的多肽或编码该氨基酸序列的表达载体，该氨基酸序列沿seqidno:9的氨基酸序列的全长具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性[0148]人cd300f-ig融合蛋白氨基酸序列(hcd300f：小写，ig：大写)：[0149][0150]在所有这些实施方案中，这些方法可以用于治疗任何合适的自身免疫性病症。在各种非限制性实施方案中，自身免疫性疾病可以选自多发性硬化症、i型糖尿病、关节炎(包括但不限于类风湿关节炎)、系统性红斑狼疮、克罗恩病、硬皮病、结节病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性心肌炎、皮肌炎、格雷夫斯病、干燥综合征和白癜风以及其他自身免疫性疾病。在一个实施方案中，这些方法进一步包括向受试者施用有效量的免疫调节剂以刺激t细胞功能。可以使用任何合适的免疫调节剂，包括但不限于抗cd3抗体。[0151]在另一方面，本公开提供了融合分子，其包含[0152](a)包含来自蛋白质的igv结构域的第一多肽，该蛋白质选自cd300c、btn5(红细胞膜相关蛋白)、tapbpl(抗原处理(tap)结合蛋白样蛋白)、skint8(选择和维持上皮内t细胞8蛋白)和cd300f，和[0153](b)异源分子。[0154]在一个实施方案中，第一多肽不包括cd300c、btn5、tapbpl、skint8或cd300f除ecm结构域之外的任何部分。在另一个实施方案中，异源分子包含第二多肽，其选自免疫球蛋白或其片段的恒定区(包括但不限于ch1、ch2和/或ch3；来自免疫球蛋白的fc区域，包括但不限于天然igg1、igg2或igg4)。在本实施方案中，免疫球蛋白或其片段通过例如帮助第一多肽靶向具有该免疫球蛋白或其片段选择性结合的细胞表面受体的细胞类型来增加功能性。因此，本实施方案的融合分子对于治疗应用特别有用。如本领域技术人员所理解的，可以采用任何合适的免疫球蛋白或其片段，其靶向感兴趣的细胞或组织。免疫球蛋白或其片段可以重组表达为多肽的一部分。在另一个实施方案中，异源分子包括感兴趣的有机分子。[0155]本文公开的融合分子可以用于例如本发明的方法中。在具体实施方案中，融合分子是包含第一多肽和第二多肽序列的融合蛋白。在一个实施方案中，第二多肽是免疫球蛋白或其片段的恒定区(例如，ch1、ch2和/或ch3)。在各种非限制性实施方案中，来自免疫球蛋白(包括但不限于igg1、igg2或igg4)的的fc区可以用于产生这种融合蛋白。在各种进一步的实施方案中，杂交igg4fc结构域可以用于产生这样的融合蛋白，经修饰的igg1fc结构域(例如，经修饰以改善与某些fcγ受体的结合的ig1；经修饰以使效应子功能最小化的igg1；具有改变的/无聚糖的igg1；与fcrn结合的ph依赖性改变的igg1)和经修饰的igg4fc结构域(例如，经修饰以防止与fcγ受体和/或补体结合的igg4)也可以。在另一些实施方案中，第一多肽可以作为靶向部分，以将治疗性第二多肽靶向感兴趣的细胞或组织靶标；此类治疗性第二多肽的非限制性实施方案包括但不限于干扰素-γ、干扰素-β、干扰素-α、白细胞介素-2(“il-2”)、白细胞介素-7(“il-7”)、白细胞介素-9(“il-9”)、白细胞介素-10(“il-10”)、白细胞介素-12(“il-12”)、白细胞介素-15(“il-15”)、白细胞介素-23(“il-23”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“gm-csf”)、粒细胞集落刺激因子(“g-csf”)或生长因子。[0156]在另一些实施方案中，该融合分子是融合蛋白或包含第一多肽和感兴趣的有机分子的缀合物(诸如经由接头)。在本实施方案中，第一多肽可以例如作为靶向部分，以靶向其与特定器官或组织(例如，淋巴器官或组织)融合或缀合的有机分子。所附附录提供了关于表达第一多肽的器官和组织的信息。与第一多肽融合或缀合的有机分子可以是本领域技术人员感兴趣的靶向特定器官或组织的分子(例如，细胞因子、药物、标记物等)。[0157]在一个实施方案中，第一多肽包含来自cd300c的igv结构域。在另一个实施方案中，igv结构域包含人cd300c的氨基酸28-114。在另一个实施方案中，igv结构域包含人cd300c的氨基酸22-128。在一个实施方案中，第一多肽包含人cd300c的残基21-183。示例性cd300c氨基酸序列在seqidno:1-2中提供。在另一个实施方案中，融合分子包含沿seqidno:26的氨基酸序列的全长具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。[0158]人cd300c-ig融合蛋白氨基酸序列(hcd300c：小写，ig：大写)：[0159][0160]在一个实施方案中，第一多肽包含来自btn5的igv结构域。在另一个实施方案中，igv结构域包含人btn5的氨基酸45-143。在另一个实施方案中，igv结构域包含人btn5的氨基酸30-144。在一个实施方案中，第一多肽包含人btn5的残基30-155。示例性btn5氨基酸序列在seqidno:3-4中提供。在另一个实施方案中，融合分子包含沿seqidno:27的氨基酸序列的全长具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。[0161]人btn5-ig融合蛋白氨基酸序列(hbtn5：小写，ig：大写)：[0162][0163]在一个实施方案中，第一多肽包含来自tapbpl的igv结构域。在另一个实施方案中，igv结构域包含人tapbpl的氨基酸198-297。在另一个实施方案中，igv结构域包含人tapbpl的氨基酸198-300。在一个实施方案中，第一多肽包含人tapbpl的残基19-405。示例性tapbpl氨基酸序列在seqidno:5-6中提供。在另一个实施方案中，融合分子包含沿seqidno:28的氨基酸序列的全长具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。[0164]人tapbpl-ig融合蛋白氨基酸序列(htapbpl：小写，ig：大写)：[0165][0166]在一个实施方案中，第一多肽包含来自skint8的igv结构域。在另一个实施方案中，igv结构域包含skint8的氨基酸35-140。在另一个实施方案中，igv结构域包含skint8的氨基酸29-140。在一个实施方案中，第一多肽包含skint8的残基26-233。示例性skint8氨基酸序列在seqidno:7中提供。在另一个实施方案中，融合分子包含沿seqidno:29的氨基酸序列的全长具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。[0167]小鼠skint8-ig融合蛋白氨基酸序列(小写，ig：大写)：[0168][0169]在一个实施方案中，igv结构域包含来自cd300f的igv结构域。在另一个实施方案中，igv结构域包含人cd300f的氨基酸2-140。在另一个实施方案中，igv结构域包含人cd300f的氨基酸24-125。在一个实施方案中，第一多肽包含人cd300f的残基20-155。示例性cd300f氨基酸序列在seqidno:8中提供。在一个实施方案中，融合分子包含沿seqidno:9的氨基酸序列的全长具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。[0170]人cd300f-ig融合蛋白氨基酸序列(hcd300f：小写，ig：大写)：[0171][0172]正如在整个本应用中所使用的那样，“多肽”一词在最广泛的意义上是指一系列亚基氨基酸，无论是自然发生的还是合成的。本发明的多肽可以包含l-氨基酸、d-氨基酸(其在体内对l-氨基酸特异性蛋白酶具有抗性)或d-和l-氨基酸的组合。本文所述的多肽可以化学合成或重组表达。这些多肽可以连接到其他化合物，以诸如通过聚乙二醇化、糖基化、磷酸化或糖基化促进体内半衰期的增加。如本领域技术人员所理解的，这种连接可以是共价或非共价的。这些多肽可以连接到任何其他合适的接头，包括但不限于可以用于纯化或检测的任何接头(诸如flag或his标签)。[0173]在另一方面，本公开提供了编码抗体或融合分子的核酸，其中异源分子是本发明任何方面或实施方案的多肽。该核酸序列可以包含rna或dna。此类核酸序列可以包含用于促进编码的蛋白的表达和/或纯化的附加序列，包括但不限于polya序列、修饰的kozak序列以及编码表位标签、输出信号和分泌信号、核定位信号和质膜定位信号的序列。基于本文的教导，对于本领域技术人员而言，何种核酸序列将编码本文公开的抗体或融合分子是显而易见的。[0174]在另一方面，本公开提供了核酸表达载体，其包含可操作地连接到合适的控制序列的本公开任何实施方案的核酸。“重组表达载体”包括将核酸编码区或基因可操作地连接至能够实现基因产物表达的任何控制序列的载体。可操作地连接至本公开的核酸序列的“控制序列”是能够影响核酸分子的表达的核酸序列。控制序列不必与核酸序列邻接，只要所述控制序列起作用以引导所述核酸序列的表达即可。因此，例如，在启动子序列与核酸序列之间可以存在中间的未翻译但被转录的序列，并且仍然可以认为所述启动子序列“可操作地连接”至所述编码序列。其他此类控制序列包括但不限于聚腺苷酸化信号、终止信号和核糖体结合位点。此类表达载体可以是本领域已知的任何类型，包括但不限于质粒和基于病毒的表达载体。用于驱动所公开的核酸序列在哺乳动物系统中表达的控制序列可以是组成型的(由多种启动子中的任一种驱动，所述启动子包括但不限于cmv、sv40、rsv、肌动蛋白、ef)或诱导型的(由许多诱导型启动子中的任一种驱动，所述诱导型启动子包括但不限于四环素、蜕皮激素、类固醇响应性)。表达载体必须可作为附加体或通过整合到宿主染色体dna中在宿主生物体中复制。在一个实施方案中，该表达载体包含质粒；在另一个实施方案中，病毒载体包括但不限于腺病毒载体或raav载体。[0175]在另一方面，本公开提供了包含本公开的核酸表达载体的重组宿主细胞。这些宿主细胞可以是原核或真核的。这些细胞可以是瞬时或稳定转染或转导的。表达载体向原核和真核细胞的这种转染和转导可以经由任何合适的技术来完成。本文还提供了一种产生本公开的抗体或融合分子的方法。该方法包括以下步骤：(a)在有利于表达抗体或融合分子的条件下培养根据本公开这一方面的宿主，和(b)任选地，回收表达的抗体或融合分子。表达的抗体或融合分子可以从无细胞提取物、细胞沉淀中回收，或者从培养基中回收。[0176]在另一方面，本公开提供了药物组合物，其包含本公开任何方面或实施方案的抗体或融合分子、核酸、核酸表达载体或重组宿主细胞以及药学上可接受的载体。本公开的药物组合物可以用于例如本公开的方法中。除了本公开的多肽、核酸等，药物组合物还可以包含(a)冻干保护剂；(b)表面活性剂；(c)填充剂；(d)张力调节剂；(e)稳定剂；(f)防腐剂和/或(g)缓冲剂。[0177]在一些实施方案中，药物组合物中的缓冲液是tris缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲液。药物组合物还可以包含冻干保护剂，例如蔗糖、山梨糖醇或海藻糖。在某些实施方案中，药物组合物包含防腐剂，例如苯扎氯铵、苄索铵、氯己定、苯酚、间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞、苯甲酸及其各种混合物。在另一些实施方案中，药物组合物包含增量剂，如甘氨酸。在又另一些实施方案中，药物组合物包含表面活性剂，例如聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-65、聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-85、泊洛沙姆-188、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨糖醇三月桂酸酯、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯、脱水山梨糖醇三油酸酯或其组合。药物组合物还可以包含张力调节剂，例如使配制品与人血基本等渗或等渗的化合物。示例性张力调节剂包括蔗糖、山梨糖醇、甘氨酸、蛋氨酸、甘露糖醇、右旋糖、肌醇、氯化钠、精氨酸和精氨酸盐酸盐。在另一些实施方案中，药物组合物另外包含稳定剂，例如当与感兴趣的蛋白质组合时，以冻干或液体形式基本上防止或减少感兴趣的蛋白质的化学和/或物理不稳定性的分子。示例性稳定剂包括蔗糖、山梨糖醇、甘氨酸、肌醇、氯化钠、蛋氨酸、精氨酸和精氨酸盐酸盐。[0178]本公开的抗体或融合分子、核酸等可以是药物组合物中唯一的活性剂，或者该组合物可以进一步包含一种或多种适用于预期用途的其他活性剂。[0179]本文所述的药物组合物通常包含本文所述的治疗剂和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合。此类组合物基本上不含非-药学上可接受的组分，即，含有的非-药学上可接受的组分的量低于提交本申请时美国法规要求所允许的量。在此方面的一些实施方案中，如果化合物被溶解或悬浮在水中，则该组合物进一步任选地包含另外的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在另一些实施方案中，本文所述的药物组合物是固体药物组合物(例如，片剂、胶囊等)。[0180]这些组合物可以以制药领域中熟知的方式制备，并且可以通过任何合适的途径施用。在优选的实施方案中，这些药物组合物和制剂被设计用于口服施用。常规药物载体、水性基质、粉末基质或油性基质、增稠剂等可能是需要的或希望的。[0181]药物组合物可以是任何适当的形式，包括但不限于片剂、药丸、粉末、含片剂、香囊、香囊、香囊、灵丹妙药、悬浮液、乳剂、溶液、糖浆、气溶胶(作为固体或液体介质)、含有活性化合物重量最多10的软膏、软硬明胶胶囊、无菌注射溶液和无菌包装粉末。[0182]实施例1.cd300c[0183]在这个实施例中，我们将cd300c描述为一种新的t细胞共抑制分子，其与现有的b7家族成员共享显著的序列同源性。cd300c蛋白在专业抗原呈递细胞(apc)上表达，包括b细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞(dc)。推定的cd300c反受体在cd4和cd8t细胞上表达，并且活化后表达水平上调。可溶性人和小鼠cd300c-fc融合蛋白在体外显著抑制cd4和cd8t细胞的增殖、活化和细胞因子产生。[0184]施用cd300c-fc蛋白减轻小鼠的移植物抗宿主病(gvhd)和自身免疫性疾病，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)和胶原诱导关节炎(cia)、人多发性硬化症(ms)和类风湿关节炎(ra)的动物模型。此外，抗cd300抗体抑制黑色素瘤和结肠癌小鼠模型的肿瘤生长，这与中和cd300c对t细胞和其他免疫细胞的抑制活性有关。我们的结果表明，与cd300c抑制途径的治疗相互作用代表了一种调节t细胞介导的免疫以治疗gvhd和自身免疫性疾病以及癌症的新策略。[0185]材料和方法[0186]hcd300c和mcd300c2的克隆和纯化[0187]将hcd300c(aa29-183)和mcd300c2(aa22-193)的细胞外结构域克隆并融合到含有小鼠igg2a(origene)的恒定区域的pcmv6-ac-fc-s表达载体中。将载体转染到hek293f细胞中。根据制造商的指示(gehealthcare)，使用proteingsepharose4fastflowtm从上清液纯化融合蛋白。通过sds-page、考马斯染色和蛋白质印迹验证纯化的蛋白。使用piercetmbcaproteinassaykit(pierce,rockford,il)定量蛋白质。对照ig(重组小鼠igg2afc蛋白)购自bxcell(westlebanon,nh)。[0188]sds-page和蛋白质印迹[0189]将纯化的cd300c-ig负载在12％sds-page上，并用考马斯蓝进行染色或转移到聚偏氟乙烯膜。将含蛋白质的膜与hrp缀合的抗小鼠igg2抗体或抗hcd300c抗体(novusbiologicals,littleton,co)，随后是hrp缀合的第二抗体一起孵育，并且然后用superwestpico化学发光底物(thermoscientific)开发。[0190]流式细胞术分析[0191]用如[35；36；37；38]所述的荧光色素缀合的抗体蛋白对器官的单细胞悬液进行染色。对于细胞内染色，首先用bdcytofix/cytoperm溶液在4℃下渗透细胞20分钟。荧光色素缀合的抗体的直接或间接染色包括：cd4、cd8、cd19、b220、cd11c、cd11b、f4/80、h2b、annexinv、ki67、cd44、cd62l、cd69、ctla-4、cd28、pd-1、btla以及icos和mcd300c2(biolegend或bdbiosciences,sanjose,ca,sandiego,ca)。用磺基-nhs-lc-生物素(pierce)生物素化mcd300c2-ig和hcd300c-ig。在facscaliburtm或lsrfortessatmx-20细胞分析仪(bdbiosciences)上分析样品。使用flowjotm软件(ashland,or)进行数据分析。[0192]鲎变形细胞溶胞产物(lal)测定[0193]根据制造商的指示(lonza,walkersville,md)，通过终点显色lal测试测定纯化蛋白中的内毒素水平[39]。[0194]体外t细胞增殖测定[0195]使用间接免疫磁pan-t标记系统从单个核细胞阴性分离的正常人外周血cd3+泛t细胞购自allcells,llc(alameda,ca)。通过免疫磁系统(miltenyi,auburn,ca)从c57bl/6小鼠纯化鼠cd3+t细胞，并且细胞的纯度通常>95％。在cd300c-ig或对照ig存在下，用抗cd3和/或抗cd28抗体(biolegend)刺激t细胞。在收获前12小时通过用1μci[3h]胸苷(perkinelmer,inc.,downersgrove,il)对培养物进行脉冲来评估增殖反应。通过液体闪烁光谱学(perkinelmer,inc.)测量[3h]胸苷的掺入。对于羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)测定，用cfse(thermofisherscientific)标记脾细胞，并在cd300c-ig或对照ig存在下用抗cd3刺激。通过流式细胞术分析细胞。[0196]小鼠[0197]四周龄的雌性c57bl/6和balb/c小鼠购自jackson实验室。这些小鼠是根据康涅狄格大学动物护理和使用委员会批准的方案使用的。[0198]gvhd模型[0199]balb/c接受者接受了来自137cs源的900cgy全身照射(gammator-50gamma照射器；radiationmachinerycorporation,parsippany,nj)。两至四小时后，对小鼠静脉内(i.v.)注射来自c57bl/6小鼠的bm和脾细胞。对接受者i.p.注射hcd300c-ig或对照ig。用临床gvhd评分系统评估gvhd的严重程度。简而言之，针对五个临床参数每周对编码笼子里的gvhd接受者进行单独评分，标度从0至2：体重减轻、姿势、活动、毛皮质地和皮肤完整性。通过五个标准得分的总和(最大指数＝10)产生临床gvhd指数。[0200]收获gvhd靶器官进行组织病理学分析。器官是福尔马林保存、石蜡包埋、切片和苏木精/伊红(h&e)染色的。组织损伤的评估是基于先前描述的评分系统进行的[40]。简而言之，基于受累血管的数量和肝细胞坏死的严重程度对肝脏gvhd进行评分；最大得分是10分。基于隐窝细胞凋亡和固有层炎症对肠道gvhd进行评分；最大得分是8分。基于腔周浸润、肺炎和所涉及肺组织的严重程度对肺gvhd进行评分；最大得分是9分。[0201]eae的诱导和评估[0202]将小鼠mog35-55(glbiochem,中国上海)在补充有结核分枝杆菌h37ra(difcolaboratories,detroit,mi)的完全弗洛伊德佐剂(sigma-aldrich,stlouis,mo,usa)中乳化。在第0天，在背侧的4个点处对小鼠s.c.注射mog。还对小鼠i.p.注射500ng纯化的百日咳杆菌毒素(sigma-aldrich)。对小鼠i.p.注射hcd300c-ig或对照ig，并基于以下量表观察临床得分：0，正常；0.5，部分跛尾；1，瘫痪尾；2，协调运动丧失，后肢瘫痪；2.5，一后肢瘫痪；3，双后肢瘫痪；3.5，后肢瘫痪，前肢无力；4，前肢瘫痪；5，垂死或死亡。按照动物伦理学的要求，将超过临床得分4分的小鼠安乐死。[0203]胶原诱导性关节炎(cia)的诱导和评估[0204]用等体积的完全弗氏佐剂(cfa)乳化ii型胶原(cii)(2mg/ml)。在第0天，用50ul乳剂在距尾底部1cm处s.c.注射dba/1小鼠。在第14天，小鼠接受了cii/不完全弗氏佐剂(ifa)乳剂在尾底部周围的s.c.加强注射。当发生cia症状时，对小鼠i.p.注射hcd300c-ig或对照ig。随时间推移，评估cia的发展。根据如下从0至4的分级量表，对每个爪子关节炎的临床严重程度进行量化：0，没有肿胀；1，一趾的肿胀或轻度水肿；2，影响若干趾的中度肿胀；3，影响大多数趾的严重肿胀；和4，最严重的肿胀和/或强直。[0205]抗hcd300c多克隆和单克隆抗体的产生[0206]在第0天用100μg在完全弗氏佐剂(cfa)中乳化的hcd300c-ig蛋白免疫balb/c小鼠，并在第14天和第21天在不完全弗氏佐剂(ifa)中以相同的蛋白量增强。用100μg不含ifa的hcd300c-ig对小鼠进行3次增强(第28、29和30天)。在第31天，收获含有抗cd300c多克隆抗体的血清。[0207]为了制备抗hcd300c单克隆抗体，还在第31天从免疫小鼠收获脾脏。将脾细胞单细胞悬液与x63-ag8.653骨髓瘤细胞融合，以产生杂交瘤。进行elisa以鉴定可以产生与hcd300c-ig反应但不与对照ig蛋白反应的mab的杂交瘤。通过有限稀释法亚克隆这些杂交瘤克隆。进一步筛选了抗hcd300cmab中和hcd300c对t细胞增殖和活化的抑制活性的能力。根据制造商的指示(gehealthcare)，使用proteingsepharose4fastflow从杂交瘤的上清液纯化抗hcd300cmab。[0208]局部肿瘤生长的评估[0209]从国家癌症研究所和atcc获得鼠ct-26结肠癌细胞和b16f10黑色素瘤细胞。将癌细胞s.c.注射到同基因balb/c或c57bl/6小鼠体内。然后将抗hcd300c或对照mab注射到肿瘤注射部位中。使用公式v＝(a2b)/2，每隔一天通过最短(a)和最长(b)直径的卡尺测量来确定肿瘤大小(体积)。[0210]统计分析[0211]p值是基于双侧学生t检验。置信水平高于95％(p<0.05)被确定为显著。[0212]结果：[0213]hcd300c在体外抑制小鼠和人t细胞的增殖和活化[0214]为了研究cd300c蛋白是否可以影响t细胞功能，我们通过将hcd300c基因的细胞外结构域克隆到含有小鼠igg2a恒定区的表达载体中，产生了hcd300c-ig融合蛋白。然后将表达载体转染到人hek-293细胞中，以产生hcd300c-ig融合蛋白，然后从细胞的上清液纯化该融合蛋白。如通过考马斯蓝染色的sds-page所测定，获得了相对高纯度的hcd300c-ig蛋白。使用抗igg2a抗体或抗hcd300c抗体通过蛋白质印迹验证融合蛋白的同一性。hcd300c-ig的实际分子量(mw)高于预测的mw，表明重组蛋白被糖基化。内毒素水平低于1μg纯化蛋白的0.01eu/ml。[0215]然后，我们确定了hcd300c-ig蛋白是否影响t细胞增殖。为此，从c57bl/c小鼠的脾细胞纯化cd3+t细胞，并在分级剂量的hcd300-ig(800、1600和3200ng/ml)存在下，在预涂覆有抗cd3抗体的板上培养3天。由于hcd300-ig融合蛋白的分子量比对照ig蛋白的分子量高约1.5倍，因此我们使用等摩尔量的对照ig作为对照。通过[3h]胸苷掺入测量t细胞增殖。如图1a所示，hcd300c-ig以剂量反应的方式抑制抗cd3活化的t细胞增殖，其中与等摩尔量的对照ig相比，由800、1600和3200ng/mlhcd300c-ig分别实现约32％、72％和78％抑制。我们还确定了hcd300c是否可以抑制抗cd3和抗cd28抗体活化的t细胞增殖。类似地，hcd300c-ig以剂量依赖性的方式减少了抗cd3和抗cd28活化的t细胞增殖，尽管程度低于仅抗cd3活化的情况(图1b)。[0216]为了证实对t细胞增殖的影响，并确定hcd300c是否影响cd4和/或cd8t细胞，我们进行了羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)稀释测定。用cfse标记鼠脾细胞，并且然后用抗cd3抗体在分级剂量的hcd300c-ig或对照ig存在下培养。通过cfse荧光稀释测量cd4和cd8t细胞中的t细胞增殖。如图1c-f所示，hcd300c-ig以剂量依赖性的方式抑制cd4和cd8t细胞两者的抗cd3活化的增殖。[0217]接下来，我们确定了hcd300c-ig是否在体外影响t细胞的活化。cd69是早期的活化标记物。在用抗cd3抗体和hcd300c-ig或对照ig培养脾细胞后，24小时后分析cd4和cd8t细胞上的cd69表达。如图1g-j所示，在3200ng/ml的剂量下，hcd300c-ig显著降低了cd4和cd8t细胞两者上的cd69表达。结果表明，hcd300c还抑制cd4和cd8t细胞的活化。[0218]已证明hcd300c-ig在体外抑制鼠t细胞增殖，我们检查了hcd300c-ig是否影响人t细胞。在分级剂量的hcd300-ig或对照ig存在下，用抗cd3抗体培养纯化的人t细胞，并通过[3h]胸苷掺入测量t细胞增殖。类似地，hcd300c-ig显著抑制人t细胞增殖，其中由1500和3000ng/mlhcd300c-ig分别实现约53％和77％抑制(图1k)。此外，在1600ng/ml和3200ng/ml两种剂量下，hcd300c-ig显著降低了人cd4和cd8t细胞两者上的cd69表达(图1l，m)。[0219]综上所述，我们的结果表明，hcd300c-ig在体外抑制tcr介导的小鼠和人t细胞两者的增殖和/或活化。hcd300c在人和小鼠原代t细胞两者中具有相似的抑制作用，这表明其结合配偶体及其赋予t细胞的功能在物种间可能是保守的。[0220]mcd300c2在体外抑制小鼠t细胞的增殖和活化[0221]我们还通过将mcd300c2的细胞外结构域融合到小鼠igg2a恒定区产生了mcd300c2-ig蛋白，并分析了纯化的mcd300c2-ig融合蛋白在体外对小鼠t细胞增殖和活化的影响。我们发现mcd300c2-ig显著抑制了抗cd3诱导的t细胞增殖，其中被800、1600或3200ng/ml的mcd300c2-ig抑制大于90％(图2a)。mcd300c2-ig还抑制抗cd3和抗cd28抗体诱导的t细胞增殖，其中由800、1600或3200ng/mlhcd300c-ig分别实现约81％、85％和94％抑制(图2b)。cfse稀释测定证实mcd300c2-ig抑制cd4+和cd8+t细胞两者的抗cd3诱导的增殖(图2c-f)。[0222]像hcd300c-ig一样，mcd300c2-ig显著降低了由抗cd3抗体或抗cd3加抗cd28抗体诱导的cd4+和cd8+t细胞两者上的cd69表达，并且这种降低也以剂量依赖性的方式(图2g-l)。为了进一步证实mcd300c2-ig抑制t细胞活化，我们分析了cd4+和cd8+t细胞对cd44和cd62l的表达。据报道，原初t细胞是cd44lowcd62lhi，而有效记忆t细胞是cd44hicd62llow。如图2m-q所示，mcd300c2-ig显著增加了抗cd3活化的cd4+和cd8+t细胞中cd44lowcd62lhi原初细胞的百分比，但降低了cd44hicd62llow效应记忆t细胞的百分比。结果进一步表明，mcd300c2-ig抑制cd4+和cd8+t细胞的活化。[0223]总之，我们的结果表明，hcd300c-ig和mcd300c2-ig两者在体外均抑制tcr介导的cd4和cd8t细胞两者的增殖和活化，这进一步证明cd300c具有t细胞共抑制特性。[0224]mcd300c2抑制由t细胞产生细胞因子[0225]然后，我们测定了mcd300c2在体外对由t细胞产生细胞因子的影响。从c57bl/6小鼠的脾脏纯化cd3+t细胞，并在分级剂量的mcd300c2-ig或对照ig蛋白存在下，用抗cd3抗体刺激3天。通过elisa测量上清液中细胞因子的含量。如图3所示，mcd300c2-ig抑制ifnγ、il-2、il-17a和il-10的产生，但不抑制tnfα。结果表明，mcd300c2-ig抑制由tcr信号传导诱导的t细胞产生某些th1/th2/th17细胞因子。[0226]cd300c在鼠免疫细胞上以及在正常和人肿瘤组织中的表达模式[0227]我们使用抗mcd300c2的单克隆抗体(克隆tx52)，通过流式细胞术分析了mcd300c2蛋白在鼠免疫细胞上的细胞表面表达。我们发现静息脾cd4+和cd8+t细胞几乎不表达mcd300c2蛋白(图4a，b)。在被抗cd3和抗cd28抗体活化后，一小部分活化的cd4+和cd8+t细胞表达mcd300c2。然后，我们检查了mcd300c2蛋白在其他免疫细胞上的表达，并且发现静息和活化的b220+b细胞、cd11b+单核细胞和f4/80+巨噬细胞表达不同水平的mcd300c2(图4a，b)。活化后，巨噬细胞上mcd300c2的表达水平上调。此外，虽然cd300c蛋白在静息cd11c+dc上几乎不表达，但它是由lps在活化后诱导的(图4a，b)。这些结果表明cd300c在多种apc上表达。[0228]然后，我们通过免疫组织化学测定了正常和肿瘤人组织中的hcd300c蛋白的表达。如图4c所示，hcd300c在正常乳腺、结肠和肝脏组织中表达较弱或根本不表达。hcd300c在乳腺、结肠和肝脏肿瘤组织中的表达水平高于相应的正常组织，而hcd300c在肺正常组织和肿瘤组织中的表达水平相似(图4c)。hcd300c蛋白主要局限于上皮细胞的质膜或细胞质。[0229]推定的cd300c反受体的表达[0230]为了确定cd300c反受体的表达模式，将纯化的mcd300c2-ig和对照ig蛋白生物素化。用生物素化的蛋白，随后是链霉亲和素pe对来自c57bl/c小鼠的脾细胞进行染色。流式细胞术分析显示，mcd300c2-ig与静息cd4+和cd8+t细胞结合，并且该结合在cd4+和cd8+t细胞被抗cd3和抗cd28抗体活化时增加(图5a，b)。[0231]我们还分析了cd300c反受体在其他免疫细胞上的表达。我们发现mcd300c2-ig与静息和活化的b220+b细胞、cd11c+dc、cd11b+单核细胞和g4/80+巨噬细胞结合(图5a，b)。在被lps活化后，这些免疫细胞上假定的mcd300c反受体的表达水平没有显著变化。[0232]为了确定mcd300c是否与先前鉴定为已知b7家族成员受体的分子结合，用含有小鼠cd28、ctla-4、pd-1、btla或icos基因的表达载体转染hek-293细胞。通过用针对相应受体的抗体进行流式细胞术分析来证实这些受体在转染的293细胞上的表达(图5c)。然后分析mcd300c与转染的hek-293细胞的结合。如图5d所示，mcd300c2未与cd28、ctla-4、pd-1、btla或icos转染的细胞结合。[0233]综上所述，我们的结果表明，mcd300c2反受体在静息和活化的cd4和cd8t细胞、b细胞、dc、单核细胞和巨噬细胞上表达。受体在活化的cd4和cd8t细胞上的表达水平上调。mcd300c反受体似乎不同于cd28、pd-1、ctla-4、pd-1或btla。[0234]hcd300c-ig蛋白改善小鼠的gvhd[0235]尽管骨髓(bm)移植(bmt)已广泛用于治疗许多疾病，但gvhd仍是同种异体bmt后的主要并发症。急性gvdh主要是由供体移植物中的t细胞攻击受体组织引起的。我们使用了一个定义明确的mhc错配[c57bl/6(h2b)→balb/c(h2d)]gvhd小鼠模型来验证体内cd300c对t细胞的影响。对balb/c小鼠进行致死剂量的照射并i.v.注射来自同种异体c57bl/6小鼠的bm和脾细胞。然后对接受者i.p.注射hcd300c-ig或对照ig。随时间推移，监测gvhd的发展。如图6a-c所示，对照ig治疗的gvhd接受者显示出体重逐渐减轻，并且在bmt后第35天全部死亡。hcd300c-ig治疗显著降低了gvhd的死亡率和发病率，其中45％的小鼠在移植后第40天仍存活(图6a-c)。通过病理分析证实了gvhd严重程度，显示肝脏、小肠(si)和肺的病理得分在hcd300c-ig治疗的接受者中明显低于对照ig治疗的接受者(图6d，e)。这些数据表明hcd300c-ig治疗在体内减轻gvhd。[0236]然后，我们分析了hcd300c-ig或对照ig治疗的gvhd小鼠中的t细胞增殖、存活和活化。对致死剂量照射的balb/c接受者i.v.注射来自c57bl/6小鼠的bm和脾细胞。在第0天对小鼠i.v.注射并且在第2天i.p.注射20μghcd300c-ig或对照ig蛋白。将接受者安乐死，并在第4天收获脾脏。我们分析了ki67的表达，其是一种细胞增殖标记物。如图6f-i所示，hcd300c-ig治疗的接受者的供体cd4+和cd8+t细胞中ki67+细胞的百分比明显低于对照组ig治疗的小鼠。我们还分析了供体cd4+和cd8+t细胞的存活，并且发现膜联蛋白v+7-add凋亡cd4+或cd8+t细胞的百分比在hcd300c-ig与对照ig治疗的组之间没有显著差异(数据未示出)。接下来，我们通过cd4+和cd8+t细胞检查了活化标记物的表达。尽管供体cd4+和cd8+t细胞中cd69+细胞的百分比在hcd300c-ig与对照ig治疗的组之间没有显著差异(数据未示出)，但在hcd300c-ig治疗的gvhd小鼠中，cd44hi细胞和cd62llo细胞在供体cd4+和cd8+t细胞中的百分比显著降低(图6j-m)。[0237]综上所述，我们的数据表明，hcd300c-ig治疗减轻gvhd，可能是通过抑制供体t细胞响应于同种抗原刺激的增殖和活化。[0238]施用hcd300c-ig融合蛋白改善小鼠的eae和cia[0239]由于hcd300c-ig融合蛋白在体外抑制t细胞增殖、活化和细胞因子产生，因此我们着手研究在体内施用hcd300c-ig是否可以改善由过度活跃的免疫系统引起的自身免疫性疾病。多发性硬化症(ms)是中枢神经系统的自身免疫性疾病，并且eae是ms的常见动物模型。为了确定hcd300c-ig是否减轻eae，用pmog肽免疫c57bl/6小鼠以诱导eae发展。然后用hcd300c-ig或对照ig蛋白处理小鼠。如图7a所示，hcd300c-ig治疗降低了整个57天时间过程中的平均临床得分。[0240]cia是人ra的动物模型。我们还确定了hcd300c-ig治疗cia的能力。类似地，hcd300c-ig治疗降低了cia的平均临床得分(图7b)。我们的数据表明，hcd300c-ig治疗改善了自身免疫性疾病，包括eae和cia。[0241]抗hcd300c单克隆抗体(mab)的产生[0242]为了产生抗hcd300cmab，在第0天用在完全弗氏佐剂(cfa)中的hcd300c-ig蛋白免疫balb/c小鼠(8-10周龄)，并在第14天和第21天在不完全弗氏佐剂(ifa)中以相同的蛋白量增强。用hcd300c-ig(无佐剂，添加100ml1xpbs代替)连续三天(第28、29、30天)对小鼠进行三次增强。在第31天从小鼠收获脾脏。将脾细胞单细胞悬液与x63-ag8.653骨髓瘤细胞融合，以产生杂交瘤。进行elisa以鉴定可以产生与hcd300c-ig反应但不与对照ig蛋白反应的mab的杂交瘤。[0243]然后，我们测定了抗hcd300cmab中和hcd300c抑制t细胞增殖和活化的能力。我们发现抗hcd300cmab(克隆b47-1d2)显著抑制了t细胞的增殖和活化。b47-1d2抗hcd300cmab的重链和轻链氨基酸序列如下[0244]重链(互补区域被加亮)：[0245][0246]轻链(互补区域被加亮)：[0247][0248]然后，我们确定了抗hcd300cmab(克隆b47-1d2)在小鼠模型中抑制肿瘤生长的能力。我们发现mab在ct-26小鼠模型中显著降低结肠癌细胞生长(图8a)。抗cd300c抗体的抗肿瘤活性与肿瘤中cd4+和cd8+t细胞、nk细胞和b细胞的浸润增加，以及b细胞和单核细胞的活化增强有关(图8b-e，并且数据未示出)。类似地，在b16/f16黑色素瘤模型中，抗cd300cmab显著抑制黑色素瘤细胞生长(图8f)。综上所述，我们的数据表明，抗cd300cmab可以在体内抑制肿瘤生长。[0249]讨论：[0250]本研究将cd300c描述为一种新的t细胞共抑制分子。cd300c蛋白在apc上表达，并且其反受体在t细胞上表达。在功能上，cd300c-ig蛋白抑制t细胞的增殖、活化和细胞因子产生。[0251]人和小鼠cd300c两者在细胞外区域中仅具有一个igv结构域。据报道，ig超家族成员中的相互作用位点往往被映射到远端ig结构域，其将是cd300c中的igv结构域。b7family,co-stimulatest-cellproliferationandinterleukin-10secretion.nat.med.5(1999)1365-9.[0260][4]g.j.freeman,a.j.long,y.iwai,k.bourque,t.chernova,h.nishimura,l.j.fitz,n.malenkovich,t.okazaki,m.c.byrne,h.f.horton,l.fouser,l.carter,v.ling,m.r.bowman,b.m.carreno,m.collins,c.r.wood,和t.honjo,engagementofthepd-1immunoinhibitoryreceptorbyanovelb7familymemberleadstonegativeregulationoflymphocyteactivation.j.exp.med.192(2000)1027-34.[0261][5]y.latchman,c.r.wood,t.chernova,d.chaudhary,m.borde,i.chernova,y.iwai,a.j.long,j.a.brown,r.nunes,e.a.greenfield,k.bourque,v.a.boussiotis,l.l.carter,[0262]b.m.carreno,n.malenkovich,h.nishimura,t.okazaki,t.honjo,a.h.sharpe,和g.j.freeman,pd-l2isasecondligandforpd-1andinhibitstcellactivation.nat.immunol.2(2001)261-8.[026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剂量的htapbpl-ig或对照ig存在下，用抗人cd3抗体培养纯化的人t细胞3天。通过[3h]胸苷掺入测量t细胞增殖。如图10f所示，htapbpl-ig还显著抑制人t细胞的增殖。当与对鼠t细胞具有影响的htapbpl-ig剂量相比时，人t细胞的剂量较低(图10f相比于a)。总之，我们的结果表明htapbpl-ig可以抑制小鼠和人原代t细胞两者的增殖。[0311]tapbpl在体外抑制t细胞活化[0312]然后，我们确定了htapbpl-ig是否在体外影响t细胞活化。在用抗cd3抗体和htapbpl-ig或对照ig培养脾细胞后，24小时后分析t细胞的早期活化标记物cd69的表达。如图11a和b所示，tapbpl-ig降低了cd4和cd8t细胞两者上抗cd3活化的cd69表达。类似地，被抗cd3和抗cd28抗体两者活化的cd4和cd8t细胞两者上的cd69表达水平也被tapbpl-ig明显降低(图11c和d)。[0313]基于cd44和cd62l的表达水平，t细胞可以分为原初(cd44locd62lhi)和有效记忆(cd44hicd62llo)t细胞。接下来我们分析了mbtn5-ig对这些t细胞亚群的影响。我们发现，在htapbpl-ig存在下，cd44hicd62llocd4和cd8有效记忆t细胞的百分比明显低于对照组(图11e-i，k)。相比之下，在htapbpl-ig存在下，cd44locd62lhicd4和cd8t原初细胞的百分比显著升高(图11e-g，i-l)。结果进一步表明，htapbpl-ig抑制cd4和cd8t细胞的活化。综上所述，我们的结果表明，htapbpl-ig在体外抑制tcr介导的cd4和cd8t细胞两者的增殖和活化。[0314]施用htapbpl-ig融合蛋白改善小鼠的eae[0315]然后，我们确定了在体内施用htapbpl-ig融合蛋白是否可以改善多发性硬化症(ms)，一种中枢神经系统的自身免疫性疾病。由自身抗原pmog肽诱导的eae是一种已建立的ms动物模型。对c57bl/6小鼠注射pmog肽以诱导eae。为了确定htapbpl-ig是否可以阻止eae发展，从诱导eae之日(第0天)开始，对小鼠注射25μg/mlhtapbpl-ig或对照ig蛋白。随时间推移，监测eae发展。如图12a所示，htapbpl-ig显著降低了整个42天时间过程中的平均临床得分。为了确定htapbpl-ig是否可以治疗已建立的eae，在小鼠发展eae后，对小鼠注射htapbpl-ig或对照ig蛋白。htapbpl-ig还显著降低了治疗模型中的平均临床得分(图12b)。在研究结束时，从小鼠收获脾脏和脊髓。htapbpl-ig治疗的小鼠脾脏中的cd4+t细胞比例降低，并且cd4+cd25+foxp3+tregs的百分比增加(图12c-f)。如cd69表达降低、效应记忆t细胞百分比降低，但原初t细胞百分比增加所指示，htapbpl-ig治疗的小鼠中的cd4t细胞活化也显著降低(图12g-j)。此外，cnf浸润性cd4t细胞减少，但tregs增加。此外，当在体外用mop刺激来自htapbpl-ig治疗的小鼠的脾细胞时，细胞增殖减少，从而表明htapbpl抑制抗原特异性增殖。[0316]综上所述，我们的结果表明，在体内施用htapbpl-ig可以预防和治疗eae。这与cd4t细胞比例降低以及脾脏和cns中tregs增加，以及cd4t细胞活化减少相关。[0317]抗htapbplmab在体内抑制肿瘤生长[0318]由于tapbpl在一些肿瘤组织中高表达，并且htapbpl-ig抑制t细胞功能，因此我们推测抗tapbppl抗体可以阻断tapbpl的抑制作用，从而在体内增强抗肿瘤免疫并抑制肿瘤生长。我们通过用htapbpl-ig蛋白免疫balb/c小鼠，产生了抗htapbplmab。将脾细胞与x63-ag8.653骨髓瘤细胞融合，以产生杂交瘤。进行elisa以鉴定可以产生与htapbpl-ig融合蛋白反应但不与对照ig蛋白反应的抗htapbplmab的杂交瘤的克隆。我们还通过测定它们在体外中和htapbpl对t细胞的抑制活性的能力来筛选mab。如图13a所示，抗htapbplmab(克隆54)中和了htapbpl对t细胞增殖的抑制活性。[0319]然后，我们确定了mab在白血病小鼠模型中治疗癌症的能力，对该模型s.c.注射p388细胞。抗htapbplmab在25和50μg剂量下抑制模型中的肿瘤生长，尽管在某些时间点差异没有达到统计学意义(数据未示出)。100μg剂量下的抗htapbplmab在大多数时间点显著抑制肿瘤生长(图13b)。肿瘤浸润性淋巴细胞的分析显示，抗htapbplmab显著增加了cd4+和cd8+t细胞的百分比(图13c-f)，但降低了cd4+cd25+foxp3+tregs的百分比(图13g，h)。综上所述，我们的结果表明，抗tapbplmab可以在体内抑制肿瘤生长，这与中和tapbpl对肿瘤浸润性t细胞的抑制活性有关。[0320]重链:[0321][0322]轻链[0323][0324]总之，我们将tapbpl描述为一种新的t细胞共抑制分子。tapbpl蛋白在apc上和肿瘤组织中表达。tapbpl-ig融合蛋白在体外抑制t细胞增殖和活化。在体内施用tapbpl-ig蛋白减轻eae。抗tapbpl抗体在小鼠模型中抑制肿瘤生长。因此，靶向tapbpl可以用于治疗自身免疫性疾病(诸如ms)和移植排斥反应，以及癌症和感染。[0325]材料和方法[0326]tapbpl的克隆与纯化[0327]将htapbpl(aa22-406)的细胞外结构域克隆并融合到含有小鼠igg2a(origene,rockville,md)的恒定区域的pcmv6-ac-fc-s表达载体中。将载体转染到hek-293细胞中。根据制造商的指示(gehealthcare)，使用proteingsepharose4fastflow纯化融合蛋白的上清液。通过sds-page、考马斯染色和蛋白质印迹验证纯化的蛋白。使用piercetmbca蛋白测定试剂盒(pierce,rockford,il)定量蛋白质。对照ig(重组小鼠igg2afc蛋白)购自bxcell(westlebanon,nh)。[0328]小鼠[0329]c57bl/6小鼠购自jackson实验室。这些小鼠是根据康涅狄格大学动物护理和使用委员会批准的方案使用的。[0330]流式细胞术分析[0331]用如[24-27]所述的荧光色素缀合的抗体蛋白对器官和肿瘤的单细胞悬液进行染色。对于细胞内染色，首先用bdcytofix/cytoperm溶液在4℃下渗透细胞20分钟。荧光色素缀合的抗体的直接或间接染色包括：cd4、cd8、cd19、b220、cd11c、cd11b、f4/80、cd44、cd62l、cd69、ctla-4、cd28、pd-1、btla和icos(biolegend或[0332]bdbiosciences,sanjose,ca,sandiego,ca)。抗tapbpl单克隆抗体购自lifespanbiosciences,inc(seattle,wa)。在facscaliburtm或lsrfortessatmx-20细胞分析仪(bdbiosciences)上分析样品。使用flowjotm软件(ashland,or)进行数据分析。[0333]组织病理学[0334]人多种正常和肿瘤组织阵列购自biochain(newark,ca)。使组织经受抗原暴露，并且然后与抗tapbpl单克隆抗体，随后是immpresstmvrpolymerhrp抗小鼠igg试剂孵育，并根据制造商的指示用过氧化物酶底物溶液(vectorlaboratories)显影。[0335]体外t细胞测定[0336]使用间接免疫磁泛t标记系统从单个核细胞阴性分离的正常人外周血cd3+泛t细胞购自allcells,llc(alameda,ca)。通过免疫磁系统(miltenyi,auburn,ca)从c57bl/6小鼠纯化鼠cd3+t细胞，并且细胞的纯度通常>95％。在htapbpl-ig或对照ig存在下，用抗cd3和/或抗cd28(biolegend)刺激t细胞。在收获前12小时通过用1μci[3h]胸苷(perkinelmer,inc.,downersgrove,il)对培养物进行脉冲来评估增殖反应。通过液体闪烁光谱学(perkinelmer,inc.)测量[3h]胸苷的掺入。对于羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)测定，用cfse(thermofisherscientific)标记脾细胞，并在htapbpl-ig或对照ig存在下用抗cd3刺激。通过流式细胞术分析细胞。[0337]eae的诱导和评估[0338]将小鼠mog35-55(glbiochem,中国上海)在补充有结核分枝杆菌h37ra(difcolaboratories,detroit,mi)的完全弗洛伊德佐剂(sigma-aldrich,stlouis,mo,usa)中乳化。在第0天，在背侧的4个点处对小鼠s.c.注射mog。还对小鼠i.p.注射500ng纯化的百日咳杆菌毒素(sigma-aldrich)。对小鼠i.p.注射htapbpl-ig或对照ig，并基于以下量表观察临床得分：0，正常；0.5，部分跛尾；1，瘫痪尾；2，协调运动丧失，后肢瘫痪；2.5，一后肢瘫痪；3，双后肢瘫痪；3.5，后肢瘫痪，前肢无力；4，前肢瘫痪；5，垂死或死亡。按照动物伦理学的要求，将超过临床得分4分的小鼠安乐死。[0339]htapbpl单克隆抗体(mab)的产生[0340]在第0天用50μg在完全弗氏佐剂(cfa)中乳化的htapbpl-ig蛋白免疫balb/c小鼠，并在第14天和第21天在不完全弗氏佐剂(ifa)中以相同的蛋白量增强。用50μg不含ifa的htapbpl-ig对小鼠进行3次增强(第28、29和30天)。在第31天，从免疫小鼠收获脾脏。将脾细胞单细胞悬液与x63-ag8.653骨髓瘤细胞融合，以产生杂交瘤。进行elisa以鉴定可以产生抗htapbplmab但不具有对照ig蛋白的杂交瘤。通过有限稀释法进一步亚克隆这些杂交瘤克隆。进一步筛选了抗htapbplmab中和htapbpl-ig对t细胞增殖和活化的抑制活性的能力。根据制造商的指示(gehealthcare)，使用蛋白gsepharose4fastflow从杂交瘤的上清液纯化抗htapbplmab。[0341]局部肿瘤生长的评估[0342]鼠p388白血病细胞获自atcc。将癌细胞s.c.注射[0343]到同基因dba/2a小鼠体内。然后将抗htapbpl或对照mab注射到肿瘤注射部位中。efficientlyinducestransplantablemurinehematopoieticstemcells.jclininvest,2012；122:3552-62.[0372][26]lail,zhangm,songy,roodd.recombinantil-7/hgfbetahybridcytokineenhancestcellrecoveryinmicefollowingallogeneicbonemarrowtransplantation.plosone,2013；8:e82998.[0373][27]songy,sum,panchatsharamp,roodd,lail.c-metsignallingisrequiredforefficientpostnatalthymicregenerationandrepair.immunology,2015；144:245-53.[0374]实施例3.skint8[0375]在这个实施例中，我们将skint8鉴定为t细胞共抑制组的新成员，其细胞外结构域与现有的b7家族成员共享显著的同源性。skint8mrna在静息和活化的b细胞、单核细胞和cd4t细胞中表达。skint8推定的受体在活化的cd4和cd8t细胞、b细胞、单核细胞和树突状细胞(dc)上表达。重组skint8-iggfc(skint8-ig)融合蛋白在体外抑制t细胞增殖、活化和细胞因子产生。在体内施用skint8-ig降低小鼠的t细胞活化并改善实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)。[0376]结果[0377]skint8mrna的表达模式[0378]首先，我们通过使用rt-pcr分析评估了skint8mrna在各种组织中的表达。如图14a所示，skint8mrna在心脏、皮肤、脊髓、肾脏、脾脏和胸腺中表达，其中在胸腺中的表达水平最高。[0379]然后，我们检查了skint8mrna在纯化免疫细胞中的表达。我们发现skint8在静息cd4+t细胞、b220+b细胞和cd11b+单核细胞中表达，但在静息cd8+t细胞、f4/80+巨噬细胞和cd11c+dc中不表达(图14b)。活化后，skint8mrna在cd4+t细胞、b220+b细胞和cd11b+单核细胞中的表达无明显改变(图14c)。活化后，在cd8+t细胞中诱导skint8mrna的表达，并且在f4/80+巨噬细胞中略有上调(图14c)。数据表明，skint8转录物在cd4t细胞、b细胞和单核细胞中组成性表达，并在cd8t细胞和巨噬细胞中诱导。[0380]为了证实skint8mrna在免疫细胞中的表达，我们还进行了实时定量rt-pcr(qrt-pcr)。skint8mrna的表达水平在静息与活化的cd4+t细胞、b220+b细胞和cd11b+单核细胞之间没有显著差异。然而，活化后，在cd8+t细胞和f4/80+巨噬细胞中诱导skint8mrna的表达(图14d)。qrt-pcr数据与rt-pcr结果一致。[0381]推定的skint8受体在活化的t细胞、b细胞、单核细胞和dc上表达[0382]为了确定推定的skint8受体的表达模式，我们克隆并表达了skint8-ig融合蛋白，其中skint8的细胞外结构域与小鼠igg2a的恒定区域融合。从表达系统纯化skint8-ig融合蛋白。如通过考马斯蓝染色的sds-page所测定，获得了相对高纯度的skint8-ig蛋白。使用抗igg2a抗体通过蛋白质印迹验证融合蛋白的同一性。skint8-ig的实际分子量(mw)高于预测的mw，表明重组蛋白被糖基化。[0383]然后生物素化纯化的skint8-ig和对照小鼠igg2afc(对照ig)蛋白。用生物素化的skint8-ig或对照ig，随后是链霉亲和素pe对来自c57bl/6小鼠的脾细胞进行染色。通过流式细胞术分析skint8-ig或对照ig与免疫细胞的结合。如图15a和b所示，skint8与新鲜收获的cd4+或cd8+t细胞的一小部分结合。据报道，原初t细胞是cd44lowcd62lhi，而有效记忆t细胞是cd44hicd62llow。我们发现，与skint8结合的cd4+和cd8+t细胞中没有cd44lowcd62lhi原初t细胞(数据未示出)。相比之下，确实与skint8结合的新鲜收获的cd4+和cd8+t细胞中有很大一部分是原初t细胞(数据未示出)。我们的数据表明，静息cd4+和cd8+t细胞不表达推定的skint8受体。我们还分析了skint8与其他免疫细胞的结合，并且发现skint8与新鲜收获的b220+b细胞、cd11b+单核细胞和cd11c+dc结合较弱。[0384]然后，我们确定了skint8与活化免疫细胞的结合。我们通过抗cd3和抗cd28抗体活化了cd4+和cd8+t细胞。在活化后，培养物中cd44lowcd62lhi原初cd4+和cd8+t细胞很少(数据未示出)，从而证实t细胞被活化。活化后，skint8与cd4+和cd8+t细胞的结合显著增加(图15a，b)。[0385]为了确定skint8配体结合是否需要igv和igc样结构域，我们产生了skint8igv-ig和skint8igc-ig融合蛋白。我们发现skint8igv-ig可以与活化的cd4+和cd8+t细胞两者结合，而skint8igc-ig不可以(数据未示出)。数据表明，igv样结构域是skint8配体结合所需要的。[0386]我们还分析了skint8与其他活化免疫细胞的结合。在被lps活化后，skint8与活化的b细胞、单核细胞和dc的结合也显著增强(图15a，b)。综上所述，我们的数据表明，活化的cd4和cd8t细胞、b细胞、单核细胞和dc表达高水平的推定skint8受体，而静息免疫细胞表达低水平或根本不表达推定受体。[0387]为了确定推定的skint8受体是否是b7家族成员的已知受体，用含有鼠pd-1、cd28、btla、ctla-4或icos基因的表达载体转染hek-293细胞。用针对各自受体的抗体，通过流式细胞术分析证实了pd-1、cd28、btla、ctla-4和icos蛋白在转染的细胞上的表达(图15c)。然后分析了skint8与转染的细胞的结合。如图15d所示，skint8未与pd-1、cd28、btla、ctla-4或icos转染的细胞结合。数据表明，skint8与不同于pd-1、cd28、btla、ctla-4或icos的受体结合。[0388]skint8-ig融合蛋白在体外抑制t细胞增殖和活化[0389]skint8推定受体在t细胞上的表达表明skint8可能对t细胞功能具有影响。首先，我们评估了skint8-ig是否在体外影响t细胞增殖。从c57bl/c小鼠的脾细胞纯化cd3+t细胞，并在分级剂量的skint8-ig存在下，在预涂覆有或没有抗cd3抗体的板上培养3天。由于skint8-ig的分子量比对照ig高1.88倍，因此我们使用等摩尔量的ig作为对照。通过[3h]胸苷掺入测量t细胞增殖。在没有抗cd3抗体刺激的情况下，skint8-ig不影响t细胞的增殖(数据未示出)。然而，skint8-ig以剂量依赖性的方式抑制抗cd3活化的t细胞增殖，其中与等摩尔量的对照ig相比，在1864、3728和7456ng/mlskint8-ig存在下分别为约10％、47％和61％抑制(图16a)。然后，我们确定了skint8-ig是否可以抑制抗cd3和抗cd28抗体活化的t细胞增殖。如图16b所示，skint8-ig还降低了抗cd3和抗cd28活化的t细胞增殖，尽管低剂量(1864ng/ml)的skint8-ig不具有这种效果。[0390]为了证实skint8-ig对t细胞增殖的抑制作用，并确定skint8-ig是否抑制cd4和/或cd8t细胞，用羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)标记脾细胞，并用抗cd3抗体和等摩尔量的skint8-ig或对照ig培养。通过cfse强度评估t细胞增殖，该cfse强度随每个细胞分裂而稀释。如图16c-e所示，skint8-ig抑制cd4+和cd8+t细胞的抗cd3活化的增殖。通过[3h]胸苷掺入纯化的cd4+和cd8+t细胞进一步证实了抑制作用(图16f、g)。[0391]然后，我们确定了skint8-ig是否在体外影响t细胞活化。在skint8-ig或对照ig存在下，用抗cd3抗体培养鼠脾细胞。24小时后，通过流式细胞术分析cd69(其是t细胞活化的早期标记物)的表达。如图16h和i所示，skint8-ig显著降低了cd4和cd8t细胞两者上cd69的表达水平。类似地，高剂量的skint8-ig还抑制了cd69在抗cd3和cd28抗体活化的cd4和cd8t细胞上的表达水平(图16j-l)。总之，我们的结果表明，skint8-ig在体外抑制tcr介导的cd4和cd8t细胞两者的增殖和活化。[0392]skint8-ig融合蛋白在体外抑制由t细胞产生细胞因子[0393]接下来，我们检查了skint8-ig是否在体外影响由t细胞产生细胞因子。在skint8-ig或对照ig蛋白存在下，将鼠纯化的t细胞用抗cd3抗体刺激3天。通过elisa测量上清液中的细胞因子。如图17a所示，skint8-ig抑制了ifnγ和tnfα的产生。结果表明skint8-ig还可以在体外抑制tcr介导的由t细胞产生细胞因子。[0394]然后，我们使用流式细胞术来确定skint8-ig是否抑制由cd4+或cd8+t细胞产生th1细胞因子。skint8-ig显著抑制由抗cd3或抗cd3和抗cd28刺激的cd4+t细胞产生ifnγ和tnfα(图17b-e)。skint8-ig还显著降低了tnfα的产生，但没有降低由抗cd3或抗cd3和cd28刺激的cd8+t细胞产生ifnγ(数据未示出)。[0395]施用skint8-ig融合蛋白改善小鼠的eae[0396]多发性硬化症(ms)是中枢神经系统的自身免疫性疾病，并且是由过度活跃的免疫系统引起的。eae是ms常见的动物模型。我们确定了在体内施用skint8-ig蛋白是否可以改善eae。对c57bl/6小鼠诱导eae，并注射skint8-ig或对照ig蛋白。如图18a所示，hbtn5-ig治疗延迟了eae发病，并降低了整个35天时间过程中的平均临床得分。[0397]由于eae主要由cd4t细胞介导，因此我们分析了小鼠的cd4t细胞活化。skint8-ig通过cd4+t细胞降低了cd69的表达(图18b，c)。此外，skint8-ig增加了cd44locd62lhi原初cd4t细胞的百分比，但降低了cd44hicd62llo效应记忆cd4t细胞的百分比(图18d，e)。[0398]我们还检查了初免(第10天)和峰值(第22天)时间时，在脾脏中cd4+t细胞和cd4+cd25+foxp3+调节性t细胞(tregs)的百分比。在skint8-ig治疗的小鼠中，cd4+t细胞的百分比降低，而tregs的百分比在两个时间点都增加(图18f-m)。然后，我们分析了抗原特异性t细胞反应。在体外刺激mog后，在skint8-ig治疗的eae小鼠中，tnfα、ifnγ和il-17的产生减少，而脾cd4+t细胞增加了il-10的产生(图18n，o)。在引流淋巴结中也观察到类似的趋势(数据未示出)。此外，我们发现在skint8-ig治疗的eae小鼠中，cns浸润性cd4+t细胞的百分比降低，而cd4+cd25+foxp3+tregs的百分比增加(图18p-s)。[0399]综上所述，我们的结果表明，体内施用skint8-ig改善小鼠的eae。这与cd4t细胞活化减少和cd4t细胞比例降低以及淋巴器官和cns中tregs百分比增加有关。此外，skint8-ig抑制抗原特异性t细胞反应。[0400]讨论[0401]在这个实施例中，我们表征了一种新的t细胞抑制分子skint8，其与b7家族的几个现有成员在细胞外区域中共享约20％同一性。像b7家族分子一样，skint8的细胞外区域含有一个igv样和一个igc样结构域。尽管skint8与btn分子的序列同一性高于b7成员，但与大多数btn成员不同，skint8不具有细胞内b30.2结构域。因此，skint8似乎是扩展的b7家族的新成员或b7家族相关分子。[0402]我们分析了其在纯化的免疫细胞中的表达，并且发现skint8mrna在纯化的cd4t细胞、b细胞和单核细胞中表达。这些免疫细胞中skint8mrna的表达水平在这些细胞被活化后没有明显改变。在包括b细胞和单核细胞在内的apc中，skint8转录物的组成性表达与其调节t细胞增殖和/或活化的功能是一致的。[0403]skint8推定受体在静息cd4和cd8t细胞上不表达，但在被抗cd3和抗cd28抗体活化后被诱导。这种表达模式类似于其他btn和btnl蛋白的受体，诸如btn1a1、btn2a2、btnl2、btnl1和btn3(24、26、29、31)，以及一些b7家族分子，诸如icosl、pdl1/pdl2、b7-h3、b7-h4(11、13)。skint8蛋白不与pd-1、cd28、btla、ctla-4或icos基因转染的细胞结合，表明推定的skint8受体不同于已知的b7家族配体的受体。[0404]skint8推定受体在活化的t细胞上的表达表明，skint8可能影响已经被活化的t细胞，并提供限制效应期的负信号，类似于pd-l1的活性。事实上，我们已经证明skint8-ig蛋白抑制抗cd3或抗cd3加上抗cd28诱导的t细胞增殖、活化和细胞因子产生。此外，在体内施用skint8-ig抑制t细胞活化，并减轻小鼠的eae。除了在活化的t细胞上表达之外，skint8推定的受体在活化的b细胞、dc和单核细胞上表达。[0405]总之，我们已经将skint8鉴定为一种新的t细胞抑制分子。skint8mrna在apc上表达，并且skint8推定受体在活化的t细胞和apc上表达。skint8-ig融合蛋白在体外抑制t细胞的增殖、活化和细胞因子产生，并在体内改善eae，因此是调节免疫反应的靶标，这对于许多免疫相关疾病的治疗具有意义。[0406]材料和方法skint8的生物信息学分析。[0407]经由macvectortm16.0.5(macvector，inc.)中的clustalwtm程序，分析了skint8和现有b7家族成员的细胞外结构域的序列比对。还经由macvectortm中的clustalwtm程序进行了系统发育树分析。[0408]skint8的克隆和纯化[0409]将skint8(aa26-233)的细胞外区域中的igv样和igc样结构域克隆并融合到含有小鼠igg2a(origene,rockville,md)的恒定区域的pcmv6-ac-fc-s表达载体中。单独地，将igv样结构域(aa26-142)或igc样结构域(aa159-233)克隆克隆并融合到载体中。将载体转染到hek-293细胞中。根据制造商的指示(gehealthcare)，使用proteingsepharose4fastflow从上清液纯化融合蛋白。通过sds-page、考马斯染色和蛋白质印迹验证纯化的蛋白。使用piercetmbcaproteinassaykit(pierce,rockford,il)定量蛋白质。对照ig(重组小鼠igg2afc蛋白)购自bxcell(westlebanon,nh)。[0410]小鼠[0411]四周龄的雌性c57bl/6小鼠购自jackson实验室。这些小鼠是根据康涅狄格大学动物护理和使用委员会批准的方案使用的。[0412]rt-pcr和qrt-pcr[0413]从组织或细胞分离出来自细胞的总rna，并且如(37)所述合成cdna。将等量的cdna用于rt-pcr。在行进通过琼脂糖凝胶后观察pcr产物。使用7500实时pcr系统(appliedbiosystems,uk)，用powersybrtm绿色主混合物(appliedbiosystems,uk)进行qrt-pcr。[0414]流式细胞术分析[0415]用如(38-41)所述的荧光色素缀合的抗体蛋白对器官的单细胞悬液进行染色。荧光色素缀合的抗体的直接或间接染色包括：cd4、cd8、b220、cd11c、cd11b、f4/80、cd69、cd44、cd62l、ifnγ、tnfα、il-2、il-10、cd28、ctla-4、pd-1、btla和icos(biolegend或bdbiosciences,sanjose,ca,sandiego,ca)。用磺基-nhs-lc-生物素(pierce)生物素化skint8-ig、skint8igv-ig或skint8igc-ig蛋白，并通过链霉亲和素pe检测。在facscalibur或lsrfortessax-20细胞分析仪(bdbiosciences)上分析样品。使用flowjo软件(ashland,or)进行数据分析。[0416]体外t细胞测定[0417]通过免疫磁系统(miltenyi,auburn,ca)从c57bl/6小鼠纯化鼠cd3+、cd4+或cd8+t细胞，并且细胞的纯度通常>95％。在skint8-ig或对照ig存在下，用抗cd3抗体或抗cd3和抗cd28抗体(biolegend)刺激t细胞。在收获前12小时通过用1μci[3h]胸苷(perkinelmer,inc.,downersgrove,il)对培养物进行脉冲来评估增殖反应。通过液体闪烁光谱学(perkinelmer,inc.)测量[3h]胸苷掺入。对于羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)测定，用cfse(thermofisherscientific,grandisland,ny)标记脾细胞，并在skint8-ig或对照ig存在下用抗cd3刺激。通过流式细胞术分析细胞。[0418]elisa[0419]根据制造商的指示，通过其相应的elisa试剂盒(biolegend)测定细胞因子ifnγ、tnfα、il-2和il-10的浓度。[0420]eae的诱导和评估[0421]将小鼠mog35-55(glbiochem,中国上海)在补充有结核分枝杆菌h37ra(difcolaboratories,detroit,mi)的完全弗洛伊德佐剂(sigma-aldrich,stlouis,mo,usa)中乳化。在第0天，在背侧对小鼠s.c.注射mog。还对小鼠i.p.注射500ng纯化的百日咳杆菌毒素(sigma-aldrich)。然后基于以下量表观察小鼠的临床得分：0，正常；0.5，部分跛尾；1，瘫痪尾；2，协调运动丧失，后肢瘫痪；2.5，一后肢瘫痪；3，双后肢瘫痪；3.5，后肢瘫痪，前肢无力；4，前肢瘫痪；5，垂死或死亡。按照动物伦理学的要求，将超过临床得分4分的小鼠安乐死。[0422]统计分析[0423]p值是基于双侧学生t检验。置信水平高于95％(p<0.05)被确定为显著。[0424]参考文献[0425]1.freeman,g.j.,g.s.gray,c.d.gimmi,d.b.lombard,l.j.zhou,m.white,j.d.fingeroth,j.g.gribben,和l.m.nadler.1991.structure,expression,andtcellcostimulatoryactivityofthemurinehomologueofthehumanblymphocyteactivationantigenb7.j.exp.med.174:625-631.[0426]2.freeman,g.j.,j.g.gribben,v.a.boussiotis,j.w.ng,v.a.restivo,jr.,l.a.lombard,g.s.gray,和l.m.nadler.1993.cloningofb7-2:actla-4counter-receptorthatcostimulateshumantcellproliferation.science(newyork,n.y.)262:909-911.[0427]3.dong,h.,g.zhu,k.tamada,和l.chen.1999.b7-h1,athirdmemberoftheb7family,co-stimulatest-cellproliferationandinterleukin-10secretion.nat.med.5:1365-1369.[0428]4.freeman,g.j.,a.j.long,y.iwai,k.bourque,t.chernova,h.nishimura,l.j.fitz,[0429]n.malenkovich,t.okazaki,m.c.byrne,h.f.horton,l.fouser,l.carter,v.ling,[0430]m.r.bowman,b.m.carreno,m.collins,c.r.wood,和t.honjo.2000.engagementofthepd-1immunoinhibitoryreceptorbyanovelb7familymemberleadstonegativeregulationoflymphocyteactivation.j.exp.med.192:1027-1034.[0431]5.latchman,y.,c.r.wood,t.chernova,d.chaudhary,m.borde,i.chernova,y.iwai,j.long,j.a.brown,r.nunes,e.a.greenfield,k.bourque,v.a.boussiotis,l.l.carter,b.m.carreno,n.malenkovich,h.nishimura,t.okazaki,t.honjo,a.h.sharpe,和g.j.freeman.2001.pd-l2isasecondligandforpd-1andinhibitstcellactivation.nat.immunol.2:261-268.[0432]6.tseng,s.y.,m.otsuji,k.gorski,x.huang,j.e.slansky,s.i.pai,a.shalabi,t.shin,d.m.pardoll,和h.tsuchiya.2001.b7-dc,anewdendriticcellmoleculewithpotentcostimulatorypropertiesfortcells.j.exp.med.193:839-846.[0433]7.wang,s.,g.zhu,a.i.chapoval,h.dong,k.tamada,j.ni,和l.chen.2000.costimulationoftcellsbyb7-h2,ab7-likemoleculethatbindsicos.blood96:2808-2813.[0434]8.ling,v.,p.w.wu,h.f.finnerty,k.m.bean,v.spaulding,l.a.fouser,j.p.leonard,s.e.hunter,r.zollner,j.l.thomas,j.s.miyashiro,k.a.jacobs,和m.collins.2000.cuttingedge:identificationofgl50,anovelb7-likeproteinthatfunctionallybindstoicosreceptor.journalofimmunology(baltimore,md.:1950)164:1653-1657.[0435]9.swallow,m.m.,j.j.wallin,和w.c.sha.1999.b7h,anovelcostimulatoryhomologofb7.1andb7.2,isinducedbytnfalpha.immunity11:423-432.[0436]10.yoshinaga,s.k.,j.s.whoriskey,s.d.khare,u.sarmiento,j.guo,t.horan,g.shih,m.zhang,m.a.coccia,t.kohno,a.tafuri-bladt,d.brankow,p.campbell,d.chang,l.chiu,t.dai,g.duncan,g.s.elliott,a.hui,s.m.mccabe,s.scully,a.shahinian,c.l.shaklee,g.van,t.w.mak,和g.senaldi.1999.t-cellco-stimulationthroughb7rp-1andicos.nature402:827-832.[0437]11.chapoval,a.i.,j.ni,j.s.lau,r.a.wilcox,d.b.flies,d.liu,h.dong,g.l.sica,[0438]g.zhu,k.tamada,和l.chen.2001.b7-h3:acostimulatorymoleculefortcellactivationandifn-gammaproduction.nat.immunol.2:269-274.[0439]12.prasad,d.v.,s.richards,x.m.mai,和c.dong.2003.b7s1,anovelb7familymemberthatnegativelyregulatestcellactivation.immunity18:863-873.[0440]13.sica,g.l.,i.h.choi,g.zhu,k.tamada,s.d.wang,h.tamura,a.i.chapoval,d.[0441]b.flies,j.bajorath,和l.chen.2003.b7-h4,amoleculeoftheb7family,immunoglobulinsuperfamilygenecluster,positivelyselectsepidermalgammadeltatcells.nat.genet.40:656-662.[0467]37.yan,y.,m.su,y.song,y.tang,c.tian,d.rood,和l.lai.2014.tbx1modulatesendodermalandmesodermaldifferentiationfrommouseinducedpluripotentstemcells.stemcellsanddevelopment.[0468]38.jin,j.,i.goldschneider,和l.lai.2011.invivoadministrationoftherecombinantil-7/hepatocytegrowthfactorbetahybridcytokineefficientlyrestoresthymopoiesisandnaivetcellgenerationinlethallyirradiatedmiceaftersyngeneicbonemarrowtransplantation.journalofimmunology(baltimore,md.:1950)186:1915-1922.[0469]39.lai,l.,m.zhang,和i.goldschneider.2012.recombinantil-7/hgfbetaefficientlyinducestransplantablemurinehematopoieticstemcells.j.clin.invest.122:3552-3562.[0470]40.lai,l.,m.zhang,y.song,和d.rood.2013.recombinantil-7/hgfbetahybridcytokineenhancestcellrecoveryinmicefollowingallogeneicbonemarrowtransplantation.plosone8:e82998.[0471]41.song,y.,m.su,p.panchatsharam,d.rood,和l.lai.2015.c-metsignallingisrequiredforefficientpostnatalthymicregenerationandrepair.immunology144:245-253.[0472]实施例4.btn5[0473]在这个实施例中，我们将btn5(先前称为红系膜相关蛋白(ermap))鉴定为一种新的t细胞抑制分子。btn5蛋白在静息和活化的抗原呈递细胞(apc)的细胞表面上和肿瘤组织中表达。btn5推定的受体在活化的cd4和cd8t细胞和巨噬细胞上表达。小鼠和人btn5-igg2afc(btn5-ig)融合蛋白两者在体外抑制t细胞增殖、活化和/或细胞因子产生。施用btn5-ig蛋白改善小鼠的自身免疫性疾病，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)和1型糖尿病(t1d)。由于抗btn5阻断抗体在体外增强癌细胞的巨噬细胞吞噬作用，因此btn5也影响巨噬细胞功能。此外，施用抗btn5抗体可能通过阻断btn5对t细胞和巨噬细胞的抑制作用来抑制小鼠的肿瘤生长。这些结果表明，btn5抑制途径的治疗相互作用代表了一种治疗患有自身免疫性疾病或癌症患者的新策略。[0474]结果：[0475]btn5在细胞外区域中与现有的b7家族成员共享序列和结构相似性[0476]b7-h3是b7家族成员，其推定的受体在活化的t细胞上表达。b7-h3已被证实对t细胞具有刺激作用或抑制作用。通过一系列全基因组数据库搜索，我们发现小鼠btn5(mbtn5)的细胞外区域与具有25％同一性和15％相似性的b7-h3共享强相似性，包括在相同位置中的4个半胱氨酸的保守模式。mbtn5与其他b7家族成员也具有显著的同源性，在细胞外区域中与小鼠pd-l1、pd-l2、b7-1、b7-2、b7-h2、b7-h4分别共享20％、17％、24％、20％、22％和22％同一性(数据未示出)。在已知的b7家族成员中观察到类似的同一性水平，这表明btn5是一个新的b7家族成员或b7相关分子。btn5在脊椎动物中是高度保守的，并且人btn5(hbtn5)与mbtn5共享惊人的同源性(73％同一性和14％相似性；数据未示出)。mbtn5和hbtn5蛋白两者均含有细胞外区域、跨膜结构域和细胞内区域。mbtn5中的细胞外区域含有lgv结构域和igc结构域，而hbtn5具有igv结构域，但没有igc结构域[37,38,41]。btn5还在其整个长度上与其他btn分子共享显著的同源性[37]。系统发育树分析显示，mbtn5的细胞外区域比b7.1和b7.2更接近b7-h3、b7-h4、pd-l1和pd-l2。btn5在apc以及一些癌组织和肿瘤细胞系上表达[0477]我们通过使用rt-pcr分析评估了mbtn5mrna在各种组织中的表达。在淋巴结、胸腺和肺中检测到mbtn5mrna。mbtn5mrna还在其他器官(包括脾脏、胰腺、血液、肝脏、心脏和肾脏)中弱表达。[0478]据报道，btn5蛋白主要位于btn5基因转染细的细胞表面上[37,38,41]。我们通过流式细胞术分析了mbtn蛋白在免疫细胞的细胞表面上的表达。如图19a所示，mbtn5蛋白未在静息cd19+或b220+b细胞、cd11b+单核细胞、f4/80+巨噬细胞和cd11c+树突状细胞(dc)的细胞表面上表达，但在被lps活化后被诱导。(图19a)。mbtn5蛋白还在静息cd4+和cd8+t细胞上弱表达，并且表达水平在被抗cd3和cd28抗体活化后上调(图19a)。这些结果表明，内源性mbtn5是一种完整的细胞表面蛋白，其在活化的apc、静息和活化的t细胞上表达。[0479]然后，我们通过免疫组织化学测定了正常和癌症人组织中的hbtn5蛋白的表达。如图19b和c所示，对照同种型抗体未染色任何正常或癌组织。相比之下，抗hbtn5抗体在正常乳腺、肺、肝脏、结肠和前列腺组织中检测到低水平的hbtn5蛋白表达(图19b)。在癌组织中也检测到hbtn5蛋白，并且hbtn5在乳腺、肺、肝脏、结肠和前列腺肿瘤组织中的表达水平高于相应的正常组织(图19c相比于19b)。hbtn5蛋白主要局限于上皮细胞的质膜或细胞质。[0480]我们还通过流式细胞术检查了一些肿瘤细胞系上的btn5蛋白表达。如图19d所示，btn5蛋白在鼠神经-2a神经母细胞瘤细胞、lewis肺癌、p388白血病和人红白血病系k562的细胞表面上高表达。btn5蛋白在鼠ct-26结肠癌细胞和b16f10黑色素瘤细胞上弱表达或不表达。[0481]推定的btn5受体的表达[0482]为了确定推定的btn5受体的表达模式，我们构建了mbtn5-ig融合蛋白，其含有mbtn5的igv结构域和小鼠igg2a的恒定区域。生物素化纯化的mbtn5-ig融合蛋白和对照小鼠igg2afc(对照ig)。用生物素化的蛋白，随后是链霉亲和素pe对来自c57bl/6小鼠的脾细胞进行染色。通过流式细胞术分析mbtn5-ig或对照ig与免疫细胞的结合。如图20a和b所示，mbtn5几乎不与静息cd4+和cd8+t细胞结合，但与抗cd3和抗cd28抗体活化的cd4+和cd8+t细胞显著结合(图20a)。结果表明，活化的cd4和cd8t细胞表达推定的btn5受体。[0483]我们还分析了推定的btn5受体在其他免疫细胞上的表达。我们发现mbtn5与一定比例的静息b220+b细胞、cd11c+dc、cd11b+单核细胞和f4/80+巨噬细胞结合(图20a)。在被lps活化后，mbtn5与b细胞、dc、单核细胞和巨噬细胞的结合增加(图20a)。数据表明，静息b细胞、dc、单核细胞和巨噬细胞也表达推定的btn5受体，并且活化后这些细胞的表达水平上调。[0484]为了确定推定的btn5受体是否是已知的b7成员受体，用含有鼠pd-1、cd28、btla、ctla-4或icos基因的表达载体转染hek-293细胞。用针对各自受体的抗体，通过流式细胞术分析证实了pd-1、cd28、btla、ctla-4或icos蛋白在转染的细胞上的表达(图20b)。然后分析了mbtn5与转染的细胞的结合。mbtn5未与pd-1、cd28、btla、ctla-4或icos转染的细胞结合(图20c)。结果表明，mbtn5与不同于pd-1、cd28、btla、ctla-4或icos的受体结合。[0485]mbtn5-ig融合蛋白在体外抑制t细胞增殖和活化[0486]mbtn5蛋白在apc上表达并且其推定受体在活化的t细胞上表达的数据表明mbtn5在t细胞上的潜在功能。因此，我们研究了mbtn5-ig在体外对t细胞增殖的影响。从c57bl/c小鼠的脾细胞纯化cd3+t细胞，并在分级剂量的mbtn5-ig或对照ig存在下，在预涂覆有或没有抗cd3抗体的板上培养3天。通过[3h]胸苷掺入测量t细胞增殖。在不存在抗cd3抗体的情况下，mbtn5-ig不影响t细胞的增殖(数据未示出)。然而，mbtn5-ig以剂量依赖性的方式抑制了抗cd3诱导的t细胞增殖，其中与相应量的对照ig相比，在1434、2868和5736ng/mlmbtn5-ig存在下分别为约22％、52％和79％抑制(图21a)。[0487]为了证实t细胞抑制作用，并确定mbtn5是否抑制cd4和/或cd8t细胞，用羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)标记脾细胞，并用抗cd3抗体和分级剂量的mbtn5-ig或对照ig培养。通过流式细胞术分析t细胞增殖以得到cd4+或cd8+t细胞中的cfse荧光强度。与[3h]胸苷掺入测定的结果一致，mbtn5-ig以剂量依赖性的方式抑制了cd4+和cd8+t细胞的抗cd3活化增殖(图21b-d)。[0488]然后，我们确定了mbtn5-ig是否影响体外t细胞活化。用抗cd3抗体和mbtn5-ig或对照ig培养脾细胞。由于cd69是t细胞活化的早期标记物，因此在24小时后分析cd69的表达。如图21e和f所示，在mbtn5-ig存在下，cd69在cd4和cd8t细胞两者上的表达水平明显降低。结果表明，mbtn5-ig抑制cd4和cd8t细胞的活化。[0489]基于cd44和cd62l的表达水平，t细胞可以分为原初和有效记忆t细胞。接下来我们分析了mbtn5-ig对这些t细胞亚群的影响。我们发现，在mbtn5-ig存在下，cd44locd62lhicd4和cd8t原初细胞的百分比明显高于对照组(图21g-i)。相比之下，在mbtn5-ig存在下，cd44hicd62llocd4和cd8有效记忆t细胞的百分比明显降低(图21，g，j，k)。结果进一步表明，mbtn5-ig抑制cd4和cd8t细胞的活化。综上所述，我们的结果表明mbtn5-ig在体外抑制tcr介导的cd4和cd8t细胞两者的增殖和活化。[0490]hbtn5-ig融合蛋白在体外抑制t细胞增殖和细胞因子产生[0491]已证明mbtn5-ig蛋白在体外抑制鼠t细胞的增殖和活化，我们想知道hbtn5是否具有类似的作用。像mbtn5-ig一样，我们克隆并表达了含有hbtn5的igv结构域和小鼠igg2a的恒定区域的hbtn5-ig融合蛋白。然后从表达系统纯化hbtn5-ig蛋白，直到相对较高的纯度，如通过考马斯蓝染色的sds-page所测定。使用抗igg2a抗体通过蛋白质印迹验证融合蛋白的同一性。[3h]胸苷掺入测定显示，hbtn5-ig也以剂量依赖性的方式抑制了鼠t细胞的增殖，其中在1434、2868和5736ng/mlhbtn5-ig存在下分别为约15％、61％和85％抑制(图22a)。cfse稀释测定显示，hbtn5-ig抑制了cd4+和cd8+t细胞两者的增殖(图22b-d)。[0492]我们还确定了hbtn5-ig是否抑制人t细胞的增殖。在hbtn5-ig或对照ig存在下，用抗人cd3抗体培养纯化的人t细胞，并通过[3h]胸苷掺入测量t细胞增殖。如图22e所示，hbtn5-ig显著抑制了人t细胞的增殖。总之，hbtn5抑制小鼠和人原代t细胞两者的增殖，这表明其结合配偶体及其赋予t细胞的功能在物种间可能是保守的。[0493]接下来，我们检查了hbtn5-ig是否在体外影响由t细胞产生细胞因子。在hbtn5-ig或对照ig蛋白存在下，将纯化的t细胞用抗cd3抗体刺激3天。通过elisa测量上清液中的细胞因子。如图22f所示，hbtn5-ig抑制由t细胞产生ifnγ、tnfα、il-2和il-10。综上所述，结果表明hbtn5-ig可以在体外抑制小鼠和人t细胞的tcr介导的增殖和/或细胞因子产生抗hbtn5抗体在体外增强癌细胞的巨噬细胞吞噬作用，并在体内抑制肿瘤生长。[0494]据报道，cd47在红系细胞和癌细胞上表达，并代表“不要吃我”的信号，该信号保护这些细胞免受巨噬细胞的吞噬[42,43]。相反，抗cd47阻断抗体增强癌细胞的巨噬细胞吞噬作用[43]。由于btn5也在红系细胞和癌细胞上表达，因此我们确定了btn5是否可以影响癌细胞的巨噬细胞吞噬作用。我们通过在小鼠体内免疫hbtn5-ig制备了抗hbtn5多克隆抗体。用cfse标记表达hbtn5的k562癌细胞。将bm来源的巨噬细胞在抗hbtn5或对照抗体存在下与k562细胞孵育2小时。然后收获、洗涤和分析细胞中cfse+细胞的百分比，其代表巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用。如图23a和b所示，在抗btn5抗体存在下，巨噬细胞介导的癌细胞的吞噬作用显著增强。[0495]巨噬细胞由不同的亚群构成，包括经典活化的m1和交替活化的m2巨噬细胞。m1巨噬细胞具有促炎作用，而m2巨噬细胞具有抗炎或保护作用。我们研究了btn5-ig蛋白是否在体外影响m1或m2的分化。首先，根据已公布的方案诱导bm细胞，以在体外产生增殖的非活化巨噬细胞(也称为m0巨噬细胞)[44]。然后如[44]所述在hbtn5-ig或对照ig蛋白存在下，诱导m0巨噬细胞分化为m1或m2。我们发现hbtn-ig显著增加了cd206himhciilom2巨噬细胞的产生(图23c，d)，但不影响mhciihicd206lom1巨噬细胞的产生(数据未示出)。[0496]已观察到btn5-ig融合蛋白在体外抑制t细胞增殖、活化和细胞因子产生，并且抗hbtn5阻断抗体增强了癌细胞的巨噬细胞吞噬作用，我们假设施用抗hbtn5抗体可以阻断btn5对t细胞和巨噬细胞的抑制作用，从而在体内增强抗肿瘤免疫和肿瘤生长的抑制。我们用含有全长hbtn5基因的表达载体转染鼠ct-26结肠癌细胞，并筛选稳定表达btn5的癌细胞。如图23e所示，转染的ct-26细胞在细胞表面上表达hbtn5蛋白。然后，我们将表达hbtn5的ct-26细胞s.c.注射到同基因balb/c小鼠体内。当肿瘤可触及时，在肿瘤部位处对小鼠注射相同量的小鼠抗hbtn5或对照多克隆抗体。如图23f所示，与对照抗体治疗相比，抗hbtn5抗体显著抑制了ct-26癌细胞的生长。肿瘤浸润性免疫细胞的分析显示，在hbtn5-ig治疗的肿瘤中，(图23g)cd4和cd8t细胞的百分比明显较高，并且(图23h)m2巨噬细胞的百分比较低。[0497]综上所述，我们的结果表明hbtn5蛋白诱导m2巨噬细胞的产生，这可能促进肿瘤生长。相反，抗hbtn5阻断抗体在体外增强癌细胞的巨噬细胞吞噬作用，并在体内抑制表达癌细胞的btn5的生长。体内抗肿瘤活性可能是由于抗btn5抗体阻断了btn5对t细胞和巨噬细胞的抑制作用。[0498]施用hbtn5-ig融合蛋白改善小鼠的eae[0499]由于btn5-ig融合蛋白在体外抑制t细胞增殖、活化和细胞因子产生，因此我们着手研究在体内施用btn5-ig是否可以改善由过度活跃的免疫系统引起的自身免疫性疾病。多发性硬化症(ms)是中枢神经系统的自身免疫性疾病，并且eae是ms的常见动物模型。为了确定btn5是否减轻eae，用pmog肽免疫c57bl/6小鼠以诱导eae发展。然后用hbtn5-ig或对照ig蛋白处理小鼠。如图24a所示，hbtn5-ig治疗延迟了eae发病，并降低了整个42天时间过程中的平均临床得分。此外，hbtn5-ig处理组中无疾病小鼠的百分比增加(图24b)。此外，组织学评估显示，在hbtn5-ig处理组中，炎性病变明显减少，其中脱髓鞘和/或轴突损伤或损失很少或没有(图24c)。因此，与对照组相比，hbtn5-ig处理小鼠的组织学得分明显降低(图24d)。[0500]然后，我们分析了eae小鼠脾脏中的t细胞亚群。如图246e-h所示，在hbtn5-ig治疗的小鼠中，cd44locd62lhi原初cd4和cd8t细胞的百分比增加，而cd44hicd62llo有效记忆cd4和cd8t细胞的百分比降低，尽管cd44hicd62lhicd4和cd8中心记忆t细胞的百分比在hbtn5-ig与对照组之间没有显著差异。结果与我们的体外数据一致，btn5-ig蛋白抑制t细胞活化。[0501]由于tregs参与免疫耐受诱导并且cd4+cd25+foxp3+细胞是最深刻表征的tregs[45]，因此我们评估了cd4+cd25+foxp3+tregs。我们发现hbtn5-ig治疗增加了脾脏中tregs的百分比(图24i，j)。此外，在hbtn5-ig治疗的小鼠中，精氨酸酶+和cd206himhclom2巨噬细胞的百分比增加，而mhchicd206lom1巨噬细胞的百分比未改变(图24k，l)。[0502]接下来，我们在体外研究了mog刺激后的t细胞增殖和细胞因子产生。如图24m和n所示，来自hbtn5-ig处理小鼠的cd4t细胞的增殖响应于pmog35-55刺激而减少，尽管cd8t细胞的增殖在对照与hbtn5-ig组之间没有显著差异。hbtn5-ig处理还降低了th1细胞因子ifnγ和tnfα以及th17细胞因子的产生，但增加了来自cd4t细胞的th2型细胞因子il-10的产生(图24o，p)。[0503]施用hbtn5-ig融合蛋白减轻小鼠的t1d[0504]1型糖尿病(t1d)是由自身反应性t细胞破坏分泌胰岛素的胰岛β细胞而引起的自身免疫性疾病。nod小鼠是人t1d最常用的动物模型[46]。我们还研究了hbtn5-ig是否可以减轻t1d。将雌性22周龄的nod小鼠分为两组，并且每组中33％的小鼠患有t1d。以2天间隔对小鼠注射30μghbtn5-ig或对照ig蛋白持续3周。在30周时，67％对照ig治疗的小鼠患有t1d，而没有hbtn5-ig治疗的小鼠患有t1d。组织学分析显示，btn5-ig处理小鼠的炎症和胰岛损失明显低于对照ig处理组(图25a)。然后我们检查了脾脏中的t细胞和巨噬细胞。像eae小鼠一样，hbtn5-ig治疗导致原初cd4和cd8原初t细胞的百分比增加，尽管cd44hicd62llo有效记忆和cd44hicd62lhi中央记忆cd4和cd8t细胞的百分比在hbtn5-ig与对照组之间没有显著差异(图25b-e)。此外，在hbtn5-ig治疗的nod小鼠中，m2巨噬细胞的百分比增加，并且m1巨噬细胞的百分比降低(图25f，g)。综上所述，我们的结果表明，hbtn5-ig治疗改善eae和t1d，可能是通过抑制自身反应性t细胞的增殖和活化，以及增加m2巨噬细胞的数量。[0505]抗hbtn5-ig单克隆抗体(mab)的产生[0506]为了产生抗hbtn5mab，在第0天用100μg在完全弗氏佐剂(cfa)中的hbtn5-ig蛋白免疫balb/c小鼠(8-10周龄)，并在第14天和第21天在不完全弗氏佐剂(ifa)中以相同的蛋白量增强。用100μghbtn5-ig(无佐剂，添加100ml1xpbs代替)连续三天(第28、29、30天)对小鼠进行三次增强。在第31天从小鼠收获脾脏。将脾细胞单细胞悬液与x63-ag8.653骨髓瘤细胞融合，以产生杂交瘤。进行elisa以鉴定可以产生抗hbtn5mab但不具有对照ig蛋白的杂交瘤。进一步亚克隆这些杂交瘤克隆。产生了总共9条可以产生抗hbtn5mab的杂交瘤株。[0507]然后，我们确定了抗hbtn5mab是否可以增强巨噬细胞介导的癌细胞的吞噬作用。将bm来源的巨噬细胞与已被cfse标记的k562细胞孵育，如图23a所示。将抗hbtn5mab添加到培养物中2小时。然后分析细胞的cfse+细胞百分比。如图26所示，巨噬细胞介导的癌细胞的吞噬作用被两种抗hbtn5mab(克隆d4和d16)显著增强。我们正在研究mab在几种肿瘤动物模型中治疗肿瘤的能力。[0508]讨论：[0509]本研究将btn5鉴定为一种新的针对t细胞和巨噬细胞的抑制分子。btn5在细胞外区域中与现有的b7家族成员共享显著的序列和结构同源性。像b7家族分子一样，mbtn5中的细胞外区域含有lgv样和igc样结构域。尽管hbtn5与mbtn5高度同源，但hbtn5仅含有igv样结构域，而没有igc样结构域。然而，在hbtn5中缺乏igc样结构域似乎不影响其功能。我们已经证明，hbnt5-ig蛋白在体外抑制t细胞增殖和细胞因子产生，并在体内改善自身免疫性疾病。我们产生的mbtn5-ig蛋白仅含有igv样结构域，但也在体外显著抑制t细胞增殖和活化。[0510]通过使用流式细胞术分析，我们表明mbtn5蛋白在活化的apc(包括dc、单核细胞、巨噬细胞和b细胞，以及静息和活化的t细胞)的细胞表面上表达。btn5蛋白在apc的细胞表面上的表达也符合其调节t细胞增殖和/或活化的功能。[0511]btn5-ig蛋白与活化的cd4和cd8t细胞结合，但不与静息t细胞结合，这表明推定的btn5受体在活化的t细胞上表达。btn5加入icos、pdl1/2、b7-h3、b7-h4、btn1a1、btn2a2、btnl2、btnl1和btn3，以识别t细胞活化后诱导的受体[24,26,29,31]。然而，btn5蛋白不结合cd28、ctla-4、pd-1、btla或icos转染的细胞。因此，推定的btn5受体似乎不同于cd28、pd-1、ctla-4、btla或icos。[0512]除了抑制t细胞功能之外，btn5还影响巨噬细胞。我们已经证明，抗btn5抗体增强了巨噬细胞介导的表达btn5的癌细胞的吞噬作用。mbtn5和hbtn5两者中的igv结构域含有c1q识别序列，该序列是巨噬细胞膜蛋白。巨噬细胞与表达btn5的癌细胞之间的相互作用可能是由c1q识别序列介导的。[0513]我们的免疫组织化学分析显示，hbtn5蛋白在乳腺、结肠、肺、肝脏和前列腺肿瘤组织中高水平表达，而在相应的正常组织中仅检测到低水平的hbtn5蛋白。此外，我们检测了btn5蛋白在几个癌细胞系的细胞表面上的表达。表达模式表明btn5参与了癌细胞的免疫逃避。事实上，我们已经证明，在体内施用抗btn5多克隆抗体在小鼠中抑制表达btn5的结肠癌细胞的生长。[0514]我们还证明，在体内施用btn5-ig蛋白改善eae。我们已经证明，来自btn5治疗的eae小鼠的t细胞响应于体外mog刺激而具有减少的增殖。此外，来自btn5治疗的eae小鼠的脾细胞响应于mog而分泌减少量的th1细胞因子tnfα、ifnγ和il-2，但th2细胞因子il-10的量增加。有趣的是，btn5增加了eae小鼠血清中的il-10量，但在体外抑制了il-10产生。[0515]除了抑制t细胞增殖和活化之外，btn5诱导的tregs和m2巨噬细胞的产生还参与了btn5在自身免疫性疾病中的有益作用[0516]在nod小鼠中，btn5-ig蛋白治疗也减轻t1d。尽管btn5-ig抑制eae和t1d的机制是相似的，但也存在一些差异。例如，btn5-ig在eae模型中不仅增加了原初t细胞的百分比，还降低了有效记忆细胞的百分比，而btn5-ig在t1d模型中仅增加了原初t细胞的百分比。此外，btn5-ig在t1d模型中增加了m2巨噬细胞的百分比，并且降低了炎性m1巨噬细胞的百分比，但在eae模型中仅增加了m2巨噬细胞的百分比。这些差异可能是由于不同的动物模型和/或所使用hbtn5-ig的不同的剂量和持续时间。[0517]总之，我们已经将btn5鉴定为一种新的针对t细胞和巨噬细胞的抑制分子。btn5蛋白在apc以及一些肿瘤组织和癌细胞上表达。btn5推定的受体在活化的t细胞以及静息和活化的巨噬细胞上表达。btn5-ig融合蛋白在体外抑制t细胞的增殖、活化和细胞因子产生，并增加抗炎m2巨噬细胞的产生。在体内施用hbtn5-ig减轻自身免疫性疾病，包括eae和t1d。相反，抗btn5抗体在体外增强巨噬细胞介导的癌细胞的吞噬作用，并且施用该抗体在体内抑制肿瘤生长。因此，靶向btn5途径是一种治疗自身免疫性疾病、癌症和感染的创新方法。[0518]材料和方法[0519]btn5的生物信息学分析。[0520]经由macvector16.0.5(macvector,inc.)中的clustalw程序，分析了mbtn5和现有b7家族成员的细胞外结构域的序列比对，以及mbtn5和hbtn5的全序列。还经由macvector中的clustalw程序进行了系统发育树分析。用tmhmm服务器2.0版本和interpro预测跨膜和ig样结构域。[0521]mbtn5和hbtn5的克隆和纯化[0522]将mbtn5(aa48-156)和hbtn5(aa30-145)的细胞外结构域克隆并融合到含有小鼠igg2a(origene,rockville,md)的恒定区域的pcmv6-ac-fc-s表达载体中。将载体转染到hek-293细胞中。根据制造商的指示(gehealthcare)，使用proteingsepharose4fastflow纯化融合蛋白的上清液。通过sds-page、考马斯染色和蛋白质印迹验证纯化的蛋白。使用piercetmbca蛋白测定试剂盒(pierce,rockford,il)定量蛋白质。对照ig(重组小鼠igg2afc蛋白)购自bxcell(westlebanon,nh)。重组蛋白的内毒素水平低于1μg纯化蛋白的0.01eu/ml。[0523]小鼠[0524]balb/c、c57bl/6和nod/ltjnod小鼠购自jackson实验室。这些小鼠是根据康涅狄格大学动物护理和使用委员会批准的方案使用的。[0525]流式细胞术分析[0526]用如[53-56]所述的荧光色素缀合的抗体蛋白对器官和肿瘤的单细胞悬液进行染色。对于细胞内染色，首先用bdcytofix/cytoperm溶液在4℃下渗透细胞20分钟。荧光色素缀合的抗体的直接或间接染色包括：cd4、cd8、cd19、b220、cd11c、cd11b、f4/80、cd44、cd62l、cd69、foxp3、cd206、mhcii、ifnγ、tnfα、il-17a、il-10、ctla-4、cd28、pd-1、btla和icos(biolegend或bdbiosciences,sanjose,ca,sandiego,ca)。抗精氨酸酶1抗体、抗hbtn5单克隆抗体购自r&dsystem(minneapolis,mn)。用磺基-nhs-lc-生物素(thermfisher,grandisland,ny)生物素化mbtn5-ig。在facscalibur或lsrfortessax-20细胞分析仪(bdbiosciences)上分析样品。使用flowjo软件(ashland,or)进行数据分析。[0527]elisa[0528]根据制造商的指示，通过elisa试剂盒(biolegend)分别测定细胞因子ifnγ、tnfα、il-2和il-10的浓度。[0529]组织病理学[0530]从小鼠切除脊髓和胰腺，并用10％甲醛固定24小时。将组织片段包埋在石蜡中，并制备切片。用苏木精-曙红(h&e)对切片进行染色。将脊髓切片分别用luxol快速蓝色(lfb)和bielschowski银浸渍(bsi)染色，以评估脱髓鞘和轴突损伤。如[57]所述，对组织学染色切片进行半定量盲评分。[0531]人多种正常和肿瘤组织阵列购自biochain(newark,ca)。使组织经受抗原暴露，并且然后与抗hbtn5单克隆抗体(r&dsystem)，随后是immpressvrpolymerhrp抗小鼠igg试剂孵育，并根据制造商的指示用过氧化物酶底物溶液(vectorlaboratories)显影。[0532]体外t细胞测定[0533]使用间接免疫磁泛t标记系统从单个核细胞阴性分离的正常人外周血cd3+泛t细胞购自allcells,llc(alameda,ca)。通过免疫磁系统(miltenyi,auburn,ca)从c57bl/6小鼠纯化鼠cd3+t细胞，并且细胞的纯度通常>95％。在btn5-ig或对照ig存在下，用抗cd3和/或抗cd28(biolegend)刺激t细胞。在收获前12小时通过用[3h]胸苷(1μci/孔)(perkinelmer,inc.,downersgrove,il)对培养物进行脉冲来评估增殖反应。通过液体闪烁光谱学(perkinelmer,inc.)测量[3h]胸苷的掺入。对于羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)测定，用cfse(thermofisherscientific)标记脾细胞，并在btn5-ig或对照ig存在下用抗cd3刺激。通过流式细胞术分析细胞。[0534]逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)[0535]从组织分离出来自细胞的总rna，并且如[58]所述合成cdna。将等量的cdna用于rt-pcr。用琼脂糖凝胶观察pcr产物。[0536]培养bm来源的巨噬细胞[0537]从c57bl/6小鼠收获bm，并在含有m-csf的培养基中培养7天以分化为m0巨噬细胞[44]。如[44]所述在mbtn5-ig或对照ig存在下，诱导m0巨噬细胞分化为m1和m2。[0538]对于巨噬细胞吞噬测定，用cfse标记癌细胞，并在抗hbtn5抗体或同种型抗体存在下，用m0巨噬细胞培养2小时。通过流式细胞分析cfse+细胞测量吞噬作用。[0539]抗hbtn5多克隆和单克隆抗体的产生[0540]在第0天用100μg在完全弗氏佐剂(cfa)中乳化的hbtn5-ig蛋白免疫balb/c小鼠，并在第14天和第21天在不完全弗氏佐剂(ifa)中以相同的蛋白量增强。用100μg不含ifa的hbtn5-ig对小鼠进行3次增强(第28、29和30天)。在第31天，收获含有抗hbtn5多克隆抗体的血清。[0541]为了制备抗hbtn5单克隆抗体，还在第31天从免疫小鼠收获脾脏。将脾细胞单细胞悬液与x63-ag8.653骨髓瘤细胞融合，以产生杂交瘤。进行elisa以鉴定可以产生抗hbtn5mab但不具有对照ig蛋白的杂交瘤。通过有限稀释法进一步亚克隆这些杂交瘤克隆。[0542]局部肿瘤生长的评估[0543]鼠ct-26结肠癌细胞获自atcc。将用含有hbtn5基因的载体转染的癌细胞皮下(s.c.)注射到同基因balb/c小鼠的侧面。然后将小鼠抗hbtn5或对照多克隆抗体注射到肿瘤注射部位。使用公式v＝(a2b)/2，每隔一天通过最短(a)和最长(b)直径的卡尺测量来确定肿瘤大小(体积)。[0544]eae的诱导和评估[0545]将小鼠mog35-55(glbiochem,中国上海)在补充有结核分枝杆菌h37ra(difcolaboratories,detroit,mi)的完全弗洛伊德佐剂(sigma-aldrich,stlouis,mo,usa)中乳化。在第0天，在背侧的4个点处对小鼠s.c.注射mog。还对小鼠i.p.注射500ng纯化的[0546]百日咳杆菌毒素(sigma-aldrich)。然后基于以下量表观察小鼠的临床得分：0，正常；0.5，部分跛尾；1，瘫痪尾；2，协调运动丧失，后肢瘫痪；2.5，一后肢瘫痪；3，双后肢瘫痪；3.5，后肢瘫痪，前肢无力；4，前肢瘫痪；5，垂死或死亡。按照动物伦理学的要求，将超过临床得分4分的小鼠安乐死。[0547]t1d的评估[0548]对雌性nod小鼠i.p.注射hbtnl5-ig或对照ig蛋白。通过测试条(advancedglucosemeter,cvshealth,usa)测定小鼠的血糖水平。在连续两次读数上血糖测量大于250mg/dl的小鼠被认为有糖尿病。[0549]统计学分析[0550]p值是基于双侧学生t检验。置信水平高于95％(p<0.05)被确定为显著。[0551]参考文献：[0552][1]freemangj,graygs,gimmicd,lombarddb,zhoulj,whitem等.structure,expression,andtcellcostimulatoryactivityofthemurinehomologueofthehumanblymphocyteactivationantigenb7.jexpmed,1991；174:625-31.[0553][2]freemangj,gribbenjg,boussiotisva,ngjw,restivova,jr.,lombardla等.cloningofb7-2:actla-4counter-receptorthatcostimulateshumantcellproliferation.science(newyork,ny),1993；262:909-11.[0554][3]dongh,zhug,tamadak,chenl.b7-h1,athirdmemberoftheb7family,co-stimulatest-cellproliferationandinterleukin-10secretion.natmed,1999；5:1365-9.[0555][4]freemangj,longaj,iwaiy,bourquek,chernovat,nishimurah等.engagementofthepd-1immunoinhibitoryreceptorbyanovelb7familymemberleadstonegativeregulationoflymphocyteactivation.jexpmed,2000；192:1027-34.[0556][5]latchmany,woodcr,chernovat,chaudharyd,bordem,chernovai等.pd-l2isasecondligandforpd-1andinhibitstcellactivation.natimmunol,2001；2:261-8.[0557][6]tsengsy,otsujim,gorskik,huangx,slanskyje,paisi等.b7-dc,anewdendriticcellmoleculewithpotentcostimulatorypropertiesfortcells.jexpmed,2001；193:839-46.[0558][7]wangs,zhug,chapovalai,dongh,tamadak,nij等.costimulationoftcellsbyb7-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是否在体外影响t细胞的活化。cd69是早期的活化标记物。在用抗cd3抗体或抗cd3加上抗cd28抗体在分级剂量cd300f-ig或对照ig存在下培养脾细胞后。24小时后分析cd69在cd4和cd8t细胞上的表达。如图29所示，cd300f-ig以剂量反应的方式降低cd69在cd4和cd8t细胞两者上的表达。结果表明，cd300f还抑制cd4和cd8t细胞的活化。[0616]为了进一步证实cd300f2-ig抑制t细胞活化，我们分析了cd4+和cd8+t细胞对cd44和cd62l的表达。据报道，原初t细胞是cd44lowcd62lhi，而有效记忆t细胞是cd44hicd62llow。我们发现，cd300f-ig显著增加了抗cd3活化的cd4+和cd8+t细胞中cd44lowcd62lhi原初细胞的百分比，但降低了cd44hicd62llow效应记忆t细胞的百分比(数据未示出)。[0617]总之，我们的结果表明，cd300f-ig在体外抑制tcr介导的cd4和cd8t细胞两者的增殖和活化。像cd300c一样，与cd300f抑制途径的治疗相互作用具有用于治疗gvhd和自身免疫性疾病以及癌症的潜力。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3