经修饰的人促红细胞生成素

文档序号：24983111发布日期：2021-05-07 22:59阅读：398来源：国知局

本发明描述了具有神经重构(neuroplastic)和神经保护(neuroprotective)能力的经修饰的促红细胞生成素分子，其可用于治疗中枢神经系统疾病，例如脑血管意外、神经创伤、神经炎症和神经退化。

现有技术

促红细胞生成素(epo)是i型细胞因子超家族的一部分，其特征在于具有重要的多效活性[1]。该细胞因子是红细胞生成的主要调节剂之一，与其他分子协同作用以促进红系谱系细胞祖细胞的增殖、分化和存活，并维持大部分循环红细胞[2]。

人epo(hepo)是高度糖基化的蛋白，其分子量范围为30至39kda。它具有三个共有的n-糖基化位点和一个o-糖基化位点[3]，它们可能以总的占用率发生。糖链由可变的单糖序列和可变数量的唾液酸(sa)组成[4,5]。n-连接的碳水化合物可包含两个、三个或四个支链，每个支链以带负电荷的sa分子结尾。就其本身而言，在o-糖基化位点结合的碳水化合物可包含至多两个sa分子[6]。

糖基化，尤其是n-聚糖的sa末端，对于epo的体内生物学活性至关重要，但对于体外受体结合并非如此[7,8]。这就是为什么糖苷含量较低的epo分子对epo受体(epor)具有高亲和力的原因；然而，它们的体内活性随着血浆清除率的增加而降低[8]。这些细胞因子的糖基化程度影响其产生效率、与受体的亲和力、血浆半衰期、分泌和蛋白稳定性[5,9]。

自1985年克隆hepo基因以来，有关细胞因子生物学的知识已发生了巨大变化。最早的进展之一是发现了该分子的一种新的生物学作用，这种作用扩展了其促红细胞生成能力，并包括几个重要的生理过程。其中一些最重要的是血管生成、血管阻力调节以及(更重要的是)细胞保护[10,11]。尽管促红细胞生成素最重要的活性是造血作用，但在各种组织和非促红细胞中epo及其受体的存在证实了上述的假说，即epo具有多种功能，并且其中最重要的一种是对中枢神经系统、心脏、肾脏、胃肠系统、生殖道和内皮细胞的细胞保护功能[12]，促进细胞增殖、血管生成并抑制细胞凋亡[13]。这些发现扩展了临床治疗其他疾病如心脏病发作、脑血管发作和许多其他与神经保护有关的疾病的预期[14]。

神经保护可以定义为维持和恢复大脑中细胞相互作用，从而最大程度地保护神经元功能的一种方法[15]。神经保护的目的是防止中枢神经系统疾病的病理性神经元丢失，例如脑血管意外、神经创伤、神经炎症和神经退化。

神经退行性疾病是一系列影响神经系统，导致认知障碍、行为障碍和机体调节系统变化的病理。它们的特点是长期性和渐进性。这些疾病包括帕金森氏病、不同类型的痴呆症、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症和亨廷顿氏病(huntington)等疾病，除了其他之外，从医学、医疗保健、社会和经济的角度来看，这是所有国家都必须面对的问题[16]。但是，随着世界人口的老龄化，无论是发达国家还是发展中国家，神经系统疾病的影响都会更大。在65岁以上人口比例增加的国家中，神经系统疾病的负担正在达到相当大的比例。仅考虑阿尔茨海默氏病，统计数据表明，全世界约有4400万人患有痴呆症，这一数字估计到2050年将增至1.15亿。这就是为什么这种疾病被认为是一种全球流行病的原因[17-19]。因此，世界各地许多研究小组都在寻找能够控制这种神经退行性疾病的治疗方法。

许多研究小组的共同努力使得研究进展为问题的根源带来了新的曙光，给早期发现带来了希望，并明确了更具体的攻击方法。但是，即使这样的努力，也没有发现任何可以治愈这种疾病的生物疗法。从这个意义上讲，制药市场仅提供了在发现这些疾病后延缓其进展的药物，但是这些药物的益处通常难以察觉，这就是为什么有必要开发新疗法的原因。今天，解决神经退行性疾病所带来的健康问题的成功，除其他方面外，将依赖于开发通过有利地影响病因或潜在发病机制以及以安全、成功和有效的方式预防或延缓疾病的发作或临床上的逐渐恶化而产生益处和持久作用的疗法。但是，反过来，有必要提出一种使大量人群皆可使用的有效的技术。近年来，制药行业的主要目标是找到能够攻击许多中枢神经系统疾病发展过程中的共同关键点(例如细胞凋亡、氧化应激、炎症、代谢功能障碍或受损的神经重构性)的化合物。

在这个研究领域中，epo由于在大脑中产生直接与细胞损伤的保护和修复有关的广泛的细胞应答的能力，而起着非常重要的作用[20]。epo可通过抗炎、抗氧化、抗神经毒性、血管生成、神经营养、再生和抗凋亡机制来诱导神经保护。

鉴于此，在epo研究中的另一个极其重要的进展是，鉴定了与它们的促红细胞生成和细胞保护性生物学活性有关的两个不同的分子位点。这两种活性是通过细胞因子与两种不同受体系统(负责促红细胞生成活性的同二聚体受体(epor)2和涉及细胞保护活性的异二聚体受体epor-βcr)的结合而产生的[21]。这些发现非常重要，因为它们提供了了解epo形成其生物学活性的途径的必要信息，由此可以选择性调节其促红细胞生成或细胞保护应答，避免或至少减少与使用非选择性药剂(例如epo或epo类似物)相关的副作用。

从这个意义上讲，尽管epo被认为是治疗贫血的安全且耐受性良好的药物，但是当epo打算用作脑血管发作或心脏病发作的患者的细胞保护剂时，即作为不患有贫血的患者的神经保护剂时，其血液学作用应视为副作用，因为它会导致红细胞增多症、高血压和血栓形成现象[22-25]。这就是为什么选择性调节其促红细胞生成作用和细胞保护作用的epo类似物的开发具有重要意义[14]。为了这个目的，已经设计了各种策略，以通过对分子进行化学修饰或调控糖苷含量，来废除细胞因子的促红细胞生成活性并维持其神经保护潜力。

关于在epo分子上进行化学修饰的策略，已经评估了七个赖氨酸残基的氨甲酰化作用，产生了高瓜氨酸残基[26]。但是，这种方法会在蛋白质中产生影响其功能的构象变化。基于这些结果，不同的工作组已通过氨基甲酰化作用完全修饰了重组hepo(rhepo)，获得了一种新分子，称为cepo，该分子保留了其细胞保护活性，而缺乏促红细胞生成活性[26-28]。然而，需要高量和多个剂量以达到所需目的并维持其治疗功效。

另一方面，已经通过控制rhepo的唾液酸(sa)含量对其进行了修饰。2003年，erbayraktar等人完全消除了epo糖苷链末端存在的sa残基，从而产生了所谓的asialoepo[29]。这种新的epo变体显示出高的体外活性。然而，其体内神经保护活性与用rhepo所获得的神经保护活性相当。

另一方面，为了增加刺激红细胞生成的细胞因子的循环半衰期，egrie和brown开发了一种刺激红细胞生成的蛋白：nesp，它是从hepo衍生而来，并具有两个额外的n-糖基化位点[6]。这种修饰导致血浆半衰期增加三倍及其体内造血效力。

关于糖苷含量的调控，本申请的发明人已经获得了具有与脑epo(rhnepo)相似的特征的rhepo变体，其是较少的rhepo酸性同功型(isoform)的组合。该变体表现出与rhepo相当的神经保护活性，并表现出小于4％的造血活性[30]。但是，当将rhnepo分子提议用作治疗要求血浆浓度要及时保持并足以发挥其生物学作用的慢性神经疾病的候选药物时，rhnepo的快速血浆清除率是一个缺点。此外，鉴于糖型的组合保留了其体外促红细胞生成活性，为了达到该目的而给予高剂量和频繁剂量具有产生血液学效应的风险，这被认为是不利的副作用。

此外，现有技术有许多其他努力尝试获得显示出神经保护活性且不存在促红细胞生成活性的促红细胞生成素分子或由其衍生的肽。在这方面，专利us2015119325描述了在植物中产生的脱唾液酸促红细胞生成素(asialo-rhepo)。专利申请us2009170759、us2003130197、mxpa02011727和us2003130197描述了与epo受体结合的肽，用于治疗涉及中枢神经系统的疾病。

文献wo2004043382描述了人促红细胞生成素多肽的变体，其包含在两个或更多个不同的epo修饰区中具有氨基酸差异并具有增强的促红细胞生成素活性的氨基酸序列。本发明的目的是促红细胞生成素多肽的人变体，其包含人促红细胞生成素氨基酸序列，该人促红细胞生成素氨基酸序列在两个或更多个不同的epo修饰区中具有氨基酸差异并且具有与其细胞保护能力有关的中等促红细胞生成素活性。

专利us2011008363描述了epo的不同变体，其中在蛋白的c-末端缺失了1-10个氨基酸。这些是具有降低的促红细胞生成活性和保留的神经保护作用的较低分子量的变体。

申请us2007027068描述了糖基聚乙二醇化的epo肽。一种突变的epo肽包含氨基酸序列(seqidno.：73)并具有选自arg<139>至ala<139>、arg<143>至ala<143>和lys<154>至ala<154>组成的组中的至少一种突变。

es2457398(t3)提到了编码epo变体的多核苷酸。

pctwo2005025606(a1)描述了一种经修饰的epo，其掺入寡糖以增加促红细胞生成活性并保持其细胞保护活性。

同样，wo2006127910描述了具有糖基化的epo以增强红细胞的产生。然而，其中提到，由于它具有细胞保护功能，也可用于治疗神经退行性疾病。

阿根廷提交的申请(ar055654)描述了用于治疗神经退行性疾病的重组促红细胞生成素。说明书详细描述了可以被修饰以添加糖基化位点的氨基酸，并着重强调了以下残基的修饰：87、88、90//30、32、87、88、90//24、87、88、90//38、87、88、90//83、87、88、90。其目的在于掺入聚糖以增加循环半衰期从而增加促红细胞生成活性。在专利wo9505465中引入的修饰中提出了相同的目的，该专利描述了具有额外糖基化位点的促红细胞生成素的变体。专利中提到的一些位点是：25、30、51、57、69、88、89、136、138。

此外，还提到了以下取代：

asn<30>thr<32>epo；

asn<51>thr<53>epo；asn<57>thr<59>epo；

asn<69>epo；

asn<69>thr<71>epo；

ser<68>asn<69>thr<71>epo；

val<87>asn<88>thr<90>epo；

ser<87>asn<88>thr<90>epo；

ser<87>asn<88>gly<89>thr<90>epo；

ser<87>asn<88>thr<90>thr<92>epo；

ser<87>asn<88>thr<90>ala<l62>epo；

asn<69>thr<72>ser<87>asn<88>thr<90>epo；

asn<30>thr<32>val<87>asn<88>thr<90>epo；

asn<89>ile<90>thr<91>epo；

ser<87>asn<89>ile<90>thr<91>epo；

asn<136>thr<138>epo；

asn<138>thr<140>epo；

thr<125>epo；和

pro<124>thr<125>epo。

文献wo2005103076描述了具有偶数个半胱氨酸残基，优选不超过四个半胱氨酸残基，或更优选不超过两个半胱氨酸残基的epo变体。优选地，半胱氨酸残基应在7、29、33和161位，甚至更优选在7和161位。这个申请提供的其他变体包括通过在以下一个或多个位置上添加而引起的任何突变：6、29、33、45、47、48、49、61、64、74、88、92、107、109、133、135、154、157和158。

申请us2011003744描述了一种促红细胞生成素制剂，其包含通过酶促修饰的糖苷残基的聚乙二醇缀合的蛋白或聚乙醇胺缀合的蛋白，以增加造血特性。

文献mxpa05000063描述了一种缺乏至少一种促红细胞生成素对骨髓的作用的组织保护性重组细胞因子；所述组织保护性重组细胞因子将缺乏促红细胞生成活性；更优选地，组织保护性重组细胞因子缺乏促红细胞生成素在骨髓中的所有作用。在说明书中提到，可以对epo进行一个或多个氨基酸的改变，或缺失或添加。在一个优选的实施方案中，组织保护性重组细胞因子在以下一个或多个区域中具有一个或多个修饰：vlqry(天然人促红细胞生成素的氨基酸11-15，seqidno.：1)和/或tkvnfyaw(天然人促红细胞生成素的氨基酸44-51，seqidno.：2)和/或sglrslttl(天然人促红细胞生成素的氨基酸100-108，seqidno.：3)和/或snflrg(天然人促红细胞生成素的氨基酸146-151，seqidno.：4)。可以在seqidno.：10的氨基酸7、20、21、29、33、38、42、59、63、67、70、83、96、126、142、143、152、153、155、156和161中产生其他突变。这些其他突变对于在至少一个前述区域中的至少一个突变可以是独有的或额外的。在某些实施方案中，tkvnfyaw(天然人促红细胞生成素的氨基酸44-51，seqidno.：2)的一个或多个氨基酸的变化产生具有部分功能的经修饰的促红细胞生成素分子，即，比rhepo具有更少的促红细胞生成活性。在其他实施方案中，改变sglrslttl(天然人促红细胞生成素的氨基酸100-108，seqidno.：3)的一个或多个氨基酸，甚至存在唾液酸或缺乏聚糖的分子的含量的修饰或碳水化合物的修饰，例如氧化、还原，或具有化学修饰的变体，例如硝化、酰化、琥珀酰化、生物素化、碘化和氨甲酰化。没有提及为了降低或阻断促红细胞生成活性而在负责促红细胞生成活性的位点添加新的聚糖。

可以理解，到目前为止，在现有技术中描述的为获得显示神经保护活性且不存在促红细胞生成活性的促红细胞生成素方面所做的努力还未取得成功。本发明提供了新的hepo突变蛋白，其已显示出神经保护作用和神经营养作用。这些突变蛋白是通过一种原创方法获得的，该方法通过在hepo分子负责结合同二聚体和异二聚体受体的区域上产生新的n-糖基化共有位点来修饰hepo分子。出乎意料的是，新的hepo突变蛋白缺乏促红细胞生成活性，但是其神经保护/神经重构活性没有改变，甚至得到提高，由此它们在药代动力学特性方面也有所改善。原始epo的修饰很少，从而与天然蛋白的结构保持高度相似性。

发明简述

本发明描述了一种经修饰的人促红细胞生成素，其不存在或具有降低的促红细胞生成活性，优选具有相对人促红细胞生成素至多0.5％的促红细胞生成活性，并且在血浆中具有更长的半衰期，这维持了其神经保护和神经重构能力。该经修饰的人促红细胞生成素与同二聚体受体或异二聚体受体中的至少一个的结合被部分或完全消除。这种失效包括通过引入用于n-糖基化的共有位点(consensussite)而使与同二聚体或异二聚体受体的一个结合位点突变。

在本发明的一个优选实施方案中，经修饰的人促红细胞生成素具有以下突变：tyr15asn和leu17thr，并包含seqidno.2。

在本发明的一个优选实施方案中，经修饰的人促红细胞生成素具有以下突变：lys45asn和asn47thr，并包含seqidno.4。

在本发明的一个优选实施方案中，经修饰的人促红细胞生成素具有以下突变：glu62asn和trp64thr，并包含seqidno.8。

在本发明的一个优选实施方案中，经修饰的人促红细胞生成素具有以下突变：gln65asn和leu67thr，并包含seqidno.10。

在本发明的一个优选的实施方案中，经修饰的人促红细胞生成素具有以下突变：glu72asn和val74thr，并包含seqidno.12。

在本发明的一个优选实施方案中，经修饰的人促红细胞生成素具有以下突变：arg76asn和gln78thr，并包含seqidno.14。

在本发明的一个优选实施方案中，经修饰的人促红细胞生成素具有以下突变：ala98asn和ser100thr，并包含seqidno.16。

在本发明的一个优选的实施方案中，经修饰的人促红细胞生成素具有以下突变：ser104asn，并包含seqidno.18。

在本发明的一个优选实施方案中，经修饰的人促红细胞生成素具有以下突变：thr106asn和leu108thr，并包含seqidno.20。

在本发明的一个优选的实施方案中，经修饰的人促红细胞生成素具有以下突变：leu149thr，并包含seqidno.22。

在本发明的一个优选实施方案中，经修饰的人促红细胞生成素具有以下突变：gly151asn和leu153thr，并包含seqidno.24。

本发明的经修饰的人促红细胞生成素具有相对人促红细胞生成素至多1％的促红细胞生成活性。优选地，其具有相对人促红细胞生成素至多0.5％的促红细胞生成活性。更优选地，其具有相对人促红细胞生成素至多0.2％的促红细胞生成活性。

另一方面，本发明描述了包含本发明的促红细胞生成素的核苷酸序列的核酸。此外，罗列了编码每个所描述和产生的突变蛋白的dna序列。这些dna序列是seqidno.1、seqidno.3、seqidno.7、seqidno.9、seqidno.11、seqidno.13、seqidno.15、seqidno.17、seqidno.19、seqidno.21和seqidno.23。在本发明的一个可选的实施方案中，这些核酸是用于转化细胞的载体，或者是表达载体或慢病毒载体。

在本发明的一个优选实施方案中，编码本发明的经修饰的人促红细胞生成素的核酸序列是seqidno.1。

在本发明的一个优选实施方案中，编码本发明的经修饰的人促红细胞生成素的核酸序列是seqidno.3。

在本发明的一个优选实施方案中，编码本发明的经修饰的人促红细胞生成素的核酸序列是seqidno.7。

在本发明的一个优选实施方案中，编码本发明的经修饰的人促红细胞生成素的核酸序列是seqidno.9。

在本发明的一个优选实施方案中，编码本发明的经修饰的人促红细胞生成素的核酸序列是seqidno.11。

在本发明的一个优选实施方案中，编码本发明的经修饰的人促红细胞生成素的核酸序列是seqidno.13。

在本发明的一个优选实施方案中，编码本发明的经修饰的人促红细胞生成素的核酸序列是seqidno.15。

在本发明的一个优选实施方案中，编码本发明的经修饰的人促红细胞生成素的核酸序列是seqidno.17。

在本发明的一个优选实施方案中，编码本发明的经修饰的人促红细胞生成素的核酸序列是seqidno.19。

在本发明的一个优选实施方案中，编码本发明的经修饰的人促红细胞生成素的核酸序列是seqidno.21。

在本发明的一个优选实施方案中，编码本发明的经修饰的人促红细胞生成素的核酸序列是seqidno.23。

此外，本发明描述了经遗传修饰的细胞，其具有选自包括以下的组的任何dna序列：seqidno.1、seqidno.3、seqidno.7、seqidno.9、seqidno.11、seqidno.13、seqidno.15、seqidno.17、seqidno.19、seqidno.21和seqidno.23；其中该经遗传修饰的细胞能够表达本发明的经修饰的促红细胞生成素。在一个优选的实施方案中，经遗传修饰的细胞是植物细胞，或动物细胞或允许添加n-聚糖的任何细胞宿主。优选地，该细胞源自动物细胞系。优选地，该细胞系选自包括cho.k1、hek293、ns0、bhk-21和hela的组。

另一方面，本发明描述了一种获得经修饰的人促红细胞生成素的方法，该方法包括以下步骤：

a.提供编码所述经修饰的人促红细胞生成素的核酸序列；

b.构建至少一种包装细胞的共转染载体；

c.共转染产生慢病毒颗粒的包装细胞，所述慢病毒颗粒包含编码所述经修饰的人促红细胞生成素的核酸序列；

d.收获由步骤c的包装细胞所产生的慢病毒颗粒；

e.用步骤d的所述慢病毒颗粒转导能够表达经修饰的人促红细胞生成素的细胞；

f.选择步骤e中包含编码经修饰的人促红细胞生成素的核酸序列的细胞；

g.培养步骤f的细胞，使得所述细胞能够表达所述经修饰的人促红细胞生成素；和

h.分离并纯化所述经修饰的人促红细胞生成素。

其中，在所述步骤a中，核酸序列选自包括以下的组：seqidno.1、seqidno.3、seqidno.7、seqidno.9、seqidno.11、seqidno.13、seqidno.15、seqidno.17、seqidno.19、seqidno.21和seqidno.23。

其中步骤b包括：允许慢病毒颗粒进入细胞的载体，编码基质蛋白、衣壳、慢病毒蛋白酶、逆转录酶和整合酶的载体，包含经修饰的人促红细胞生成素序列的转移载体；和诱导转移载体核输出的载体。

其中，在所述步骤e中，所述细胞选自包括cho.k1、hek293、ns0、bhk-21和hela的组。

其中，所述步骤h是通过包括抗rhepo抗体和洗脱剂的免疫亲和的纯化。

其中所述洗脱剂选自包括以下的组：甘氨酸、乙酸-nacl、乙酸盐、柠檬酸、磷酸盐、乙醇、异丙醇、二噁烷、乙二醇、tris-hcl、及其混合物。优选地，该洗脱剂选自包含以下的组：甘氨酸、乙酸-nacl。更优选地，洗脱剂选自包括以下的组：0.1m甘氨酸(ph＝2)；0.15m甘氨酸(ph＝2.5)；以及0.2m乙酸，0.15mnacl(ph＝3)。

附图简要说明

图1.通过定点突变法获得12个hepo突变蛋白的步骤的顺序图。

图2.使用琼脂糖凝胶分析在每个pcr反应中获得的片段：a-从pcr1获得的片段；b-从pcr2获得的片段。

图3.使用iedb数据库对hepo突变蛋白和未修饰分子的潜在抗原性进行计算机分析。

图4.蛋白质印迹法证实了新的n-糖基化位点的插入。

图5.通过elisa夹心技术评估rhepo分子或其突变蛋白的洗脱能力：

■方案a(形成复合物ag-ac后的洗脱能力)；

■方案b(用不同的洗脱剂处理mab后，与目标分子的结合能力的保留程度)。

图6.使用mab2b2通过免疫亲和色谱(iac)纯化hepo突变蛋白mut104：

a-纯化hepo突变蛋白mut104期间获得的完整色谱图

b-色谱图a洗脱区的放大。

图7.使用0.15m甘氨酸(ph2.5)作为洗脱剂通过免疫亲和色谱(iac)来评估突变蛋白mut104纯化。样品：1-接种；2-流过物；3-洗涤1；4-洗涤2；5-洗涤3；6-洗脱级份的混合物；7-rhepo标准品(zellteks.a.)。

图8.hepo突变蛋白的免疫亲和层析(iac)后获得的洗脱物的纯度分析。样品：1-分子量标记物；2-rhepo标准品(zellteks.a.)；3-洗脱物mut45_47；4-洗脱物mut104；5-洗脱物151_153。

图9.hepo突变蛋白的表观分子量的测定。mm：分子质量标记物。

图10.通过免疫亲和色谱法(iac)纯化的hepo突变蛋白的ief。样品：1-mut45_47；2-mut104；3-rhepo标准品(zellteks.a)。

图11.获得的rhepo及其突变蛋白的ecz电泳图。a：mut45_47；b：mut104；c：rhepo。术语“峰”对应于ecz电泳图中归属的每个峰；“面积”(％)表示通过对每个峰的曲线下面积进行积分而计算得出的每个同功型的百分比。

图12-a-.体外评估的用于hepo突变蛋白的特定促红细胞生物学活性的比较。

图12-b-.hepo突变蛋白的体内促红细胞生成活性评估。在正常红细胞(normocytemic)小鼠(n＝4)中评估了hepo突变蛋白(mut)的体内促红细胞生成活性，小鼠适当地用相同的rhepo或hepomut处理，或以pbs作为对照进行处理。处理后，量化每种治疗的网织红细胞百分比。***p≤0.001和ns(无显著性)表示在anova检验ypost-anovatukey检验之后的统计学显著性程度(n＝4)。

图13.使用神经元起源的sh-sy5y细胞培养，rhepo和mut104的细胞/神经保护活性。cstp：星形孢菌素(stp)添加的对照；ccel：细胞对照(不添加stp或突变蛋白)。*p≤0.05和**p≤0.01表示在anova检验ypost-anovadunnet检验之后的统计学显著性程度(n＝3)。

图14海马神经元原代培养物中神经元发育的示意图。

图15.通过鼠n2a细胞评估神经突的形成。(a)每个分析组的代表图；(b)通过评估以下神经突参数获得的代表图：平均长度、最长神经突的延伸和每个神经元的平均神经突数。*p≤0.05和**p≤0.01表示在anova检验ypost-anovabonferroni检验后的统计学显著程度(n＝3)。

图16.使用大鼠胚胎海马神经元原代培养物来评估丝足密度。*p≤0.05和**p≤0.01代表anova检验ypost-anovabonferroni检验后的统计学显著性程度(n＝3)。

图17.使用大鼠胚胎海马神经元原代培养物来评估突触形成。*p≤0.05和**p≤0.001代表anova检验ypost-anovabonferroni检验后的统计学显著性程度

图18.评估hepo突变蛋白对11天体外(div)培养的原代神经培养物的神经保护生物学活性。在11div的sprague-dawley大鼠的海马神经元原代培养物中，评估了hepo突变蛋白(mut)的体外神经保护活性。视情况用等质量的rhepo或突变蛋白或以pbs作为对照来处理培养物。然后，通过与星形孢菌素(stp)一起孵育来诱导凋亡。用hoescht和phalloidin-fitc试剂进行免疫荧光，以分析凋亡细胞核的百分比。***p≤0.001、**p≤0.01和ns(无显著性)代表在anova检验ypost-anovabonferroni检验后的统计学显著性程度。

发明详述

正如在现有技术中提到的那样，目的是尝试设计不同的策略来降低细胞因子的促红细胞生成活性，保持其神经保护和神经营养潜力，这是基于对分子的化学修饰的应用，或者基于对其糖苷含量的调控。然而，现有技术尚未描述使用糖基化作为参与负责促红细胞生成的相互作用的分子部分的阻断机制。

因此，本发明提供了一种新的经修饰的促红细胞生成素，其通过同时实现以下技术而解决了现有技术中提到的问题：

·在需要与神经保护有关的治疗且促红细胞生成成为不良反应的患者中抑制hepo造血功能。

·延长hepo半衰期，以改善体内生物学活性，并减少给药剂量。

因此，本发明包括衍生自hepo的高糖基化突变蛋白在制备旨在用于预防或治疗神经重构和/或神经保护在其中具有有益作用的疾病或患有这种疾病的遗传易感性的药物组合物中的用途。本发明可施用于患有神经退行性疾病，例如阿尔茨海默氏病(ad)、帕金森氏病(pd)、肌萎缩性侧索硬化症(als)等的患者；施用于患有运动神经元疾病，例如亨廷顿氏病、脊髓小脑萎缩症、克罗伊茨费尔德-雅各布病(creutzfeld-jakobdisease)等的患者；施用于失能性疾病，例如抑郁症或精神分裂症；发育性疾病，例如唐氏综合症；以及因脑血管意外或颅脑损伤而遭受神经组织损伤的人。

在本文中，术语“突变蛋白(mutein)”是指已经被定点突变修饰的蛋白，该定点突变包括置换其氨基酸残基的1或2个，以引入共有的潜在n-糖基化位点。

n-糖基化的共有位点的产生或添加包括目标分子的位点或区域处的氨基酸突变。为了使细胞进行聚糖添加，必须存在asn-xaa-ser/thr位点，其中xaa可以是pro以外的任何氨基酸。为此，如果要添加n-糖基化位点的位点中存在asn残基，则+2位的氨基酸(相对于asn)突变为thr，其与ser相比具有更高的功效从而使得asn残基被聚糖占据。另一种方式，如果要修饰的位点在+2位具有表明存在ser或thr的氨基酸，则该氨基酸突变为asn。就是说，随时都有保守的改变。

本发明描述了人促红细胞生成素，其具有氨基酸结构的修饰从而可以实现以下目的：

i.保留氨基酸残基，这些残基构成分子构象或神经保护/神经重构活性形成的关键位点。

ii.在造血活性消除中提出的氨基酸修饰。

iii.n-糖基化的共有位点的产生。

已构建了12个hepo突变蛋白。在这些突变蛋白中，进行了1或2个氨基酸的修饰，以掺入n-糖基化的共有位点，从而消除造血活性、保留神经保护/神经重构活性并获得具有优异的血浆半衰期的突变体。

为获得本发明的分子而进行的测定详述如下。这些测定旨在举例说明本申请，并且应以其最宽泛的意义来理解，而不是限制本发明的保护范围。

1.hepo衍生的突变蛋白的设计和获得，该突变蛋白消除了促红细胞生成的活性，并保留了神经保护/神经重构作用。

我们设计了26个寡核苷酸：其中2个用于扩增新的完整epo序列，其余24个(正向和反向寡核苷酸)用于引入12个点突变。

根据本发明提供的描述，修饰应解释为给定位置的氨基酸被相同位置的另一个氨基酸取代。因此，以突变1(lys45→asn45)+(asn47→thr47)为例，其应解释为45位的赖氨酸残基变化为在所述位置的天冬酰胺残基；和47位的天冬酰胺变化为苏氨酸。

通过定点突变法产生hepo突变蛋白的策略概述于图1所示的方案中。

使用hepodna作为模板，每个突变体的寡核苷酸和寡核苷酸pmatepof(gccgtcaaggccacgtgtcttgtcca)和与hepo序列的末端互补结合的pmatepor(aggccagtcttgtgctccaggtaccg)，进行第一pcr以引入上述每个突变。获得了24个片段，对应于12个hepo突变蛋白。所述12个合成的hepo突变蛋白(突变蛋白)的核苷酸和氨基酸序列是：

引物为：

mut15_17f：gtgctggaaagaaacctgacggaagccaaa

mut15_17r：tttggcttccgtcaggtttctttccagcac

突变蛋白15-17的核苷酸序列(seqidno.1)

突变蛋白15-17的氨基酸序列(seqidno.2)

突变蛋白45-47(ls45→asn45)+(asn47→thr47)

引物为：

mut45_47f：cccgacaccaacgtgaccttctacgcc

mut45_47r：ggcgtgaaggtcacgttggtgtcggg

突变蛋白45-47的核苷酸序列(seqidno.3)

突变蛋白45-47的氨基酸序列(seqidno.4)

突变蛋白49(tyr49→thr49)

引物为：

mut49f：aaagtgaacttcaccgcctggaagcgg

mut49r：ccgcttccaggcggtgaagttcacttt

突变蛋白49的核苷酸序列(seqidno.5)

突变蛋白49的氨基酸序列(seqidno.6)

突变蛋白62-64(glu62→asn62)+(trp64→thr64)

引物为：

mut62_64f：caggctgtgaacgtgacgcagggactg

mut62_64r：cagtccctgcgtcacgttcacagcctg

突变蛋白62-64的核苷酸序列(seqidno.7)

突变蛋白62-64的氨基酸序列(seqidno.8)

突变蛋白65-67(gln65→asn65)+(leu67→thr67)

引物为：

mut65_67f：gaagtgtggaacggaacggctctgctg

mut65_67r：cagcagagccgttccgttccacacttc

突变蛋白65-67的核苷酸序列(seqidno.9)

突变蛋白65-67的氨基酸序列(seqidno.10)

引物为：

mut72_74f：ctgctgagcaacgctacgctgagagga

mut72_74r：tcctctcagcgtagcgttgctcagcag

突变蛋白72-74的核苷酸序列(seqidno.11)

突变蛋白72-74的氨基酸序列(seqidno.12)

突变蛋白76-78(arg76→asn76)+(gln78→thr78)

引物为：

mut76_78f：gctgtgctgaacggaacggccctgctc

mut76_78r：gagcagggccgttccgttcagcacagc

突变蛋白76-78的核苷酸序列(seqidno.13)

突变蛋白76-78的氨基酸序列(seqidno.14)

突变蛋白98-100(ala98→asn98)+(ser100→thr100)

引物为：

mut98_100f：gtggacaagaatgtgaccggcctgagatcc

mut98_100r：ggatctcaggccggtcacattcttgtccac

突变蛋白98-100的核苷酸序列(seqidno.15)

突变蛋白98-100的氨基酸序列(seqidno.16)

突变蛋白104(ser104→asn104)

引物为：

mut104f：tccggcctgagaaacctgaccaccctg

mut104r：cagggtggtcaggtttctcaggccgga

突变蛋白104的核苷酸序列(seqidno.17)

突变蛋白104的氨基酸序列(seqidno.18)

突变蛋白106-108(thr106→asn106)+(leu108→thr108)

引物为：

mut106_108f：agatccctgaacaccacgctgagagca

mut106_108r：tgctctcagcgtggtgttcagggatct

突变蛋白106-108的核苷酸序列(seqidno.19)

突变蛋白106-108的氨基酸序列(seqidno.20)

突变蛋白149(leu149→thr149)

引物为：

mut149f：tactccaacttcacgcggggcaagctg

mut149r：cagcttgccccgcgtgaagttggagta

突变蛋白149的核苷酸序列(seqidno.21)

突变蛋白149的氨基酸序列(seqidno.22)

突变蛋白151-153(gly151→asn151)+(leu153→thr153)

引物为：

mut151_153f：aacttcctgcggaacaagacgaagctgtac

mut151_153r：gtacagcttcgtcttcttccgcaggaagtt

突变蛋白151-153的核苷酸序列(seqidno.23)

突变蛋白151-153的氨基酸序列(seqidno.24)

人epo序列

人epo的核苷酸序列(seqidno.25)

人epo的氨基酸序列(seqidno.26)

这些在图2a中示出。这些片段用作模板进行第二次pcr，这次仅使用与hepo末端结合的寡核苷酸以获得12个突变体的序列(图2b)。pcr反应后，用限制酶xbai/sali消化对应于12个hepo突变蛋白的产物，xbai/sali在hepo分子侧翼，克隆到用相同限制酶消化的plv-plk载体中。氨苄青霉素转化并筛选出前10个细菌。在液体培养基中扩增每种hepo突变蛋白的3-4个菌落，以进行质粒dna的微量制备。然后，我们通过限制酶消化hepo序列中存在且载体序列中不存在的位点，确认了插入的存在。最后，对质粒dna微量制备物进行测序，以确认在hepo分子上进行的突变的插入。

2.hepo突变蛋白的潜在抗原性的计算机分析

使用iedb数据库(免疫表位数据库和分析资源)进行计算机分析，以比较hepo突变蛋白的潜在抗原性和未修饰分子的潜在抗原性。针对所有，通过分析全世界8个最具代表性的等位基因(人，hla-dr：drb1*01.01、drb1*03.01、drb1*04.01、drb1*07.01、drb1*08.01、drb1*11.01、drb1*13.01、drb1*15.01)，进行了t表位(ii类主要组织相容性复合物(mhcii)中识别)的预测。获得每个hepo变体的抗原性评分，并将每个抗原性评分与针对hepo获得的评分进行比较。图3示意性地总结了它们各自的潜在抗原性程度。因此，观察到两个具有与hepo相同程度的抗原性的突变蛋白(mut98_100，mutl51_153)，两个突变蛋白可能具有更高的抗原性(mut72_74和mut62_64)，以及8个突变蛋白可能具有更低的抗原性(mut45_47、mut49、mutl5_17、mut65_67、mutl49、mut76_78、mut104和mut106_108)，最后两个抗原性较低。

3.获得产生所述突变蛋白的细胞系

组装慢病毒颗粒以随后转导cho.k1细胞。因此，将hek293t/17细胞(包装细胞)与4种载体共转染，以为12个突变蛋白的每一个生成相应的慢病毒颗粒。使用的4种载体是：prev(其诱导转移载体的核输出及其包装)；pvsvg(编码vsv包膜g蛋白，是病毒颗粒进入细胞所必需的，具有广泛的嗜性)；pmdl(其编码基质和衣壳蛋白(能够包装表达载体)、蛋白酶、逆转录酶和整合酶(切割结构元件和整合到细胞基因组中所需)和转移载体plv-plk-mutx(其中所有病毒基因已被去除并由与本发明的hepo突变蛋白相对应的目标基因代替)。转染hek293t/17细胞两天后，收集每个含有mutx慢病毒颗粒的细胞的上清液，将其用于转导cho.k1细胞。获得了12个cho.k1mutxhepo系。72小时后，收集上清液并保存以用于以后的表征。同样，为了产生稳定的重组细胞系，用增加量的嘌呤霉素抗生素压制细胞，以选择掺入转基因的那些细胞。扩增经压制的细胞系并将其冷冻保存在低温混合物(90％(v/v)fbs，10％(v/v)dmso)中，并将其存储在液氮罐中。

最初，通过夹心elisa技术和对hepo分子具有特异性的抗体，使用通过转导获得的细胞系培养物确定浓度。单克隆抗体被用作捕获，兔多克隆抗体被用于检测(两种类型的抗体都是在我们的实验室开发的)。认为所获得的浓度(示于表i)足以进行研究。

此外，使用多克隆抗体通过蛋白质印迹(westernblot)技术分析培养上清液，以检测所有hepo突变蛋白。这种方法使与未经修饰的hepo相比呈现更高分子量的突变蛋白可视化，这与在分子结构中插入新的n-糖基化位点相吻合(图4)。

同样，进行等电聚焦分析，然后进行蛋白质印迹分析，以研究cho.k1细胞培养上清液中表达的每个hepo突变蛋白中的糖同功型(glycoisoform)的数量。在评估的12种突变蛋白中的11种中获得的同功型数量高于未经修饰的hepo。与在未经修饰的hepo的培养上清液中观察到的7种同功型相比，同功型的范围为8至16种同功型。

本发明提供了具有很少或没有促红细胞生成活性的hepo突变蛋白，以避免在用作潜在的神经保护/神经重构候选物时由细胞因子产生的副作用。因此，使用其增殖取决于存在的hepo的tf-1细胞，研究了上述体外活性。为了测量促红细胞生成活性，在用具有众所周知的生物学活性的hepo标准品刺激96小时后，评估了这些细胞的增殖。与商业化的hepo标准品和未经修饰的hepo分子相比，所有开发的hepo突变蛋白都成功地表现出降低的或没有促红细胞生成活性，除了mut49(其维持了促红细胞生成活性)。结果总结在表i中。

表i.hepo突变蛋白的表征。通过夹心elisa在培养上清液中进行浓度定量，通过等电聚焦评估测量的同功型的数量，并确定体外生物活性，以相对未修饰分子的百分比表示。

nda：不可检测的活性；rhepo：重组人促红细胞生成素；mut：突变蛋白。

本发明提供了hepo突变蛋白，其在不消除细胞保护性生物学活性但消除造血活性的位置上包含对n-糖基化敏感的位点。它们在cho.k1细胞培养上清液中表达并随后进行表征。它们全部显示出更高的糖基化程度，达到了包括额外的n-糖基化位点以增加其血浆半衰期的目的。同样，已经证实对所述分子进行的修饰对造血生物学活性有影响，在大多数突变蛋白中取消了造血生物学活性而在剩余的突变蛋白中造血生物学活性大大降低。

4.通过免疫亲和色谱法纯化hepo衍生的突变蛋白

下面给出了本发明突变蛋白的纯化方法。为了更好地理解此方法，下面以免疫亲和(ia)纯化方案为例介绍了以下突变蛋白：mut45_47、mut104、mut151_153。最初，我们模拟了一个与ia基质中发生的过程相同的过程，目的是确定洗脱由抗rhepo单克隆抗体捕获的每个高糖基化hepo突变蛋白的最有利的条件，该抗体是在我们实验室中为此目的开发的(方案a)。基于以上所述，进行了夹心elisa测定，以量化在使抗原-抗体复合物经受每种洗脱条件后仍与mab2b2结合的hepo衍生物的比例。同样，鉴于ia基质的未来重复使用程序，我们评估了每种洗脱溶液对抗体的影响，以确定它们是否会影响与hepo突变蛋白的结合能力(方案b)。

评估以下溶液的洗脱能力：

1.甘氨酸0.1mph2

2.甘氨酸0.15mph2.5

3.乙酸0.2m；氯化钠0.15mph2.5

4.甘氨酸0.15mph3

5.柠檬酸0.1mph3

6.乙酸0.2m，氯化钠0.15mph3

7.甘氨酸0.15mph3.5

8.乙酸钠0.1mph4

9.乙酸钠0.1m/二噁烷10％(v/v)ph4

10.乙酸钠0.1mph5

11.磷酸钠0.1mph6

12.磷酸盐缓冲盐水(pbs)中40％异丙醇(v/v)，ph7

13.pbsph7

14.pbs中40％(v/v)乙醇，ph7

15.pbs中10％(v/v)二噁烷，ph7

16.pbs中40％(v/v)乙二醇，ph7

17.tris/hcl0.1mph8

18.甘氨酸0.1mph9

19.甘氨酸0.1mph10

20.甘氨酸0.1mph11

21.磷酸钠0.1mph11

22.磷酸钠0.1mph11.7。

假定抗原-抗体复合物100％形成，认为所得到的用pbs处理的抗原-抗体复合物的吸光度值是对照(即，没有rhepo或其突变蛋白解吸)。对于方案b，将所获得的用pbs处理的抗体(在形成ag-ac复合物之前)的吸光度值视为抗体与所研究分子的结合能力的保留情况的对照。因此，相对用pbs评估的对照来表示其余测试溶液获得的结果(图5)。

在所有情况下，观察到与其他溶液相比，由甘氨酸0.1mph2确立的条件具有最高的抗原解吸能力。然而，在用其进行在前处理后，前述复合物的形成能力显著降低。因此，在免疫亲和色谱中使用此类洗脱并不方便，因为这会影响色谱基质的重复使用。

另一方面，该测定选择了两种洗脱溶液作为免疫亲和色谱法(iac)中的候选溶液：甘氨酸0.15mph2.5和乙酸0.2m，nacl0.15mph3。这两种溶液都能够解离ag-ac复合物，剥离目标蛋白(表ii)，并且在用它们进行在前处理后，不影响抗体结合抗原的能力。

表ii.考虑选择的洗脱溶液，hepo突变蛋白的洗脱

(2)甘氨酸0.15mph2.5

(6)乙酸0.2m，nacl0.15mph3

ia树脂中使用的2b2mab预先已通过蛋白a亲和色谱法纯化，并在碳酸盐溶液中透析。然后，将树脂cnbr活化的sepharose4b偶联。通过在固定化反应之前和之后测量溶液中免疫球蛋白的浓度来计算偶联度，结果为96％。因此，理论容量为rhepo481μg/ml凝胶。

图6显示了使用0.15mph2.5的甘氨酸洗脱溶液纯化突变蛋白mut104的示例色谱图。

夹心elisa技术用于评估每个色谱程序中hepo变体在不同级份(流过、洗涤、洗脱)中的存在，以计算允许分析方法性能的参数。

获得的纯化结果示于表iii。与在平板中评估的静态条件相比，在动态条件下观察到目标蛋白回收效率的一些差异。与ph3的溶液相比，用ph2.5溶液洗脱时，突变蛋白mut104和mut151_153的回收率更高(分别为54％vs.19％，55％vs.21％)，而对于mut45_47变体，用ph3的溶液洗脱时回收率更高(49％vs.34％).

表iii.hepo突变蛋白的免疫亲和色谱法(iac)的纯化参数

sol.i：乙酸0.2m；nacl0.15mph3.0；以及sol.ii：甘氨酸0.15mph2。

当通过sds-page然后用考马斯亮蓝(coomassiebrilliantblue)染料染色来分析突变蛋白mut104的色谱过程的不同阶段时(图7)，可以观察到样品中存在的大多数污染物均未被保留，而是作为流过物和洗涤液的一部分。因此，如在所述图的泳道6中观察到的，获得了高纯度。

尽管iac并未显示出目标蛋白的高回收率，但它是纯化hepo突变蛋白的最合适方法，因为它能够相对于起始样品进行37-90倍的纯化，具有很高的纯度并且在单个色谱步骤中进行。

通过带密度测定法对与每种hepo突变蛋白相对应的洗脱液的纯度进行评估(图8)。

电泳之前，使用截止点为10kda的渗滤芯将样品浓缩75-80倍。所获得的所有突变蛋白的纯度均高于89％(表iv)，这是ia纯化程序的特征性数值。

表iv.从每个免疫亲和色谱(iac)获得的洗脱物的纯度

iac结果是hepo突变蛋白的纯度很高，认为其适用于以下测试。因此，iac被确立为纯化本发明的hepo突变蛋白的合适、简单且实用的方法。

5.hepo突变蛋白的物理化学表征

5.1.测定不同hepo突变蛋白的表观分子质量

图9显示了通过免疫亲和层析法(iac)纯化的突变蛋白的蛋白质印迹。使用已知的分子质量标记物来计算此类突变蛋白的分子质量。

hepo的高糖基化突变蛋白的表观分子质量的测定是通过在根据每个标记物的分子质量的对数在每个标记物迁移距离的变化曲线中，插入与每个变体相对应的谱带的前沿和后端的迁移距离来进行的。为每个变体计算的表观分子质量总结如下：

*mut45_47:34-66kda

*mut104:29-66kda

*mut151_153:35-45kda

*rhepo:31-43kda

该测定证实了将额外的n-糖基化位点成功掺入hepo分子中，因为突变蛋白表现出的平均分子质量大于未经修饰的hepo的分子质量。

5.2.通过ief测定同功型谱图

为了评估由于糖基化引起的hepo突变蛋白的异质性程度，特别是唾液酸残基的含量，通过ief评估样品，以测定组成各hepo高糖基化变异体的具有不同pi的同功型。

图10显示了组成mut45_47变体的13个同功型，mut104变体的14个同功型和标准rhepo的6个同功型的测定。值得一提的是，rhepo标准品是为促进红细胞生成而作为一种生物疗法生产的激素，其中普遍存在hepo分子的最多酸性同功型，这些同功型是在4个色谱步骤中形成的纯化工艺后获得的。另外，可以看出突变蛋白mut45_47和mut104包含的酸性同功型比rhepo同功型多5-7个，反映出这些分子中唾液酸的含量更高。

表观分子质量测定中获得的数据与来自ief的数据证实，与rhepo相比，所生成的突变蛋白具有更高的糖基化程度。

5.3.通过iac纯化的hepo突变蛋白的毛细管区带电泳(cze)分析同功型谱图

cze还用于测定被认为是应用实例的每个hepo变体的同功型。对从hepo突变蛋白的iac纯化获得的样品进行处理，所述hepo突变蛋白进行水渗滤并浓缩至约1mg/ml。

cze提供所观察到的不同同功型的定量信息。因此，使用cze数据，针对每个hepo变体，将同功型分配给的各个所观察到的峰。对于mutinsmut45_47和mut104从1到11，对于rhepo标准品从1到7；同功型1是沿毛细管区带迁移最多的同功型(图11)。接下来，通过对每个峰的曲线下的面积进行积分，来计算每个同功型的百分比。

当比较每个变体与rhepo的同功型的电泳迁移率时，发现后者的同功型与mut45_47的同功型1至7和mut104的同功型3至9一致，这表明mut45_47与rhepo相比多4个酸性同功型，而mut104少2个酸性同功型且与rhepo相比多2个酸性同功型。

当评估每种同功型的比率时，发现rhepo具有更高比率的同功型3、4和5，而mut45_47具有更高比率的同功型6、7、8和9，而mut104则具有更高比率的同功型4、5、6和7。这再次证实了每种hepo变体相对于rhepo糖基化程度的异质性，这是由于更高含量的更多的酸性同功型且它们的比率更大。

观察每种hepo变体的电泳图时，在两种情况下都可以看到两个额外峰(再多两个同功型)的存在，一个在峰1之前，另一个在峰11之前，这无法准确解析。这是由于样品中此类同功型的比率低，低于系统的检测极限。这解释了ief和cze检测到的同功型数量的差异。

5.4.a突变蛋白的体外促红细胞生成生物学活性的表征

对所纯化和设计的hepo突变蛋白进行生物学表征。为此，使用ut-7细胞系培养物进行体外增殖测定，以评估突变蛋白的促红细胞生物学活性(所述突变蛋白已被用作显示本发明的实施方案(a-f)的应用实例)，因为这些细胞谱系的存活和增殖取决于生长培养基中hepo的存在。与使用tf-1细胞系的测定法不同，使用ut-7细胞系的测定法的特点是具有更高的响应灵敏度，因此被选择用于该阶段的工作。

作为实例，分析了从各自的生产细胞系表达的所有突变蛋白的培养上清液和三种iac纯化的突变蛋白。将这些分子产生的增殖与rhepo标准品产生的增殖进行比较。

当以与rhepo标准品相同的浓度进行测试时，已视为应用实例的hepo突变蛋白(mut49除外)显示出低或无刺激细胞增殖的能力(图12-a-)。为了计算体外评估的特定促红细胞生成活性(sea)，我们使用了较高浓度的突变蛋白，即纯的培养物清液中的突变蛋白。因此，突变蛋白mut104和mut151_153显示完全失去了促红细胞生成的生物学活性，而mut45_47、mut62_64和mut98_100显示非常低的促红细胞生成活性(seamut45_47＝0.2ui/μg，seamut62_64＝0.2ui/μg，和seamut98_100＝0.1ui/μg；与rhepo的sea＝120ui/μg相比)。与之相比，认为mut49保持了这种活性(sea＝216ui/μg)。尽管mut49sea有所增加，但这可能是由于用于测定该参数的曲线区域所致，因为mut49曲线的线性响应区域的斜率与标准品曲线明显不同。因此，获得这种突变蛋白的所进行的修饰被认为不足以抑制其促红细胞生成活性。

另外，分析了纯化的rhepo突变蛋白的体外细胞/神经保护生物学活性，作为本发明的应用实例。进行评估以研究细胞/神经保护活性，rhepo及其突变蛋白保护sh-sy5y神经元细胞免受星形孢菌素(stp)产生的凋亡/细胞毒性作用的能力。因此，细胞/神经保护测定包括在诱导由stp引起的细胞损伤之前12小时，通过添加rhepo或其突变蛋白来保护神经元细胞。在细胞损伤诱导时间之后，通过确定代谢活性细胞来评估培养物的存活。

在该测定中，以相同的浓度使用了rhepo和纯化的mut104(其视为本发明的应用实例)。(图13)。

为了比较每个样本与cstp，使用anova检验随后使用dunnet检验，对获得的结果进行了统计分析。cstp获得的细胞毒性百分比被认为是100％细胞毒性，因此，相对于cstp，计算针对每个样品确定的细胞毒性值。

如图13所示，rhepo能够将stp诱导的细胞毒性降低45％(p<0.05)，而mut104则显著降低了stp引起的细胞毒性，降低了65％，显著性程度99％(p<0.01)。

5.4.b.突变蛋白的体内促红细胞生成生物学活性的表征

用作应用实例的突变蛋白没有或几乎没有体外生物学活性。反过来，广泛的糖基化赋予增加在血液中的停留时间所必需的药代动力学特性。这些特性将使分子改善与受体相互作用的低能力并表现出促红细胞生成活性。

为了评估这种体内活性，向正常红细胞的小鼠注射rhepo作为标准品，或注射先前实施例中使用的三种突变蛋白中的每一种，或用pbs作为阴性对照。在与蛋白接种(proteininoculation)相对应的所有情况下，均使用相当于80iurhepo的蛋白质量。接种96小时后收集血液，并使用流式细胞仪确定噻唑橙标记的网织红细胞的百分比含量。

图12-b-显示了每种突变蛋白和阴性对照相对于rhepo的显著不同的响应(p<0.001)。另外，将每个突变蛋白产生的网状红细胞响应与阴性对照进行比较时，未观察到显著差异。两种类型的分析都证实了，由于通过高糖基化方法进行的n-糖工程化，导致了预期的突变蛋白的促红细胞生成活性的丢失。

5.5.hepo高糖基化突变蛋白在结构神经元重构中的作用

5.5.1.神经元发育(分化)和结构重构

结构神经元重构包括刺激或促进神经元发育和/或分化的过程。从这个意义上讲，促进神经突的形成和/或轴突生长、丝足/树突棘的发育和/或突触数量增加的化学试剂或化合物将被视为神经营养化合物。神经元和神经元细胞系的原代培养物已广泛用于此类过程的体外研究。

图14概述了海马神经元原代培养物中神经元发育的阶段。在dotti等人的工作(1998)中已经正确表征了这些阶段[31]，其中描述了在接种后，神经元发育出薄层(lamellae)，神经元由此粘附至基底(0div，体外培养的天数)。然后，在头两天(1-2div)，未成熟的神经突会随着质膜的延伸而发育。在2-3div，这些神经突中的一个延伸超出其余部分，并分化形成轴突，该轴突在其末端具有称为轴突生长锥的三角形结构。之后，神经突分支形成次级神经突(3-4div)。在这些神经突上形成了薄的胞质突起，这些突起包含被称为丝足的交联的肌动蛋白丝(4-5div)。然后丝足可以导致树突棘，其是发生突触的优先位点(7-21div)。

研究的这一部分评估了本发明的不同hepo高糖基化突变蛋白在神经元发育的不同阶段的神经营养作用。

5.5.2.神经突的形成

为了确定本发明的突变蛋白是否产生神经突生长作用(增加每个神经元神经突的数量和长度)，使用了n2a神经元细胞系(小鼠神经母细胞瘤)。将细胞(50,000)接种到培养板(24孔)中的玻璃上，并保存在dmem完全培养基中，该培养基中补充了20％(v/v)的抑制神经元分化的胎牛血清(fbs)以及作为抗生素的庆大霉素。然后，将培养基替换为不含fbs并补充不同浓度(50和300ng/ml)的rhepo或突变蛋白的培养基，持续3小时以诱导神经突生成[32]。在那之后，将细胞用具有4％蔗糖和4％多聚甲醛(pfa)的磷酸盐缓冲盐水(pbs)在4℃下固定10分钟，并用含0.1％(v/v)的tritonx-100的pbs渗透2分钟。所固定的细胞然后用含3％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)的pbs封闭1-2小时，用含小鼠抗α-微管蛋白igg单克隆抗体(1：1000，sigma)的1％(w/v)bsa在4℃下标记神经突16小时。第二天，用pbs洗涤3次后，将其与罗丹明缀合的鬼笔环肽孵育(1：1000，invitrogen)以标记肌动蛋白丝，并与alexa488缀合的山羊抗小鼠抗体(1：1000，invitrogen)在室温下孵育1小时。用冷的pbs洗涤3次5分钟后，将玻璃用fluorosave(calbiochem)封固。

为了量化神经突生成，用尼康te2000落射荧光显微镜(nikon)获取图像。使用imagej(nih)软件的neuroj插件，通过计数每种条件下至少30个神经元中神经突的数量及其平均长度(神经突的延伸)和最长神经突的长度(轴突生长)来进行定量。然后使用adobephotoshop处理代表性图像，并使用graphpadprism5软件进行统计分析。

图15-a-显示了每个研究组的代表性图像。在右侧详细说明了每种测量的统计分析。本发明的突变蛋白具有显著的剂量依赖性神经源性作用，其表现为每个神经元神经突数量的增加，神经突的延伸和轴突生长。这些作用是可比的，与rhepo所获得的值相似。换句话说，在n2a细胞系中，本发明的突变蛋白显示出与观察到的rhepo相似的神经营养作用。

5.5.3.丝足密度

丝足和树突棘是富含肌动蛋白丝的膜突起，其出现于神经突/树突并充当突触后隔室，在中枢神经系统的兴奋性突触中非常丰富。棘的形态是可变的，并且根据它们的差异结构进行分类。公认的是，树突棘可以在神经元发育过程中改变其形状/结构，从而有利于神经元的重构[33]。从这个意义上讲，某些神经退行性疾病与树突棘的形状和数量的变化有关(增加和减少二者)。例如，在唐氏综合症中，确定了丝足数量的大大减少[34]。与之相比，在自闭症谱系障碍中发现更多数量的棘[35]。

因此，通过促进丝足的形成来确定本发明的高糖基化突变蛋白诱导神经元重构的能力。我们使用暴露于不同浓度(50和300ng/ml)rhepo或突变蛋白mut104、mut45-47和mut151-1534天(4div)的海马神经元的原代培养物。

如先前所述，从大鼠胚胎海马体(e19)制备神经元培养物[36]。简而言之，在37℃下用胰蛋白酶-edta(0.25％(w/v))处理组织15分钟。在补充了2mm谷氨酰胺、100单位/ml青霉素(pen)、100μg/ml链霉素(strp)和10％(v/v)马血清的neurobasalmedium(nb，invitrogen)中制备完全分散的细胞溶液。将数量为20,000-30,000的细胞接种到预先用0.1mg/ml聚-l-赖氨酸氢溴酸盐(sigma)和20mg/ml层粘连蛋白(invitrogen)处理过的24孔培养板中。2小时后，将培养基更改为指定的培养基(nb中含1g/1卵清蛋白，n2和b27，其是invitrogen的无血清补充剂)，并添加了不同浓度(50和300ng/ml)的rhepo或本发明的突变蛋白，保持4div。将细胞用含4％(w/v)pfa、4％(w/v)蔗糖的pbs溶液在4℃固定10分钟。然后，将细胞用含0.1％(v/v)tritonx-100的pbs渗透2分钟。所固定的细胞然后用含3％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)pbs封闭1-2小时，并用含小鼠抗α-微管蛋白igg单克隆抗体(1：1000，sigma)的1％(w/v)bsa在4℃下孵育16小时，以标记神经突。第二天，用pbs洗涤3次后，将其与罗丹明缀合的鬼笔环肽(1：1000，invitrogen)孵育以标记肌动蛋白丝，并与alexa488缀合的山羊抗小鼠二抗(1：1000，invitrogen)在室温下孵育1小时。用冷的pbs洗涤3次5分钟后，将玻璃用fluorosave(calbiochem)封固。

为了量化丝足的形成，用尼康e600落射荧光显微镜(nikon)获取图像。通过计数距神经元胞体(至少30个神经元中3个神经突/神经元)少于50μm的20μm神经突中存在的丝足(从神经突膜突出的富含肌动蛋白的突起)的数目来进行定量。然后使用adobephotoshop处理代表性图像，并使用graphpadprism5软件进行统计分析。

图16(左侧图)显示了丝足密度的代表性图像，而右侧图详细列出了各组的统计分析。注意，与对照神经元(pbs)相比，本发明的突变蛋白根据剂量显著诱导丝足的形成。出乎意料的是，这些作用仍优于用rhepo处理的神经元所观察到的作用。总之，本发明的突变蛋白在海马神经元的原代培养物中显示出比rhepo所观察到的更好的神经营养作用。

5.5.3.突触

突触被定义为两个神经元之间的膜的特定的邻接关连(联合)。这种联合(称为突触裂隙)促进了电脉冲的传导以及物质从一种联合(突触前)到另一种联合(突触后)的传递。已经开发出不同的技术来量化突触的数量。因此，突触的公认定义是仅来自突触前隔室的蛋白簇与仅来自突触后隔室的蛋白簇的共存。

继续研究本发明突变蛋白的神经营养作用，评估了它们诱导神经元突触的能力。

为此，在15div原代神经元培养物中进行了免疫检测测定，其中通过重叠突触前和突触后标记物来检测突触的形成。

不久，用不同浓度(50和300ng/ml)的hepo突变蛋白、rhepo或pbs处理神经元(15,000/孔)15div。然后在4℃下用90％(v/v)甲醇和10％(v/v)mes(100mmmesph6.9，1mmegta，1mmmgcl2)的溶液固定10分钟。之后，用滤过tween20(0.1％(v/v))的pbs洗涤3次5分钟。在室温下用具有tritonx-100的fbs的溶液(10％fbs(v/v)，在pbs中的0.1％的tritonx-100(v/v))封闭1小时，然后将其也在室温下用含3％(w/v)bsa的pbs溶液孵育15分钟。两种封闭溶液均预先以最大速度离心10分钟。然后，将它们与小鼠抗nmda-r1一抗(突触后标记物，来自synapticsystems)和兔抗突触素抗体(突触前标记物，来自synapticsystems)在4℃下孵育12-16小时。两种抗体均在1％(w/v)pbs-bsa溶液中制备，并以最大速度离心10分钟。用pbs洗涤3次后，将其再次用3％(w/v)bsa(离心10分钟)，10％(v/v)fbs溶液，tritonx-1000.1％(v/v)pbs在室温下封闭1小时。然后将它们与缀合alexa647的抗小鼠二抗和缀合alexa568的抗兔抗体(在1％(w/v)bsa中制备，并以最大速度离心10分钟，均来自molecularprobes)一起孵育。然后将它们用fluorsave封固。

照片是用与olympusix81倒置显微镜关联的olympusfv1000共焦显微镜拍摄的。使用符合nyquist标准的fluoview软件(版本3.3，olympus；60x物镜；an1.42；0.066μm/像素分辨率)对图像进行顺序处理。

通过突触前标记和突触后标记之间在25μm树枝状组织中的共定位点，测量突触形成，每种条件下大约10至20个神经元，每个神经元使用3个区段。这些共定位点是使用puncta分析仪imagej插件(1.28u版))测定的[37]。

图17显示了每种测试条件及其相应定量的代表照片。与神经突生成和丝足诱导的情况一样，我们观察到突变蛋白显著诱导神经元培养物中新突触的形成。该作用类似于对rhepo观察到的作用。

考虑到上述数据，有强有力的实验证据表明，本发明的新的高糖基化的hepo突变蛋白在神经元发育/分化的不同阶段(从神经突形成到突触形成)具有神经元重构促进作用。此外，这些作用与epo所观察到的作用相当，并且在某些特定情况下，作用(丝足形成)甚至更大。本发明的这些令人惊讶的新颖的技术效果以及创新的技术特征使得本发明的突变蛋白非常适合用于其中神经元重构降低或对这种降低具有遗传易感性的治疗中。

5.6.b.rhepo突变蛋白在大鼠海马神经元原代培养物中的神经保护生物学活性研究。

hepo突变蛋白对海马神经元原代培养物抗凋亡作用的评估使我们能够研究这些化合物对新陈代谢不变(与已建立的细胞系相同)的细胞的影响。出于这个原因，构成了一个有趣的模型，因为它实际上更类似于体内大脑发生的事情。

评估hepo和本发明的经修饰的促红细胞生成素的神经保护活性，作为此类分子保护神经元细胞免受由星形孢菌素治疗诱导的凋亡刺激的能力。

为了评估这种体外活性，获得了来自sprague-dawley大鼠的海马神经元的原代培养物。将11div培养物用400ng/ml的本发明的hepo突变蛋白或用通常用于造血功能恢复治疗的400ng/ml的rhepo预处理24小时。此后，将细胞在所述分子存在下暴露于30nmstp24小时，最后将其固定并用hoechst荧光染料和phalloidin-fitc染色。

图18显示，与细胞死亡对照(仅用stp处理的细胞)相比，用不同分子进行的处理可显著降低凋亡(**p<0.01；***p<0.001)，达到的凋亡值与未使用stp的细胞对照相似。另外，就保护海马神经元的原代培养物免受stp的影响而言，本发明的大多数分子显示出优于rhepo的作用。

该结果也对应于在突变蛋白对sh-sy5y神经元培养物的神经保护活性研究中获得的结果。因此，添加额外的糖基化位点获得的本发明的分子允许在不修饰与神经保护有关的位点的情况下阻断其造血生物学活性。

文献目录

[1]j.w.fisher.expbiolmed(maywood)228(2003)1-14.

[2]c.lacombe,p.mayeux.nephroldialtransplant14suppl2(1999)22-28.

[3]u.hammerling,r.kroon,t.wilhelmsen,l.sjodin,j.pharmbiomedanal14(1996)1455-1469.

[4]h.sasaki,b.bothner,a.dell,m.fukuda.jbiolchem262(1987)12059-12076.

[5]e.tsuda,m.goto,a.murakami,k.akai,m.ueda,g.kawanishi,n.takahashi,r.sasaki,h.chiba,h.ishihara,etal.biochemistry27(1988)5646-5654.

[6]j.c.egrie,j.k.browne.brjcancer84suppl1(2001)3-10.

[7]a.j.sytkowski,l.feldman,d.j.zurbuch,biochembiophysrescommun176(1991)698-704.

[8]e.delorme,t.lorenzini,j.giffin,f.martin,f.jacobsen,t.boone,s.elliott.biochemistry31(1992)9871-9876.

[9]t.toyoda,t.arakawa,h.yamaguchi.jbiochem131(2002)511-515.

[10]nangaku,m.kidneyinternational(2013)84,427-429.

[11]tng,gmarx,tlittlewood,imacdougall.postgradmedj(2003)79:367-376

[12]n.debeljak,a.j.sytkowski,erythropoietin:newapproachestoimprovedmoleculardesignsandtherapeuticalternatives.currpharmdes14(2008)1302-1310.

[13]noguchi,c.t.,asavaritikrai,p.,teng,r.,andjia,y.(2007).roleoferythropoietininthebrain.critrevoncolhematol64,159-171.

[14]p.a.konstantinopoulos,m.v.karamouzis,a.g.papavassiliou.biochim.biophys.acta1776(2007)1-9.

[15]siren,a.l.yehrenreich,h.eur.arch.psychiatryclin.neurosci.(2001)251(4):179-184.

[16]neurodegenerativedisorders,publichealth-europeancommission.http://ec.europa.eu/health/majorchronicdiseases/diseases/brainneurological/indexen.htm

[17]policybrief:theglobalimpactofdementia2013-2050-theglobalvoiceondementia.alzheimer'sdiseaseinternational.http://www.alz.co.uk/research/g8-policy-brief.

[18]nihmeetingadvancesalzheimer'sresearchagenda.fogartyinternationalcenter.advancingscienceforglobalhealth.http://www.fic.nih.gov/news/globalhealthmatters/march-april-2015pages/nih-alzheimers-research-summit.aspx

[19]toledoatucha,j.alzheimer.realinvestdemenc.(2011),47:16-23.

[20]mawaddaalnaeeli,liwang,barborapiknova,heatherrogers,xiaoxiali,andconstancetomnoguchi.anatomyresearchinternational.volume2012,articleid953264,15pages

[21]masuda,s.ycol.j.biol.chem.(1993)268(15):11208-11216.

[22]wolfycol.thrombhaemost(1997),77:10201024.

[23]p.j.stohlawetz,l.dzirlo,n.hergovich,e.lackner,c.mensik,h.g.eichler,e.kabrna,k.geissler,b.jilma.blood95(2000)2983-2989.

[24]casesaycol.kidneyinternacional(1992),42:668-672.

[25]beguiny.,haematologica(1999),84:541-547.

[26]m.leist,p.ghezzi,g.grasso,r.bianchi,p.villa,m.fratelli,c.savino,m.bianchi,j.nielsen,j.gerwien,p.kallunki,a.k.larsen,l.helboe,s.christensen,l.o.pedersen,m.nielsen,l.torup,t.sager,a.sfacteria,s.erbayraktar,z.erbayraktar,n.gokmen,o.yilmaz,c.cerami-hand,q.w.xie,t.coleman,a.cerami,m.brines.science305(2004)239-242.

[27]t.mennini,m.depaola,p.bigini,c.mastrotto,e.fumagalli,s.barbera,m.mengozzi,b.viviani,e.corsini,m.marinovich,l.torup,j.vanbeek,m.leist,m.brines,a.cerami,p.ghezzi.mol.med.12(2006)153-160.

[28]siren,a.l.ycol.neurotherapeutics(2009),6(1):108-127.

[29]erbayraktar,s.ycol.proc.natl.acad.sci.(2003),usa100:6741-6746.

[30]m.mattio,n.ceaglio,m.oggero,n.perotti,i.amadeo,g.orozco,g.forno,r.kratje,m.etcheverrigaray.biotechnolprog27(2011)1018-1028.

[31]dotticg,sullivanca,bankerga.1988.jneurosci(1988)8:1454-1468.

[32]daskp,freudenrichtm,mundywr.neurotoxicolteratol(2004)26:397-406.

[33]rochefortnl,konnertha.emborep.(2012)aug；13(8):699-708.doi:10.1038/embor.2012.102.

[34]suetsugum,mehraeinp.actaneuropathol.(1980)50(3):207-10.

[35]hutslerjj1,zhangh.brainres.(2010)jan14；1309:83-94.doi:10.1016/j.brainres.2009.09.120.

[36]alfonsoj.,fernandezm.e.,cooperb.,fluggeg.andfrascha.c.proc.natlacad.sci.(2005)usa102,17196-17201.

[37]ippolito,d.m.,eroglu,c.,journalofvisualizedexperiments.(2010)exp.45:2270.doi:10.3791/2270.

序列表

<110>利托瑞尔国立大学（universidadnacionaldellitoral）

国家科学和技术研究委员会（consejonacionaldeinvestigacionescientificasytecnicas(conicet)）

圣马丁国立大学（universdadnacionaldegeneralsanmartin）

<120>经修饰的人促红细胞生成素

<130>-

<160>26

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>579

<212>dna

<213>dna突变体15_17

<400>1

atgggcgtgcacgaatgtcctgcttggctgtggctgctgctgtccctgctgtctctgcct60

ctgggactgcctgtgctgggcgctcctcctagactgatctgcgactcccgggtgctggaa120

agaaacctgctggaagccaaagaggccgagaacatcaccaccggctgcgccgagcactgc180

tccctgaacgagaatatcaccgtgcccgacaccaaagtgaacttctacgcctggaagcgg240

atggaagtgggccagcaggctgtggaagtgtggcagggactggctctgctgagcgaggct300

gtgctgagaggacaggccctgctcgtgaactcctcccagccttgggaacccctgcagctg360

cacgtggacaaggctgtgtccggcctgagatccctgaccaccctgctgagagcactggga420

gcccagaaagaggccatctctccacctgacgccgcctctgctgctcctctgagaaccatc480

accgccgacaccttcagaaagctgttccgggtgtactccaacttcctgcggggcaagctg540

aagctgtacaccggcgaggcttgccggaccggcgacaga579

<210>2

<211>193

<212>prt

<213>aa-突变体15_17

<400>2

metglyvalhisglucysproalatrpleutrpleuleuleuserleu

151015

leuserleuproleuglyleuprovalleuglyalaproproargleu

202530

ilecysaspserargvalleugluargasnleuleuglualalysglu

354045

alagluasnilethrthrglycysalagluhiscysserleuasnglu

505560

asnilethrvalproaspthrlysvalasnphetyralatrplysarg

65707580

metgluvalglyglnglnalavalgluvaltrpglnglyleualaleu

859095

leuserglualavalleuargglyglnalaleuleuvalasnserser

100105110

glnprotrpgluproleuglnleuhisvalasplysalavalsergly

115120125

leuargserleuthrthrleuleuargalaleuglyalaglnlysglu

130135140

alaileserproproaspalaalaseralaalaproleuargthrile

145150155160

thralaaspthrphearglysleupheargvaltyrserasnpheleu

165170175

argglylysleulysleutyrthrglyglualacysargthrglyasp

180185190

arg

<210>3

<211>579

<212>dna

<213>dna突变体45_47

<400>3

atgggcgtgcacgaatgtcctgcttggctgtggctgctgctgtccctgctgtctctgcct60

ctgggactgcctgtgctgggcgctcctcctagactgatctgcgactcccgggtgctggaa120

agatacctgctggaagccaaagaggccgagaacatcaccaccggctgcgccgagcactgc180

tccctgaacgagaatatcaccgtgcccgacaccaacgtgaccttctacgcctggaagcgg240

atggaagtgggccagcaggctgtggaagtgtggcagggactggctctgctgagcgaggct300

gtgctgagaggacaggccctgctcgtgaactcctcccagccttgggaacccctgcagctg360

cacgtggacaaggctgtgtccggcctgagatccctgaccaccctgctgagagcactggga420

gcccagaaagaggccatctctccacctgacgccgcctctgctgctcctctgagaaccatc480

accgccgacaccttcagaaagctgttccgggtgtactccaacttcctgcggggcaagctg540

aagctgtacaccggcgaggcttgccggaccggcgacaga579

<210>4

<211>193

<212>prt

<213>aa-突变体45_47

<400>4

metglyvalhisglucysproalatrpleutrpleuleuleuserleu

151015

leuserleuproleuglyleuprovalleuglyalaproproargleu

202530

ilecysaspserargvalleugluargtyrleuleuglualalysglu

354045

alagluasnilethrthrglycysalagluhiscysserleuasnglu

505560

asnilethrvalproaspthrasnvalthrphetyralatrplysarg

65707580

metgluvalglyglnglnalavalgluvaltrpglnglyleualaleu

859095

leuserglualavalleuargglyglnalaleuleuvalasnserser

100105110

glnprotrpgluproleuglnleuhisvalasplysalavalsergly

115120125

leuargserleuthrthrleuleuargalaleuglyalaglnlysglu

130135140

alaileserproproaspalaalaseralaalaproleuargthrile

145150155160

thralaaspthrphearglysleupheargvaltyrserasnpheleu

165170175

argglylysleulysleutyrthrglyglualacysargthrglyasp

180185190

arg

<210>5

<211>579

<212>dna

<213>dna突变体49

<400>5

atgggcgtgcacgaatgtcctgcttggctgtggctgctgctgtccctgctgtctctgcct60

ctgggactgcctgtgctgggcgctcctcctagactgatctgcgactcccgggtgctggaa120

agatacctgctggaagccaaagaggccgagaacatcaccaccggctgcgccgagcactgc180

tccctgaacgagaatatcaccgtgcccgacaccaaagtgaacttcaccgcctggaagcgg240

atggaagtgggccagcaggctgtggaagtgtggcagggactggctctgctgagcgaggct300

gtgctgagaggacaggccctgctcgtgaactcctcccagccttgggaacccctgcagctg360

cacgtggacaaggctgtgtccggcctgagatccctgaccaccctgctgagagcactggga420

gcccagaaagaggccatctctccacctgacgccgcctctgctgctcctctgagaaccatc480

accgccgacaccttcagaaagctgttccgggtgtactccaacttcctgcggggcaagctg540

aagctgtacaccggcgaggcttgccggaccggcgacaga579

<210>6

<211>193

<212>prt

<213>aa-突变体49

<400>6

metglyvalhisglucysproalatrpleutrpleuleuleuserleu

151015

leuserleuproleuglyleuprovalleuglyalaproproargleu

202530

ilecysaspserargvalleugluargtyrleuleuglualalysglu

354045

alagluasnilethrthrglycysalagluhiscysserleuasnglu

505560

asnilethrvalproaspthrlysvalasnphethralatrplysarg

65707580

metgluvalglyglnglnalavalgluvaltrpglnglyleualaleu

859095

leuserglualavalleuargglyglnalaleuleuvalasnserser

100105110

glnprotrpgluproleuglnleuhisvalasplysalavalsergly

115120125

leuargserleuthrthrleuleuargalaleuglyalaglnlysglu

130135140

alaileserproproaspalaalaseralaalaproleuargthrile

145150155160

thralaaspthrphearglysleupheargvaltyrserasnpheleu

165170175

argglylysleulysleutyrthrglyglualacysargthrglyasp

180185190

arg

<210>7

<211>579

<212>dna

<213>dna-突变体62_64

<400>7

atgggcgtgcacgaatgtcctgcttggctgtggctgctgctgtccctgctgtctctgcct60

ctgggactgcctgtgctgggcgctcctcctagactgatctgcgactcccgggtgctggaa120

agatacctgctggaagccaaagaggccgagaacatcaccaccggctgcgccgagcactgc180

tccctgaacgagaatatcaccgtgcccgacaccaaagtgaacttctacgcctggaagcgg240

atggaagtgggccagcaggctgtgaacgtgacgcagggactggctctgctgagcgaggct300

gtgctgagaggacaggccctgctcgtgaactcctcccagccttgggaacccctgcagctg360

cacgtggacaaggctgtgtccggcctgagatccctgaccaccctgctgagagcactggga420

gcccagaaagaggccatctctccacctgacgccgcctctgctgctcctctgagaaccatc480

accgccgacaccttcagaaagctgttccgggtgtactccaacttcctgcggggcaagctg540

aagctgtacaccggcgaggcttgccggaccggcgacaga579

<210>8

<211>193

<212>prt

<213>aa-突变体62_64

<400>8

metglyvalhisglucysproalatrpleutrpleuleuleuserleu

151015

leuserleuproleuglyleuprovalleuglyalaproproargleu

202530

ilecysaspserargvalleugluargtyrleuleuglualalysglu

354045

alagluasnilethrthrglycysalagluhiscysserleuasnglu

505560

asnilethrvalproaspthrlysvalasnphetyralatrplysarg

65707580

metgluvalglyglnglnalavalasnvalthrglnglyleualaleu

859095

leuserglualavalleuargglyglnalaleuleuvalasnserser

100105110

glnprotrpgluproleuglnleuhisvalasplysalavalsergly

115120125

leuargserleuthrthrleuleuargalaleuglyalaglnlysglu

130135140

alaileserproproaspalaalaseralaalaproleuargthrile

145150155160

thralaaspthrphearglysleupheargvaltyrserasnpheleu

165170175

argglylysleulysleutyrthrglyglualacysargthrglyasp

180185190

arg

<210>9

<211>579

<212>dna

<213>dna-突变体65_67

<400>9

atgggcgtgcacgaatgtcctgcttggctgtggctgctgctgtccctgctgtctctgcct60

ctgggactgcctgtgctgggcgctcctcctagactgatctgcgactcccgggtgctggaa120

agatacctgctggaagccaaagaggccgagaacatcaccaccggctgcgccgagcactgc180

tccctgaacgagaatatcaccgtgcccgacaccaaagtgaacttctacgcctggaagcgg240

atggaagtgggccagcaggctgtggaagtgtggaacggaacggctctgctgagcgaggct300

gtgctgagaggacaggccctgctcgtgaactcctcccagccttgggaacccctgcagctg360

cacgtggacaaggctgtgtccggcctgagatccctgaccaccctgctgagagcactggga420

gcccagaaagaggccatctctccacctgacgccgcctctgctgctcctctgagaaccatc480

accgccgacaccttcagaaagctgttccgggtgtactccaacttcctgcggggcaagctg540

aagctgtacaccggcgaggcttgccggaccggcgacaga579

<210>10

<211>193

<212>prt

<213>aa-突变体65_67

<400>10

metglyvalhisglucysproalatrpleutrpleuleuleuserleu

151015

leuserleuproleuglyleuprovalleuglyalaproproargleu

202530

ilecysaspserargvalleugluargtyrleuleuglualalysglu

354045

alagluasnilethrthrglycysalagluhiscysserleuasnglu

505560

asnilethrvalproaspthrlysvalasnphetyralatrplysarg

65707580

metgluvalglyglnglnalavalgluvaltrpasnglythralaleu

859095

leuserglualavalleuargglyglnalaleuleuvalasnserser

100105110

glnprotrpgluproleuglnleuhisvalasplysalavalsergly

115120125

leuargserleuthrthrleuleuargalaleuglyalaglnlysglu

130135140

alaileserproproaspalaalaseralaalaproleuargthrile

145150155160

thralaaspthrphearglysleupheargvaltyrserasnpheleu

165170175

argglylysleulysleutyrthrglyglualacysargthrglyasp

180185190

arg

<210>11

<211>579

<212>dna

<213>dna-突变体72_74

<400>11

atgggcgtgcacgaatgtcctgcttggctgtggctgctgctgtccctgctgtctctgcct60

ctgggactgcctgtgctgggcgctcctcctagactgatctgcgactcccgggtgctggaa120

agatacctgctggaagccaaagaggccgagaacatcaccaccggctgcgccgagcactgc180

tccctgaacgagaatatcaccgtgcccgacaccaaagtgaacttctacgcctggaagcgg240

atggaagtgggccagcaggctgtggaagtgtggcagggactggctctgctgagcaacgct300

acgctgagaggacaggccctgctcgtgaactcctcccagccttgggaacccctgcagctg360

cacgtggacaaggctgtgtccggcctgagatccctgaccaccctgctgagagcactggga420

gcccagaaagaggccatctctccacctgacgccgcctctgctgctcctctgagaaccatc480

accgccgacaccttcagaaagctgttccgggtgtactccaacttcctgcggggcaagctg540

aagctgtacaccggcgaggcttgccggaccggcgacaga579

<210>12

<211>193

<212>prt

<213>aa-突变体72_74

<400>12

metglyvalhisglucysproalatrpleutrpleuleuleuserleu

151015

leuserleuproleuglyleuprovalleuglyalaproproargleu

202530

ilecysaspserargvalleugluargtyrleuleuglualalysglu

354045

alagluasnilethrthrglycysalagluhiscysserleuasnglu

505560

asnilethrvalproaspthrlysvalasnphetyralatrplysarg

65707580

metgluvalglyglnglnalavalgluvaltrpglnglyleualaleu

859095

leuserasnalathrleuargglyglnalaleuleuvalasnserser

100105110

glnprotrpgluproleuglnleuhisvalasplysalavalsergly

115120125

leuargserleuthrthrleuleuargalaleuglyalaglnlysglu

130135140

alaileserproproaspalaalaseralaalaproleuargthrile

145150155160

thralaaspthrphearglysleupheargvaltyrserasnpheleu

165170175

argglylysleulysleutyrthrglyglualacysargthrglyasp

180185190

arg

<210>13

<211>579

<212>dna

<213>dna-突变体76_78

<400>13

atgggcgtgcacgaatgtcctgcttggctgtggctgctgctgtccctgctgtctctgcct60

ctgggactgcctgtgctgggcgctcctcctagactgatctgcgactcccgggtgctggaa120

agatacctgctggaagccaaagaggccgagaacatcaccaccggctgcgccgagcactgc180

tccctgaacgagaatatcaccgtgcccgacaccaaagtgaacttctacgcctggaagcgg240

atggaagtgggccagcaggctgtggaagtgtggcagggactggctctgctgagcgaggct300

gtgctgaacggaacggccctgctcgtgaactcctcccagccttgggaacccctgcagctg360

cacgtggacaaggctgtgtccggcctgagatccctgaccaccctgctgagagcactggga420

gcccagaaagaggccatctctccacctgacgccgcctctgctgctcctctgagaaccatc480

accgccgacaccttcagaaagctgttccgggtgtactccaacttcctgcggggcaagctg540

aagctgtacaccggcgaggcttgccggaccggcgacaga579

<210>14

<211>193

<212>prt

<213>aa-突变体76_78

<400>14

metglyvalhisglucysproalatrpleutrpleuleuleuserleu

151015

leuserleuproleuglyleuprovalleuglyalaproproargleu

202530

ilecysaspserargvalleugluargtyrleuleuglualalysglu

354045

alagluasnilethrthrglycysalagluhiscysserleuasnglu

505560

asnilethrvalproaspthrlysvalasnphetyralatrplysarg

65707580

metgluvalglyglnglnalavalgluvaltrpglnglyleualaleu

859095

leuserglualavalleuasnglythralaleuleuvalasnserser

100105110

glnprotrpgluproleuglnleuhisvalasplysalavalsergly

115120125

leuargserleuthrthrleuleuargalaleuglyalaglnlysglu

130135140

alaileserproproaspalaalaseralaalaproleuargthrile

145150155160

thralaaspthrphearglysleupheargvaltyrserasnpheleu

165170175

argglylysleulysleutyrthrglyglualacysargthrglyasp

180185190

arg

<210>15

<211>579

<212>dna

<213>dna-突变体98_100

<400>15

atgggcgtgcacgaatgtcctgcttggctgtggctgctgctgtccctgctgtctctgcct60

ctgggactgcctgtgctgggcgctcctcctagactgatctgcgactcccgggtgctggaa120

agatacctgctggaagccaaagaggccgagaacatcaccaccggctgcgccgagcactgc180

tccctgaacgagaatatcaccgtgcccgacaccaaagtgaacttctacgcctggaagcgg240

atggaagtgggccagcaggctgtggaagtgtggcagggactggctctgctgagcgaggct300

gtgctgagaggacaggccctgctcgtgaactcctcccagccttgggaacccctgcagctg360

cacgtggacaagaatgtgaccggcctgagatccctgaccaccctgctgagagcactggga420

gcccagaaagaggccatctctccacctgacgccgcctctgctgctcctctgagaaccatc480

accgccgacaccttcagaaagctgttccgggtgtactccaacttcctgcggggcaagctg540

aagctgtacaccggcgaggcttgccggaccggcgacaga579

<210>16

<211>193

<212>prt

<213>aa-突变体98_100

<400>16

metglyvalhisglucysproalatrpleutrpleuleuleuserleu

151015

leuserleuproleuglyleuprovalleuglyalaproproargleu

202530

ilecysaspserargvalleugluargtyrleuleuglualalysglu

354045

alagluasnilethrthrglycysalagluhiscysserleuasnglu

505560

asnilethrvalproaspthrlysvalasnphetyralatrplysarg

65707580

metgluvalglyglnglnalavalgluvaltrpglnglyleualaleu

859095

leuserglualavalleuargglyglnalaleuleuvalasnserser

100105110

glnprotrpgluproleuglnleuhisvalasplysasnvalthrgly

115120125

leuargserleuthrthrleuleuargalaleuglyalaglnlysglu

130135140

alaileserproproaspalaalaseralaalaproleuargthrile

145150155160

thralaaspthrphearglysleupheargvaltyrserasnpheleu

165170175

argglylysleulysleutyrthrglyglualacysargthrglyasp

180185190

arg

<210>17

<211>579

<212>dna

<213>dna-突变体104

<400>17

atgggcgtgcacgaatgtcctgcttggctgtggctgctgctgtccctgctgtctctgcct60

ctgggactgcctgtgctgggcgctcctcctagactgatctgcgactcccgggtgctggaa120

agatacctgctggaagccaaagaggccgagaacatcaccaccggctgcgccgagcactgc180

tccctgaacgagaatatcaccgtgcccgacaccaaagtgaacttctacgcctggaagcgg240

atggaagtgggccagcaggctgtggaagtgtggcagggactggctctgctgagcgaggct300

gtgctgagaggacaggccctgctcgtgaactcctcccagccttgggaacccctgcagctg360

cacgtggacaaggctgtgtccggcctgagaaacctgaccaccctgctgagagcactggga420

gcccagaaagaggccatctctccacctgacgccgcctctgctgctcctctgagaaccatc480

accgccgacaccttcagaaagctgttccgggtgtactccaacttcctgcggggcaagctg540

aagctgtacaccggcgaggcttgccggaccggcgacaga579

<210>18

<211>193

<212>prt

<213>aa-突变体104

<400>18

metglyvalhisglucysproalatrpleutrpleuleuleuserleu

151015

leuserleuproleuglyleuprovalleuglyalaproproargleu

202530

ilecysaspserargvalleugluargtyrleuleuglualalysglu

354045

alagluasnilethrthrglycysalagluhiscysserleuasnglu

505560

asnilethrvalproaspthrlysvalasnphetyralatrplysarg

65707580

metgluvalglyglnglnalavalgluvaltrpglnglyleualaleu

859095

leuserglualavalleuargglyglnalaleuleuvalasnserser

100105110

glnprotrpgluproleuglnleuhisvalasplysalavalsergly

115120125

leuargasnleuthrthrleuleuargalaleuglyalaglnlysglu

130135140

alaileserproproaspalaalaseralaalaproleuargthrile

145150155160

thralaaspthrphearglysleupheargvaltyrserasnpheleu

165170175

argglylysleulysleutyrthrglyglualacysargthrglyasp

180185190

arg

<210>19

<211>579

<212>dna

<213>dna-突变体106_108

<400>19

atgggcgtgcacgaatgtcctgcttggctgtggctgctgctgtccctgctgtctctgcct60

ctgggactgcctgtgctgggcgctcctcctagactgatctgcgactcccgggtgctggaa120

agatacctgctggaagccaaagaggccgagaacatcaccaccggctgcgccgagcactgc180

tccctgaacgagaatatcaccgtgcccgacaccaaagtgaacttctacgcctggaagcgg240

atggaagtgggccagcaggctgtggaagtgtggcagggactggctctgctgagcgaggct300

gtgctgagaggacaggccctgctcgtgaactcctcccagccttgggaacccctgcagctg360

cacgtggacaaggctgtgtccggcctgagatccctgaacaccacgctgagagcactggga420

gcccagaaagaggccatctctccacctgacgccgcctctgctgctcctctgagaaccatc480

accgccgacaccttcagaaagctgttccgggtgtactccaacttcctgcggggcaagctg540

aagctgtacaccggcgaggcttgccggaccggcgacaga579

<210>20

<211>193

<212>prt

<213>aa-突变体106_108

<400>20

metglyvalhisglucysproalatrpleutrpleuleuleuserleu

151015

leuserleuproleuglyleuprovalleuglyalaproproargleu

202530

ilecysaspserargvalleugluargtyrleuleuglualalysglu

354045

alagluasnilethrthrglycysalagluhiscysserleuasnglu

505560

asnilethrvalproaspthrlysvalasnphetyralatrplysarg

65707580

metgluvalglyglnglnalavalgluvaltrpglnglyleualaleu

859095

leuserglualavalleuargglyglnalaleuleuvalasnserser

100105110

glnprotrpgluproleuglnleuhisvalasplysalavalsergly

115120125

leuargserleuasnthrthrleuargalaleuglyalaglnlysglu

130135140

alaileserproproaspalaalaseralaalaproleuargthrile

145150155160

thralaaspthrphearglysleupheargvaltyrserasnpheleu

165170175

argglylysleulysleutyrthrglyglualacysargthrglyasp

180185190

arg

<210>21

<211>579

<212>dna

<213>dna-突变体149

<400>21