专利名称：一种免疫预防和免疫治疗性病和癌症的融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术——基因工程领域。其特征在于融合一段或整个人类乳头瘤病毒(HPV)的早期表达的蛋白(如第16类型(HPV-16)的早期蛋白E4或E5或E6或E7)，在细菌mycobacterium bovis var.BCG(M.BOVIS BCG)的热休克蛋白(Heat shock protein，即Hsp。如65kDa或70kDa的热休克蛋白)上，构成融合蛋白。该种类型的融合蛋白在大肠杆菌、酵母或植物中表达。该蛋白不仅具有免疫预防HPV侵染的能力，而且具有免疫预防和免疫治疗由HPV引起的尖锐湿疣、肿瘤和癌症的能力。
人类乳头瘤病毒(HPV)感染是目前最广泛传染的性病。生殖器官HPV感染是普遍的，在美国大约10％的男人和女人在年纪15-49岁发生，而且，大多数这样的感染是亚临床的(即没有临床表现)。在PCR检测中，HPV-16几乎存在于所有的女人中，与细胞学结果无关。其中1％的HPV-16型阳性的妇女将发展为扩散性子宫癌(在中国，上述数据将高得多)。不管在男人，还是女人中，受HPV感染在外阴部产生瘤状突起，称尖锐湿疣。在女性中HPV感染还诱发产生子宫颈肿瘤和癌症。严重的HPV感染都将影响生育能力，也导致婴儿发育的崎形。
受HPV感染引起的尖锐湿疣，在中国现有的治疗是激光碳化，或严重的打干扰素，然而有效率低，只治表不治根，一般几个月就要复发。因为是病毒感染，没有特效药可治。
子宫颈癌是妇女第二大最普遍的恶性病，仅次于乳腺癌。但是，不管是对侵染性疾病还是对更普通已诊断出的子宫颈上皮细胞间肿瘤的治疗，都还仅限于手术性切除和放射性治疗。
因此，以治疗性免疫接种方式对感染HPV的细胞进行免疫治疗具极大的潜力。此外，对HPV免疫接种可以成功的诱导长期的免疫反应，因而证明可以长期地预防HPV侵染，防止尖锐湿疣和肿瘤的发生。
本发明的目的在于，用基因工程方法创造一种融合蛋白，提供一种新的简单有效的免疫预防和免疫治疗的新方法。不仅可以免疫预防HPV的侵染，而且可以治疗已由HPV侵染而诱发的尖锐湿疣和癌症。
实施方案(1)重组融合蛋白的结构融合热休克蛋白(Hsp)到肿瘤特异性的抗原(HPV)上而构成融合蛋白。以重组融合蛋白Hsp-E7为例，其N-末端的539个氨基酸来自于mycobacteriumbovis var.BCG的65kda(千道尔顿)的热休克蛋白；C-末端98个氨基酸来自于人类乳头瘤病(HPV)类型16的早期蛋白E7，其蛋白质的氨基顺序如
图1，预计的分子量约67737道尔顿。
HspE7的N-末端可接多个组氨酸(Histidine)的领头顺序，便于纯化。
(2)重组融合蛋白HspE7在大肠杆菌中的表达。
重组融合蛋白克隆在pet28a载体上，其起动子为T7，可被IPTG诱导表达该重组蛋白。重组融合蛋白也可克隆在其它大肠杆菌的载体上，表达在大肠杆菌中。
(3)重组融合蛋白表达于植物中重组融合蛋白可克隆于pBI121或pBI221上，分别通过农杆菌和基因枪转入植物中，在植物中表达。重组融合蛋白也可克隆在其它质粒载体上，表达在植物中。
(4)重组融合蛋白可克隆于酵母的质粒载体上，在酵母中表达。
实施例(1)重组融合蛋白Hsp-E7克隆在pet28a载体上，其起动子为T7，在大肠杆菌中表达。
(2)重组融合蛋白可克隆于pBI121或pBI221上，在植物中表达。其起动子为2×CaMV35S+AMV RNA4起动子和增强子。
(3)重组融合蛋白可克隆于酵母的质粒载体上，在酵母中表达。
(4)用重组融合蛋白Hsp-E7免疫老鼠，不仅诱导细胞免疫而且也诱导体液免疫。这些免疫对HPV-16-E7是特异性的。进一步，用这种在生理盐水中的重组融合蛋白进行预防免疫，保护免受HPV和肿瘤的侵染挑战；而治疗性的免疫导致已存在的肿瘤消失。尽管大多数的资料是用一个具多个组氨酸的领头顺序的(Histidine-tagged)重组融合蛋白(h)Hsp-E7得到的，但直接比较重组融合蛋白(h)Hsp-E7与重组但没有组氨酸领头顺序(Histidine-tag)的融合蛋白Hsp-E7，二者都具有同等预防HPV侵染、消除尖锐湿疣和肿瘤的能力。
权利要求
1.本发明是一种治疗性病和由性病引起的癌症的融合蛋白。权利要求重组融合蛋白的方法，即融合mycobacterium bovis var.BCG的热休克蛋白(Heatshock protein)到人类乳头瘤病毒(HPV)的病毒蛋白上。
2.如权利要求1所述的方法，热休克蛋白的一部份或全部融合于人类乳头瘤病毒的病毒蛋白的一部份或全部上，构成融合蛋白。
3.如权利要求1、2所述的方法，重组融合蛋白N-末端的氨基酸来自于mycobacterium bovis var.BCG的热休克蛋白，C-末端氨基酸来自于人类乳头瘤病毒(HPV)类型16(HPV-16)或类型18(HPV-18)的早期表达的蛋白(如HPV-16的E4或E5或E6或E7)。
4.如权利要求1、2所述的方法，重组融合蛋白N-末端的氨基酸来自于人类乳头瘤病毒(HPV)类型16(HPV-16)或类型18(HPV-18)的早期表达的蛋白(如HPV-16的E4或E5或E6或E7)，C-末端氨基酸来自于mycobacterium bovisvar.BCG的热休克蛋白。
5.如权利要求1、2、3和4所述的融合蛋白，重组融合蛋白的N-末端可接多个组氨酸(Histidine)的领头顺序(Histidine-tagged)，便于纯化。
6.如权利要求1、2、3、4、5所述的重组融合蛋白，可通过质粒载体表达在大肠杆菌、酵母菌和植物中。
7.如权利要求1、2、3和5所述的重组融合蛋白，其N-末端的氨基酸来自于mycobacterium bovis var.BCG的65kDa或70kDa热休克蛋白，C-末端氨基酸来自于人类乳头瘤病毒(HPV)类型16(HPV-16)或类型18(HPV-18)的早期表达的蛋白(如HPV-16的E4或E5或E6或E7)。
8.如权利要求7所述的重组融合蛋白Hsp-E7，其N-末端539个的氨基酸来自于mycobacterium bovis var.BCG的65kDa热休克蛋白，C-末端98个氨基酸来自于人类乳头瘤病毒(HPV)类型16(HPV-16)的早期表达的蛋白E7。
9.如权利要求8所述的重组融合蛋白Hsp-E7，其氨基酸顺序如说明书附图1。
10.如权利要求8、9所述的重组融合蛋白Hsp-E7，其N-末端可接多个组氨酸(Histidine)的领头顺序，便于纯化。
11.如权利要求8、9、10所述的重组融合蛋白Hsp-E7和N-末端可带多个组氨酸(Histidine)的重组融合蛋白(h)Hsp-E7，不仅具有免疫预防人类乳头瘤病毒(HPV)侵染的能力，而且具有免疫预防和免疫治疗由人类乳头瘤病毒(HPV)引起的尖锐湿疣、肿瘤和癌症的作用。
全文摘要
本发明融合细菌mycobacterium bovis var.BCG(M.Bovis BCG)的热休克蛋白到肿瘤特异性的抗原即人类乳头瘤病毒(HPV)上而构成融合蛋白。这种融合蛋白表达在大肠杆菌、酵母菌和植物中。用这种融合蛋白进行免疫注射,产生对肿瘤特异性抗原的特异性细胞免疫和体液免疫反应,不仅具有免疫预防人类乳头瘤病毒(HPV)侵染的能力,而且,免疫预防和免疫治疗由HPV引起的尖锐湿疣、肿瘤和癌症,因此,该种类型的重组融合蛋白,提供了一种简单有效的预防免疫制剂和治疗免疫制剂。
文档编号C12P21/00GK1248631SQ9811226
公开日2000年3月29日 申请日期1998年9月24日 优先权日1998年9月24日
发明者周国庆 申请人:周国庆