用于核酸递送的混合分解细胞穿透复合物

用于核酸递送的混合分解细胞穿透复合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术案主张于2018年11月9日提交的美国临时申请第62/758,487号的权益，所述申请以全文引用的方式且出于所有目的并入本文中。
3.关于在联邦政府资助的研究和研发下完成的发明的权利的申明
4.本发明在政府支持下在由能源部(department of energy)授予的合同第de
‑
sc0005430号、在由美国国家科学基金会(national science foundation)授予的合同第1306730号及在由美国国家卫生研究院(national institutes of health)授予的合同第ca031841及ca031845号下进行。政府在本发明中具有某些权利。
5.对序列表、表格或作为ascii文件提交的计算机程序列表附录的引用
6.写入创建于2019年11月11日、字节数为6,992、机器格式为ibm
‑
pc、采用ms windows操作系统的文件041243
‑
533001wo_sequence_listing_st25.txt中的序列表通过引用并入本文。


背景技术：

7.需要新型材料和策略，其根据大范围的临床、诊断和/或研究应用所需要可实现或增强治疗剂、诊断探针和/或研究工具在细胞的质膜和其它生物屏障之间的递送。此类货物(例如，核酸)的递送结合对于传染病、癌症免疫疗法、蛋白质疗法和基因编辑的接种策略具有相当大的临床潜力。本文提供了对本领域中的这些和其它问题的解决方案。


技术实现要素：

8.在第一方面，提供一种细胞穿透复合物，其包括非共价结合到阳离子两性聚合物的核酸，所述阳离子两性聚合物包括ph敏感分解域。
9.在另一方面，提供一种纳米粒子组合物，其包括如本文所公开的多个细胞穿透复合物。
10.在另一方面，提供了下式的阳离子两性聚合物：h
‑
l1‑
[(lp1)
z1
‑
(im)
z2
‑
(lp2)
z3
]
z4
‑
l2‑
h(i)，其中：l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；lp1和lp2独立地为一键或亲脂性聚合物域，其中lp1或lp2中的至少一个为亲脂性聚合物域；im为ph敏感分解域；z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和z2为2到100的整数。在实施例中，l1为被取代或未被取代的亚烷基。在实施例中，l1为肽(例如氨基酸序列)。
[0011]
在另一方面，提供了下式的阳离子两性聚合物：h
‑
l1‑
[(lp1)
z1
‑
(lp3)
z1a
‑
(im)
z2
‑
(lp2)
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‑
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]
z4
‑
l2‑
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‑
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‑
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‑
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、
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nh
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‑
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、
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‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代
的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；lp1、lp2、lp3和lp4独立地为一键或亲脂性聚合物域，其中lp1、lp2、lp3和lp4中的至少一个为亲脂性聚合物域；im为ph敏感分解域；z1、z1a、z3和z3b独立地为0到100的整数，其中z1、z1a、z3或z3a中的至少一个不为0；z4为1到100的整数，且z2为2到100的整数。在实施例中，l1为被取代或未被取代的亚烷基。在实施例中，l1为肽(例如氨基酸序列)。
[0012]
在另一方面，提供一种将核酸转染到细胞中的方法，所述方法包括使细胞与本文所公开的复合物接触。
[0013]
在另一方面，提供了下式的阳离子两性聚合物：r
1a
‑
[l1‑
[(lp1)
z1
‑
(im)
z2
‑
(lp2)
z3
]
z4
‑
l2‑
r
2a
]
z5
，其中r
1a
是氢、卤素、
‑
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‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基，r
2a
独立地为氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
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chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
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ch2cl、
‑
ch2br、
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ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
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nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
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nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基，l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
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nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基，lp1和lp2独立地为一键或亲脂性聚合物域，其中lp1或lp2中的至少一个为亲脂性聚合物域；im独立地为ph敏感分解域，z5为1到10的整数，z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和z2独立地为2到100的整数。在实施例中，r
1a
为氢。其中r
1a
为氢，z5为1。
[0014]
在另一方面，提供一种诱导有需要的个体的免疫反应的方法，所述方法具有投与有效量的此处所公开的细胞穿透复合物。
附图说明
[0015]
图1展示了绘示在用cart系统稳定转染之后细胞的平均光亮度(p/s/cm2/sr)的数据。
[0016]
图2展示了绘示cart和cart与佐剂的组合的抗肿瘤免疫原性的数据。
[0017]
图3a
‑
3c展示了绘示预防性接种策略的功效的数据。图3a：肿瘤大小图，图3b：存活表，图3c：用表现tsa的a20淋巴瘤再攻击的小鼠的肿瘤大小图(注意，分别展示重叠线；黑线值都处于零)。
[0018]
图4a
‑
4b展示了预先建立的肿瘤大小和存活数据(在第7天初始接种，在第10天和第13天追加。图4a：肿瘤大小数据。图4b：存活曲线数据。
[0019]
图5a
‑
5b展示了绘示使用编码免疫刺激蛋白质的cart和mrna的原位接种的数据。
[0020]
图6展示了绘示用于mrna递送的电荷可变型可释放转运蛋白(cart)的图式。
[0021]
图7a
‑
7c展示了合成用于递送mrna的寡聚(碳酸酯
‑
b
‑
α
‑
氨基酯)cart。图7a)经由用于酰胺形成的串联5元随后6元过渡状态用于寡聚(α
‑
氨基酯)的重排机制。图7b)合成用于经由环状碳酸酯和酯单体的orop的mrna递送的寡聚(碳酸酯
‑
b
‑
α
‑
氨基酯)cart。图7c)经由先前报告的orop方法合成的两性寡聚(碳酸酯)。
[0022]
图8a
‑
8b展示了寡聚(α
‑
氨基酯)cart重排机制的探索。图8a)嵌段共寡聚物的α
‑
氨基酯部分的自分解重排得到具有附接的引发剂和小分子hegd 2的完整亲脂性寡聚碳酸酯嵌段。图8b)与独立合成的d
15
均寡聚物11相比，受保护的嵌段共寡聚物pyr
‑
d
15
:a
12 10及在去保护和碱催化重排之后的gpc迹线。
[0023]
图9a
‑
9d展示了与用于egfp mrna递送的cart的评估有关的数据。图9a)流式细胞测量术确定的来自用各种转运蛋白处理的hela细胞的平均egfp荧光值。图9b)展示了用egfp mrna转运蛋白处理的hela细胞中的转染％的egfp荧光的代表性流式细胞测量术。图9c)电荷比对由d
13
:a
11 7的mrna递送产生的egfp表达的影响。图9d)用裸mrna、与脂染胺复合的mrna或与d
13
:a
11 7复合的mrna处理的hela细胞的落射荧光显微图像。所有展示的数据都在于24孔板中用0.125g/孔的mrna浓缩处理8小时的hela细胞中。μ
[0024]
图10a
‑
10d展示了mrna的表达归因于通过cart寡聚物驱动mrna释放和胞内体逸出的电荷可变型自分解机制。图10a)在4℃下(抑制内吞作用的条件)的cy5
‑
mrna/d
13
:a
11
7复合物的摄取。图10b)用由降解和非降解转运蛋白系统形成的复合物处理之后egfp mrna的相对摄取和表达。实心条表示gfp表达且空心条表示cy5
‑
mrna荧光。图10c)当mrna/d
13
:a
11 7复合物为已知抑制胞内体酸化(刀豆素a，con a)且经胞内体破裂剂(氯奎，chl)共处理的化合物。图10d)在处理4小时之后用cart d
13
:a
11 7或非释放寡聚物7处理后的细胞的共聚焦显微成像技术。细胞用转运蛋白/cy5
‑
mrna复合物和tritc
‑
葡聚糖
4400
共处理。
[0025]
图11a
‑
11f.在多个细胞系和小鼠中使用cart的mrna递送的应用。图11a)在hela(a)、j774(b)、hek 293(c)、cho(d)和hepg2(e)细胞系中与脂染胺相比通过d
13
:a
11
##的egfp mrna递送的转染效率。图11b)cart 7的fluc mrna的递送遵循与egfp相同的电荷比的倾向。电荷报告为理论(+/
‑
)比。图11c)在肌肉内注射裸fluc mrna(空心圆)和mrna/d
13
:a
11
##复合物(实心圆)之后的体内bli。条表示所有动物的平均值(对于1h、4h和7h，n＝3；对于24h和48h，n＝5)。图11d)在肌肉内注射裸mrna(左侧)或mrna/cart复合物(右侧)之后的代表性生物发光图像。图11e)在静脉内尾部静脉注射mrna(空心圆)和mrna/cart复合物(实心圆)之后的体内bli。条表示所有动物的平均值(对于1h和7h，n＝2；对于4h、24h和48h，n＝4)。虚线为未注射d
‑
萤光素的动物的背景生物发光信号。图11f)用经由静脉内尾部静脉注射的mrna/d
13
:a
11
复合物处理的小鼠的代表性生物发光图像。
[0026]
图12.用bdk
‑
cart
‑
fluc mrna转染的小鼠的体内生物发光成像。小鼠通过尾部静脉注射用bdk(荧光)cart封装的含有5ug fluc mrna的150ul pbs注射。1.使小鼠成像以用于生物发光分布。2.处死小鼠且收集肝脾脏和肺。来自这些器官的bli的量化揭露从脾脏到(肝+肺)的99:1(99％)的相对比率。3.收集来自这些小鼠的脾脏且均质化。在bdk荧光团上流式细胞测量术门控用于使来自脾脏的细胞群体表型化。
[0027]
图13.经由car19 mrna
‑
cart递送体内产生表达抗cd
‑
19的t细胞(car
‑
t细胞)。在
细胞表面上表达car
‑
19构建体的每一细胞谱系的群体百分比。(顶部行)用5ug car19mrna
‑
cart处理的小鼠。(底部行)用5ug不相关的(seap)mrna
‑
cart处理的小鼠。在处理后36小时分析细胞。我们提出，如果获得car19构建体，那么除t细胞外的细胞系还可能促成治疗效果。
[0028]
将car
‑
19构建体递送到多个淋巴细胞谱系且通过多个淋巴细胞谱系表达。1.)小鼠用5ug car19 mrna
‑
cart或不相关的mrna
‑
cart(10:1+/
‑
比率)静脉内注射，2.)在注射之后24小时，使脾脏分离且均质化，3.)单细胞悬浮液用荧光团染色，所述荧光团识别呈现于细胞表面上的细胞亚群和car 19构建体(抗car
‑
19抗体)，4.)流式细胞测量术用于识别在所识别的群体内表达car19蛋白质的细胞群体和细胞分数(表达框中展示的表达car19构建体的群体百分比)。还产生了importantly、car
‑
19b细胞和car
‑
19nk细胞。经由cd
‑
19mrna
‑
cart递送体内产生表达cd
‑
19的t细胞(car
‑
t细胞)。
[0029]
图14.表达car19 car的细胞特异性地杀死表达cd19的细胞。使在两个连续日用5ug cart
‑
car
‑
19mrna处理的小鼠处死且收集脾脏。从脾脏分离出t细胞且将这些t细胞与表达cd19的a20肿瘤细胞共培养。5:1、10:1、20:1的效应:目标比率。随后评估对目标细胞的特异性杀死48小时。
[0030]
从经处理的小鼠分离的car细胞离体杀死表达cd19的细胞。表达cd19 car的细胞特异性地杀死表达cd19的细胞。第0天：注射5ug car19 mrna
‑
cart的小鼠；第1天：使小鼠注射第二个剂量的5ug car19 mrna
‑
cart；第3天：将t细胞从脾脏分离且以5:1、10:1、and 20:1效应:目标比率与表达肿瘤cd19的肿瘤细胞共培养；第5天：定量肿瘤特异性杀死。
[0031]
图15.用cart
‑
car
‑
19mrna处理的小鼠表现出肿瘤的显著消退。在11天内对携带表达萤光素酶的a20肿瘤的小鼠成像用以生物发光(即肿瘤尺寸)。左图：用不相关的mrna(seap)处理的小鼠。右图：用cart
‑
car
‑
19mrna处理小鼠。
[0032]
体内car
‑
19mrna递送使肿瘤缩小。小鼠通过静脉内注射接种表达萤光素酶的a20淋巴瘤细胞；使肿瘤建立持续3天；肿瘤大小/进展与萤光素酶信号的强度直接相关；用5ug cart
‑
car
‑
19mrna静脉内处理小鼠；随时间推移监测小鼠且分析萤光素酶信号的变化。用cart
‑
car19
‑
mrna处理的小鼠表现出肿瘤消退。天数表示开始处理后的天数。在肿瘤接种后3天内投与治疗。
[0033]
图16.用cart
‑
car
‑
19mrna处理的小鼠表现出肿瘤的显著消退。在14天内对携带表达萤光素酶的a20肿瘤的小鼠成像用以生物发光(即肿瘤尺寸)。在14天内的过程内对总身体生物发光进行定量。经car19 mrna
‑
cart处理的小鼠显示出信号量的显著减少，而对照经处理的小鼠增加。总身体生物发光为肿瘤负担的半定量测量。
[0034]
图17.用5ug cart
‑
car
‑
19mrna处理的小鼠用5ug不相关的seap)或cart
‑
car
‑
19mrna处理的小鼠。监测小鼠随时间推移的肿瘤负担，且在出现截瘫、继发性皮下肿瘤、腹膜明显增大和外部苦恼迹象时处死。体内car
‑
19mrna递送极大地延长存活。监测小鼠(来自先前图)随时间推移的肿瘤负担，且在出现截瘫、继发性皮下肿瘤、腹膜明显增大和外部苦恼迹象时处死。数据显示：用盐水、cart不相关的mrna(seap)或cart
‑
car
‑
19mrna处理的小鼠。
[0035]
图18.car19构建体的静脉内递送使得免疫系统能够选择性地杀死表达cd19分子的肿瘤细胞。具有已建立的皮下表达cd19的或cd19阴性肿瘤的小鼠用一个剂量的
car19mrna
‑
cart处理且监测在7天的过程内的肿瘤生长/消退。
[0036]
图19.car19构建体的瘤内递送使得肿瘤浸润性细胞能够杀死表达cd19的肿瘤细胞。具有已建立的皮下表达cd19的或cd19阴性肿瘤的小鼠用一个剂量的car19 mrna
‑
cart直接处理肿瘤且监测在7天的过程内的肿瘤生长/消退。
[0037]
图20.离体car
‑
t细胞产生的卡通图。
[0038]
图21.原位基因工程改造的卡通图。概念：体内表达细胞内的基因(mrna)；此基因编码car蛋白质；身体产生其自身的car
‑
t细胞；不需要在身体外进行任何事情；不需要从患者收集细胞；不需要昂贵的患者细胞运输。
[0039]
图22.使用cart递送mrna的卡通图。要求：必须转染t细胞(或其它)；必须表达功能性蛋白质；足够群体必须表达car；用于治疗反应的发生。
[0040]
图23.产生mrna用于体内car
‑
t细胞编程。我们使递送媒剂转染t细胞和表达功能性car蛋白质的mrna。
[0041]
图24.标准car
‑
t细胞疗法(顶部图)和体内car
‑
t细胞编程(底部图)的示意图。st
[0042]
图25.体内car构建体整合到t细胞中及细胞内编码car的基因的表达的卡通图。
[0043]
图26.通过本文所提供(包括其实施例)的cart化合物递送的嵌合抗原受体分子(例如，抗小鼠cd19和抗人类cd19 car)的示意性表示。
[0044]
图27.用cart
‑
car
‑
19mrna处理的小鼠表现出肿瘤消退。小鼠用1
×
106个表达luc的a20细胞静脉内接种。对携带表达萤光素酶的cd19+a20肿瘤模型的小鼠成像用以生物发光(即肿瘤尺寸)。使小鼠在肿瘤攻击后在d+4及d+7时用cart
‑
car19 mrna或对照cart
‑
mrna静脉内处理两次。在所指示的时间点时拍摄发光图像。经car19 mrna
‑
cart处理的小鼠展现出信号数量的显著减少，而经crt处理的小鼠展现出增加的信号。总身体生物发光为肿瘤负担的半定量测量。
[0045]
图28a
‑
28b.图28a
‑
28b.比较在c3813(图28a)和a20(图28b)肿瘤模型中的cd19+及cd19基因敲除的体内car19 mrna疗法的图展现出治疗性反应的特异性。来自表达萤火虫萤光素酶的肿瘤细胞的生物发光用作肿瘤负担的标记物。仅表达cd19的肿瘤由体内car
‑
19mrna递送实现。注射表达萤火虫萤光素酶的wt cd19、表达萤火虫萤光素酶的38c13或a20、cd19ko 38c13或a20 b淋巴瘤细胞的小鼠(1x106每个小鼠)。图28a：用cart
‑
car19 mrna或对照cart
‑
mrna处理的具有已建立的全身性表达wt cd19或cd19ko 38c13 b淋巴瘤细胞的小鼠中的肿瘤负担/生物发光。wt cd19+(黑色圆形)及cd19ko(黑色菱形)及具有不相关的mrna的cd19+细胞(空心圆形)及用不相关的mrna处理的cd19ko细胞(空心菱形)。数据表示为在处理开始时测量的生物发光强度相对于强度的相对增加。图28b：用cart
‑
car19 mrna或对照cart
‑
mrna处理的具有已建立的全身性表达wt cd19或cd19ko a20 b淋巴瘤细胞的小鼠中的长期存活。wt cd19+(黑色圆形)及cd19ko(黑色菱形)及具有不相关的mrna的cd19+细胞(空心圆形)及用不相关的mrna处理的cd19ko细胞(空心菱形)。
[0046]
图29.cart
‑
car mrna诱导允许多个给药疗法的car19的瞬时表达。抽取血液且通过流式细胞测量术定量car 19+细胞。卡通示意图展示靶向cart的car 19+细胞(左图)。在投与cart不相关的mrna或cart
‑
car19 mrna之后，且在投与第二剂量的10ug cart
‑
car19 mrna(右图)之后1、2和3天获取测量结果。最终测量结果表明car
‑
19+细胞的再出现。
[0047]
图30a
‑
30c.car cart
‑
mrna疗法比t细胞更能参与肿瘤细胞杀死。用car19 cart
‑
mrna处理的巨噬细胞(图30a)及b细胞(图30b)可以以效应与目标细胞比率依赖性方式杀死表达cd19的肿瘤细胞。在用car19 cart
‑
mrna处理后携带表达cd19的wt a20肿瘤的小鼠的长期存活不依赖于t细胞的存在(图30c)。使小鼠在处理开始之前耗尽t细胞且在整个实验中使用acd4和acd8单克隆抗体维持耗尽。
[0048]
图31a
‑
31c.人类pbmc中的cart
‑
mrna人类化car
‑
19疗法展现出在人类临床试验中观察到的天然b细胞的预期杀死。离体用人类car19 cart mrna处理块状人类健康供体pbmc。在处理后十二小时，通过流式细胞测量术评估杀死表达正常cd19的b细胞。图31a：经对照cart
‑
mrna处理的pbmc的代表性点图。图31b：经人类car19 cart
‑
mrna处理的pbmc的代表性点图。图31c：经对照cart
‑
mrna处理的pbmc及经人类car19cart
‑
mrna处理pbmc中剩余的表达活的cd19的b细胞的总数。n＝5个个别复本。
[0049]
图32.本文所提供(包括其实施例)的细胞穿透复合物中所包括的示例性嵌合抗原受体的示意性表示。
[0050]
图33.本文所提供(包括其实施例)的细胞穿透复合物中所包括的示例性受体分子的示意性表示。
[0051]
图34a
‑
34b.b细胞耗尽分析。在肿瘤建立后四天，投与car cart
‑
mrna的初始剂量。在所指示的时间点时，car cart
‑
mrna经静脉内投与。在所指示的天数时定量表达循环cd19的b细胞。car cart
‑
mrna处理引起表达循环cd19的b细胞的减少，但在投与对照mrna(seap)的情况下保持处于基线(图34a)。t细胞数目未受影响(图34b)。
[0052]
图35a
‑
35b.car19+细胞的百分比与b细胞耗尽相关。在经cart
‑
car
‑
19mrna处理之后的表达内源性cd19的b细胞定量。图35a：增加的car
‑
19+细胞与全身b细胞的减少相关。图35b：未耗尽的b细胞表现出更低的cd19表达，其指示表达更高cd19的细胞的选择性耗尽。
[0053]
图36a
‑
36b.使用crispr/cas9技术从a20(图36a)和38c13(图36b)去除目标抗原cd19。图形展示表达cd
‑
19的细胞(顶部曲线)、同型对照(中间曲线)、cd
‑
19基因敲除(底部曲线)。wt a20和38c13在表面上表达中等到较高水平的cd19(顶部曲线)。
[0054]
图37.dna和mrna提供有效治疗性处理媒剂pdna(b)媒剂
‑
mrna(a)car19
‑
rna(c)和car19
‑
dna(d)。用以下处理具有已建立的表达cd19的a20淋巴瘤的小鼠三次：car cart
‑
mrna(c)、car cart
‑
质粒dna(d)、ctr cart
‑
mrna(a)或ctr cart
‑
质粒dna(b)。在肿瘤注射后35天内测量存活。疾病导致的死亡定义为出现截瘫。
具体实施方式
[0055]
虽然已在本文中展示和描述了本公开的各种实施例和方面，但所属领域的技术人员应显而易见，这类实施例和方面是仅作为实例而提供。所属领域的技术人员现将在不脱离本公开的情况下意识到大量变型、变化和取代。应当理解，本文所述的本公开的实施例的多种替代方案可以用于实践本公开。
[0056]
除非上下文另外指示，否则确切地说，希望本文所述的本公开的各种特征可以以任何组合来使用。此外，本公开还涵盖，在一些实施例中，可以排除或省略本文所阐述的任何特征或特征的组合。为了说明，如果说明书指出复合物具有组分a、b和c，那么尤其期望a、b或c中的任一个或其组合可以单独地或以任何组合形式省略和否认。
[0057]
应注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用的单数
形式“一(a/an)”以及“所述”包括多个指示物。因此，举例来说，提及“癌细胞”包括多个癌细胞。在其它实例中，提及“核酸(a nucleic acid)”或“核酸(nucleic acid)”包括多个核酸分子，即，核酸。
[0058]
术语“约”是指包括指定值在内的值的范围，本领域普通技术人员将认为其与指定值合理相似。在实施例中，约是指在使用本领域通常可接受的测量结果的标准偏差内。在实施例中，约是指扩展至指定值的+/
‑
10％的范围。在实施例中，约是指指定值。
[0059]
此外，如本文所用，“和/或”是指且涵盖相关所列项中的一个或多个项的任何和所有可能的组合，以及当以替代形式(“或”)解释时组合的缺乏。
[0060]
如本文所用，术语“包含”意指组合物和方法包括所叙述的要素，但不排除其它。如本文所用，“主要由
……
组成的”过渡短语(和语法变化形式)应解释为涵盖所叙述的材料或步骤“及不会实质上影响所叙述的实施例的基本和新颖特征的那些材料或步骤”。因此，如本文所用，术语“主要由
……
组成”不应解释为等效于“包含”。“由
……
组成”应意味着排除超过痕量元素的其它成分和用于投与本文所公开的组合物的基本方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的方面都在本公开的范围内。
[0061]
定义
[0062]
本文所用的缩写具有其在化学和生物学领域内的常规含义。本文中所阐述的化学结构和化学式是根据化学领域中已知的化学价的标准规则构建。
[0063]
如本文所用，术语“寡聚物”和“聚合物”是指具有多个重复子单元(例如聚合单体)的化合物。术语“共寡聚物”或“共聚合物”是指包括2个或更多个不同残基(在本文中可互换地使用的单体单元或单体)的寡聚物或聚合物。寡聚物中单体的数目通常小于聚合物中单体的数目。因此，在实施例中，寡聚物可以具有1到约10个单体、1到约20个单体、1到约30个单体、1到约40个单体、1到约50个单体、1到约100个单体、1到约150个单体、1到约200个单体、1到约250个单体、1到约300个单体、1到约350个单体、1到约400个单体、1到约450个单体或1到约500个单体的长度。在实施例中，寡聚物可以具有小于约500个单体、小于约450个单体、小于约400个单体、小于约350个单体、小于约300个单体、小于约250个单体、小于约200个单体、小于约150个单体、小于约100个单体、小于约50个单体、小于约40个单体、小于约30个单体、小于约20个单体或小于约10个单体的长度。在聚合物的情形下，聚合物中单体的数目通常大于寡聚物中单体的数目。因此，在实施例中，聚合物可以具有约500到约1000个单体、约500到约2000个单体、约500到约3000单体、约500到约4000单体、约500到约5000单体、约500到约6000单体、约500到约7000单体、约500到约8000个单体、约500到约9000个单体、约500到约10000个单体或大于10000个单体的长度。
[0064]
术语“可聚合单体”根据其在聚合物化学物质领域中的含义使用且是指可以以化学方式与其它单体分子(如相同或不同的其它可聚合单体)结合以形成聚合物的化合物。
[0065]
术语“嵌段共聚物”根据其普通含义使用，且是指通过共价键连接的聚合单体的两个或更多个部分(例如，嵌段)。在实施例中，嵌段共聚物为聚合物的重复模式。在实施例中，嵌段共聚物包括呈周期性(例如重复模式)顺序的两种或更多种单体。举例来说，二嵌段共聚物具有下式：
‑
b
‑
b
‑
b
‑
b
‑
b
‑
b
‑
a
‑
a
‑
a
‑
a
‑
a
‑
，其中
‘
b’为共价结合在一起的第一子单元，且
‘
a’为第二子单元。因此，三嵌段共聚物为具有三个不同嵌段的共聚物，其中的两个可能相同(例如，
‑
a
‑
a
‑
a
‑
a
‑
a
‑
b
‑
b
‑
b
‑
b
‑
b
‑
b
‑
a
‑
a
‑
a
‑
a
‑
a
‑
)或所有三个不同(例如，
‑
a
‑
a
‑
a
‑
a
‑
a
‑
b
‑
b
‑
b
‑
b
‑
b
‑
b
‑
c
‑
c
‑
c
‑
c
‑
c
‑
)，其中
‘
a’为共价结合在一起的第一子单元，
‘
b’为第二子单元，且
‘
c’为第三子单元。
[0066]
除非另外说明，否则术语“烷基”，本身或作为另一取代基的一部分，意指直链(即，未分支)或分支或其组合，其可以是完全饱和、单不饱和或多不饱和的，且可以包括二价和多价基团。烷基可以具有指定的碳原子数目(即，c1‑
c
10
意指一个到十个碳)。烷基是未环化的链。饱和烃基的实例包括但不限于如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同源物和异构体的基团。不饱和烷基为具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2
‑
丙烯基、巴豆基、2
‑
异戊烯基、2
‑
(丁二烯基)、2,4
‑
戊二烯基、3
‑
(1,4
‑
戊二烯基)、乙炔基、1
‑
和3
‑
丙炔基、3
‑
丁炔基以及更高的同源物和异构体。烷氧基是通过氧连接体(
‑
o
‑
)附接到分子其余部分的烷基。
[0067]
除非另外说明，否则术语“亚烷基”，本身或作为另一取代基的一部分，意指衍生于烷基的二价基团，例如但不限于
‑
ch2ch2ch2ch2‑
。通常，烷基(或亚烷基)将具有1到24个碳原子，具有10个或更少碳原子的那些基团是优选的。“低碳数烷基”或“低碳数亚烷基”为c1‑
c8烷基或亚烷基。
[0068]
除非另外陈述，否则单独或与另一术语组合，术语“杂烷基”意指由至少一个碳原子和至少一个杂原子组成(选自由o、n、p、si和s组成的群组，且其中氮和硫原子可以任选地进行氧化，且氮杂原子可以任选地季铵化)的稳定的直链或分支链，或其组合。杂原子(例如o、n、p、s和si)可以位于杂烷基的任何内部位置处或位于烷基连接到分子其余部分的位置处。杂烷基是未环化的链。实例包括但不限于：
‑
ch2‑
ch2‑
o
‑
ch3、
‑
ch2‑
ch2‑
nh
‑
ch3、
‑
ch2‑
ch2‑
n(ch3)
‑
ch3、
‑
ch2‑
s
‑
ch2‑
ch3、
‑
ch2‑
ch2、
‑
s(o)
‑
ch3、
‑
ch2‑
ch2‑
s(o)2‑
ch3、
‑
ch＝ch
‑
o
‑
ch3、
‑
si(ch3)3、
‑
ch2‑
ch＝n
‑
och3、
‑
ch＝ch
‑
n(ch3)
‑
ch3、
‑
o
‑
ch3、
‑
o
‑
ch2‑
ch3和
‑
cn。最多两个杂原子可以是连续的，例如
‑
ch2‑
nh
‑
och3。
[0069]
类似地，除非另外说明，否则术语“亚杂烷基”，本身或作为另一取代基的一部分，意指衍生于杂烷基的二价基团，例如但不限于
‑
ch2‑
ch2‑
s
‑
ch2‑
ch2‑
和
‑
ch2‑
s
‑
ch2‑
ch2‑
nh
‑
ch2‑
。对于亚杂烷基，杂原子也可以占据链末端中的任一种或两种(例如，亚烷氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基以及上文所述的类似物，如本文所用，杂烷基包括通过杂原子，如
‑
c(o)r'、
‑
c(o)nr'、
‑
nr'r"、
‑
or'、
‑
sr'和/或
‑
so2r'连接到分子的其余部分的那些基团。当叙述“杂烷基”，随后叙述特定杂烷基，如
‑
nr'r"或类似基团时，应理解，术语杂烷基和
‑
nr'r"不是冗余或相互排斥的。相反，叙述特定杂烷基是为了增加清晰性。因此，术语“杂烷基”在本文中不应解释为排除特定杂烷基，如
‑
nr'r"或类似基团。
[0070]
除非另外说明，否则单独或与其它术语组合，术语“环烷基”和“杂环烷基”分别意指“烷基”和“杂烷基”的环状形式。环烷基和杂烷基不是芳香族的。另外地，对于杂环烷基，杂原子可以占据杂环与分子连接的其余部分的位置。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、1
‑
环己烯基、3
‑
环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于：1
‑
(1,2,5,6
‑
四氢吡啶基)、1
‑
哌啶基、2
‑
哌啶基、3
‑
哌啶基、4
‑
吗啉基、3
‑
吗啉基、四氢呋喃
‑2‑
基、四氢呋喃
‑3‑
基、四氢噻吩
‑2‑
基、四氢噻吩
‑3‑
基、1
‑
哌嗪基、2
‑
哌嗪基等。“亚环烷基”和“亚杂环烷基”单独或作为另一个取代基的一部分意指分别衍生自环烷基和杂环烷基的二价基团。
[0071]
除非另外说明，否则术语“卤基”或“卤素”，本身或作为另一取代基的一部分，意指氟、氯、溴或碘原子。另外地，如“卤代烷基”等术语意指包含单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤(c1‑
c4)烷基”包括但不限于氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2,2,2
‑
三氟乙基、4
‑
氯丁基、3
‑
溴丙基等。
[0072]
除非另外说明，否则术语“酰基”意指
‑
c(o)r，其中r是被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0073]
除非另外说明，否则术语“芳基”意指多元不饱和的芳香族烃取代基，其可以是单环或共同稠合(即，稠环芳基)或共价连接的多个环(优选地，1到3个环)。稠环芳基是指稠合在一起的多个环，其中稠环中的至少一个是芳基环。术语“杂芳基”是指含有选自n、o和s的一个至四个杂原子的芳基(或环)，其中所述氮原子和硫原子任选地氧化，且所述氮原子任选地季铵化。因此，术语“杂芳基”包括稠环杂芳基(即，稠合在一起的多个环，其中稠环中的至少一个是杂芳环)。5,6
‑
稠环亚杂芳基是指稠合在一起，其中一个环具有5个成员并且另一个环具有6个成员，并且其中至少一个环为杂芳基环的两个环。同样，6,6
‑
稠环亚杂芳基是指稠合在一起的两个环，其中一个环具有6个成员并且另一个环具有6个成员，并且其中至少一个环是杂芳基环。并且6,5
‑
稠环亚杂芳基是指稠合在一起的两个环，其中一个环具有6个成员并且另一个环具有5个成员，并且其中至少一个环是杂芳基环。杂芳基可以通过碳或杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1
‑
萘基、2
‑
萘基、4
‑
联苯基、1
‑
吡咯基、2
‑
吡咯基、3
‑
吡咯基、3
‑
吡唑基、2
‑
咪唑基、4
‑
咪唑基、吡嗪基、2
‑
恶唑基、4
‑
恶唑基、2
‑
苯基
‑4‑
恶唑基、5
‑
恶唑基、3
‑
异恶唑基、4
‑
异恶唑基、5
‑
异恶唑基、2
‑
噻唑基、4
‑
噻唑基、5
‑
噻唑基、2
‑
呋喃基、3
‑
呋喃基、2
‑
噻吩基、3
‑
噻吩基、2
‑
吡啶基、3
‑
吡啶基、4
‑
吡啶基、2
‑
嘧啶基、4
‑
嘧啶基、5
‑
苯并噻唑基、嘌呤基、2
‑
苯并咪唑基、5
‑
吲哚基、1
‑
异喹啉基、5
‑
异喹啉基、2
‑
喹喔啉基、5
‑
喹喔啉基、3
‑
喹啉基和6
‑
喹啉基。以上所指出的芳基和杂芳基环系统中的每一个的取代基选自下文所述的可接受取代基的群组。“亚芳基”和“亚杂芳基”单独或作为另一个取代基的一部分，意指分别衍生自芳基和杂芳基的二价基团。
[0074]
为简洁起见，当与其它术语(例如，芳氧基、芳基硫氧基、芳基烷基)组合使用时，术语“芳基”包括如上定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”意指包含其中芳基附接到烷基(例如，苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)的那些基团，所述烷基包含其中碳原子(例如，亚甲基)已经被例如氧原子(例如，苯氧基甲基、2
‑
吡啶基氧基甲基、3
‑
(1
‑
萘氧基)丙基等)替代的那些烷基。
[0075]
如本文所用，术语“氧代”意指与碳原子双键键合的氧。
[0076]
如本文所用，术语“烷基磺酰基”意指具有式
‑
s(o2)
‑
r'的部分，其中r'为如上文所定义的烷基。r'可以具有指定数量的碳(例如，“c1‑
c4烷基磺酰基”)。
[0077]
以上术语中的每一个(例如“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)包括所指示的基团的被取代和未被取代的形式两者。
[0078]
用于烷基和杂烷基的取代基(包括通常被称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)可以是选自但不限于以下的多种基团中的一个或多个：
‑
or'、＝o、＝nr'、＝n
‑
or'、
‑
nr'r"、
‑
sr'、
‑
卤素、
‑
sir'r"r"'、
‑
oc(o)r'、
‑
c(o)r'、
‑
co2r'、
‑
conr'r"、
‑
oc(o)nr'r"、
‑
nr"c(o)r'、
‑
nr'
‑
c(o)nr"r"'、
‑
nr"c(o)
2
r'、
‑
nr
‑
c(nr'r"r"')＝nr""、
‑
nr
‑
c(nr'r")＝nr"'、
‑
s(o)r'、
‑
s(o)2r'、
‑
s(o)2nr'r"、
‑
nrso2r'、
‑
cn和
‑
no2(数值在零到(2m'+1)范围内)，其中m'为此类基团中的碳原子总数。r'、r"、r"'和r""各自优选地独立地指代氢、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基(例如，用1
‑
3个卤素取代的芳基)、被取代或未被取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳烷基。当本文所公开的化合物包括多于一个r基团时，例如当存在这些基团中的多于一个时，r基团中的每一个独立地选择为每一r'、r"、r"'和r""基团。当r'和r"与同一氮原子连接时，其可以与所述氮原子组合以形成4元、5元、6元或7元环。例如，
‑
nr'r"包括但不限于1
‑
吡咯烷基和4
‑
吗啉基。根据对取代基的以上讨论，本领域的技术人员将理解，术语“烷基”意指包含包括与除氢基之外的基团键合的碳原子的基团，如卤代烷基(例如，
‑
cf3和
‑
ch2cf3)和酰基(例如，
‑
c(o)ch3、
‑
c(o)cf3、
‑
c(o)ch2och3等)。
[0079]
类似于所述的针对烷基的取代基，芳基和杂芳基的取代基是不同的且选自例如：数值范围为零到芳香族环系上的开放价的总数的
‑
or'、
‑
nr'r"、
‑
sr'、
‑
卤素、
‑
sir'r"r"'、
‑
oc(o)r'、
‑
c(o)r'、
‑
co2r'、
‑
conr'r"、
‑
oc(o)nr'r"、
‑
nr"c(o)r'、
‑
nr'
‑
c(o)nr"r"'、
‑
nr"c(o)2r'、
‑
nr
‑
c(nr'r"r"')＝nr""、
‑
nr
‑
c(nr'r")＝nr"'、
‑
s(o)r'、
‑
s(o)2r'、
‑
s(o)2nr'r"、
‑
nrso2r'、
‑
cn、
‑
no2、
‑
r'、
‑
n3、
‑
ch(ph)2、氟(c1‑
c4)烷氧基和氟(c1‑
c4)烷基；且其中r'、r"、r"'和r""优选地独立地选自氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基和被取代或未被取代的杂芳基。当本文所公开的化合物包括多于一个r基团时，例如当存在这些基团中的多于一个时，r基团中的每一个独立地选择为每一r'、r"、r"'和r""基团。
[0080]
两个或更多个取代基可以任选地接合以形成芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基。这种所谓的成环取代基通常(尽管不是必须的)附接到环状碱基结构上。在实施例中，环形成取代基与基础结构的邻近成员连接。例如，与环状基础结构的邻近成员连接的两个环形成取代基产生稠环结构。在另一个实施例中，环形成取代基与基础结构的单个成员连接。例如，与环状基础结构的单个成员连接的两个环形成取代基产生螺环结构。在又另一个实施例中，环形成取代基与基础结构的非邻近成员连接。
[0081]
芳环或杂芳环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地形成式
‑
t
‑
c(o)
‑
(crr')
q
‑
u
‑
的环，其中t和u独立地是
‑
nr
‑
、
‑
o
‑
、
‑
crr'
‑
或单键，且q是0到3的整数。或者，芳环或杂芳环的邻近原子上的取代基中的两个可以任选地用式
‑
a
‑
(ch2)
r
‑
b
‑
的取代基置换，其中a和b独立地是
‑
crr'
‑
、
‑
o
‑
、
‑
nr
‑
、
‑
s
‑
、
‑
s(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)2nr'
‑
或单键，且r是1到4的整数。如此形成的新环的单键之一可以任选地用双键置换。可替代地，芳基环或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个取代基可以任选地用式
‑
(crr')
s
‑
x'
‑
(c"r")
d
‑
的取代基置换，其中s和d独立地为0到3的整数，且x'为
‑
o
‑
、
‑
nr'
‑
、
‑
s
‑
、
‑
s(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
或
‑
s(o)2nr'
‑
。取代基r、r'、r"和r"'优选地独立地选自氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基和被取代或未被取代的杂芳基。
[0082]
如本文所用，术语“杂原子”或“环杂原子”意指包括氧(o)、氮(n)、硫(s)、磷(p)和硅(si)。
[0083]
如本文所用，“取代基”意指选自以下部分的基团：
[0084]
(a)氧代、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、未被取代的烷基(例如，c1‑
c8烷基、c1‑
c6烷基或c1‑
c4烷基)、未被取代的杂烷基(例如，2到8元杂烷基、2到6元杂烷基或2到4元杂烷基)、未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8环烷基、c3‑
c6环烷基或c5‑
c6环烷基)、未被取代的杂环烷基(例如，3到8元杂环烷基、3到6元杂环烷基或5到6元杂环烷基)、未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)或未被取代的杂芳基(例如，5到10元杂芳基、5到9元杂芳基或5到6元杂芳基)和
[0085]
(b)烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，经选自以下的至少一个取代基取代：
[0086]
(i)氧代、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、未被取代的烷基(例如，c1‑
c8烷基、c1‑
c6烷基或c1‑
c4烷基)、未被取代的杂烷基(例如，2到8元杂烷基、2到6元杂烷基或2到4元杂烷基)、未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8环烷基、c3‑
c6环烷基或c5‑
c6环烷基)、未被取代的杂环烷基(例如，3到8元杂环烷基、3到6元杂环烷基或5到6元杂环烷基)、未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)或未被取代的杂芳基(例如，5到10元杂芳基、5到9元杂芳基或5到6元杂芳基)和
[0087]
(ii)烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，经选自以下的至少一个取代基取代：
[0088]
(a)氧代、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、未被取代的烷基(例如，c1‑
c8烷基、c1‑
c6烷基或c1‑
c4烷基)、未被取代的杂烷基(例如，2到8元杂烷基、2到6元杂烷基或2到4元杂烷基)、未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8环烷基、c3‑
c6环烷基或c5‑
c6环烷基)、未被取代的杂环烷基(例如，3到8元杂环烷基、3到6元杂环烷基或5到6元杂环烷基)、未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)或未被取代的杂芳基(例如，5到10元杂芳基、5到9元杂芳基或5到6元杂芳基)和
[0089]
(b)烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，所述基团被选自以下的至少一个取代基取代：氧代、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、未被取代的烷基(例如，c1‑
c8烷基、c1‑
c6烷基或c1‑
c4烷基)、未被取代的杂烷基(例如，2到8元杂烷基、2到6元杂烷基或2到4元杂烷基)、未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8环烷基、c3‑
c6环烷基或c5‑
c6环烷基)、未被取代的杂环烷基(例如，3到8元杂环烷基、3到6元杂环烷基或5到6元杂环烷基)、未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)或未被取代的杂芳基(例如，5到10元杂芳基、5到9元杂芳基或5到6元杂芳基)。
[0090]
如本文所用，“大小限制的取代基”或“大小限制的取代基”意指选自如上文针对“取代基”所述的所有取代基的基团，其中每一被取代或未被取代的烷基为被取代或未被取
代的c1‑
c
20
烷基，每一被取代或未被取代的杂烷基为被取代或未被取代的2到20元杂烷基、每一被取代或未被取代的环烷基为被取代或未被取代的c4‑
c8环烷基，且每一被取代或未被取代的杂环烷基为被取代或未被取代的4到8元杂环烷基。
[0091]
如本文所用，“低碳数取代基”或“低碳数取代基”意指选自如上文针对“取代基”所述的所有取代基的基团，其中每一被取代或未被取代的烷基为被取代或未被取代的c1‑
c8烷基，每一被取代或未被取代的杂烷基为被取代或未被取代的2到8元杂烷基、每一被取代或未被取代的环烷基为被取代或未被取代的c5‑
c7环烷基，且每一被取代或未被取代的杂环烷基为被取代或未被取代的5到7元杂环烷基。
[0092]
在实施例中，本文化合物中所述的每一被取代的基团被至少一个取代基取代。更具体地说，在实施例中，本文化合物中所述的每一被取代的烷基、被取代的杂烷基、被取代的环烷基、被取代的杂环烷基、被取代的芳基、被取代的杂芳基、被取代的亚烷基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚杂环烷基、被取代的亚芳基和/或被取代的亚杂芳基，被至少一个取代基取代。在实施例中，这些基团中的至少一个或全部被至少一个大小限制的取代基取代。在实施例中，这些基团中的至少一个或全部被至少一个低碳数取代基取代。
[0093]
在本文中的化合物的实施例中，每一被取代或未被取代的烷基可以是被取代或未被取代的c1‑
c
20
烷基，每一被取代或未被取代的杂烷基为被取代或未被取代的2到20元杂烷基、每一被取代或未被取代的环烷基为被取代或未被取代的c3‑
c8环烷基、每一被取代或未被取代的杂环烷基为被取代或未被取代的3到8元杂环烷基、每一被取代或未被取代的芳基为被取代或未被取代的c6‑
c
10
芳基和/或每一被取代或未被取代的杂芳基为被取代或未被取代的5到10元杂芳基。在本文的化合物的实施例中，每一被取代或未被取代的亚烷基是被取代或未被取代的c1‑
c
20
亚烷基，每一被取代或未被取代的亚杂烷基是被取代或未被取代的2到20元亚杂烷基，每一被取代或未被取代的亚环烷基是被取代或未被取代的c3‑
c8亚环烷基，每个取代或未被取代的亚杂环烷基是被取代或未被取代的3到8元亚杂环烷基，每一被取代或未被取代的亚芳基是被取代或未被取代的c6‑
c
10
亚芳基，和/或每一被取代或未被取代的亚杂芳基是被取代或未被取代的5到10元亚杂芳基。
[0094]
在实施例中，每一被取代或未被取代的烷基为被取代或未被取代的c1‑
c8烷基，每一被取代或未被取代的杂烷基为被取代或未被取代的2到8元杂烷基、每一被取代或未被取代的环烷基为被取代或未被取代的c3‑
c7环烷基、每一被取代或未被取代的杂环烷基为被取代或未被取代的3到7元杂环烷基、每一被取代或未被取代的芳基为被取代或未被取代的c6‑
c
10
芳基和/或每一被取代或未被取代的杂芳基为被取代或未被取代的5到9元杂芳基。在实施例中，每一被取代或未被取代的亚烷基是被取代或未被取代的c1‑
c8亚烷基，每一被取代或未被取代的亚杂烷基是被取代或未被取代的2到8元亚杂烷基，每一被取代或未被取代的亚环烷基是被取代或未被取代的c3‑
c7亚环烷基，每一被取代或未被取代的亚杂环烷基是被取代或未被取代的3到7元亚杂环烷基，每一被取代或未被取代的亚芳基是被取代或未被取代的c6‑
c
10
亚芳基，和/或每一被取代或未被取代的亚杂芳基是被取代或未被取代的5到9元亚杂芳基。在实施例中，所述化合物为本文所阐述的化学物质。
[0095]
如本文所用，术语“一(a/an)”意指一个或多个。另外，如本文所使用的短语“用[n]...取代”意指指定基团可以用所指名的取代基中的任何或全部取代基中的一个或多个
取代。例如，当如烷基或杂芳基等基团“用未取代的c1‑
c
20
烷基或未取代的2元到20元杂烷基取代”时，所述基团可以含有一个或多个未取代的c1‑
c
20
烷基，和/或一个或多个未被取代的2元到20元杂烷基。此外，在部分用r取代基取代的情况下，所述基团可以被称为“r取代的”。在部分是r取代的情况下，所述部分用至少一个r取代基取代，并且每个r取代基任选地不同。
[0096]
术语“亲核部分”是指能够将一个或多个电子(例如，2个)供应到亲电子试剂的化学物质或官能团。在实施例中，亲核部分是指可以在化学反应中将电子供给到亲电子试剂以形成键的化学物质或官能团。
[0097]
术语“亲电子部分”是指能够接收一个或多个电子(例如2个)的化学物质或官能团。在实施例中，亲电子部分是指在化学反应中具有空轨道且因此可以接受电子以形成键的化学物质或官能团。
[0098]
术语“寡聚二醇部分”是指具有以下通式的化学实体：r
400
‑
o
‑
(ch2‑
ch2‑
o)n
300
‑
其中r
400
为h，是被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基，且n300为1或更大的整数。在实施例中，r
400
为h或烷基。
[0099]
本公开的化合物的描述受所属领域的技术人员已知的化学键合原理限制。因此，在基团可被多个取代基中的一个或多个取代时，选择此类取代以便符合化学键合原理并且得到并非固有地不稳定和/或将是本领域的普通技术人员已知的如可能在环境条件(如水性、中性和几种已知生理条件)下不稳定的化合物。例如，杂环烷基或杂芳基按照本领域技术人员已知的化学键合原理经由环杂原子附接到分子的其余部分，从而避免固有不稳定的化合物。
[0100]
除非另外规定，否则本文所用的技术和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。参见例如singleton等人，《微生物学和分子生物学词典(d
ictionary of m
icrobiology and m
olecular b
iology
)》,第2版,j.wiley&sons(new york,ny 1994)；sambrook等人，《分子克隆实验指南(m
olecular c
loning
，a l
aboratory m
anual
)》,cold springs harbor press(cold springs harbor,ny 1989)。与本文所述的那些类似或等效的任何方法、装置和材料均可以用于本公开的实践中。提供以下定义以便于理解本文中频繁使用的某些术语，且不意味着限制本公开的范围。
[0101]“核酸”是指呈单链、双链或多链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物，或其补体。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“寡聚”等在通常和习惯意义上是指核苷酸的线性序列。术语“核苷酸”在通常和惯用意义上是指聚核苷酸的单一单元，即单体。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其修饰形式。本文所设想的多核苷酸的示例包括单链和双链dna、单链和双链rna以及具有单链和双链dna和rna的混合物的杂合分子。核酸(例如本文预期的多核苷酸)的实例包括任何类型的rna，例如信使rna(mrna)、小分子干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微rna(mirna)、导向rna(grna)、crispr rna(crrna)、转录活化rna(tracrrna)、质粒dna(pdna)、微环dna、基因组dna(gnda)和其任何片段。在多核苷酸的情况下，术语“双链体”在通常和惯用意义上是指双链。核酸可以是线性或支化的。例如，核酸可以是直链的核苷酸或核酸可以是分支的，例如，使得所述核酸具有核苷酸的一个或
多个臂或分支。任选地，分支核酸被重复分支以形成更高级结构，例如树枝状聚合物和其类似物。
[0102]
核酸，包括例如具有硫代磷酸酯主链的核酸可以包括一个或多个反应性部分。如本文所用，术语反应性部分包括能够通过共价、非共价或其它相互作用与另一分子(例如核酸或多肽)反应的任何基团。借助于实例，核酸可以包括氨基酸反应性部分，其通过共价、非共价或其它相互作用与蛋白质或多肽上的氨基酸反应。
[0103]
所述术语还包含含有已知核苷酸类似物或经修饰的骨架残基或键联的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有类似于参考核酸的结合特性，且代谢的方式类似于参考核苷酸。此类类似物的实例包括但不限于磷酸二酯衍生物，所述磷酸二酯衍生物包括例如氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(也被称为硫代磷酸，其具有双键硫置换的含氧的磷酸盐)、二硫代磷酸酯、膦酰羧酸、膦酰羧酸酯、膦酰基乙酸、膦酰甲酸、甲基膦酸酯、硼膦酸酯或o
‑
甲基亚磷酰胺键(参见eckstein,《寡核苷酸以及类似物：实用方法(o
ligonucleotides and a
nalogues
:a p
ractical a
pproach
)》,牛津大学出版社(oxford university press))，以及如在5
‑
甲基胞苷或假尿苷中对核苷酸碱基的修饰；以及肽核酸骨架和键。其它类似核酸包括具有正骨架的核酸；非离子骨架、经修饰的糖和非核糖骨架(例如本领域已知的二氨基磷酸吗啉代寡核苷酸或锁核酸(lna))，包括美国专利号5,235,033和5,034,506以及asc研讨会序列580(asc symposium series 580)，sanghui和cook编辑的《反义研究中的碳水化合物修饰(c
arbohydrate m
odifications in a
ntisense r
esearch
)》第6章和第7章中描述的那些。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的一个定义内。可以出于多种原因进行核糖
‑
磷酸骨架的修饰，例如，增加这些分子在生理环境中，或作为生物芯片上的探针的稳定性和半衰期。可以制备天然存在的核酸和类似物的混合物；可替代地，可以制备不同核酸类似物的混合物，以及天然存在的核酸和类似物的混合物。在实施例中，dna中的核苷酸间连接键是磷酸二酯、磷酸二酯衍生物或两者的组合。
[0104]
核酸可以包括非特异性序列。如本文所用，术语“非特异性序列”是指含有未被设计成与任何其它核酸序列互补或与任何其它核酸序列仅部分互补的一系列残基的核酸序列。举例来说，非特异性核酸序列为当在与细胞或生物体接触时不充当抑制性核酸的核酸残基的序列。“抑制性核酸"是能够与目标核酸(例如可翻译成蛋白质的mrna)结合且减少目标核酸(例如来自dna的mrna)的转录或减少目标核酸(例如mrna)的翻译或改变转录物剪接(例如单链吗啉代寡核苷酸(single stranded morpholino oligo))的核酸(例如dna、rna、核苷酸类似物的聚合物)。在实施例中，核酸为rna(例如mrna)。在实施例中，核酸的长度为10到100,000个碱基。在实施例中，核酸的长度为50和10,000个碱基。在实施例中，核酸的长度为50和5,000个碱基。在实施例中，核酸的长度为50和1,000个碱基。
[0105]
术语“多肽”、“肽”及“蛋白质”在本文中可互换使用以指氨基酸残基的聚合物，其中聚合物可以与不由氨基酸组成的部分结合。所述术语适用于中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。所述术语适用于大环肽、已经被非肽官能团修饰的肽、肽模拟物、聚酰胺及大环内酰胺。“融合蛋白”是指编码重组表达为单个部分的两个或更多个单独的蛋白序列的嵌合蛋白。
[0106]
术语“肽基”和“肽基部分”意指单价肽。
[0107]
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ
‑
羧基谷氨酸和o
‑
磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和r基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的r基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的化合物。术语“非天然存在的氨基酸”和“非天然氨基酸”是指自然界中未发现的氨基酸类似物、合成氨基酸和氨基酸模拟物。
[0108]
氨基酸在本文中可以由其通常已知的三字母符号或由iupac
‑
iub生物化学命名法委员会(biochemical nomenclature commission)所推荐的单字母符号来提及。同样，核苷酸可以通过它们通常接受的单字母代码来指代。
[0109]
如本文所用，术语“il
‑
12蛋白质”或“il
‑
12”包括维持il
‑
12活性的白细胞介素12，还称为白细胞介素
‑
12子单元β，或其变异体或同源物的重组或天然存在形式中的任一种(例如，相比于il
‑
12，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的il
‑
12蛋白质相比，变异体或同源物在整个序列或一部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致性。在实施例中，il
‑
12蛋白质与由uniprot参考编号p29460鉴别的蛋白质或与其具有相当大的一致性的变异体或同源物实质上一致。
[0110]
如本文所用，术语“il
‑
15蛋白质”或“il
‑
15”包括维持il
‑
15活性的白细胞介素15，或其变异体或同源物的重组或天然存在形式中的任一种(例如，相比于il
‑
15，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的il
‑
15蛋白质相比，变异体或同源物在整个序列或一部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致性。在实施例中，il
‑
15蛋白质与由uniprot参考编号p40933鉴别的蛋白质或与其具有相当大的一致性的变异体或同源物实质上一致。
[0111]
如本文所用，术语“il
‑
18蛋白质”或“il
‑
18”包括维持il
‑
18活性的白细胞介素18，也被称为干扰素
‑
γ诱导因子，或其变异体或同源物的重组或天然存在形式中的任一种(例如，相比于il
‑
18，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的il
‑
18蛋白质相比，变异体或同源物在整个序列或一部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致性。在实施例中，il
‑
18蛋白质与由uniprot参考编号q14116鉴别的蛋白质或与其具有相当大的一致性的变异体或同源物实质上一致。
[0112]
如本文所用，术语“il
‑
3蛋白质”或“il
‑
3”包括维持il
‑
3活性的白细胞介素
‑
3，也被称为造血生长因子、肥大细胞生长因子、p细胞刺激因子，或其变异体或同源物的重组或天然存在形式中的任一种(例如，相比于il
‑
3，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的il
‑
3蛋白质相比，变异体或同源物在整个序列或一部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致性。在实施例中，il
‑
3蛋白质与由
uniprot参考编号p08700鉴别的蛋白质或与其具有相当大的一致性的变异体或同源物实质上一致。
[0113]
如本文所用，术语“il
‑
21蛋白质”或“il
‑
21”包括维持il
‑
21活性的白细胞介素
‑
21，也被称为za11，或其变异体或同源物的重组或天然存在形式中的任一种(例如，相比于il
‑
21，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的il
‑
21蛋白质相比，变异体或同源物在整个序列或一部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致性。在实施例中，il
‑
21蛋白质与由uniprot参考编号q9hbe4鉴别的蛋白质或与其具有相当大的一致性的变异体或同源物实质上一致。
[0114]
如本文所用，术语“il
‑
7蛋白质”或“il
‑
7”包括维持il
‑
7活性的白细胞介素
‑
7，或其变异体或同源物的重组或天然存在形式中的任一种(例如，相比于il
‑
7，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的il
‑
7蛋白质相比，变异体或同源物在整个序列或一部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致性。在实施例中，il
‑
7蛋白质与由uniprot参考编号p13232鉴别的蛋白质或与其具有相当大的一致性的变异体或同源物实质上一致。
[0115]
如本文所用，术语“il
‑
9蛋白质”或“il
‑
9”包括维持il
‑
9活性的白细胞介素
‑
9，也被称为细胞活素p40、t细胞生长因子p40，或其变异体或同源物的重组或天然存在形式中的任一种(例如，相比于il
‑
9，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的il
‑
9蛋白质相比，变异体或同源物在整个序列或一部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致性。在实施例中，il
‑
9蛋白质与由uniprot参考编号p15248鉴别的蛋白质或与其具有相当大的一致性的变异体或同源物实质上一致。
[0116]
如本文所用，术语“ifng蛋白质”或“ifng”包括维持ifng活性的干扰素γ，也被称为ifnγ、ii型干扰素，或其变异体或同源物的重组或天然存在形式中的任一种(例如，相比于ifng，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的ifng蛋白质相比，变异体或同源物在整个序列或一部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致性。在实施例中，ifng蛋白质与由uniprot参考编号p01579鉴别的蛋白质或与其具有相当大的一致性的变异体或同源物实质上一致。
[0117]“接触”根据其普通一般含义使用，且是指使至少两个不同的物种(例如，包括生物分子或细胞的化学化合物)变得足够接近以进行反应、相互作用或物理触摸的过程。然而，应理解，所得反应产物可以直接由所添加试剂之间的反应或者由来自一种或多种所添加试剂的可以在反应混合物中产生的中间物来制备。在实施例中，接触包括例如使核酸与核酸内切酶相互作用。
[0118]“对照”样品或值是指用作参照物(通常是已知参照物，用于与测试样品进行比较)的样品。例如，可以从测试条件下，例如在存在测试化合物的情况下采集测试样品，并与已知条件下的样品进行比较，例如在不存在测试化合物的情况下(阴性对照)，或在存在已知化合物情况下(阳性对照)。对照也可以代表从多个测试或结果中收集的平均值。本领域技
术人员将认识到可以设计对照，以评估任何数量的参数。例如，可以设计对照，以基于药理学数据(例如半衰期)或治疗措施(例如副作用的比较)比较治疗益处。所属领域的技术人员将理解，在给定情形下哪种标准对照是最适合的，且能够基于与标准对照值的比较来分析数据。标准对照对于确定数据的显著性(例如统计显著性)也是有价值的。举例来说，如果标准对照中给定参数的值广泛变化，那么测试样品的变化将不被视为显著的。
[0119]“标记”或“可检测部分”是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，有用的标记包括
32
p、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如通常用于elisa中的酶)、生物素、地高辛(digoxigenin)或半抗原和蛋白质或能被检测到的其它实体，例如通过将放射性标记并入与目标肽发生特异性反应的肽或抗体中。可以使用本领域已知的用于使抗体与标记结合的任何适当方法，例如使用hermanson，《生物结合物技术(bioconjugate techniques)》1996，academic press,inc.,san diego.中描述的方法。
[0120]“生物样品”或“样品”是指获自或来源于个体或患者的物质。生物样品包括组织切片，如活检和尸检样品，以及用于组织学目的的冷冻切片。此类样品包括体液，例如血液和血液部分或产物(例如血清、血浆、血小板、红细胞等)、痰、组织、培养的细胞(例如原代培养物、外植体以及转化的细胞)、粪便、尿液、滑液、关节组织、滑膜组织、滑膜细胞、成纤维细胞样滑膜细胞、巨噬细胞样滑膜细胞、免疫细胞、造血细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、t细胞等。生物样品通常获自真核生物体，例如哺乳动物，如灵长类动物，例如黑猩猩或人类；牛；犬；猫；啮齿动物，例如豚鼠、大鼠、小鼠；兔；或鸟；爬行动物；或鱼。
[0121]
如本文所用，“细胞”是指执行足以保存或复制其基因组dna的代谢或其它功能的细胞。可以通过本领域众所周知的方法来鉴定细胞，包括例如完整膜的存在、通过特定染料染色、产生子代的能力，或者在配子的情况下与第二配子结合以产生有活力的后代的能力。细胞可以包括原核和真核细胞。原核细胞包括但不限于细菌。真核细胞包括但不限于酵母细胞和来源于植物和动物的细胞，例如哺乳动物、昆虫(例如，夜蛾)和人细胞。
[0122]
术语“干细胞”或“干细胞”是指多潜能且因此可以产生数种分化的细胞类型的克隆自更新的细胞群体。
[0123]
术语“基因”是指涉及产生蛋白质的dna片段；其包括编码区之前和之后的区域(前导和尾部)以及各个编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。前导、尾部和内含子包括基因转录和翻译过程中必需的调节元件。此外，“蛋白质基因产物”为由特定基因表达的蛋白。
[0124]
如本文关于基因所用的词语“表达”或“表达的”是指所述基因的转录和/或翻译产物。dna分子在细胞中的表达水平可以基于存在于细胞内的相应mrna的量或由细胞产生的那个dna编码的蛋白质的量来确定(sambrook等人，1989，《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》，18.1
‑
18.88)。
[0125]
转染的基因的表达可以在细胞中瞬时或稳定发生。在“瞬时表达”期间，转染的基因在细胞分裂过程中不转移至子细胞。由于其表达局限于转染的细胞，因此基因的表达随时间推移丧失。相反，当基因与另一个赋予转染的细胞选择优势的基因共转染时，可能发生转染基因的稳定表达。此类选择优势可能是对呈递给细胞的某种毒素的抗性。
[0126]
术语“质粒”是指一种核酸分子，其编码基因表达而必需的基因和/或调控元件。来自质粒的基因表达可以顺式或反式发生。如果基因以顺式表达，则基因和调控元件由同一
质粒编码。反式表达是指其中基因和调控元件由单独的质粒编码的情况。
[0127]
术语“外源的”是指源自给定细胞或生物体外部的分子或物质(例如核酸或蛋白质)。相反，术语“内源的”是指给定细胞或生物体原生的或源于给定细胞或生物体内的分子或物质。
[0128]“载体”为能够将另一核酸传送到细胞中的核酸。当载体存在于适当环境中时，载体能够引导由载体所携带的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白质的表达。
[0129]
术语“密码子优化的”是指用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区，是指改变基因或核酸分子的编码区中的密码子，以反映宿主生物体的典型密码子使用而不改变dna编码的多肽。此类优化包括用在所述生物的基因中更频繁使用的一个或多个密码子替代至少一个，或多于一个或相当大数目的密码子。考虑到可用于多种动物、植物和微生物物种的大量基因序列，有可能计算出密码子使用的相对频率。密码子使用表可轻易地(例如)在www.kazusa.or.jp/codon/在“密码子使用数据库”中获得。通过利用对每个生物体中的密码子使用或密码子偏好的知识，所属领域的普通技术人员可以将频率应用到任何给定多肽序列，且产生编码多肽的密码子优化的编码区的核酸片段，但其使用对于给定物种最佳的密码子。经密码子优化的编码区可以通过所属领域的技术人员已知的各种方法来设计。
[0130]“细胞培养物”是存在于生物体外的体外细胞群体。细胞培养物可以由自细胞库或动物分离的原代细胞，或源自这些来源中的一个且永生化以进行长期体外培养的次生细胞建立。
[0131]
术语“转染(transfection)”、“转导(transduction)”、“转染(transfecting)”或“转导(transducing)”可以互换使用且定义为将核酸分子和/或蛋白质引入细胞的过程。可以使用非病毒或基于病毒的方法将核酸引入细胞。核酸分子可为编码完整蛋白或其功能部分的序列。典型地，核酸载体具有蛋白质表达必需的元件(例如启动子、转录起始位点等)。非病毒转染方法包括不使用病毒dna或病毒颗粒作为递送系统将核酸分子引入至细胞的任何适当方法。示例性非病毒转染方法包括磷酸钙转染、脂质粒转染、核转染、声穿孔、通过热激转染、磁转染和电穿孔。对于基于病毒的方法，任何有用的病毒载体均可用于本文所述的方法。病毒载体的实例包括但不限于反转录病毒、腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体。在一些方面，按照本领域公知的标准程序使用逆转录病毒载体将核酸分子引入细胞中。术语“转染”或“转导”还指将蛋白从外部环境引入至细胞中。通常，蛋白的转导或转染依赖于能够穿过细胞膜的肽或蛋白与相关蛋白质的附接。参见例如ford等人(2001)gene therapy 8:1
‑
4and prochiantz(2007)nat.methods 4:119
‑
20。
[0132]
如本文所用，术语“特异性结合(specific binding)”或“特异性结合(specifically binds)”是指两种分子在生理条件下形成相对稳定的复合物(例如核糖核蛋白和转染肽)。
[0133]
用于确定配体是否结合另一物质(例如，蛋白质或核酸)和/或这类配体
‑
物质相互作用的亲和力的方法为所属领域中已知的。举例来说，可以使用多种技术检测和/或定量配体与蛋白质的结合，所述技术例如但不限于蛋白质印迹法、点印迹法、表面等离子体共振法(例如，biacore系统；pharmacia biosensor ab，uppsala,sweden and piscataway，n.j.)、等温滴定量热法(itc)或酶联免疫吸附分析(elisa)。
[0134]
可以用于分析配体的免疫特异性结合和交叉反应性的免疫分析包括但不限于使
用如以下技术的竞争性和非竞争性分析系统：蛋白质印迹法、ria、elisa(酶联免疫吸附分析)、“三明治”免疫分析、免疫沉淀分析、免疫扩散分析、凝集分析、补体固定分析、免疫放射分析和荧光免疫分析。此类分析是常规的且本领域中熟知的。
[0135]
术语“抗体”是指由特异性结合和识别抗原的免疫球蛋白基因或其功能片段编码的多肽。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，这进而分别限定免疫球蛋白类别igg、igm、iga、igd和ige。
[0136]
术语“抗原”和“表位”可互换地指代特定地被免疫系统的组分，例如抗体、t细胞受体或其它免疫受体，如自然杀伤(nk)细胞上的受体，识别的分子(例如多肽)的部分。如本文所用，术语“抗原”涵盖抗原表位和其抗原片段。
[0137]
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元可以具有四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kda)和一条“重”链(约50
‑
70kda)。每条链的n端定义了约100
‑
110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语“可变重链”、“v
h”或“vh”指代免疫球蛋白重链的可变区，包括fv、scfv、dsfv或fab；而术语“可变轻链”、“v
l”或“vl”指代免疫球蛋白轻链的可变区，包括fv、scfv、dsfv或fab。
[0138]
抗体功能片段的实例包括但不限于完整抗体分子、抗体片段(如fv)、单链fv(scfv)、互补决定区(cdr)、vl(轻链可变区)、vh(重链可变区)、fab、f(ab)2'和能够结合到目标抗原的免疫球蛋白肽的那些或任何其它功能部分的任何组合(参见例如《基础免疫学》(paul编，第4版.2001)。如本领域的技术人员所理解的，可以通过多种方法获得各种抗体片段，例如用酶(例如胃蛋白酶)消化完整抗体；或从头合成。常用化学方法或通过使用重组dna方法从头合成抗体片段。因此，如本文所用，术语抗体包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段，或使用重组dna方法从头合成的抗体片段(例如，单链fv)或使用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段(参见，例如，mccafferty等，(1990)《自然(nature)》348:552)。术语“抗体”还包括二价或双特异性分子、双抗体、三抗体和四抗体。二价和双特异性分子描述于例如kostelny等(1992)《免疫学杂志(j.immunol.)》148:1547，pack和pluckthun(1992)《生物化学(biochemistry)》31:1579，hollinger等(1993),《美国国家科学院院刊(pnas)》.usa90:6444,gruber等(1994)《免疫学杂志(j.immunol.)》152:5368，zhu等(1997)《蛋白质科学(protein sci.)》6:781，hu等(1996)《癌症研究(cancer res.)》56:3055，adams等(1993)《癌症研究(cancer res.)》53:4026和mccartney等(1995)《蛋白质工程(protein eng.)》8:301。
[0139]
如本文所用，术语“分解”、“自分解”、“自分解机制”、“分解部分”、“分解域”和其类似物在本文中是指化学基团经历分子内反应的能力，由此产生化学基团的化学重排，且使经重排的化学基团从其所连接的化合物的其余部分释放。“ph敏感”分解域是指在精密ph范围内经历分解反应且在精密ph范围之外基本上不经历分解反应的化学基团(例如ph约1
‑
5、ph约5
‑
7或ph约7
‑
10)。在实施例中，精密ph范围为：ph 1
‑
3、ph 2
‑
4、ph 3
‑
5、ph 4
‑
6、ph 5
‑
7、ph 6
‑
8、ph 7
‑
9或ph 8
‑
10。在实施例中，ph敏感分解区域包括阳离子α氨基酯(寡聚(α
‑
氨基酯))。在实施例中，阳离子α氨基酯的阳离子组分为带正电氮原子(例如阳离子胺)。在实施例中，阳离子α氨基酯的阳离子组分不是胍基。在实施例中，阳离子α氨基酯的阳离子组分不是哌啶鎓基。
[0140]
术语“细胞穿透复合物”或类似物在常见和惯用意义上是指能够穿透到细胞(生物细胞，如真核细胞或原核细胞)中的化学复合物(例如，本文所公开和其实施例的复合物或组合物)。在实施例中，细胞穿透复合物包括以离子方式结合到阳离子两性聚合物的核酸。在实施例中，核酸在不存在阳离子两性聚合物的情况下不能够基本上穿透细胞。因此，在实施例中，阳离子两性聚合物有助于将核酸递送到细胞中。如本文所用，术语“阳离子电荷可变型可释放转运蛋白”、“cart”等是指本文所公开的细胞穿透复合物。cart化合物能够通过在阳离子两性聚合物组分内的ph敏感分解域的作用释放细胞内的核酸组分，其响应于细胞内ph而反应，由此释放细胞中的核酸。在实施例中，阳离子两性聚合物在细胞内快速降解(例如在ph7.4下低于6小时的t1/2)。至少在一些实施例中，聚合复合物、复合物、静电复合物、cart/mrna复合物、cart/寡核苷酸复合物和纳米粒子可以互换地用于指细胞穿透复合物。
[0141]
如本文所用，术语“两性聚合物”是指含有亲水性部分和疏水性部分的聚合物。在实施例中，亲水性部分与疏水性部分以1比1的质量比存在。在实施例中，亲水性部分与疏水性部分以1比2的质量比存在。在实施例中，亲水性部分与疏水性部分以1比5的质量比存在。在实施例中，亲水性部分与疏水性部分以2比1的质量比存在。在实施例中，亲水性部分与疏水性部分以5比1的质量比存在。两性聚合物可以是二嵌段或三嵌段共聚物。在实施例中，两性聚合物可以包括两个亲水性部分(例如，嵌段)和一个疏水性部分(例如，嵌段)。
[0142]
术语“亲脂性聚合物域”等，通常称为“脂质嵌段”，是指阳离子两性聚合物的非亲水性区域(例如，单独不可溶于水)。在实施例中，亲脂性聚合物域在水中具有较低溶解性。举例来说，较低水溶性是指亲脂性聚合物域在水中的溶解度，约0.0005mg/ml到约10mg/ml可溶于水中。
[0143]
术语“引发剂”是指涉及合成具有引发聚合反应的目的的阳离子两性聚合物的反应的化合物。因此，引发剂通常在合成的聚合物的末端处并入。举例来说，一种类型(或式)的单体或多于一种类型的单体(例如两种不同类型的单体)的多个分子可以与引发剂反应以提供阳离子两性聚合物。引发剂可以存在于所得聚合物的至少一端上且不构成存在于聚合物中的重复(或聚合)单元。
[0144]
术语“疾病”或“病状”是指能够用本文所提供的化合物、药物组合物或方法治疗的个体生存状态或健康状态。疾病可以是自身免疫、发炎性、癌症、感染性、代谢性、发展性、心血管、肝脏、肠道、内分泌、神经或其它疾病。在实施例中，疾病为癌症(例如乳癌、卵巢癌、肉瘤、骨肉瘤、肺癌、膀胱癌、子宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌(例如梅克尔细胞癌)、睾丸癌、白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰脏癌、黑素瘤、神经母细胞瘤)。
[0145]
术语“感染”或“传染病”是指可以由例如细菌、病毒、真菌或任何其它病原性微生物剂的生物体引起的疾病或病状。
[0146]
如本文所用，术语“癌症”是指发现于哺乳动物中的所有癌症、赘瘤或恶性肿瘤类型，包括白血病、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌瘤、癌瘤和肉瘤。可以用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示例性癌症包含：淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑瘤、宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌、白血病、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性、er阳性、er阴性、化疗抗性、赫赛汀抗性、her2阳性、阿霉素抗性、他莫苷芬抗性、导管癌、小叶癌、原发性、转移性)、卵巢癌、胰腺癌、肝癌(例如肝细胞癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌、鳞
状细胞肺癌、腺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、类癌、肉瘤)、多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如头、颈或食管)、结肠直肠癌、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、b细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤。另外的实例包括甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、食道癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或髓母细胞瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、多形胶质母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑瘤、癌症、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性前列腺癌、泌尿膀胱癌、恶性前皮肤病灶、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺肿瘤、甲状腺髓样癌症、甲状腺髓样癌、黑素瘤、结直肠癌、甲状腺乳头状癌、肝细胞癌、paget乳头病、叶状肿瘤、小叶癌、导管癌、胰腺星状细胞癌、肝星状细胞癌或前列腺癌。
[0147]
如本文关于分子(例如多核苷酸或蛋白质)的活性和/或功能性所用的术语“抑制”、“抑制”、“抑制”等意谓相对于不存在抑制的情况下蛋白质的活性或功能，不利地影响(例如减少或降低)分子的活性或功能。因此，抑制至少部分地包括部分或完全阻断蛋白质或多核苷酸的刺激，降低、预防或延迟活化，或失活，降敏，或下调信号转导或酶促活性或所述蛋白质或多核苷酸的量。类似地，“抑制剂”为抑制目标生物分子(即核酸、肽、碳水化合物、脂质或可以从自然界发现的任何其它分子)的化合物，例如，通过结合、部分或完全阻断、降低、预防、延迟、失活、去敏化或下调目标生物分子的活性。在疾病预防治疗的情形下，抑制是指疾病或疾病症状的减少。
[0148]
使用药剂“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”和“治疗(treat)”被定义为作用于疾病、病症或病状以减少或改善疾病、病症或病状和/或其症状的有害或任何其它非所需作用。“治疗(treating)”或“治疗(treatment of)”病状或有需要的个体是指(1)采取措施以获得有益或所希望的结果，包括临床结果，如症状减少；(2)抑制所述疾病，例如遏制或减少所述疾病或其临床症状的发展；(3)缓解所述疾病，例如使得疾病或其临床症状消退；或(4)延迟所述疾病。举例来说，有益或所希望的临床结果包括但不限于减少和/或消除癌细胞且预防和/或减少癌细胞的癌转移。
[0149]
术语“预防”、“预防”或“预防”在疾病的情形下是指使疾病的临床症状不会在尚未经历或展现出疾病的症状的个体中发展。在实施例中，此类预防可以应用于可以被视为易受疾病影响的个体，而在一些其它实例中，所述个体可能未必被视为易受疾病影响。
[0150]
如本文所用，“投与”是指使用所属领域的技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将组合物物理引入到个体。本文所述的组合物的优选投与途径包括静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、脊髓或其它非肠道投与途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“非肠道投与”意指除了肠内投与和局部投与之外的、通常通过注射进行的投与模式，且包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。或者，本文所述的组合物可以经由非肠道途径投与，如局部、表皮或粘膜途径投与，例如鼻内、经口、经阴道、经直肠、舌下或局部投与。也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时期内进行投与。
[0151]
如本文所用，术语“癌转移”、“转移性”和“转移性癌症”可以互换使用，且指增殖性疾病或病症(例如癌症)从一个器官或另一个不相邻的器官或身体部分的扩散。癌症发生在起源部位，例如乳腺，该部位称为原发性肿瘤，例如原发性乳腺癌。原发肿瘤或起源部位中的一些癌细胞获得了穿透和浸润局部区域周围正常组织的能力，和/或穿透淋巴系统或通过系统循环的血管系统的壁至身体内的其他部位和组织的能力。由原发性肿瘤的癌细胞形成的第二种临床上可检测的肿瘤称为转移性或继发性肿瘤。当癌细胞转移时，推测转移性肿瘤及其细胞与原始肿瘤的那些相似。因此，如果肺癌转移到乳腺，则乳腺部位的继发性肿瘤由异常的肺细胞而不是异常的乳腺细胞组成。乳房中的继发性肿瘤被称为转移性肺癌。因此，短语转移性癌症是指其中个体患有或曾经患有原发性肿瘤并患有一种或多种继发性肿瘤的疾病。短语非转移性癌症或患有非转移性癌症的个体是指其中个体患有原发性肿瘤但不患有一种或多种继发性肿瘤的疾病。例如，转移性肺癌是指患有原发性肺肿瘤或具有原发性肺肿瘤史并且在第二个位置或多个位置，例如在乳房中含有一种或多种继发性肿瘤的个体中的疾病。
[0152]“抗癌剂”为具有可以用于治疗或预防癌症的抗癌活性的治疗剂。抗癌剂可以是大分子或小分子。实例抗癌剂包括抗体、小分子和大分子或其组合。“抗癌活性”的实例包括但不限于减少癌细胞数目、减少癌症大小、杀死癌细胞、减少和/或抑制癌转移和减少癌细胞生长和/或增殖。
[0153]
术语“相关的”或“与
……
相关”在与疾病相关的物质或物质活性或功能的上下文中是指疾病由物质或物质活性或功能(全部或部分)引起，或疾病的症状由物质或物质活性或功能(全部或部分)引起。当所述术语在症状(例如与疾病或病状相关的症状)的情形下使用时，其意思是症状可以指示存在于展现出所述症状的个体的疾病或病状。
[0154]
术语“个体”、“个体”、“宿主”或“有需要的个体”是指罹患疾病或病状或具有在未来患上疾病或病状的可能性的活生物体。术语“患者”是指已患有疾病或病状的活生物体，例如已诊断患有疾病或病状或具有与疾病或病状相关的一种或多种症状的患者。非限制性实例包括人、其他哺乳动物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴子、山羊、绵羊、奶牛、鹿和其他非哺乳动物。在一些实施例中，患者是人。
[0155]
术语“疫苗”是指可以对特定疾病或病原体提供主动获得性免疫和/或治疗效果(例如治疗)的组合物。疫苗通常含有一种或多种可以诱导个体针对病原体或疾病(即目标病原体或疾病)的免疫反应的药剂。免疫原性药剂刺激身体的免疫系统，将药剂识别为目标病原体或疾病存在的威胁或指示，由此诱导免疫记忆，使得免疫系统可以更易于在后续暴露时识别和破坏病原体中的任一种。疫苗可以是预防性(例如预防或改善任何天然或病原体的未来感染的影响，或易受影响的个体的预期发生的癌症的影响)或治疗性(例如，治疗已诊断患有癌症的个体的癌症)的。疫苗的投与是指接种。在实施例中，疫苗组合物可以向个体提供编码抗原分子(例如肽)的核酸，例如mrna。经由个体中的疫苗组合物递送的核酸可以表达到抗原分子中且使个体获取针对抗原分子的免疫性。在针对感染疾病的接种的情形下，疫苗组合物可以提供编码与特定病原体相关的抗原分子的mrna，例如已知在病原体(例如病原性细菌或病毒)中表达的一种或多种肽。在癌症疫苗的情形下，疫苗组合物可以提供编码与癌症相关的某些肽的mrna，例如与正常细胞相比，在癌细胞中基本上完全或高度表达的肽。在用癌症疫苗组合物接种之后，个体可以对与癌症相关的肽具有免疫性且以
特异性杀死癌细胞。
[0156]
本文所用的术语“免疫反应”涵盖但不限于“适应性免疫反应”，也称为“获得性免疫反应”，其中适应性免疫在对由所述免疫反应靶向的特异性病原体或特定类型的细胞的初始反应之后引发免疫记忆，且在后续遇到时产生对所述目标的增强型反应。免疫记忆的诱导可以提供接种的基础。
[0157]
术语“免疫原性”或“抗原”是指诱导免疫反应的化合物或组合物，例如，细胞毒性t淋巴细胞(ctl)反应、b细胞反应(例如，产生特异性结合表位的抗体)、nk细胞反应或其任何组合，当投与到具有免疫能力的个体时。因此，免疫原性或抗原组合物是能够引发具有免疫能力的个体的免疫反应的组合物。举例来说，免疫原性或抗原组合物可以包括与由免疫反应靶向的病原体或特定类型的细胞相关的一个或多个免疫原性表位。此外，免疫原性组合物可以包括可以用于表达一个或多个表位的编码抗原多肽的一个或多个免疫原性表位的经分离核酸构建体(如dna或rna)(且因此用于引发针对与经靶向病原体或细胞类型相关的这种多肽或相关多肽的免疫反应)。
[0158]
根据本文所提供的方法，所述个体可以投与有效量的本文所提供的药剂、组合物或复合物中的一种或多种，其全部在本文中可互换使用(例如，本文所提供的细胞穿透复合物或疫苗组合物)。术语“有效量”和“有效剂量”可互换地使用。术语“有效量”定义为产生所希望的作用(例如将核酸转染到细胞中且呈现经转染核酸的预期结果)所必需的任何量。投与药剂的有效量和时间表可以由所属领域的技术人员凭经验确定。用于投与的剂量范围足够大以产生所希望的作用，例如核酸转染、基因表达调节、基因编辑、干细胞诱导、免疫反应诱导等等。剂量应不大到引起不良副作用，如非所需交叉反应、过敏性反应等。一般来说，剂量可以随年龄、病状、性别、疾病类型、疾病或病状的严重程度、投与途径或其它药物是否包括于所述方案中而变化，且可以由本领域的技术人员确定。在任何禁忌症的情况下，可以由个别医师调整剂量。剂量可以变化，且可以以每日一个或多个投与剂量进行投与，持续一天或若干天。可以在文献中找到关于给定类别药物产品的适当剂量的指导。举例来说，对于既定参数，有效量可以显示增加或降低至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％。功效也可以表示为
“‑
倍”增加或减少。例如，治疗有效量相对于对照可以具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多倍的作用。确切剂量和调配物可以取决于治疗目的，且可以由所属领域的技术人员使用已知技术可确定的(参见例如，利伯曼(lieberman),《医药学剂量形式》(pharmaceutical dosage forms)(第1
‑
3卷,1992)；劳埃德(lloyd),《医药学混配的艺术、科学和技术》(the art,science和technology of pharmaceutical compounding)(1999)；《雷明顿：医药科学和实践》(remington:the science和practice of pharmacy),第20版,根纳罗(gennaro)编2003和pickar,《剂量计算(dosage calculations)》(1999))。
[0159]
关于癌症治疗的术语“杀死”是针对包括将引起癌细胞或癌细胞群体的至少一部分死亡的任何类型的操纵。
[0160]
细胞穿透复合物
[0161]
在第一方面，提供了一种细胞穿透复合物，其包括非共价结合到阳离子两性聚合物的核酸，所述阳离子两性聚合物包括ph敏感分解域。在实施例中，一个或多个相对离子(例如，阴离子)还可以作为在阳离子两性聚合物中的正电荷的负电荷而存在。在实施例中，
核酸非共价结合到阳离子两性聚合物。在实施例中，核酸以离子方式结合到阳离子两性聚合物。在实施例中，细胞穿透复合物包括多个任选地不同的核酸(例如1到10个额外核酸、1到5个额外核酸、1到5个额外核酸、2个额外核酸或1个额外核酸)。在实施例中，核酸为rna。在实施例中，核酸为mrna。
[0162]
在实施例中，存在于细胞穿透复合物中的阳离子两性聚合物分子中阳离子的数目与核酸分子上阴离子的数目之间的比率可以是约1:1、约5:1、约10:1、约20:1、约30:1、约40:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约102:1、约103:1、约104:1、约105:1、约106:1、约107:1、约108:1、约109:1、约10
10
:1或更高，或前述的任何中间范围。在其它实施例中，存在于细胞穿透复合物中的核酸分子上的阴离子数目与阳离子两性聚合物分子上的阳离子数目之间的比率可以是约1:1、约5:1、约10:1、约20:1、约30:1、约40:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约10:1、约102:1、约103:1、约104:1、约105:1、约106:1、约107:1、约108:1、约109:1、约10
10
:1或更高，或前述的任何中间范围。在一些优选的实施例中，此比率为两性聚合物分子上的约10个阳离子电荷比核酸上的1个负电荷。其它实施例可以具有在两性聚合物分子上的5个阳离子电荷比核酸上的1个负电荷，或在两性聚合物分子上的20个阳离子电荷比核酸上的1个负电荷。
[0163]
在实施例中，存在于细胞穿透复合物中的核酸分子的数目与阳离子两性聚合物分子的数目之间的比率可以是约1:1、约10:1、约102:1、约103:1、约104:1、约105:1、约106:1、约107:1、约108:1、约109:1、约10
10
:1或更高，或前述的任何中间范围。在其它实施例中，存在于细胞穿透复合物中的阳离子两性聚合物分子的数目与核酸分子的数目之间的比率可以是约1:1、约10:1、约102:1、约103:1、约104:1、约105:1、约106:1、约107:1、约108:1、约109:1、约10
10
:1或更高，或前述的任何中间范围。
[0164]
在实施例中，阳离子两性聚合物可以是阳离子电荷可变型可释放转运蛋白(cart)。在实施例中，cart可以包括含有一系列阳离子序列的寡聚链，所述阳离子序列经历从阳离子到中性或阳离子到阴离子的电荷的ph敏感的变化。
[0165]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有ph敏感分解域和亲脂性聚合物域。在实施例中，亲脂性聚合物域可以促进在细胞膜之间的细胞穿透、细胞递送和/或传输。在实施例中，亲脂性聚合物域可以基本上不溶于水(例如，低于约0.0005mg/ml到约10mg/ml可溶于水中)。在实施例中，亲脂性聚合物域可以促进阳离子两性聚合物聚合成纳米粒子。在实施例中，此类纳米粒子可以具有约50nm到约500nm的平均最长尺寸。在实施例中，亲脂性聚合物域可以促进阳离子两性聚合物的残余物进入之后的胞内体融合和在胞内体内分解。在实施例中，本公开的细胞穿透复合物保护核酸货物免于降解。术语“核酸货物”或类似物在常见和惯用意义上是指本文所公开的细胞穿透复合物和其实施例运输到细胞中所需的物质。
[0166]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有式(i)：h
‑
l1‑
[(lp1)
z1
‑
(im)
z2
‑
(lp2)
z3
]
z4
‑
l2‑
h(i)，其中l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；lp1和lp2独立地为一键或亲脂性聚合物域，其中lp1或lp2中的至少一个为亲脂性聚合物域；im为ph敏感分解域；z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和z2为2到100的整数。
[0167]
在实施例中，l1为被取代或未被取代的c1‑
c3亚烷基。在实施例中，l1是被取代或未被取代的亚甲基。在实施例中，l1是被取代或未被取代的c1‑
c6亚烷基或被取代或未被取代的2到6元亚杂烷基。在实施例中，l1是被取代或未被取代的c1‑
c3亚烷基或被取代或未被取代的2到3元亚杂烷基。
[0168]
在实施例中，l1为被取代或未被取代的亚烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被取代或未被取代的亚杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的亚环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的亚杂环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的亚芳基(例如，c6‑
c
10
或亚苯基)或被取代或未被取代的亚杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，l1为被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的亚烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的亚杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的亚环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的亚杂环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的亚芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的亚杂芳基。在实施例中，l1为未被取代的亚烷基、未被取代的亚杂烷基、未被取代的亚环烷基、未被取代的亚杂环烷基、未被取代的亚芳基或未被取代的亚杂芳基。在实施例中，l1为未被取代的亚烷基(例如，c1‑
c6亚烷基)。在实施例中，l1为一键。
[0169]
在实施例中，l2被取代或未被取代的c1‑
c3亚烷基。在实施例中，l2为被取代或未被取代的亚甲基。在实施例中，l2为被取代或未被取代的c1‑
c6亚烷基或被取代或未被取代的2到6元亚杂烷基。在实施例中，l2为被取代或未被取代的c1‑
c3亚烷基或被取代或未被取代的2到3元亚杂烷基。
[0170]
在实施例中，l2为被取代或未被取代的亚烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被取代或未被取代的亚杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的亚环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的亚杂环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的亚芳基(例如，c6‑
c
10
或亚苯基)或被取代或未被取代的亚杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，l2为被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的亚烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的亚杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的亚环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的亚杂环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的亚芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的亚杂芳基。在实施例中，l2为未被取代的亚烷基、未被取代的亚杂烷基、未被取代的亚环烷基、未被取代的亚杂环烷基、未被取代的亚芳基或未被取代的亚杂芳基。在实施例中，l2为未被取代的亚烷基(例如，c1‑
c6亚烷基)。在实施例中，l2为一键。
[0171]
在实施例中，z2是以下的整数：2到90(例如5到90、10到90或20到90)、2到80(例如5到80、10到80或20到80)、2到70(例如5到70、10到70或20到70)、2到50(例如5到50、10到50或20到50)或2到25。在实施例中，z1和z3独立地是以下的整数：0到90(例如5到90、10到90或20
到90)、0到80(例如5到80、10到80或20到80)、0到70(例如5到70、10到70或20到70)、0到50(例如5到50、10到50或20到50)或2到25。在实施例中，z1和z3独立地是以下的整数：2到90(例如5到90、10到90或20到90)、2到80(例如5到80、10到80或20到80)、2到70(例如5到70、10到70或20到70)、2到50(例如5到50、10到50或20到50)或2到25。在实施例中，z4是以下的整数：1到90(例如5到90、10到90或20到90)、1到80(例如5到80、10到80或20到80)、1到70(例如5到70、10到70或20到70)、1到50(例如5到50、10到50或20到50)或2到25。在实施例中，z4是以下的整数：2到90(例如5到90、10到90或20到90)、2到80(例如5到80、10到80或20到80)、2到70(例如5到70、10到70或20到70)、2到50(例如5到50、10到50或20到50)或2到25。
[0172]
在细胞穿透复合物的实施例中，ph敏感分解域包括第一亲核部分和第一亲电子部分，其中第一亲核部分在ph范围内与第一亲电子部分具有反应性，且在ph范围之外与亲电子部分基本上不具有反应性(例如，ph约1
‑
5、ph约5
‑
7或ph约7
‑
10)。在实施例中，第一亲核部分与第一亲电子部分最具有反应性的ph范围为：ph 1
‑
3、ph 2
‑
4、ph 3
‑
5、ph 4
‑
6、ph 5
‑
7、ph 6
‑
8、ph 7
‑
9或ph 8
‑
10。亲核部分根据其化学上的普通含义使用，且是指能够给电子供电的部分(例如，官能团)。
[0173]
在实施例中，第一亲核部分与第一亲电子部分最具有反应性的ph范围为ph 1
‑
3。在实施例中，第一亲核部分与第一亲电子部分最具有反应性的ph范围为ph 2
‑
4。在实施例中，第一亲核部分与第一亲电子部分最具有反应性的ph范围为ph 3
‑
5。在实施例中，第一亲核部分与第一亲电子部分最具有反应性的ph范围为：ph 4
‑
6。在实施例中，第一亲核部分与第一亲电子部分最具有反应性的ph范围为：ph 5
‑
7。在实施例中，第一亲核部分与第一亲电子部分最具有反应性的ph范围为：ph 6
‑
8。在实施例中，第一亲核部分与第一亲电子部分最具有反应性的ph范围为：ph 7
‑
9。在实施例中，第一亲核部分与第一亲电子部分最具有反应性的ph范围为：ph 8
‑
10。在实施例中，ph为1。在实施例中，ph为2。在实施例中，ph为3。在实施例中，ph为4。在实施例中，ph为5。在实施例中，ph为6。在实施例中，ph为7。在实施例中，ph为8。在实施例中，ph为9。在实施例中，ph为10。在实施例中，ph为约1。在实施例中，ph为约2。在实施例中，ph为约3。在实施例中，ph为约4。在实施例中，ph为约5。在实施例中，ph为约6。在实施例中，ph为约7。在实施例中，ph为约8。在实施例中，ph为约9。在实施例中，ph为约10。
[0174]
在实施例中，第一亲核部分在较低ph下(例如，ph约1到约5)基本上质子化。在实施例中，第一亲核部分在ph 5
‑
7范围内基本上质子化。在实施例中，第一亲核部分为阳离子性的。在实施例中，第一亲核部分包括阳离子氮(例如阳离子胺)。
[0175]
在实施例中，第一亲核部分可以连接到ph不稳定保护基。术语“ph不稳定保护基”等在通常和惯用意义上是指能够保护其所连接的另一官能团的化学部分，且所述保护基可以在某些ph条件下裂解或以其它方式不活化为保护基(例如，如降低ph)。在一个实施例中，ph不稳定保护基为
‑
co2‑
t
‑
bu，在酸性条件下去除的基团(例如，ph低于7)。额外亲核试剂保护基还可以包括通过光、热、亲核试剂和碱裂解的亲核试剂保护基。
[0176]
在上文所公开的细胞穿透复合物的实施例和其实施例中，ph敏感分解域具有以下
式(ii)的结构：其中n为2或更大的整数；n1为0到50的整数；z为亲核部分；x1为一键、
‑
c(r5)(r6)
‑
、
‑
c(r5)(r6)
‑
c(r7)(r8)
‑
、
‑
o
‑
c(r5)(r6)
‑
或
‑
o
‑
c(r5)(r6)
‑
c(r7)(r8)
‑
；x2为
‑
o
‑
或
‑
s
‑
和r1、r2、r5、r6、r7和r8独立地是氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。在实施例中，n为在以下范围内的整数：2
‑
100、2
‑
90、2
‑
80、2
‑
70、2
‑
60、2
‑
50、2
‑
40、2
‑
30、2
‑
2或2
‑
10。在实施例中，n1为在以下范围内的整数：0
‑
25、0
‑
10、0
‑
5。在实施例中，n1为0、1、2、3、4或5。在实施例中，n1为1或2。
[0177]
在实施例中，r1、r2、r5、r6、r7和r8独立地为被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的杂环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，r1、r2、r5、r6、r7和r8独立地为被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂芳基。在实施例中，r1、r2、r5、r6、r7和r8独立地为未被取代的烷基、未被取代的杂烷基、未被取代的环烷基、未被取代的杂环烷基、未被取代的芳基或未被取代的杂芳基。在实施例中，r1、r2、r5、r6、r7和r8独立地是氢或未被取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)。在实施例中，r1、r2、r5、r6、r7和r8为氢。
[0178]
在上文所公开的细胞穿透复合物和其实施例的实施例中，ph敏感分解域具有以下结构：其中r1、r2、r3、r4、x1、z和x2如本文所定义，且n1和n2为大于1的整数。
[0179]
在本文所公开和其实施例的细胞穿透复合物的实施例中，ph敏感分解域具有以下
式(iii)的结构：其中n为2或更大的整数；z为亲核部分；x1为一键、
‑
c(r5)(r6)
‑
、
‑
c(r5)(r6)
‑
c(r7)(r8)
‑
、
‑
o
‑
c(r5)(r6)
‑
或
‑
o
‑
c(r5)(r6)
‑
c(r7)(r8)
‑
；x2为
‑
o
‑
或
‑
s
‑
和r1。1、r
1.2
、r
2.1
、r
2.2
、r5、r6、r7和r8独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。在实施例中，n为在以下范围内的整数：2
‑
100、2
‑
90、2
‑
80、2
‑
70、2
‑
60、2
‑
50、2
‑
40、2
‑
30、2
‑
2或2
‑
10。在实施例中，n为在以下范围内的整数：2
‑
100或2
‑
50。
[0180]
在实施例中，r
1.1
、r
1.2
、r
2.1
、r
2.2
、r5、r6、r7和r8独立地为被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的杂环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，r
1.1
、r
1.2
、r
2.1
、r
2.2
、r5、r6、r7和r8独立地为被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
1.1
、r
1.2
、r
2.1
、r
2.2
、r5、r6、r7和r8独立地为未被取代的烷基、未被取代的杂烷基、未被取代的环烷基、未被取代的杂环烷基、未被取代的芳基或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
1.1
、r
1.2
、r
2.1
、r
2.2
、r5、r6、r7和r8独立地为氢或未被取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)。在实施例中，r
1.1
、r
1.2
、r
2.1
、r
2.2
、r5、r6、r7和r8为氢。
[0181]
在本文所公开和其实施例的细胞穿透复合物的实施例中，ph敏感分解域具有以下式(iv)的结构：其中n为2或更大的整数。在实施例中，n为在以下范围内的整数：2
‑
100、2
‑
90、2
‑
80、2
‑
70、2
‑
60、2
‑
50、2
‑
40、2
‑
30、2
‑
20或2
‑
10。在实施例中，n为在以下范围内的整数：2
‑
100或2
‑
50。在一些实施例中，n为2到50的整数。在实施例中，n为2到15的整数。
[0182]
在本文所公开和其实施例的细胞穿透复合物的实施例中，ph敏感分解域具有以下
式(iva)的结构：其中n为2或更大的整数。在实施例中，n为在以下范围内的整数：2
‑
100、2
‑
90、2
‑
80、2
‑
70、2
‑
60、2
‑
50、2
‑
40、2
‑
30、2
‑
20或2
‑
10。在实施例中，n为在以下范围内的整数：2
‑
100或2
‑
50。
[0183]
在本文所公开和其实施例的细胞穿透复合物的实施例中，ph敏感分解域具有以下式(v)的结构：其中n为2或更大的整数。在实施例中，n为在以下范围内的整数：2
‑
100、2
‑
90、2
‑
80、2
‑
70、2
‑
60、2
‑
50、2
‑
40、2
‑
30、2
‑
20或2
‑
10。在实施例中，n为在以下范围内的整数：2
‑
100或2
‑
50。
[0184]
在本文所公开和其实施例的细胞穿透复合物的实施例中，ph敏感分解域具有以下式(va)的结构：
[0185]
其中n为2或更大的整数。在实施例中，n为在以下范围内的整数：2
‑
100、2
‑
90、2
‑
80、2
‑
70、2
‑
60、2
‑
50、2
‑
40、2
‑
30、2
‑
2或2
‑
10。在实施例中，n为在以下范围内的整数：2
‑
100或2
‑
50。
[0186]
在实施例中，ph敏感分解域具有以下结构：其中x6为
‑
o
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
conh
‑
、
‑
coo
‑
、
‑
oco
‑
或
‑
nhco
‑
；r
20
为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基，且r
21
为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
21
为寡聚二醇部分。在实施例中，r
20
为寡聚二醇部分。
[0187]
在实施例中，r
20
为被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被
取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的杂环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，r
20
为被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
20
为未被取代的烷基、未被取代的杂烷基、未被取代的环烷基、未被取代的杂环烷基、未被取代的芳基或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
20
为氢或未被取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)。在实施例中，r
20
为氢。
[0188]
在实施例中，r
21
为被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的杂环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，r
21
为被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
21
为未被取代的烷基、未被取代的杂烷基、未被取代的环烷基、未被取代的杂环烷基、未被取代的芳基或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
21
为氢或未被取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)。在实施例中，r
21
为氢。
[0189]
在本文所公开和其实施例的细胞穿透复合物的实施例中，ph敏感分解域具有以下结构：其中r
24
、r
25
和r
26
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基，且n3为0到50的整数。
[0190]
在实施例中，r
24
、r
25
和r
26
独立地为被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的杂
环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，r
24
、r
25
和r
26
独立地为被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
24
、r
25
和r
26
独立地为未被取代的烷基、未被取代的杂烷基、未被取代的环烷基、未被取代的杂环烷基、未被取代的芳基或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
24
、r
25
和r
26
独立地为氢或未被取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)。在实施例中，r
24
、r
25
和r
26
独立地为氢。
[0191]
在本文所公开和其实施例的细胞穿透复合物的实施例中，ph敏感分解域具有以下式(vi)的结构：其中n为2或更大的整数；n1为0到50的整数；x1为一键、
‑
o
‑
、
‑
nr5‑
、
‑
c(r5)(r6)
‑
或
‑
c(r5)(r6)
‑
c(r7)(r8)
‑
；x2为一键、
‑
o
‑
、
‑
c(r9)(r
10
)
‑
或
‑
c(r9)(r
10
)
‑
c(r
11
)(r
12
)
‑
；x4为一键、
‑
nr
16
‑
、
‑
o
‑
、
‑
c(r
16
)(r
17
)
‑
或
‑
c(r
16
)(r
17
)
‑
c(r
18
)(r
19
)
‑
；x5为亲核部分；且r1、r2、r5、r6、r7、r8、r9、r
10
、r
11
、r
12
、r
16
、r
17
、r
18
和r
19
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0192]
在实施例中，r1、r2、r5、r6、r7、r8、r9、r
10
、r
11
、r
12
、r
16
、r
17
、r
18
和r
19
独立地为被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的杂环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，r1、r2、r5、r6、r7、r8、r9、r
10
、r
11
、r
12
、r
16
、r
17
、r
18
和r
19
独立地为被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂芳基。在实施例中，r1、r2、r5、r6、r7、r8、r9、r
10
、r
11
、r
12
、r
16
、r
17
、r
18
和r
19
独立地为未被取代的烷基、未被取代的杂烷基、未被取代的环烷基、未被取代的杂环烷基、未被取代的芳基或未被取代的杂芳基。在实施例中，r1、r2、r5、r6、r7、r8、r9、r
10
、r
11
、r
12
、r
16
、r
17
、r
18
和r
19
独立地为氢或未被
取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)。在实施例中，r1、r2、r5、r6、r7、r8、r9、r
10
、r
11
、r
12
、r
16
、r
17
、r
18
和r
19
为氢。
[0193]
在实施例中，z为亲核部分。在实施例中，z为
‑
s
‑
、
‑
o
+
r
13
‑
、
‑
s
+
r
13
‑
、
‑
nr
13
‑
或
‑
n
+
(r
13
)(h)
‑
，其中r
13
为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。在实施例中，z为
‑
s
‑
。在实施例中，z为
‑
s
+
r
13
‑
。在实施例中，z为
‑
nr
13
‑
。在实施例中，z为
‑
n
+
(r
13
)(h)
‑
。在实施例中，z为
‑
s
+
h
‑
。在实施例中，z为
‑
nh
‑
。在实施例中，z为
‑
n
+
h2‑
。在实施例中，z为
‑
o
+
h
‑
。
[0194]
在实施例中，r
13
独立地为被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的杂环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，r
13
独立地为被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
13
独立地为未被取代的烷基、未被取代的杂烷基、未被取代的环烷基、未被取代的杂环烷基、未被取代的芳基或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
13
独立地为氢或未被取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)。在实施例中，r
13
为氢。
[0195]
在实施例中，z为其中x3为
‑
c(r
15
)
‑
或
‑
n
‑
；x4为一键、
‑
c(o)
‑
、
‑
p(o)(or
16
)2‑
、
‑
s(o)(or
17
)2‑
、
‑
c(r
16
)(r
17
)
‑
或
‑
c(r
16
)(r
17
)
‑
c(r
18
)(r
19
)
‑
；x5为亲核部分；且r
13
、r
14
、r
15
、r
16
、r
17
、r
18
和r
19
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。在实施例中，x3为
‑
ch。
[0196]
在实施例中，r
13
、r
14
、r
15
、r
16
、r
17
、r
18
和r
19
独立地为被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的杂环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，r
13
、r
14
、r
15
、r
16
、r
17
、r
18
和r
19
独立地为被取代(例如，被取代基、大小限制的
取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
13
、r
14
、r
15
、r
16
、r
17
、r
18
和r
19
独立地为未被取代的烷基、未被取代的杂烷基、未被取代的环烷基、未被取代的杂环烷基、未被取代的芳基或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
13
、r
14
、r
15
、r
16
、r
17
、r
18
和r
19
独立地为氢或未被取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)。
[0197]
在实施例中，x5为
‑
n(r
13
)(h)，其中r
13
为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0198]
除本文所公开和其实施例的细胞穿透复合物以外，在实施例中，亲脂性聚合物域具有下式：其中，n2为1到100的整数；r
20
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0199]
在实施例中，r
20
为独立地为被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的杂环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，r
20
独立地为被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的烷基、未被取代的杂烷基、未被取代的环烷基、未被取代的杂环烷基、未被取代的芳基或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
20
独立地为氢或未被取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)。
[0200]
在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c1‑
c
30
烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c1‑
c
20
烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c8‑
c
30
烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c8‑
c
20
烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c9‑
c
20
烷基。在实施例中，r
20
独
立地为未被取代的c9‑
c
18
烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c
18
烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c
17
烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c
16
烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c
15
烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c
14
烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c
13
烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c
12
烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c
11
烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c
10
烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c9烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c8烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c7烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c6烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c5烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c4烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c3烷基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c2烷基。
[0201]
在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c1‑
c
30
烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c1‑
c
20
烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c8‑
c
30
烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c8‑
c
20
烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c9‑
c
20
烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c9‑
c
18
烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c
18
烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c
17
烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c
16
烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c
15
烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c
14
烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c
13
烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c
12
烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c
11
烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c
10
烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c9烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c8烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c7烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c6烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c5烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c4烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c3烯基。在实施例中，r
20
独立地为未被取代的c2烯基。
[0202]
在实施例中，r
20
独立地为十八烷基部分(例如，未被取代的c
18
烷基)。在实施例中，r
20
独立地为油基部分(例如，未被取代的c
18
烯基)。在实施例中，r
20
独立地为亚油基部分(例如，未被取代的c
18
烯基)。在实施例中，r
20
独立地为十二烷基部分(例如，未被取代的c
12
烷基)。在实施例中，r
20
独立地为壬烯基部分(例如，未被取代的c9烯基)。在实施例中，r
20
独立地为
[0203]
除本文所公开和其实施例的细胞穿透复合物以外，在实施例中，lp1具有下式：
其中，n21为0到100的整数；r
201
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0204]
在实施例中，r
201
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的杂环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，r
201
为被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的烷基、未被取代的杂烷基、未被取代的环烷基、未被取代的杂环烷基、未被取代的芳基或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
201
独立地为氢或未被取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)。
[0205]
在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c1‑
c
30
烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c1‑
c
20
烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c8‑
c
30
烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c8‑
c
20
烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c9‑
c
20
烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c9‑
c
18
烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c
18
烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c
17
烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c
16
烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c
15
烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c
14
烷基。在实施例中，r
201
为未被取代的c
13
烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c
12
烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c
11
烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c
10
烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c9烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c8烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c7烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c6烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c5烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c4烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c3烷基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c2烷基。
[0206]
在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c1‑
c
30
烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c1‑
c
20
烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c8‑
c
30
烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c8‑
c
20
烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c9‑
c
20
烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c9‑
c
18
烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c
18
烯基。在实施
例中，r
201
独立地为未被取代的c
17
烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c
16
烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c
15
烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c
14
烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c
13
烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c
12
烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c
11
烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c
10
烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c9烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c8烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c7烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c6烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c5烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c4烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c3烯基。在实施例中，r
201
独立地为未被取代的c2烯基。
[0207]
在实施例中，r
201
独立地为十八烷基部分(例如，未被取代的c
18
烷基)。在实施例中，r
201
独立地为油基部分(例如，未被取代的c
18
烯基)。在实施例中，r
201
独立地为亚油基部分(例如，未被取代的c
18
烯基)。在实施例中，r
201
独立地为十二烷基部分(例如，未被取代的c
12
烷基)。在实施例中，r
201
独立地为壬烯基部分(例如，未被取代的c9烯基)。在实施例中，r
201
独立地为
[0208]
除本文所公开和其实施例的细胞穿透复合物以外，在实施例中，lp2具有下式：其中，n22为0到100的整数；r
202
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0209]
在实施例中，r
202
独立地为被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的杂环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，r
202
独立地为被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂环烷
基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的烷基、未被取代的杂烷基、未被取代的环烷基、未被取代的杂环烷基、未被取代的芳基或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
202
独立地为氢或未被取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)。
[0210]
在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c1‑
c
30
烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c1‑
c
20
烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c8‑
c
30
烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c8‑
c
20
烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c9‑
c
20
烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c9‑
c
18
烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c
18
烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c
17
烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c
16
烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c
15
烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c
14
烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c
13
烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c
12
烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c
11
烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c
10
烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c9烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c8烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c7烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c6烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c5烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c4烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c3烷基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c2烷基。
[0211]
在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c1‑
c
30
烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c1‑
c
20
烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c8‑
c
30
烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c8‑
c
20
烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c9‑
c
20
烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c9‑
c
18
烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c
18
烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c
17
烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c
16
烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c
15
烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c
14
烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c
13
烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c
12
烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c
11
烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c
10
烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c9烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c8烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c7烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c6烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c5烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c4烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c3烯基。在实施例中，r
202
独立地为未被取代的c2烯基。
[0212]
在实施例中，r
202
独立地为十八烷基部分(例如，未被取代的c
18
烷基)。在实施例中，r
202
独立地为油基部分(例如，未被取代的c
18
烯基)。在实施例中，r
202
独立地为亚油基部分(例如，未被取代的c
18
烯基)。在实施例中，r
202
独立地为十二烷基部分(例如，未被取代的c
12
烷基)。在实施例中，r
202
独立地为壬烯基部分(例如，未被取代的c9烯基)。在实施例中，r
202
独立地为
[0213]
在实施例中，在实施例中，亲脂性聚合物域为以下式(ia)化合物：
[0214]
其中x6独立地为
‑
o
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
co2‑
、
‑
conh
‑
、
‑
oc(o)
‑
或
‑
nhco
‑
、r
20
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基，r
21
独立地为氢或被取代或未被取代的烷基，且n如本文所定义。在实施例中，r
20
为寡聚二醇部分。
[0215]
在本文所公开和其实施例的细胞穿透复合物的实施例中，所述ph敏感分解域具有以下结构：其中n4为0到50的整数。在实施例中，n4为0到10。在实施例中，n4为1到15的整数。
[0216]
在本文所公开和其实施例的细胞穿透复合物的实施例中，亲脂性聚合物具有以下结构：其中x7独立地为
‑
o
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
co2‑
、
‑
conh
‑
、
‑
oc(o)
‑
或
‑
nhco
‑
；r
22
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基，且r
23
独立地为被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
22
为寡聚二醇部分。在实施例中，r
23
为寡聚二醇部分。
[0217]
在实施例中，r
22
独立地为被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的杂环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
或苯
基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，r
22
独立地为取代的(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
22
独立地为未被取代的烷基、未被取代的杂烷基、未被取代的环烷基、未被取代的杂环烷基、未被取代的芳基或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
22
独立地为氢或未被取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)。
[0218]
在实施例中，亲脂性聚合物域可以是以下式(ib)的化合物：
[0219]
其中r
100
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；r1、r2、r3和r4独立地为氢、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基，并且n100为2或更大的整数。
[0220]
在实施例中，r1、r2、r3和r4独立地为被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的杂环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，r1、r2、r3和r4独立地为被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂芳基。在实施例中，r1、r2、r3和r4独立地为未被取代的烷基、未被取代的杂烷基、未被取代的环烷基、未被取代的杂环烷基、未被取代的芳基或未被取代的杂芳基。在实施例中，r1、r2、r3和r4独立地为氢或未被取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)。在实施例中，r1、r2、r3和r4独立地为氢。
[0221]
在实施例中，亲脂性聚合物域可以是以下式(ic)化合物：
[0222]
其中r
200
独立地为被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基，且n200为2或更大的整数。在实施例中，r
200
独立地为寡聚二醇部分。在实施例中，r
200
独立地为胺封端的寡聚二醇部分。术语“寡聚二醇部分”是指且“胺封端的寡聚二醇部分”是指其中n200为2或更大的整数。
[0223]
在实施例中，r
200
独立地为被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的杂环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，r
200
独立地为取代的(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
200
独立地为未被取代的烷基、未被取代的杂烷基、未被取代的环烷基、未被取代的杂环烷基、未被取代的芳基或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
200
独立地为氢或未被取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)。在实施例中，r
200
独立地为氢。
[0224]
在实施例中，亲脂性聚合物域可以是以下式(id)的化合物：
[0225]
其中r
300
、r
301
和r
302
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基，且n300如本文中所定义。在实施例中，r
300
和r
301
独立地为氢或被取代或未被取代的烷基。在实施例中，r
302
独立地为寡聚二醇部分。在实施例中，r
302
独立地为胺封端的寡聚二醇部分。在实施例中，r
300
、r
301
和r
302
独立地为氢。
[0226]
在实施例中，r
300
、r
301
和r
302
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的杂环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，r
300
、r
301
和r
302
独立地为被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
300
、r
301
和r
302
独立地为未被取代的烷基、未被取代的杂烷基、未被取代的环烷基、未被取代的杂环烷基、未被取代的芳基或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
300
、r
301
和r
302
独立地为氢或未被取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)。
[0227]
在一个方面，此处的公开内容提供具有非共价结合到阳离子两性聚合物的核酸的细胞穿透复合物。阳离子两性聚合物可以具有ph敏感分解域。在一些实施例中，阳离子两性聚合物具有ph敏感分解域和亲脂性聚合物域。在一些实施例中，细胞穿透复合物具有以下式(vii)的阳离子两性聚合物：
[0228]
r
1a
‑
[l1‑
[(lp1)
z1
‑
(im)
z2
‑
(lp2)
z3
]
z4
‑
l2‑
r
2a
]
z5
[0229]
其中
[0230]
r
1a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0231]
r
2a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0232]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[0233]
lp1和lp2独立地为一键或亲脂性聚合物域，其中lp1或lp2中的至少一个为亲脂性聚合物域；
[0234]
im为ph敏感分解域；
[0235]
z5为1到10的整数；
[0236]
z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和z2为2到100的整数。
[0237]
在实施例中，r
1a
独立地为被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0238]
在实施例中，r
1a
独立地为被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的杂环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，r
1a
独立地为被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
1a
独立地为未被取代的烷基、未被取代的杂烷基、未被取代的环烷基、未被取代的杂环烷基、未被取代的芳基或未被取代的杂芳基。
[0239]
在实施例中，r
1a
独立地为氢、被取代或未被取代的c1‑
c6烷基、被取代或未被取代的2到6元杂烷基、被取代或未被取代的c3‑
c6环烷基、被取代或未被取代的3到6元杂环烷基、被取代或未被取代的苯基或被取代或未被取代的5到6元杂芳基。
[0240]
在实施例中，r
1a
独立地为被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8烷基、c1‑
c6烷基或c1‑
c4烷基)。在实施例中，r
1a
独立地为被取代的烷基(例如，c1‑
c8烷基、c1‑
c6烷基或c1‑
c4烷基)。在实施例中，r
1a
独立地为未被取代的烷基(例如，c1‑
c8烷基、c1‑
c6烷基或c1‑
c4烷基)。在实施例中，r
1a
独立地为被取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元杂烷基、2到6元杂烷基或2到4元杂烷基)。在实施例中，r
1a
独立地为被取代的杂烷基(例如，2到8元杂烷基、2到6元杂烷基或2到4元杂烷基)。在实施例中，r
1a
独立地为未被取代的杂烷基(例如，2到8元杂烷基、2到6元杂烷基或2到4元杂烷基)。在实施例中，r
1a
独立地为被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8环烷基、c3‑
c6环烷基或c5‑
c6环烷基)。在实施例中，r
1a
独立地为被取代的环烷基(例如，c3‑
c8环烷基、c3‑
c6环烷基或c5‑
c6环烷基)。在实施例中，r
1a
独立地为未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8环烷基、c3‑
c6环烷基或c5‑
c6环烷基)。在实施例中，r
1a
独立地为被取代或未被取代的杂环烷基(例如，3到8元杂环烷基、3到6元杂环烷基或5到6元杂环烷基)。在实施例中，r
1a
独立地为被取代的杂环烷基(例如，3到8元杂环烷基、3到6元杂环烷基或5到6元杂环烷基)。在实施例中，r
1a
独立地为未被取代的杂环烷基(例如，3到8元杂环烷基、3到6元杂环烷基或5到6元杂环烷基)。在实施例中，r
1a
独立地为被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施例中，r
1a
为被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施例中，r
1a
独立地为未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施例中，r
1a
独立地为被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元杂芳基、5到9元杂芳基或5到6元杂芳基)。
在实施例中，r
1a
独立地为被取代的杂芳基(例如，5到10元杂芳基、5到9元杂芳基或5到6元杂芳基)。在实施例中，r
1a
独立地为未被取代的杂芳基(例如，5到10元杂芳基、5到9元杂芳基或5到6元杂芳基)。
[0241]
在实施例中，r
1a
独立地为被取代或未被取代的芳基。在一些其它实施例中，r
1a
独立地为被取代或未被取代的苯基。在又一些其它实施例中，r
1a
独立地为被取代或未被取代的芳基。在又一些其它实施例中，r
1a
独立地为被取代或未被取代的苯基或萘基。
[0242]
在实施例中，r
2a
独立地独立地为被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8、c1‑
c6、c1‑
c4或c1‑
c2)、被取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元、2到6元、4到6元、2到3元或4到5元)、被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8、c3‑
c6、c4‑
c6或c5‑
c6)、被取代或未被取代的杂环烷基(例如，3到8元、3到6元、4到6元、4到5元或5到6元)、被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元、5到9元或5到6元)。在实施例中，r
2a
独立地为被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂环烷基、被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的芳基或被取代(例如，被取代基、大小限制的取代基或低碳数取代基取代)或未被取代的杂芳基。在实施例中，r
2a
独立地为未被取代的烷基、未被取代的杂烷基、未被取代的环烷基、未被取代的杂环烷基、未被取代的芳基或未被取代的杂芳基。
[0243]
在实施例中，r
2a
独立地为氢、被取代或未被取代的c1‑
c6烷基、被取代或未被取代的2到6元杂烷基、被取代或未被取代的c3‑
c6环烷基、被取代或未被取代的3到6元杂环烷基、被取代或未被取代的苯基或被取代或未被取代的5到6元杂芳基。
[0244]
在实施例中，r
2a
独立地为被取代或未被取代的烷基(例如，c1‑
c8烷基、c1‑
c6烷基或c1‑
c4烷基)。在实施例中，r
2a
独立地为被取代的烷基(例如，c1‑
c8烷基、c1‑
c6烷基或c1‑
c4烷基)。在实施例中，r
2a
独立地为未被取代的烷基(例如，c1‑
c8烷基、c1‑
c6烷基或c1‑
c4烷基)。在实施例中，r
2a
独立地为被取代或未被取代的杂烷基(例如，2到8元杂烷基、2到6元杂烷基或2到4元杂烷基)。在实施例中，r
2a
独立地为被取代的杂烷基(例如，2到8元杂烷基、2到6元杂烷基或2到4元杂烷基)。在实施例中，r
2a
独立地为未被取代的杂烷基(例如，2到8元杂烷基、2到6元杂烷基或2到4元杂烷基)。在实施例中，r
2a
独立地为被取代或未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8环烷基、c3‑
c6环烷基或c5‑
c6环烷基)。在实施例中，r
2a
独立地为被取代的环烷基(例如，c3‑
c8环烷基、c3‑
c6环烷基或c5‑
c6环烷基)。在实施例中，r
2a
为未被取代的环烷基(例如，c3‑
c8环烷基、c3‑
c6环烷基或c5‑
c6环烷基)。在实施例中，r
2a
独立地为被取代或未被取代的杂环烷基(例如，3到8元杂环烷基、3到6元杂环烷基或5到6元杂环烷基)。在实施例中，r
2a
独立地为被取代的杂环烷基(例如，3到8元杂环烷基、3到6元杂环烷基或5到6元杂环烷基)。在实施例中，r
2a
独立地为未被取代的杂环烷基(例如，3到8元杂环烷基、3到6元杂环烷基或5到6元杂环烷基)。在实施例中，r
2a
独立地为被取代或未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施例中，r
2a
为被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施例中，r
2a
独立地为未被取代的芳基(例如，c6‑
c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施例中，r
2a
独立地为被取代或未被取代的杂芳基(例如，5到10元杂芳基、5到9元杂芳基或5到6元杂芳基)。在实
施例中，r
2a
独立地为被取代的杂芳基(例如，5到10元杂芳基、5到9元杂芳基或5到6元杂芳基)。在实施例中，r
2a
独立地为未被取代的杂芳基(例如，5到10元杂芳基、5到9元杂芳基或5到6元杂芳基)。
[0245]
在一些实施例中，细胞穿透复合物可以具有含有下式(viii)的阳离子两性聚合物：
[0246][0247]
其中
[0248]
环a为被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0249]
cart具有下式：
‑
l1‑
[(lp1)
z1
‑
(im)
z2
‑
(lp2)
z3
]
z4
‑
l2‑
r
2a
[0250]
其中，
[0251]
r
2a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；lp1和lp2独立地为一键或亲脂性聚合物域，其中lp1或lp2中的至少一个为亲脂性聚合物域；im为ph敏感分解域；z5为1到10的整数；z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和z2为2到100的整数。
[0252]
在一些实施例中，在上式(viii)中，环a为被取代或未被取代的芳基。在一些其它实施例中，环a为被取代或未被取代的苯基。在又一些其它实施例中，环a为被取代或未被取代的芳基。在又一些其它实施例中，环a为被取代或未被取代的苯基或萘基。
[0253]
在实施例中，环a为未被取代的芳基(即，未被取代的超出cart部分)。在实施例中，环a为未被取代的苯基(即，未被取代的超出cart部分)。在实施例中，环a为未被取代的苯基或萘基(即，未被取代的超出cart部分)。在实施例中，环a为被取代的芳基(即，除cart部分以外被取代)。在实施例中，环a为被取代的苯基(即，除cart部分以外被取代)。在实施例中，环a为被取代的苯基或萘基(即，除cart部分以外被取代)。
[0254]
在实施例中，细胞穿透复合物具有可检测试剂(例如，荧光团)。
[0255]
在实施例中，r
1a
为经甲氧基连接子取代的芳基。在实施例中，r
1a
为经连接子取代的芳基(例如，
‑
ch2‑
o
‑
)。r
1a
为经甲氧基连接子取代的芳基的非限制性实例具有下式：
[0256]
在一些实施例中，阳离子两性聚合物具有式(ix)：
[0257][0258]
在一些实施例中，阳离子两性聚合物具有式(x)：
[0259][0260]
在一些实施例中，阳离子两性聚合物可以具有式(xi)：
[0261][0262]
其中cart1、cart2和cart3独立地为如式(viii)中定义的cart部分(例如，
‑
l1‑
[(lp1)
z1
‑
(im)
z2
‑
(lp2)
z3
]
z4
‑
l2‑
r
2a
)。在实施例中，每一cart部分任选地不同。
[0263]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0264][0265][0266]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0267]
在实施例中，阳离子两性聚合物
具有下式：在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0268]
在实施例中，环a经可检测试剂经由连接子取代(例如，一键、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基)。
[0269]
在一些实施例中，细胞穿透复合物具有含有前式中的任一种的阳离子两性聚合物，其中l1为
‑
ch2‑
o
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基。在实施例中，l1为
‑
ch2‑
o
‑
。
[0270]
在一些实施例中，阳离子两性聚合物可以具有前式中的任一种，其中l1为
‑
ch2‑
o
‑
、在实施例中，l1为
‑
ch2‑
o
‑
。在实
施例中，l1为在实施例中，l1为在实施例中，l1为
[0271]
在一些实施例中，阳离子两性聚合物可以具有前式中的任一种，其中z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不为0且z4为1到100的整数。在一些实施例中，z1、z3和z4可以独立地为以下范围内的整数：2
‑
100、2
‑
90、2
‑
80、2
‑
70、2
‑
60、2
‑
50、2
‑
40、2
‑
30、2
‑
2或2
‑
10，其中z1或z3中的至少一种不为0。在实施例中，z1、z3和z4可以独立地为2到100或2到50范围内的整数，其中z1或z3中的至少一种不为0。
[0272]
在实施例中，z1为0到100的整数。在实施例中，z1为0到90的整数。在实施例中，z1为0到80的整数。在实施例中，z1为0到70的整数。在实施例中，z1为0到60的整数。在实施例中，z1为0到50的整数。在实施例中，z1为0到40的整数。在实施例中，z1为0到30的整数。在实施例中，z1为0到20的整数。在实施例中，z1为0到10的整数。在实施例中，z1为5到100的整数。在实施例中，z1为15到100的整数。在实施例中，z1为25到100的整数。在实施例中，z1为35到100的整数。在实施例中，z1为45到100的整数。在实施例中，z1为55到100的整数。在实施例中，z1为65到100的整数。在实施例中，z1为75到100的整数。在实施例中，z1为85到100的整数。在实施例中，z1为95到100的整数。在实施例中，z1为0。在实施例中，z1为1。在实施例中，z1为2。在实施例中，z1为3。在实施例中，z1为4。在实施例中，z1为5。在实施例中，z1为6。在实施例中，z1为7。在实施例中，z1为8。在实施例中，z1为9。在实施例中，z1为10。在实施例中，z1为11。在实施例中，z1为12。在实施例中，z1为13。在实施例中，z1为14。在实施例中，z1为15。在实施例中，z1为16。在实施例中，z1为17。在实施例中，z1为18。在实施例中，z1为19。在实施例中，z1为20。在实施例中，z1为21。在实施例中，z1为22。在实施例中，z1为23。在实施例中，z1为24。在实施例中，z1为25。在实施例中，z1为26。在实施例中，z1为27。在实施例中，z1为28。在实施例中，z1为29。在实施例中，z1为30。在实施例中，z1为31。在实施例中，z1为32。在实施例中，z1为33。在实施例中，z1为34。在实施例中，z1为35。在实施例中，z1为36。在实施例中，z1为37。在实施例中，z1为38。在实施例中，z1为39。在实施例中，z1为40。在实施例中，z1为41。在实施例中，z1为42。在实施例中，z1为43。在实施例中，z1为44。在实施例中，z1为45。在实施例中，z1为46。在实施例中，z1为47。在实施例中，z1为48。在实施例中，z1为49。在实施例中，z1为50。在实施例中，z1为51。在实施例中，z1为52。在实施例中，z1为53。在实施例中，z1为54。在实施例中，z1为55。在实施例中，z1为56。在实施例中，z1为57。在实施例中，z1为58。在实施例中，z1为59。在实施例中，z1为60。在实施例中，z1为61。在实施例中，z1为62。在实施例中，z1为63。在实施例中，z1为64。在实施例中，z1为65。在实施例中，z1为66。在实施例中，z1为67。在实施例中，z1为68。在实施例中，z1为69。在实施例中，z1为70。在实施例中，z1为71。在实施例中，z1为72。在实施例中，z1为73。在实施例中，z1为74。在实施例中，z1为75。在实施例中，z1为76。在实施例中，z1为77。在实施例中，z1为78。在实施例中，z1为79。在实施例中，z1为80。在实施例中，z1为81。在实施例中，z1为82。在实施例中，z1为83。在实施例中，z1为84。在实施例中，z1为85。在实施例中，z1为86。在实施例中，z1为
87。在实施例中，z1为88。在实施例中，z1为89。在实施例中，z1为90。在实施例中，z1为91。在实施例中，z1为92。在实施例中，z1为93。在实施例中，z1为94。在实施例中，z1为95。在实施例中，z1为96。在实施例中，z1为97。在实施例中，z1为98。在实施例中，z1为99。在实施例中，z1为100。
[0273]
在实施例中，z3为0到100的整数。在实施例中，z3为0到90的整数。在实施例中，z3为0到80的整数。在实施例中，z3为0到70的整数。在实施例中，z3为0到60的整数。在实施例中，z3为0到50的整数。在实施例中，z3为0到40的整数。在实施例中，z3为0到30的整数。在实施例中，z3为0到20的整数。在实施例中，z3为0到10的整数。在实施例中，z3为5到100的整数。在实施例中，z3为15到100的整数。在实施例中，z3为25到100的整数。在实施例中，z3为35到100的整数。在实施例中，z3为45到100的整数。在实施例中，z3为55到100的整数。在实施例中，z3为65到100的整数。在实施例中，z3为75到100的整数。在实施例中，z3为85到100的整数。在实施例中，z3为95到100的整数。在实施例中，z3为0。在实施例中，z3为1。在实施例中，z3为2。在实施例中，z3为3。在实施例中，z3为4。在实施例中，z3为5。在实施例中，z3为6。在实施例中，z3为7。在实施例中，z3为8。在实施例中，z3为9。在实施例中，z3为10。在实施例中，z3为11。在实施例中，z3为12。在实施例中，z3为13。在实施例中，z3为14。在实施例中，z3为15。在实施例中，z3为16。在实施例中，z3为17。在实施例中，z3为18。在实施例中，z3为19。在实施例中，z3为20。在实施例中，z3为21。在实施例中，z3为22。在实施例中，z3为23。在实施例中，z3为24。在实施例中，z3为25。在实施例中，z3为26。在实施例中，z3为27。在实施例中，z3为28。在实施例中，z3为29。在实施例中，z3为30。在实施例中，z3为31。在实施例中，z3为32。在实施例中，z3为33。在实施例中，z3为34。在实施例中，z3为35。在实施例中，z3为36。在实施例中，z3为37。在实施例中，z3为38。在实施例中，z3为39。在实施例中，z3为40。在实施例中，z3为41。在实施例中，z3为42。在实施例中，z3为43。在实施例中，z3为44。在实施例中，z3为45。在实施例中，z3为46。在实施例中，z3为47。在实施例中，z3为48。在实施例中，z3为49。在实施例中，z3为50。在实施例中，z3为51。在实施例中，z3为52。在实施例中，z3为53。在实施例中，z3为54。在实施例中，z3为55。在实施例中，z3为56。在实施例中，z3为57。在实施例中，z3为58。在实施例中，z3为59。在实施例中，z3为60。在实施例中，z3为61。在实施例中，z3为62。在实施例中，z3为63。在实施例中，z3为64。在实施例中，z3为65。在实施例中，z3为66。在实施例中，z3为67。在实施例中，z3为68。在实施例中，z3为69。在实施例中，z3为70。在实施例中，z3为71。在实施例中，z3为72。在实施例中，z3为73。在实施例中，z3为74。在实施例中，z3为75。在实施例中，z3为76。在实施例中，z3为77。在实施例中，z3为78。在实施例中，z3为79。在实施例中，z3为80。在实施例中，z3为81。在实施例中，z3为82。在实施例中，z3为83。在实施例中，z3为84。在实施例中，z3为85。在实施例中，z3为86。在实施例中，z3为87。在实施例中，z3为88。在实施例中，z3为89。在实施例中，z3为90。在实施例中，z3为91。在实施例中，z3为92。在实施例中，z3为93。在实施例中，z3为94。在实施例中，z3为95。在实施例中，z3为96。在实施例中，z3为97。在实施例中，z3为98。在实施例中，z3为99。在实施例中，z3为100。
[0274]
在实施例中，z4为1到100的整数。在实施例中，z4为1到90的整数。在实施例中，z4为1到80的整数。在实施例中，z4为1到70的整数。在实施例中，z4为1到60的整数。在实施例中，z4为1到50的整数。在实施例中，z4为1到40的整数。在实施例中，z4为1到30的整数。在实
施例中，z4为1到20的整数。在实施例中，z4为1到10的整数。在实施例中，z4为5到100的整数。在实施例中，z4为15到100的整数。在实施例中，z4为25到100的整数。在实施例中，z4为35到100的整数。在实施例中，z4为45到100的整数。在实施例中，z4为55到100的整数。在实施例中，z4为65到100的整数。在实施例中，z4为75到100的整数。在实施例中，z4为85到100的整数。在实施例中，z4为95到100的整数。在实施例中，z4为1。在实施例中，z4为2。在实施例中，z4为3。在实施例中，z4为4。在实施例中，z4为5。在实施例中，z4为6。在实施例中，z4为7。在实施例中，z4为8。在实施例中，z4为9。在实施例中，z4为10。在实施例中，z4为11。在实施例中，z4为12。在实施例中，z4为13。在实施例中，z4为14。在实施例中，z4为15。在实施例中，z4为16。在实施例中，z4为17。在实施例中，z4为18。在实施例中，z4为19。在实施例中，z4为20。在实施例中，z4为21。在实施例中，z4为22。在实施例中，z4为23。在实施例中，z4为24。在实施例中，z4为25。在实施例中，z4为26。在实施例中，z4为27。在实施例中，z4为28。在实施例中，z4为29。在实施例中，z4为30。在实施例中，z4为31。在实施例中，z4为32。在实施例中，z4为33。在实施例中，z4为34。在实施例中，z4为35。在实施例中，z4为36。在实施例中，z4为37。在实施例中，z4为38。在实施例中，z4为39。在实施例中，z4为40。在实施例中，z4为41。在实施例中，z4为42。在实施例中，z4为43。在实施例中，z4为44。在实施例中，z4为45。在实施例中，z4为46。在实施例中，z4为47。在实施例中，z4为48。在实施例中，z4为49。在实施例中，z4为50。在实施例中，z4为51。在实施例中，z4为52。在实施例中，z4为53。在实施例中，z4为54。在实施例中，z4为55。在实施例中，z4为56。在实施例中，z4为57。在实施例中，z4为58。在实施例中，z4为59。在实施例中，z4为60。在实施例中，z4为61。在实施例中，z4为62。在实施例中，z4为63。在实施例中，z4为64。在实施例中，z4为65。在实施例中，z4为66。在实施例中，z4为67。在实施例中，z4为68。在实施例中，z4为69。在实施例中，z4为70。在实施例中，z4为71。在实施例中，z4为72。在实施例中，z4为73。在实施例中，z4为74。在实施例中，z4为75。在实施例中，z4为76。在实施例中，z4为77。在实施例中，z4为78。在实施例中，z4为79。在实施例中，z4为80。在实施例中，z4为81。在实施例中，z4为82。在实施例中，z4为83。在实施例中，z4为84。在实施例中，z4为85。在实施例中，z4为86。在实施例中，z4为87。在实施例中，z4为88。在实施例中，z4为89。在实施例中，z4为90。在实施例中，z4为91。在实施例中，z4为92。在实施例中，z4为93。在实施例中，z4为94。在实施例中，z4为95。在实施例中，z4为96。在实施例中，z4为97。在实施例中，z4为98。在实施例中，z4为99。在实施例中，z4为100。
[0275]
在实施例中，n为2到100的整数。在实施例中，n为2到90的整数。在实施例中，n为2到80的整数。在实施例中，n为2到70的整数。在实施例中，n为2到60的整数。在实施例中，n为2到50的整数。在实施例中，n为2到40的整数。在实施例中，n为2到30的整数。在实施例中，n为2到20的整数。在实施例中，n为2到10的整数。在实施例中，n为5到100的整数。在实施例中，n为15到100的整数。在实施例中，n为25到100的整数。在实施例中，n为35到100的整数。在实施例中，n为45到100的整数。在实施例中，n为55到100的整数。在实施例中，n为65到100的整数。在实施例中，n为75到100的整数。在实施例中，n为85到100的整数。在实施例中，n为95到100的整数。在实施例中，n为2。在实施例中，n为3。在实施例中，n为4。在实施例中，n为5。在实施例中，n为6。在实施例中，n为7。在实施例中，n为8。在实施例中，n为9。在实施例中，n为10。在实施例中，n为11。在实施例中，n为12。在实施例中，n为13。在实施例中，n为14。在实施例中，n为15。在实施例中，n为16。在实施例中，n为17。在实施例中，n为18。在实施例中，
n为19。在实施例中，n为20。在实施例中，n为21。在实施例中，n为22。在实施例中，n为23。在实施例中，n为24。在实施例中，n为25。在实施例中，n为26。在实施例中，n为27。在实施例中，n为28。在实施例中，n为29。在实施例中，n为30。在实施例中，n为31。在实施例中，n为32。在实施例中，n为33。在实施例中，n为34。在实施例中，n为35。在实施例中，n为36。在实施例中，n为37。在实施例中，n为38。在实施例中，n为39。在实施例中，n为40。在实施例中，n为41。在实施例中，n为42。在实施例中，n为43。在实施例中，n为44。在实施例中，n为45。在实施例中，n为46。在实施例中，n为47。在实施例中，n为48。在实施例中，n为49。在实施例中，n为50。在实施例中，n为51。在实施例中，n为52。在实施例中，n为53。在实施例中，n为54。在实施例中，n为55。在实施例中，n为56。在实施例中，n为57。在实施例中，n为58。在实施例中，n为59。在实施例中，n为60。在实施例中，n为61。在实施例中，n为62。在实施例中，n为63。在实施例中，n为64。在实施例中，n为65。在实施例中，n为66。在实施例中，n为67。在实施例中，n为68。在实施例中，n为69。在实施例中，n为70。在实施例中，n为71。在实施例中，n为72。在实施例中，n为73。在实施例中，n为74。在实施例中，n为75。在实施例中，n为76。在实施例中，n为77。在实施例中，n为78。在实施例中，n为79。在实施例中，n为80。在实施例中，n为81。在实施例中，n为82。在实施例中，n为83。在实施例中，n为84。在实施例中，n为85。在实施例中，n为86。在实施例中，n为87。在实施例中，n为88。在实施例中，n为89。在实施例中，n为90。在实施例中，n为91。在实施例中，n为92。在实施例中，n为93。在实施例中，n为94。在实施例中，n为95。在实施例中，n为96。在实施例中，n为97。在实施例中，n为98。在实施例中，n为99。在实施例中，n为100。
[0276]
在实施例中，n1为0到50的整数。在实施例中，n1为2到45的整数。在实施例中，n1为0到40的整数。在实施例中，n1为0到30的整数。在实施例中，n1为0到20的整数。在实施例中，n1为0到10的整数。在实施例中，n1为5到50的整数。在实施例中，n1为15到50的整数。在实施例中，n1为25到50的整数。在实施例中，n1为35到50的整数。在实施例中，n1为45到50的整数。在实施例中，n1为0。在实施例中，n1为1。在实施例中，n1为2。在实施例中，n1为3。在实施例中，n1为4。在实施例中，n1为5。在实施例中，n1为6。在实施例中，n1为7。在实施例中，n1为8。在实施例中，n1为9。在实施例中，n1为10。在实施例中，n1为11。在实施例中，n1为12。在实施例中，n1为13。在实施例中，n1为14。在实施例中，n1为15。在实施例中，n1为16。在实施例中，n1为17。在实施例中，n1为18。在实施例中，n1为19。在实施例中，n1为20。在实施例中，n1为21。在实施例中，n1为22。在实施例中，n1为23。在实施例中，n1为24。在实施例中，n1为25。在实施例中，n1为26。在实施例中，n1为27。在实施例中，n1为28。在实施例中，n1为29。在实施例中，n1为30。在实施例中，n1为31。在实施例中，n1为32。在实施例中，n1为33。在实施例中，n1为34。在实施例中，n1为35。在实施例中，n1为36。在实施例中，n1为37。在实施例中，n1为38。在实施例中，n1为39。在实施例中，n1为40。在实施例中，n1为41。在实施例中，n1为42。在实施例中，n1为43。在实施例中，n1为44。在实施例中，n1为45。在实施例中，n1为46。在实施例中，n1为47。在实施例中，n1为48。在实施例中，n1为49。在实施例中，n1为50。
[0277]
在实施例中，n为1到100的整数。在实施例中，n为1到90的整数。在实施例中，n为1到80的整数。在实施例中，n为1到70的整数。在实施例中，n为1到60的整数。在实施例中，n为1到50的整数。在实施例中，n为1到40的整数。在实施例中，n为1到30的整数。在实施例中，n为1到20的整数。在实施例中，n为1到10的整数。在实施例中，n为5到100的整数。在实施例
中，n为15到100的整数。在实施例中，n为25到100的整数。在实施例中，n为35到100的整数。在实施例中，n为45到100的整数。在实施例中，n为55到100的整数。在实施例中，n为65到100的整数。在实施例中，n为75到100的整数。在实施例中，n为85到100的整数。在实施例中，n为95到100的整数。在实施例中，n2为1。在实施例中，n2为2。在实施例中，n2为3。在实施例中，n2为4。在实施例中，n2为5。在实施例中，n2为6。在实施例中，n2为7。在实施例中，n2为8。在实施例中，n2为9。在实施例中，n2为10。在实施例中，n2为11。在实施例中，n2为12。在实施例中，n2为13。在实施例中，n2为14。在实施例中，n2为15。在实施例中，n2为16。在实施例中，n2为17。在实施例中，n2为18。在实施例中，n2为19。在实施例中，n2为20。在实施例中，n2为21。在实施例中，n2为22。在实施例中，n2为23。在实施例中，n2为24。在实施例中，n2为25。在实施例中，n2为26。在实施例中，n2为27。在实施例中，n2为28。在实施例中，n2为29。在实施例中，n2为30。在实施例中，n2为31。在实施例中，n2为32。在实施例中，n2为33。在实施例中，n2为34。在实施例中，n2为35。在实施例中，n2为36。在实施例中，n2为37。在实施例中，n2为38。在实施例中，n2为39。在实施例中，n2为40。在实施例中，n2为41。在实施例中，n2为42。在实施例中，n2为43。在实施例中，n2为44。在实施例中，n2为45。在实施例中，n2为46。在实施例中，n2为47。在实施例中，n2为48。在实施例中，n2为49。在实施例中，n2为50。在实施例中，n2为51。在实施例中，n2为52。在实施例中，n2为53。在实施例中，n2为54。在实施例中，n2为55。在实施例中，n2为56。在实施例中，n2为57。在实施例中，n2为58。在实施例中，n2为59。在实施例中，n2为60。在实施例中，n2为61。在实施例中，n2为62。在实施例中，n2为63。在实施例中，n2为64。在实施例中，n2为65。在实施例中，n2为66。在实施例中，n2为67。在实施例中，n2为68。在实施例中，n2为69。在实施例中，n2为70。在实施例中，n2为71。在实施例中，n2为72。在实施例中，n2为73。在实施例中，n2为74。在实施例中，n2为75。在实施例中，n2为76。在实施例中，n2为77。在实施例中，n2为78。在实施例中，n2为79。在实施例中，n2为80。在实施例中，n2为81。在实施例中，n2为82。在实施例中，n2为83。在实施例中，n2为84。在实施例中，n2为85。在实施例中，n2为86。在实施例中，n2为87。在实施例中，n2为88。在实施例中，n2为89。在实施例中，n2为90。在实施例中，n2为91。在实施例中，n2为92。在实施例中，n2为93。在实施例中，n2为94。在实施例中，n2为95。在实施例中，n2为96。在实施例中，n2为97。在实施例中，n2为98。在实施例中，n2为99。在实施例中，n2为100。
[0278]
在实施例中，z2为2到100的整数。在实施例中，z2为2到90的整数。在实施例中，z2为2到80的整数。在实施例中，z2为2到70的整数。在实施例中，z2为2到60的整数。在实施例中，z2为2到50的整数。在实施例中，z2为2到40的整数。在实施例中，z2为2到30的整数。在实施例中，z2为2到20的整数。在实施例中，z2为2到10的整数。在实施例中，z2为5到100的整数。在实施例中，z2为15到100的整数。在实施例中，z2为25到100的整数。在实施例中，z2为35到100的整数。在实施例中，z2为45到100的整数。在实施例中，z2为55到100的整数。在实施例中，z2为65到100的整数。在实施例中，z2为75到100的整数。在实施例中，z2为85到100的整数。在实施例中，z2为95到100的整数。在实施例中，z2为2。在实施例中，z2为3。在实施例中，z2为4。在实施例中，z2为5。在实施例中，z2为6。在实施例中，z2为7。在实施例中，z2为8。在实施例中，z2为9。在实施例中，z2为10。在实施例中，z2为11。在实施例中，z2为12。在实施例中，z2为13。在实施例中，z2为14。在实施例中，z2为15。在实施例中，z2为16。在实施例中，z2为17。在实施例中，z2为18。在实施例中，z2为19。在实施例中，z2为20。在实施例中，z2
为21。在实施例中，z2为22。在实施例中，z2为23。在实施例中，z2为24。在实施例中，z2为25。在实施例中，z2为26。在实施例中，z2为27。在实施例中，z2为28。在实施例中，z2为29。在实施例中，z2为30。在实施例中，z2为31。在实施例中，z2为32。在实施例中，z2为33。在实施例中，z2为34。在实施例中，z2为35。在实施例中，z2为36。在实施例中，z2为37。在实施例中，z2为38。在实施例中，z2为39。在实施例中，z2为40。在实施例中，z2为41。在实施例中，z2为42。在实施例中，z2为43。在实施例中，z2为44。在实施例中，z2为45。在实施例中，z2为46。在实施例中，z2为47。在实施例中，z2为48。在实施例中，z2为49。在实施例中，z2为50。在实施例中，z2为51。在实施例中，z2为52。在实施例中，z2为53。在实施例中，z2为54。在实施例中，z2为55。在实施例中，z2为56。在实施例中，z2为57。在实施例中，z2为58。在实施例中，z2为59。在实施例中，z2为60。在实施例中，z2为61。在实施例中，z2为62。在实施例中，z2为63。在实施例中，z2为64。在实施例中，z2为65。在实施例中，z2为66。在实施例中，z2为67。在实施例中，z2为68。在实施例中，z2为69。在实施例中，z2为70。在实施例中，z2为71。在实施例中，z2为72。在实施例中，z2为73。在实施例中，z2为74。在实施例中，z2为75。在实施例中，z2为76。在实施例中，z2为77。在实施例中，z2为78。在实施例中，z2为79。在实施例中，z2为80。在实施例中，z2为81。在实施例中，z2为82。在实施例中，z2为83。在实施例中，z2为84。在实施例中，z2为85。在实施例中，z2为86。在实施例中，z2为87。在实施例中，z2为88。在实施例中，z2为89。在实施例中，z2为90。在实施例中，z2为91。在实施例中，z2为92。在实施例中，z2为93。在实施例中，z2为94。在实施例中，z2为95。在实施例中，z2为96。在实施例中，z2为97。在实施例中，z2为98。在实施例中，z2为99。在实施例中，z2为100。
[0279]
在实施例中，z5为1。在实施例中，z5为2。在实施例中，z5为3。在实施例中，z5为4。在实施例中，z5为5。在实施例中，z5为6。在实施例中，z5为7。在实施例中，z5为8。在实施例中，z5为9。在实施例中，z5为10。
[0280]
在一些实施例中，阳离子两性聚合物可以具有前式中的任一种，其中z2为2到100的整数。在一些实施例中，z2可以是以下范围内的整数：2到100、2
‑
90、2到80、2到70、2到60、2到50、2到40、2到30、2到20或2到10。在实施例中，z2可以是以下范围内的整数：2到100或2到50。
[0281]
在一些实施例中，阳离子两性聚合物可以具有前式中的任一种，其中z5为1到3的整数。在一些其它实施例中，z5为1或3。在又一些其它实施例中，z5为1。在一些又其它实施例中，z5为3。
[0282]
在一些实施例中，阳离子两性聚合物可以具有前式中的任一种，其中r2为氢。
[0283]
在一些实施例中，阳离子两性聚合物可以具有前式中的任一种，其中l2为一键。
[0284]
在实施例中，cart具有式：
[0285]
[0286]
[0287][0288]
在一些实施例中，ph敏感分解域可以具有式：其中n为2或更大的整数；n1为0到50的整数；x1为一键、
‑
o
‑
、
‑
nr5‑
、
‑
c(r5)(r6)
‑
或
‑
c(r5)(r6)
‑
c(r7)(r8)
‑
；x2为一键、
‑
o
‑
、
‑
c(r9)(r
10
)
‑
或
‑
c(r9)(r
10
)
‑
c(r
11
)(r
12
)
‑
；x4为一键、
‑
c(o)
‑
、
‑
p(o)(or
16
)2‑
、
‑
s(o)(or
17
)2‑
、
‑
c(r
16
)(r
17
)
‑
或
‑
c(r
16
)(r
17
)
‑
c(r
18
)(r
19
)
‑
；x5为亲核部分；且r1、r2、r5、r6、r7、r8、r9、r
10
、r
11
、r
12
、r
16
、r
17
、r
18
和r
19
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0289]
在一些实施例中，在具有前述式中的任一种的ph敏感分解域中，z为
‑
s
‑
、
‑
s
+
r
13
‑
、
‑
nr
13
‑
或
‑
n
+
(r
13
)(h)
‑
，其中r
13
为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0290]
在一些实施例中，在具有前述式中的任一种的ph敏感分解域中，z为
‑
s
‑
、
‑
s
+
r
13
‑
、
‑
nr
13
‑
或
‑
n
+
(r
13
)(h)
‑
，其中r
13
为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0291]
在一些实施例中，ph敏感分解域可以具有下式中的一种：在本文所公开和其实施例的细胞穿透复合物的实施例中，ph敏感分解域具有以下式(iv)的结构：
[0292][0293]
在一些实施例中，亲脂性聚合物域，或可互换地称为亲脂性聚合物域，可以具有r基团的以下变型中的一个：
[0294][0295]
除本文所公开和其实施例的细胞穿透复合物以外，在实施例中，核酸可以是dna或rna，如信使rna(mrna)、小分子干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微rna(mirna)、导向rna(grna)、crispr rna(crrna)、转录活化rna(tracrrna)、质粒dna(pdna)、微环dna、基因组dna(gnda)。细胞穿透复合物可以进一步包括蛋白质或肽。
[0296]
除本文所公开和其实施例的细胞穿透复合物以外，在实施例中，细胞穿透复合物进一步包括多个亲脂性部分。
[0297]
除本文所公开和其实施例的细胞穿透复合物以外，在实施例中，细胞穿透复合物进一步包括多个分解域。
[0298]
除本文所公开和其实施例的细胞穿透复合物以外，在实施例中，相对离子与以上阳离子序列可以包括所属领域中已知的共同平衡离子，例如乙酸根、三氟乙酸根、三氟甲磺酸根、氯离子、溴离子、硫酸根、磷酸根、丁二酸根或柠檬酸根。在实施例中，相对离子为乙酸根、三氟乙酸根、三氟甲磺酸根、氯离子、溴离子、硫酸根、磷酸根、丁二酸根或柠檬酸根。
[0299]
转染
[0300]
在另一方面，提供一种将核酸转染到细胞中的方法，所述方法包括使细胞与本文所公开的细胞穿透复合物或其实施例接触。
[0301]
在实施例中，所述方法进一步包括使阳离子两性聚合物在细胞内降解，从而形成降解产物。在实施例中，降解产物为被取代或未被取代的二酮哌嗪。
[0302]
除将核酸转染到细胞中的方法的任何实施例以外，在实施例中，核酸为mrna。在实施例中，所述方法进一步包括使mrna在细胞中表达。在实施例中，所述细胞形成生物体的一部分。在实施例中，所述生物体为人类。
[0303]
本文尤其提供新颖材料和策略，其实现或增强寡核苷酸和聚阴离子货物(例如信使rna(mrna))体外和体内复合、保护、递送和释放到目标细胞、组织和器官中。
[0304]
举例来说，使用生物可降解的聚(碳酸酯
‑
共
‑
氨基酯)寡聚物和其变化形式(发现静电络合聚阴离子(如mrna))，产生保护mrna货物、易于进入细胞且唯一地释放寡核苷酸货物的非共价大分子粒子实现本文中所公开的mrna递送的一种策略。细胞中释放的mrna随后通过细胞过程转化为肽和蛋白质，所述肽和蛋白质的序列和因此活性由mrna序列确定。
[0305]
因此，提供例如相比于使用核酸本身和已知基因递送载体，极大地提高细胞转染效率。用于递送mrna的材料和策略还可以用于递送其它寡核苷酸，如sirna、pdna、shrna和gdna。其可以另外用于递送其它阴离子生物分子，如肝素、无机多磷酸根和肌醇多磷酸根(例如，ip3、ip7、ip8)。这种递送可以通过多种人类和非人类细胞系以及通过包括但不限于以下的体内多种投与模式实现：肌肉内、静脉内、腹膜内、眼内、鼻内、皮下、经颊和局部。本文所公开的聚(碳酸酯
‑
共
‑
氨基酯)可以例如用作用于生物医学疗法、成像和装置中的应用的可定制、可生物降解、生物相容性材料。与生物可降解无毒化合物材料(如戊内酯、己内酯、丙交酯和环碳酸酯)的共聚允许调谐物理和生物特性，包括货物释放速率、疏水性、靶向配体的并入、生物分布和毒性。
[0306]
因此，在一些实施例中，本文所提供的药剂包括可以衍生自环状氨基
‑
酯和环状甲基三亚甲基碳酸酯(mtc)单体的寡聚物、聚合物、共寡聚物和共聚物。环状氨基
‑
酯具有吗啉
‑2‑
酮和其同系物的基底结构，其中可能包括以下的多种取代模式。
[0307]
(1)与以下的n
‑
酰化：多种疏水基团(例如，r＝烷基、烯基、芳基、包括类固醇的多环、杂环)、阳离子基团(例如，铵、鏻、锍、胍，包括用氨基酸(如甘氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸)酰化)、阴离子基团(例如，羧酸根、硫酸根、磷酸根)或亲水性(例如，peg)氨基甲酸根。用n
‑
boc或n
‑
cbz基团保护吗啉氮，接着有机催化开环寡聚或聚合可以在去保护阳离子聚合物或寡聚物主链后获得。
[0308]
(2)具有前述可能官能团的紧邻酯羰基的α
‑
烷基化或官能化被选择以使货物复合和随后通过生物降解的货物释放。
[0309]
(3)邻近吗啉氮的烷基化具有前述官能团。
[0310]
(4)以上修改的组合。
[0311]
另外，可以通过以下方式制备共聚物或共寡聚物(嵌段或统计)：混合两种或更多种吗啉
‑2‑
酮单体，或通过一种或多种吗啉
‑2‑
酮单体与本文所述的一种或多种环状碳酸酯单体的共聚(或共寡聚)。这些碳酸酯单体可以并有类似多种侧链官能团，尤其亲脂性基团或阳离子基团，以调节寡核苷酸稳定性、递送和释放特性。此外，可以使用多种其它市售环状酯单体，包括但不限于丙交酯、乙交酯、戊内酯和/或己内酯以并入亲脂性官能团。经由吗
啉
‑2‑
酮和环状碳酸酯单体的开环聚合和/或共聚达成聚氨基酯和聚(碳酸酯
‑
共
‑
氨基酯)的合成。使用有机催化系统使受n
‑
boc保护的吗啉酮(mboc)聚合到较高转化率(>85％)、可调谐mn(1kda
‑
20kda)和低分子量分布(mw/mn
‑
1.1
‑
1.3)。boc基团的后聚合去保护提供阳离子(二质子酸，仲胺)水溶性聚合物(
‑‑
0.5m于d20中，稳定>3天)。此外，使mboc与mtc
‑
十二烷基碳酸酯单体的共聚，接着去保护，得到较高产率(>60％)及较窄多分散性<1.4pdi)和可调谐嵌段长度的适度带电阳离子材料。通过引发剂与单体的比率控制嵌段长度。
[0312]
聚氨基酯和聚(碳酸酯
‑
共
‑
氨基酯)为生物相容性和生物可降解的。阳离子聚氨基酯通过新颖的ph依赖性和缓冲液依赖性分解机制快速降解，得到在一个实施例中的双
‑
n
‑
羟基乙基
‑
2,5
‑
哌嗪二酮双
‑
羟基乙基甘氨酸。此未预见的降解产生在处理浓度下无毒的产物，且单体形式(进一步水解的预期产物)为用于梅纳反应中的磷脂改性的天然生物标记。氨基酯/碳酸酯共聚物的碳酸酯片段经由水解和去羧基降解，且其副产物先前已显示为无毒的。归因于其独特的降解机制，新的聚及寡聚(碳酸酯
‑
共
‑
氨基酯)展现出作为基因递送剂的未预期性能。这些新材料非共价络合、保护、递送和释放在中等理论电荷比下的mrna(例如，约10:1)，从而在体外和体内产生异常转染效率(在一些情况下>99％)和稳固诱导基因表达。这策略对于不同长度的mrna分子(所测试的1000和2000核苷酸转录物)的递送有效。在一个实施例中，通过用阴离子货物来调配阳离子聚(碳酸酯
‑
共
‑
氨基酯)以形成大小为200
‑
400nm的自组装粒子来实现基因递送。这些粒子在细胞内基因递送所需的时间标度上是稳定的，且随后其在细胞内部后释放寡核苷酸货物一次。虽然不受任何特定理论束缚，但这些材料降解为双
‑
n
‑
羟基乙基1
‑
2,5
‑
哌嗪二酮产物双
‑
羟基乙基甘氨酸。用mrna/两性复合物处理多种人类和非人类细胞系(例如，hela、hacat、j774、hek293)引起通过多种投与模式(肌肉内和静脉内测试)在体外和体内诱导蛋白质表达(例如，gfp、萤光素酶)。
[0313]
已通过流式细胞测量术和荧光显微法(gfp)以及生物发光(萤火虫萤光素酶)使用编码mrna的萤光报导基因的mrna测量蛋白质表达。聚(碳酸酯
‑
共
‑
氨基酯)已经表现出比商业标准脂染胺2000更有效的转染剂，以及此前针对sirna递送描述的许多其它先导化合物。
[0314]
在实施例中，通过在存在经选择以调节所得复合物的稳定性和大小，增加细胞摄取，调节mrna从复合物释放速率，且增强货物mrna的表达的第三组分的情况下用mrna货物调配混合的两性寡聚物来实现基因递送。第三组分包括但不限于配位金属，如zn
+2
、mg
+2
、ca
+2
等；动态非共价交联剂，如碳水化合物、平衡离子，如cl
‑
、aco
‑
、丁二酸根和柠檬酸根；以及溶解性调节剂，如脂质和peg。
[0315]
此技术的应用可以包括：临床应用：(1a)核酸转染载体：尽管已提议利用dna和rna治疗遗传疾病许多年，但临床上使用基因疗法的最大障碍仍为寡核苷酸货物的有效递送。(1b)rna接种以预防传染病：mrna类疫苗呈现出比dna疫苗更强的安全性优势，然而，其在临床上当前受mrna递送到细胞中的限制。目前在临床上研究本技术，但最先进的技术需要从患者中去除原代细胞以进行体外转染，接着将经转型细胞随后再引入到患者中。此方法可以使用我们的递送技术得以显著地改进以直接诱导体内mrna表达。(1c)干细胞诱导：可以在未分化干细胞中通过使用我们的技术诱导4种已知转录因子的表达来诱导多能性。聚(碳酸酯
‑
共
‑
氨基酯)递送媒剂的模块化性质使得能够同时便利地递送所有四种必要mrna转录物。(1)基本研究应用包括但不限于：经培养细胞的体外转染、使用crispr/cas9的基因编辑、使用组合基因表达(mrna翻译)和基因敲落(rnai)的途径验证。癌症免疫疗法、过敏耐受
性、蛋白质替代疗法、基因编辑、诊断、
[0316]
本发明所公开的复合物、组合物和方法的优点可以包括例如：
[0317]
(1)与可商购的转染剂(如脂染胺2000)相比更高的体外mrna转染效率，甚至在难以转染的细胞系(如j774巨噬细胞)中，由此改进功效，同时增加可耐受性。
[0318]
(2)体内稳固的基因表达(balb/c小鼠)，表明这种技术的临床适用性，由此避免阳离子载剂(如脂染胺)的毒性且提供基因递送和表达的离体方法的临床替代方案。
[0319]
(3)可以使用不同投与途径实现不同的体内基因表达，其中在静脉内注射后肝脏和脾脏表达占优势，而局部表达在用肌肉内(例如)递送的投与部位处维持。鼻递送提供到粘膜和/或肺摄取的途径。
[0320]
(4)实现有效的基因表达的已知代谢物(双
‑
羟基乙基甘氨酸)的快速降解
[0321]
(5)以ph依赖性方式释放mrna，如使用承载寡核苷酸的粒子在低ph环境(例如皮肤或肠道)中显示出稳定性，但在较高ph环境中降解。
[0322]
(6)材料易于经由不含金属的合成获得，以制备具有目标分子量和对分散度的高度控制的寡聚物、聚合物或嵌段/统计共聚物或共寡聚物。
[0323]
(7)材料能够通过将靶向配体(如叶酸或生物素)添加到所形成的粒子的表面或通过连接到单克隆抗体来靶向。
[0324]
(8)阳离子聚氨基酯域对可分离的中性小分子的特定分解机制使得形成生物相容性/生物可降解产物，双
‑
n
‑
羟基乙基1
‑
2,5
‑
哌嗪二酮，羟基乙基甘氨酸的环状二聚体。
[0325]
复合物、组合物和方法的特征包括以下。在实施例中，聚(碳酸酯
‑
共
‑
氨基酯)聚(氨基酯)和其衍生的阳离子材料，其可以展现出以下特性和功能中的至少一个：
[0326]
(1)产生生物相容性/生物可降解的羟基乙基甘氨酸二聚体的阳离子聚氨基酯的特定的ph反应性分解机制；产生寡核苷酸货物的释放的这些材料的域甚至在其它反应性生物材料之中也是独特的，因为其经由未预期的分子内粘合形成事件发生，所述事件使得阳离子铵的不可逆中和，以快速触发阴离子货物的释放。
[0327]
(2)分子内降解的可分离的产物，如双
‑
n
‑
羟基乙基
‑
2,5
‑
哌嗪
‑7‑
二酮，其进一步降解为羟基乙基甘氨酸。
[0328]
(3)提供活性时窗，使得阴离子货物静电封装到粒子中以用于递送，随后在细胞内化之后快速释放。
[0329]
(4)通过对大分子架构的控制实现多个内酯单体的共聚。官能化单体可以在嵌段或统计架构中聚合，且这进一步使多个单体类型(如环状碳酸酯或磷酸酯)组合。
[0330]
(5)甚至当局部或全身性投与时，体内使用这些材料可以在无急性毒性的情况下发生，指示在治疗反应所必需的浓度下的较高耐受性。
[0331]
(6)使用作为基因递送媒剂，聚(碳酸酯
‑
共
‑
氨基酯)，实现包括信使rna的寡核苷酸的高效递送和释放。mtc
‑
十二烷基碳酸酯和n
‑
boc吗啉
‑2‑
酮单体的两性嵌段共寡聚物可以用较大阴离子货物(如mrna)调配以形成稳定的低于400nm的粒子。这些所得粒子可以有效地由细胞吸收且释放其mrna货物，产生稳固的基因表达。这一概念已经在多个细胞系中以及在小鼠研究中体内展现。这些材料的功效已表明由于阳离子氨基酯嵌段形成中性小分子，双
‑
n
‑
羟基乙基1
‑
2,5
‑
哌啶二酮双
‑
羟基乙基甘氨酸的ph反应性重排。虽然先前已报告了其它阳离子基因递送媒剂，但这些寡聚(碳酸酯
‑
共
‑
氨基酯)由于其独特的在适合于细胞
摄入和其耐受性的时间标度上释放mrna(或其它寡核苷酸)货物的能力是独特的且为表现最佳的之一。
[0332]
(7)凭经验确定的用于mrna递送的最优长度教示了与我们的现有技术不同，因为mtc
‑
十二烷基碳酸酯和n
‑
boc吗啉
‑2‑
酮域的平均dp 12的二嵌段表现最佳。这一长度比可商购的阳离子多胺载体(如pei)短得多；其也长于我们先前发现的sirna递送载体(参考文献wo2013036532a1和《美国国家科学院院刊》2012,109(33),13171
‑
13176)。
[0333]
在一个方面，此处提供一种将核酸转染到细胞中的方法，所述方法可以具有使细胞与本技术案中其它地方所述的细胞穿透复合物接触。在一些实施例中，所述方法可以在细胞中引起基因编辑。在实施例中，基因编辑可以涵盖作为基因工程改造的类型的基因组编辑(genome
‑
edition/genome editing)，其中使用分离或工程改造的核酸酶系统在活生物体的基因组中插入、删除或替换dna。在某些实施例中，本文所公开的方法可以用于递送可以引起经转染的细胞中的基因编辑的遗传工具或系统。基因编辑的遗传工具或系统的一些非限制性实例包括crispr
‑
cas系统和转座子系统。
[0334]
在一个方面，根据一些实施例的通过转染方法转染的核酸(即，货物核酸)可以具有一个或多个载体，所述载体具有编码crispr
‑
cas系统导向rna的第一核苷酸序列和编码cas9蛋白质的第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列与所述细胞的基因组中的目标序列混合。在某些实施例中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可以位于相同或不同载体上。
[0335]
一般来说，采用crispr/cas9的系统提供高度保真度和基因编辑的相对简单的构造。系统可以取决于其特异性的两个因素：目标序列和前间隔片段临近基序(pam)。目标序列可以是，例如20个碱基长，作为crrna阵列中每个crispr基因座的一部分。crrna阵列可以具有多个独特目标序列。cas9蛋白质可以通过利用序列与宿主dna上的碱基对结合来选择宿主的基因组上的正确位置。宿主基因组上的pam序列可以由cas9识别。一旦将元件组装(例如)到一种或多种质粒中且转染到细胞中，借助于crrna的cas9蛋白质可以在宿主细胞的dna中发现正确序列，且取决于cas9变异体，在产生在dna中单链或双链断裂。宿主dna中的适当间隔的断裂可以触发同源定向修复。提供dna修复模板可以使在基因组内的预期位置处插入特定dna序列。一旦并入，新的序列现在是细胞的基因材料的一部分且可以递送到其子细胞中。许多在线工具可以用于本领域中以帮助设计出有效的sgrna序列。根据一些实施例，根据本文中的某些实施例的方法和组合物可以递送或转染编码crispr
‑
cas系统导向rna的核苷酸序列和编码cas9蛋白质的核苷酸序列，以诱导经转染的细胞中的基因编辑。
[0336]
在一些实施例中，通过根据某些实施例的转染方法转染的货物核酸可以具有crispr rna(crrna)。在一些实施例中，此crrna可以处于编码crispr
‑
cas系统导向rna的第一核苷酸序列的相同载体中。
[0337]
在一些实施例中，通过根据某些实施例的转染方法转染的货物核酸可以具有转录活化rna(tracrrna)。在一些实施例中，此tracrrna可以处于编码cas9蛋白质的第二核苷酸序列的相同载体中。
[0338]
在一些实施例中，根据一些实施例的转染方法中所利用的cas9蛋白质可以是经密码子优化以在经转染细胞中表达。
[0339]
在另一方面，根据一些实施例的通过转染方法转染的核酸(即，货物核酸)可以具有一个或多个载体，具有编码转座酶的第一核苷酸序列和具有由转座酶识别位点侧接的相
关基因的核酸序列的第二核苷酸序列。在一些实施例中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可以位于相同或不同载体上。
[0340]
转座元件(或转座子)一般是指dna序列，其可以改变其在基因组内的位置，有时产生或反转突变且改变细胞的遗传组合物和基因组大小。转座酶一般是指可以结合到转座子且催化转座子移动到基因组的另一部分的酶，通过例如切割和补偿机制或复制型转座机制。在细胞中引入转座酶和与转座酶识别位点侧接的相关基因可以诱导相关基因插入到细胞基因组中。根据一些实施例，根据此处的某些实施例的方法和组合物可以递送或转染编码转座酶和相关基因的核酸以诱导经转染的细胞中的基因编辑。
[0341]
在一些实施例中，根据一些实施例的转染方法中使用的转座酶可以识别和切除基因组序列。在一些其它实施例中，经由转染方法转染的相关基因的核酸序列可以整合到经转染的细胞的基因组中。
[0342]
在一些实施例中，经由根据一些实施例的转染方法进行的遗传编辑可以引起以下中的一种或多种：dna缺失、基因破坏、dna插入、dna反转、点突变、dna替换、基因敲入和基因敲落。
[0343]
诱导免疫反应的方法
[0344]
在另一方面，本文提供诱导个体的免疫反应的方法。在一些实施例中，所述方法可以使用细胞穿透复合物治疗和/或预防疾病或病状。所述方法一般涉及向有需要的个体投与治疗有效量的单独(例如，在单一疗法中)或组合(例如，在组合疗法中)的细胞穿透复合物或具有本文所述的细胞穿透复合物的药物组合物，以及一种或多种额外成分，例如药学上可接受的赋形剂和/或额外治疗剂。
[0345]
在一些实施例中，细胞穿透复合物或具有细胞穿透复合物的药物组合物可以用作可以诱导投与细胞穿透复合物或其药物组合物的个体中的免疫反应的疫苗。
[0346]
在一些实施例中，所述疫苗可以具有预防活性，使得疫苗可以预防或减少个体的疾病或病状的发生的可能性。在实施例中，其中所述疫苗用于预防目的，个体可以是不具有疾病或病状的动物，例如未诊断患有疾病或病状或未患有与疾病或病状相关的明显症状的人类。在一些其它实施例中，所述疫苗具有治疗效果，使得所述疫苗可以用于治疗疾病或病状。治疗性疫苗的一些实例可以包括但不限于可以向已患有癌症的患者投与的癌症疫苗。癌症疫苗可以展现出一种或多种抗癌活性，例如癌细胞数目的减少、癌症大小的减少、杀死癌细胞、减少和/或抑制癌转移和减少癌细胞生长和/或增殖。在一些其它实施例中，癌症疫苗还可以用于预防目的，尤其在被视为易患癌症但目前未患癌症的个体中。可以向已诊断患有某一癌症的个体投与预防性疫苗且预防或减少所述个体的癌症的发生的可能性。
[0347]
在一个方面，此处的公开内容提供一种诱导有需要的个体的针对疾病的免疫反应的方法。所述方法可以含有向个体投与有效量的细胞穿透复合物。
[0348]
在一些实施例中，细胞穿透复合物可以用作可以诱导投与所述复合物的个体的免疫反应的疫苗。复合物可以含有非共价结合到阳离子两性聚合物的核酸，且阳离子两性聚合物可以具有ph敏感分解域。
[0349]
在一些实施例中，由所述疫苗或疫苗组合物靶向的疾病或病状可以包括但不限于自身免疫、发炎性、癌症、感染性、代谢、发展性、心血管、肝脏、肠道、内分泌、神经或其它疾病。
[0350]
在一些实施例中，所述疫苗或其组合物中含有的所述核酸可以是编码抗原或免疫原性表位的核酸序列。举例来说，当涉及传染病时，疫苗中所含的核酸可以编码已知在传染病的病原体(例如病原性细菌或病毒)中表达的一种或多种肽，且当在个体中投与时可以诱导免疫反应。在疾病为特定类型的癌症的另一实例中，使用疫苗组合物投与到个体的核酸可以编码与癌症相关的一种或多种肽，例如相比于非癌细胞，癌细胞中的肽(在癌症类型中或其表达水平下大体上完全表达)显著更高。当向个体投与编码抗原或免疫原性肽的核酸且递送(即转染)到个体的某些细胞中时，经转染的核酸可以最终翻译且表达到抗原肽中。因为所表达的肽是抗原或免疫原性的，所以可以诱导个体的针对所表达的肽的免疫反应。诱导的免疫反应可以用以治疗目标疾病，例如，如果个体已经患有疾病，那么通过降低具有特异性的感染的细胞群体，展现出治疗效果。或者，个体可以经由此接种具有获得性免疫反应，其中适应性免疫性可以在对由免疫反应靶向的免疫原性肽的初始反应之后引发免疫记忆，且在后续遇到时引起对所述目标的增强型反应，展现出预防作用。
[0351]
在一些实施例中，接种可以通过在单一疫苗组合物中递送两种单独类型(或序列)的核酸来提供治疗和预防作用的双重活性。两个单独的核酸可以编码两种不同的免疫原性肽。因此，在一些实施例中，所述疫苗组合物可以转染(1)编码第一免疫原性肽的第一核酸，其可以诱导对现有疾病或病状的更立即治疗作用，和(2)编码不同的第二免疫原性肽的第二核酸，所述第二核酸旨在诱导未来出现不同疾病或病状的个体的适应性免疫。在一些实施例中，所述疫苗可以将两种或更多种不同的核酸递送到个体，且每个核酸分别独立地展现出治疗或预防作用。
[0352]
在实施例中，疫苗组合物可以具有两种或更多种不同类型(或不同式)的阳离子两性聚合物。或者，疫苗组合物可以具有仅单一类型(或单一式)的阳离子两性聚合物。在一些实施例中，单一类型的阳离子两性聚合物可以非共价结合到一种类型(序列)的核酸。或者，单一类型的阳离子两性聚合物可以非共价结合到两种或更多种类型(序列)的核酸。因此，在实施例中，不同类型的阳离子两性聚合物的混合物，其中的每一种结合到不同序列的核酸，可以一起向个体投与以便递送两种或更多种核酸序列(或类型)。或者，可以将与多种类型(或序列)核酸结合的单一类型(或式)的阳离子两性聚合物投与到个体，以便递送两种或更多种核酸序列(或类型)。或者，可以将与单序列(或类型)核酸结合的单类型(或式)阳离子两性聚合物投与到个体中。
[0353]
在一些实施例中，含有疫苗或其组合物的核酸可以是信使rna(mrna)、小分子干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微rna(mirna)、导向rna(grna)、crispr rna(crrna)、转录活化rna(tracrrna)、质粒dna(pdna)、微环dna、基因组dna(gnda)。在替代性实施例中，含有疫苗或其组合物的核酸可以是mrna。在一些实施例中，核酸经由接种转染到个体的一个或多个细胞中。在一些实施例中，一种或多于一种核酸序列可以经由疫苗组合物转染。因此，在一些实施例中，疫苗组合物含有两种不同核酸，其中的每一种分别编码不同抗原肽。因此，当将疫苗投与需要接种的个体时，可以表达两种或更多种类型的抗原表位且诱导个体的免疫反应。在替代性实施例中，一种类型的核酸可以经由接种来转染，使得一种类型的表位可以表达且诱导个体的免疫反应。
[0354]
在一些实施例中，诱导有需要的个体的免疫反应的方法可以具有以有效量向个体投与一种或多种额外药物组合物，以及向所述个体投与有效量的细胞穿透复合物。在一些
实施例中，所述额外药物组合物可以含有抗癌剂和任选地药学上可接受的载剂。额外抗癌剂可以是例如抗体、小分子和大分子或其组合。抗癌活性的实例包括但不限于减少癌细胞数目、减少癌症大小、杀死癌细胞、减少和/或抑制癌转移和减少癌细胞生长和/或增殖。在实施例中，细胞穿透复合物和额外药物组合物的投与可以展现出大于个别投与的总和的协同效应。
[0355]
组合物
[0356]
在一个方面，此处的公开内容提供本文所述的阳离子两性聚合物。在一些实施例中，阳离子两性聚合物可以非共价结合到核酸。在一些实施例中，阳离子两性聚合物可以具有一个或多个亲脂性聚合物域和一个或多个ph敏感分解域。在一些实施例中，阳离子两性聚合物可以配制成具有一个或多个任选的成分的组合物。阳离子两性聚合物或其组合物可以经由与一种或多种核酸非共价结合而调配成细胞穿透复合物。
[0357]
在另一方面，此处的公开内容提供含有核酸和阳离子两性聚合物的细胞穿透复合物。在一些实施例中，阳离子两性聚合物可以非共价结合到核酸。在一些实施例中，阳离子两性聚合物可以具有一个或多个亲脂性聚合物域和一个或多个ph敏感分解域。在一些实施例中，细胞穿透复合物可以调配成具有一个或多个任选的成分的组合物。
[0358]
在一些实施例中，阳离子两性聚合物或细胞穿透复合物可以调配成可以用于将核酸转染到细胞中的组合物。能够将核酸转染到细胞中的这些组合物至少在一些实施例中被称作转染组合物。在一些实施例中，可以结合到阳离子两性聚合物且形成细胞穿透复合物的货物核酸可以是信使rna(mrna)、小分子干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微rna(mirna)、导向rna(grna)、crispr rna(crrna)、转录活化rna(tracrrna)、质粒dna(pdna)、微环dna、基因组dna(gnda)。可以将具有阳离子两性聚合物而非货物核酸的转染组合物用货物核酸调配，例如在转染之前使阳离子两性聚合物与核酸接触(或混合)。
[0359]
在实施例中，使用本文所公开的组合物和方法的转染可以改变一种或多种细胞特性。在实施例中，转染可以产生改变经转染的细胞中的基因表达谱，例如减少或增加一种或多种基因产物(例如rna或肽)的表达。在一些其它实例中，转染可以引起改变基因组结构，例如通过转染crispr/cas9系统或转座子系统的组分进行基因编辑。在一些其它实例中，转染可以引起调节细胞路径的活性。因此，在一些此类实例中，转染可以引起干细胞的诱导。在一些其它实例中，组合物可以递送或(转染)具有治疗效果的货物核酸，使得转染可以治疗和/或预防疾病或病状。在一些实施例中，递送(或转染)治疗性货物核酸的组合物可以诱导投与所述组合物的个体的免疫反应。如从前述显而易见，取决于货物核酸和其功能性，根据本公开的组合物，包括具有阳离子两性聚合物或细胞穿透复合物的组合物，可以用于在经转染的细胞或所投与的个体中提供多种结果。
[0360]
药物组合物
[0361]
在一些实施例中，具有阳离子两性聚合物或细胞穿透复合物的组合物可以用于治疗目的。在一些实施例中，治疗目的涵盖预防目的(预防疾病或病状发生的目的)和治疗目的(治疗现有疾病或病状的目的)。当组合物具有阳离子两性聚合物而非货物核酸时，所述货物核酸(可以展现出治疗效果)可以在向个体投与之前非共价结合到阳离子两性聚合物。
[0362]
在一些实施例中，组合物可以是疫苗或其组合物，即含有所述疫苗和任选地药学上可接受的载剂的组合物。疫苗或疫苗组合物可以用于预防和/或治疗疾病或病状或与疾
病或病状相关的病原体。在一些实施例中，疫苗或疫苗组合物含有具有阳离子两性聚合物和货物核酸的细胞穿透复合物。在一些实施例中，当向个体投与时，细胞穿透复合物可以诱导免疫反应，即免疫原性。此免疫原性可以至少部分地在由在经转染的细胞中表达由货物核酸编码的一种或多种抗原肽时诱导。
[0363]
在一个方面，本文所公开的阳离子两性聚合物或细胞穿透复合物可以调配于药物组合物中。阳离子两性聚合物可以具有ph敏感分解域。在一个实施例中，药物组合物可以进一步含有药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的载剂。
[0364]
在一些实施例中，药物组合物可以具有细胞穿透复合物，其具有非共价结合到阳离子两性聚合物的核酸作为活性成分的细胞穿透复合物且进一步含有药学上可接受的赋形剂或添加剂，取决于投与途径。此类赋形剂或添加剂的实例包括水、药学上可接受的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、二丙三醇、丙三醇、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人类血清白蛋白(hsa)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、药学上可接受的表面活性剂等。所用的添加剂可以选自但不限于上述或其组合，适当时，取决于本公开的剂型。
[0365]
在一些实施例中，所述药学上可接受的载剂为免疫佐剂。在实施例中，免疫辅助剂可以包括但不限于toll样受体(tlr)的促效剂、sting路径的促效剂、针对cd40、ox40、ctla4、pd1或pd1
‑
l的促效抗体、弗氏佐剂、对于cd40、ox40、cd137、pd1、ctla4和其任何组合的苔藓抑素及配体。在一些实施例中，佐剂可以增加当向个体共同投与复合物的细胞穿透复合物时诱导的免疫原性。
[0366]
本公开的药物组合物的调配物可以根据所选择的投与途径而变化(例如，溶液、乳液)。投与途径可以是例如肌肉内、皮下、静脉内、淋巴管内、皮下、肌肉内、眼内、局部皮肤、局部结膜、口服、膀胱内(膀胱)、肛门内和阴道内。
[0367]
在一些实施例中，所述组合物可以包括低温保护剂。低温保护剂的非限制性实例包括乙二醇(例如，乙二醇、丙二醇和丙三醇)、二甲亚砜(dmso)、甲酰胺、蔗糖、海藻糖、右旋糖和其任何组合。
[0368]
在一些实施例中，所述调配物是控制释放调配物。术语“控制释放调配物”包括持续释放和限时释放调配物。控制释放调配物在所属领域中众所周知。这些包括允许组合物持续性、周期性、脉冲或延迟释放的赋形剂。控制释放调配物包括但不限于将组合物包埋到基质；肠溶包衣；微囊封；凝胶和水凝胶；植入物；和允许组合物的控制释放的任何其它调配物中。
[0369]
在一个方面，提供具有细胞穿透复合物或其组合物的部件的套组。在另一方面，提供一种具有未结合到核酸或其组合物的阳离子两性聚合物的部件的套组。套组可以进一步含有描述用于使用阳离子两性聚合物和货物核酸制备细胞穿透复合物的方案的文献或说明书。套组的文献或说明书还可以描述用于向有需要的个体投与组合物的方案。
[0370]
本文所述的治疗性调配物可以通过混合具有所希望的纯度程度以及任选的生理学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂的活性成分(即，一种或多种免疫原性药剂)来制备用于储存。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂可以在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒性，且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐
剂(如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、氯化六羟季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁基或苯甲基醇；对羟苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3
‑
戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，如甘氨酸、麸酰胺酸、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠离子；金属络合物(例如，zn蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，如tween
tm
、pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。
[0371]
本文中的调配物还可以含有多于一种活性化合物(例如，除具有细胞穿透复合物的免疫原性药剂以外的第二活性剂)，其可以经选择以用于不会不利地影响彼此的互补活性。此类分子可以适合地按组合的量存在，其可以有效地用于所希望的目的。
[0372]
投与
[0373]
在一些方面，提供将组合物递送到细胞或个体以便将所希望的活性提供到细胞或个体中的方法。在一些实施例中，所述组合物可以含有具有非共价结合到阳离子两性聚合物的货物核酸的细胞穿透复合物。当转染到细胞中或向个体投与时，货物核酸可以取决于核酸序列的性质提供多种既定作用。预期作用的一些非限制性实例包括对基因表达的调节、细胞路径的调节、基因组编辑和免疫反应的诱导。在一些实施例中，所述组合物可以以足以实现个体的所希望作用的至少一部分的有效量投与个体。
[0374]
当与组合物结合使用时，“投与”、“投与”等是指直接投与，其可以体外投与到细胞，体内投与到细胞，通过医学专业人员投与到个体或通过个体自身投与到个体和/或间接投与，其可以是处方本公开的组合物的行为。当本文中参考细胞使用时，是指将组合物引入到细胞中。通常，投与有效量，所述量可以由所属领域的技术人员确定。可以使用任何投与方法。化合物(例如，药物或抗体)可以通过例如将化合物添加到细胞培养基或体内注射向细胞投与。向个体投与可以通过例如血管内注射、直接瘤内递送等实现。
[0375]
投与可以意味着向个体口服投与、以栓剂形式投与、局部接触、静脉内、腹膜内、肌肉内、病灶内、鞘内、鼻内或皮下投与，或植入缓慢释放装置(例如微型渗透泵)。通过任何途径进行投与，包含肠胃外和经粘膜(例如，颊、舌下、腭、牙龈、鼻、阴道、直肠或经皮)。肠胃外投与包括例如静脉内、肌内、动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内投与。其它递送模式包括但不限于使用脂质粒调配物、静脉内输注、透皮贴片等。"共投与"意味着本文所述的组合物与投与一种或多种额外疗法同时、恰好在投与一种或多种额外疗法之前或之后投与，例如癌症疗法，如化学疗法、激素疗法、放射线疗法或免疫疗法。本公开的化合物可以向患者单独投与或可以共同投与。共投与意指包括单独或组合地同时或依序投与化合物(多于一种化合物)。
[0376]
向个体投与的剂量和频率(单个或多个剂量)可以取决于多种因素而变化，例如所述个体是否罹患另一疾病，其投与途径；接受者的大小、年龄、性别、健康、体重、身体质量指数和饮食；所治疗的疾病的性质和症状的严重程度、同时治疗的种类、正治疗的疾病的并发症或其它健康相关问题。其它治疗方案或药剂可以与本文(包括其实施例)所述的方法和组合物结合使用。对建立的剂量(例如，频率和持续时间)的调整和操纵完全处于本领域技术人员的能力范围内。
[0377]
使用本文提供的教示，可以计划不引起大量毒性且通过特定患者证实仍可有效治疗临床症状的有效防治性或治疗性治疗方案。该计划应涉及通过考虑如化合物效价、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的存在和严重性、优选的给药方式和所选试剂的毒性特征等因素来谨慎选择活性化合物。
[0378]
在一些实施例中，个体为哺乳动物(例如人类)、非人类灵长类、鼠类(即小鼠和大鼠)、犬、猫或马。在一个实施例中，个体为人类。
[0379]
在一些实施例中，组合物可以以下的剂量(或量)投与：约1ng/kg的个体体重、约10ng/kg的个体体重、约50ng/kg的个体体重、约100ng/kg的个体体重、约500ng/kg的个体体重、约1ug/kg的个体体重、约10μg/kg的个体体重、约50ug/kg的个体体重、约100μg/kg的个体体重、约150μg/kg的个体体重、约200μg/kg的个体体重、约250μg/kg的个体体重、约300μg/kg的个体体重、约350μg/kg的个体体重、约375μg/kg的个体体重、约400μg/kg的个体体重、约450μg/kg的个体体重、约500μg/kg的个体体重、约550μg/kg的个体体重、约600μg/kg的个体体重、约650μg/kg的个体体重、约700μg/kg的个体体重、约750μg/kg的个体体重、约800μg/kg的个体体重、约850μg/kg的个体体重、约900μg/kg的个体体重、约1mg/kg的个体体重、约10mg/kg的个体体重、约50mg/kg的个体体重、约100mg/kg的个体体重、约500mg/kg的个体体重、约1g/kg的个体体重或更高，或前述的任何中间范围。在一些实施例中，组合物可以以以下的剂量(或量)投与：约0.5μg、约1.0μg、约1.5μg、约2.0μg、约2.5μg、约3.0μg、约3.5μg、约4.0μg、约4.5μg、约5.0μg、约5.5μg、约6.0μg、约6.5μg、约7.0μg、约7.5μg、约8.0μg、约8.5μg、约9.0μg、约9.5μg、约1.0mg、约1.5mg、约2.0mg、约2.5mg、约3.0mg、约3.5mg、约4.0mg、约4.5mg、约5.0mg、约5.5mg、约6.0mg、约6.5mg、约7.0mg、约7.5mg、约8.0mg、约8.5mg、约9.0mg、约9.5mg、约1g或更高，或前述的任何中间范围。在一些实施例中，组合物可以以以下的剂量(或量)投与：约7.5μg或约0.375mg/kg的个体体重。可以在所希望的时段内重复给药，例如，在约1天到约5天的时段内重复给药，或在例如约五天、在约1个月、约2个月等的时段内重复给药。本文中的重量可以是细胞穿透复合物的重量或其组合物或药物调配物的重量。在一些实施例中，
[0380]
在一个实施例中，组合物可以以6小时、12小时、每日或每隔一天或以每周或每月计的间隔全身性或局部投与(例如瘤内注射、静脉内注射)，以引发所希望的益处或以其它方式提供治疗效果。
[0381]
在一个实施例中，与基线参考或对照参考相比，对组合物(确切地说癌症疫苗)的反应速率可以降低。术语“反应速率”在本文中在其惯用意义上用以指示治疗后罹患癌症缓解的患者的百分比。反应速率包括(例如)部分或完全缓解。部分反应包括：约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％的癌细胞缓解。在一些实施例中，对照参考获自健康个体、癌症个体(例如正治疗的癌症个体或另一癌症个体)或其任何群体。
[0382]
应理解，本文所述的实例和实施例仅是出于说明性目的，且根据其的各种修改或变化将由所属领域的技术人员想到且包括在本技术的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。本文所引用的所有出版物、专利和专利申请均出于所有目的以其整体通过并入。
[0383]
组合物和方法
[0384]
本文所提供的组合物和方法尤其可以用于体内将编码受体蛋白质(例如，嵌合抗原受体、t细胞受体)的核酸递送到细胞。本文所提供的组合物出人意料地为非免疫原性的，且提供将核酸体内靶向递送到有需要的个体(如骨髓或淋巴细胞)的细胞的优良手段。使用本文所提供的方法和组合物，编码多个基因的核酸可以容易地调配和体内递送。组合物和方法提供体内的稳固表达且可以递送dna或mrna。在实施例中，可以共同递送编码表面或分泌蛋白质的核酸(形成本文所提供的复合物的一部分)。表面或分泌的蛋白质可以增强效应功能，减少副作用且抑制所递送的受体蛋白质(例如car)。在一个方面，提供了包括非共价结合到阳离子两性聚合物的核酸的细胞穿透复合物，阳离子两性聚合物包括ph敏感分解域和亲脂性聚合物域，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[0385]
r
1a
‑
[l1‑
[(lp1)
z1
‑
(lp2)
z3
‑
(im)
z2
]
z4
‑
l2‑
r
2a
]
z5
[0386]
其中
[0387]
r
1a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0388]
r
2a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0389]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[0390]
lp1和lp2独立地为亲脂性聚合物域；im为ph敏感分解域；z5为1到10的整数；z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和z2为2到100的整数。
[0391]
上式的取代基如整个本技术中所述来定义。因此，在本文中的化合物的其它实施例中，各自被取代或未被取代的烷基为被取代或未被取代的c1‑
c
20
烷基，每一被取代或未被取代的杂烷基为被取代或未被取代的2到20元杂烷基、每一被取代或未被取代的环烷基为被取代或未被取代的c3‑
c8环烷基、每一被取代或未被取代的杂环烷基为被取代或未被取代的3到8元杂环烷基、每一被取代或未被取代的芳基为被取代或未被取代的c6‑
c
10
芳基和/或每一被取代或未被取代的杂芳基为被取代或未被取代的5到10元杂芳基。在本文的化合物的一些实施例中，每一被取代或未被取代的亚烷基是被取代或未被取代的c1‑
c
20
亚烷基，每一被取代或未被取代的亚杂烷基是被取代或未被取代的2元到20元亚杂烷基，每一被取代或未被取代的亚环烷基是被取代或未被取代的c3‑
c8亚环烷基，每种取代或未取代的亚杂环
烷基是被取代或未被取代的3元到8元亚杂环烷基，每一被取代或未被取代的亚芳基是被取代或未被取代的c6‑
c
10
亚芳基，和/或每一被取代或未被取代的亚杂芳基是被取代或未被取代的5元到10元亚杂芳基。在一些实施例中，化合物是以下实例章节、附图或表格中所述的化学物种。
[0392]
在一些实施例中，每一被取代或未被取代的烷基为被取代或未被取代的c1‑
c8烷基，每一被取代或未被取代的杂烷基为被取代或未被取代的2到8元杂烷基、每一被取代或未被取代的环烷基为被取代或未被取代的c3‑
c7环烷基、每一被取代或未被取代的杂环烷基为被取代或未被取代的3到7元杂环烷基、每一被取代或未被取代的芳基为被取代或未被取代的c6‑
c
10
芳基和/或每一被取代或未被取代的杂芳基为被取代或未被取代的5到9元杂芳基。在一些实施例中，每一被取代或未被取代的亚烷基是被取代或未被取代的c1‑
c8亚烷基，每一被取代或未被取代的亚杂烷基是被取代或未被取代的2元到8元亚杂烷基，每一被取代或未被取代的亚环烷基是被取代或未被取代的c3‑
c7亚环烷基，每一被取代或未被取代的亚杂环烷基是被取代或未被取代的3元到7元亚杂环烷基，每一被取代或未被取代的亚芳基是被取代或未被取代的c6‑
c
10
亚芳基，和/或每一被取代或未被取代的亚杂芳基是被取代或未被取代的5元到9元亚杂芳基。在一些实施例中，化合物是以下实例章节、附图或表格中所述的化学物种。
[0393]
r
1a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0394]
r
1a
可以独立地为氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br或
‑
och2i或
‑
och2f。在实施例中，r
1a
独立地为r
1a1
‑
取代或未被取代的(例如，c1‑
c
20
或c1‑
c6)烷基、r
1a1
‑
取代或未被取代的(例如，2到20元或2到6元)杂烷基、r
1a1
‑
取代或未被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)环烷基、r
1a1
‑
取代或未被取代的(例如，3到8元或3到6元)杂环烷基、r
1a1
‑
取代或未被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)芳基或r
1a1
‑
取代或未被取代的(例如，5到10元或5到6元)杂芳基。
[0395]
r
1a1
可以独立地为氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i或
‑
och2f。在实施例中，r
1a1
独立地为r
1a2
‑
取代或未被取代的(例如，c1‑
c
20
或c1‑
c6)烷基、r
1a2
‑
取代或未被取代的(例如，2到20元或2到6元)杂烷基、r
1a2
‑
取代或未被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)环烷基、r
1a2
‑
取代或未被取代的(例如，3到8元或3到6元)杂环烷基、r
1a2
‑
取代或未被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)芳基或r
1a2
‑
取代或未被取代的(例如，5到10元或5到6元)杂芳基。
[0396]
r
1a2
可以独立地为氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i或
‑
och2f。在实施例中，r
1a2
独立地为r
1a3
‑
取代或未被取代的(例如，c1‑
c
20
或c1‑
c6)烷基、r
1a3
‑
取代或未被取代的(例如，2到20元或2到6元)杂烷基、r
1a3
‑
取代或未被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)环烷基、r
1a3
‑
取代或未被取代的(例如，3到8元或3到6元)杂环烷基、r
1a3
‑
取代或未被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)芳基或r
1a3
‑
取代或未被取代的(例如，5到10元或5到6元)杂芳基。
[0397]
r
1a3
可以独立地为氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i或
‑
och2f。在实施例中，r
1a3
独立地为未被取代的(例如，c1‑
c
20
或c1‑
c6)烷基、未被取代的(例如，2到20元或2到6元)杂烷基、未被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)环烷基、未被取代的(例如，3到8元或3到6元)杂环烷基、未被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)芳基或未被取代的(例如，5到10元或5到6元)杂芳基。
[0398]
r
2a
可以独立地为氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br或
‑
och2i或
‑
och2f。在实施例中，r
2a
独立地为r
2a1
‑
取代或未被取代的(例如，c1‑
c
20
或c1‑
c6)烷基、r
2a1
‑
取代或未被取代的(例如，2到20元或2到6元)杂烷基、r
2a1
‑
取代或未被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)环烷基、r
2a1
‑
取代或未被取代的(例如，3到8元或3到6元)杂环烷基、r
2a1
‑
取代或未被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)芳基或r
2a1
‑
取代或未被取代的(例如，5到10元或5到6元)杂芳基。
[0399]
r
2a1
可以独立地为氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i或
‑
och2f。在实施例中，r
2a1
独立地为r
2a2
‑
取代或未被取代的(例如，c1‑
c
20
或c1‑
c6)烷基、r
2a2
‑
取代或未被取代的(例如，2到20元或2到6元)杂烷基、r
2a2
‑
取代或未被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)环烷基、r
2a2
‑
取代或未被取代的(例如，3到8元或3到6元)杂环烷基、r
2a2
‑
取代或未被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)芳基或r
2a2
‑
取代或未被取代的(例如，5到10元或5到6元)杂芳基。
[0400]
r
2a2
可以独立地为氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i或
‑
och2f。在实施例中，r
2a2
独立地为r
2a3
‑
取代或未被取代的(例如，c1‑
c
20
或c1‑
c6)烷基、r
2a3
‑
取代或未被取代的(例如，2到20元或2到6元)杂烷基、r
2a3
‑
取代或未被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)环烷基、r
2a3
‑
取代或未被取代的(例如，3到8元或3到6元)杂环烷基、r
2a3
‑
取代或未被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)芳基或r
2a3
‑
取代或未被取代的(例如，5到10元或5到6元)杂芳基。
[0401]
r
2a3
可以独立地为氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i或
‑
och2f。在实施例中，r
2a3
独立地为未被取代的(例如，c1‑
c
20
或c1‑
c6)烷基、未被取代的(例如，2到20元或2到6元)杂烷基、未被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)环烷基、未被取代的(例如，3到8元或3到6元)杂环烷基、未被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)芳基或未被取代的(例如，5到10元或5到6元)杂芳基。
[0402]
l1独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基。在实施例中，l1为未被取代的(例如，c1‑
c
20
或c1‑
c6)亚烷基、未被取代的(例如，2到20元或2到6元)亚杂烷基、未被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)亚环烷基、未被取代的(例如，3到8元或3到6元)亚杂环烷基、未被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)亚芳基或未被取代的(例如，5到10元或5到6元)亚杂芳基。在实施例中，l1为r
l1
‑
被取代的(例如，c1‑
c
20
或c1‑
c6)亚烷基、r
l1
‑
被取代的(例如，2到20元或2到6元)亚杂烷基、r
l1
‑
被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)亚环烷基、r
l1
‑
被取代的(例如，3到8元或3到6元)亚杂环烷基、r
l1
‑
被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)亚芳基或r
l1
‑
被取代的(例如，5到10元或5到6元)亚杂芳基。r
l1
可以独立地为氢、卤素、＝o、＝s、
‑
cf3、
‑
cn、
‑
ccl3、
‑
cooh、
‑‑
ch2cooh、
‑
conh2、
‑
oh、
‑
sh、
‑
so2cl、
‑
so3h、
‑
so4h、so2nh2、
‑
no2、
‑
nh2、
‑‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc＝(o)nhnh2、未被取代的(例如，c1‑
c
20
或c1‑
c6)烷基、未被取代的(例如，2到20元或2到6元)杂烷基、未被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)环烷基、未被取代的(例如，3到8元或3到6元)杂环烷基、未被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)芳基或未被取代的(例如，5到10元或5到6元)杂芳基。
[0403]
l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基。在实施例中，l2为未被取代的(例如，c1‑
c
20
或c1‑
c6)亚烷基、未被取代的(例如，2到20元或2到6元)亚杂烷基、未被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)亚环烷基、未被取代的(例如，3到8元或3到6元)亚杂环烷基、未被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)亚芳基或未被取代的(例如，5到10元或5到6元)亚杂芳基。在实施例中，l2为r
l2
‑
被取代的(例如，c1‑
c
20
或c1‑
c6)亚烷基、r
l2
‑
被取代的(例如，2到20元或2到6元)亚杂烷基、r
l2
‑
被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)亚环烷基、r
l2
‑
被取代的(例如，3到8元或3到6元)亚杂环烷基、r
l2
‑
被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)亚芳基或r
l2
‑
被取代的(例如，5到10元或5到6元)亚杂芳基。r
l2
可以独立地为氢、卤素、＝o、＝s、
‑
cf3、
‑
cn、
‑
ccl3、
‑
cooh、
‑‑
ch2cooh、
‑
conh2、
‑
oh、
‑
sh、
‑
so2cl、
‑
so3h、
‑
so4h、so2nh2、
‑
no2、
‑
nh2、
‑‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc＝(o)nhnh2、未被取代的(例如，c1‑
c
20
或c1‑
c6)烷基、未被取代的(例如，2到20元或2到6元)杂烷基、未被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)环烷基、未被取代的(例如，3到8元或3到6元)杂环烷基、未被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)芳基或未被取代的(例如，5到10元或5到6元)杂芳基。
[0404]
在实施例中，所述阳离子两性聚合物具有下式：
[0405]
其中
[0406]
环a为被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；cart具有下式：
‑
l1‑
[(lp1)
z1
‑
(lp2)
z3
‑
(im)
z2
]
z4
‑
l2‑
r
2a
，其中r
2a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；lp1和lp2独立地为亲脂性聚合物域；im为ph敏感分解域；z5为1到10的整数；z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，且z2为2到100的整数。
[0407]
在实施例中，环a为被取代或未被取代的芳基。在实施例中，环a为被取代或未被取代的苯基。在实施例中，环a为被取代或未被取代的芳基。在实施例中，环a为被取代或未被取代的苯基或萘基。
[0408]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0409]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0410]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0411]
其中cart1、cart2和cart3独立地为本文所定义的cart。
[0412]
在实施例中，z5为1到3的整数。在实施例中，z5为1或3。在实施例中，z5为1。在实施例中，z5为3。在实施例中，r
2a
为氢。在实施例中，l2为一键。
[0413]
在实施例中，ph敏感分解域具有下式：
[0414][0415]
其中n为2或更大的整数。在实施例中，n为2到50范围内的整数。在实施例中，n为7。
[0416]
在实施例中，亲脂性聚合物域具有下式：
[0417]
其中n2为1到100的整数；
[0418]
r
20
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0419]
在实施例中，lp1具有下式：
[0420]
其中n21为1到100的整数；
[0421]
r
201
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0422]
在实施例中，r
201
独立地为r
201a
‑
被取代或未被取代的(例如，c1‑
c
30
或c1‑
c6)烷基、r
201a
‑
被取代或未被取代的(例如，2到20元或2到6元)杂烷基、r
201a
‑
被取代或未被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)环烷基、r
201a
‑
被取代或未被取代的(例如，3到8元或3到6元)杂环烷基、r
201a
‑
被取代或未被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)芳基或r
201a
‑
被取代或未被取代的(例如，5到10元或5到6元)杂芳基。
[0423]
在实施例中，r
201a
独立地为r
201b
‑
被取代或未被取代的(例如，c1‑
c
30
或c1‑
c6)烷基、r
201b
‑
被取代或未被取代的(例如，2到20元或2到6元)杂烷基、r
201b
‑
被取代或未被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)环烷基、r
201b
‑
被取代或未被取代的(例如，3到8元或3到6元)杂环烷基、r
201b
‑
被取代或未被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)芳基或r
201b
‑
被取代或未被取代的(例如，5到10元或5到6元)杂芳基。
[0424]
在实施例中，r
201b
独立地为未被取代的(例如，c1‑
c
30
或c1‑
c6)烷基、未被取代的(例如，2到20元或2到6元)杂烷基、未被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)环烷基、未被取代的(例如，3到8元或3到6元)杂环烷基、未被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)芳基或未被取代的(例如，5到10元或5到6元)杂芳基。
[0425]
在实施例中，n21为5和r
201
为未被取代的c
18
烯基。在实施例中，未被取代的c
18
烯基为油基。
[0426]
在实施例中，n21为0到100的整数。在实施例中，n21为0到90的整数。在实施例中，n21为0到80的整数。在实施例中，n21为0到70的整数。在实施例中，n21为0到60的整数。在实施例中，n21为0到50的整数。在实施例中，n21为0到40的整数。在实施例中，n21为0到30的整数。在实施例中，n21为0到20的整数。在实施例中，n21为0到10的整数。在实施例中，n21为5到100的整数。在实施例中，n21为15到100的整数。在实施例中，n21为25到100的整数。在实施例中，n21为35到100的整数。在实施例中，n21为45到100的整数。在实施例中，n21为55到100的整数。在实施例中，n21为65到100的整数。在实施例中，n21为75到100的整数。在实施例中，n21为85到100的整数。在实施例中，n21为95到100的整数。在实施例中，n21为0。在实施例中，n21为1。在实施例中，n21为2。在实施例中，n21为3。在实施例中，n21为4。在实施例中，n21为5。在实施例中，n21为6。在实施例中，n21为7。在实施例中，n21为8。在实施例中，n21为9。在实施例中，n21为10。在实施例中，n21为11。在实施例中，n21为12。在实施例中，n21为13。在实施例中，n21为14。在实施例中，n21为15。在实施例中，n21为16。在实施例中，n21为17。在实施例中，n21为18。在实施例中，n21为19。在实施例中，n21为20。在实施例中，n21为21。在实施例中，n21为22。在实施例中，n21为23。在实施例中，n21为24。在实施例中，n21为25。在实施例中，n21为26。在实施例中，n21为27。在实施例中，n21为28。在实施例中，n21为29。在实施例中，n21为30。在实施例中，n21为31。在实施例中，n21为32。在实施例中，n21为33。在实施例中，n21为34。在实施例中，n21为35。在实施例中，n21为36。在实施例中，n21为37。在实施例中，n21为38。在实施例中，n21为39。在实施例中，n21为40。在实施例中，n21为41。在实施例中，n21为42。在实施例中，n21为43。在实施例中，n21为44。在实施例中，n21为45。在实施例中，n21为46。在实施例中，n21为47。在实施例中，n21为48。在实施例中，n21为49。在实施例中，n21为50。在实施例中，n21为51。在实施例中，n21为52。在实施例中，n21为53。在实施例中，n21为54。在实施例中，n21为55。在实施例中，n21为56。在实施例中，n21为57。在实施例中，n21为58。在实施例中，n21为59。在实施例中，n21为60。在实施例中，n21为61。在实施例中，n21为62。在实施例中，n21为63。在实施例中，n21为64。在实施例中，n21为65。在实施例中，n21为66。在实施例中，n21为67。在实施例中，n21为68。在实施例中，n21为69。在实施例中，n21为70。在实施例中，n21为71。在实施例中，n21为72。在实施例中，n21为73。在实施例中，n21为74。在实施例中，n21为75。在实施例中，n21为76。在实施例中，n21为77。在实施例中，n21为78。在实施例中，n21为79。在实施例中，n21为80。在实施例中，n21为81。在实施例中，n21为82。在实施例中，n21为83。在实施例中，n21为84。在实施例中，n21为85。在实施例中，n21为86。在实施例中，n21为87。在实施例中，n21为88。在实施例中，n21为89。在实施例中，n21为90。在实施例中，n21为91。在实施例中，n21为92。在实施例中，n21为93。在实施例中，n21为94。在实施例中，n21为95。在实施例中，n21为96。在实施例中，n21为97。在实施例中，n21为98。在实施例中，n21为99。在实施例中，n21为100。
[0427]
在实施例中，lp2具有下式：
[0428]
其中n22为1到100的整数；r
202
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。在实施例中，n22为5和r
202
为未被取代的c9烯基。在实施例中，未被取代的c9烯基为壬烯基。
[0429]
在实施例中，r
202
独立地为r
202a
‑
被取代或未被取代的(例如，c1‑
c
30
或c1‑
c6)烷基、r
202a
‑
被取代或未被取代的(例如，2到20元或2到6元)杂烷基、r
202a
‑
被取代或未被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)环烷基、r
202a
‑
被取代或未被取代的(例如，3到8元或3到6元)杂环烷基、r
202a
‑
被取代或未被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)芳基或r
202a
‑
被取代或未被取代的(例如，5到10元或5到6元)杂芳基。
[0430]
在实施例中，r
202a
独立地为r
202b
‑
被取代或未被取代的(例如，c1‑
c
30
或c1‑
c6)烷基、r
202b
‑
被取代或未被取代的(例如，2到20元或2到6元)杂烷基、r
202b
‑
被取代或未被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)环烷基、r
202b
‑
被取代或未被取代的(例如，3到8元或3到6元)杂环烷基、r
202b
‑
被取代或未被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)芳基或r
202b
‑
被取代或未被取代的(例如，5到10元或5到6元)杂芳基。
[0431]
在实施例中，r
202b
独立地为未被取代的(例如，c1‑
c
30
或c1‑
c6)烷基、未被取代的(例如，2到20元或2到6元)杂烷基、未被取代的(例如，c3‑
c8或c5‑
c7)环烷基、未被取代的(例如，3到8元或3到6元)杂环烷基、未被取代的(例如，c5‑
c
10
或c5‑
c6)芳基或未被取代的(例如，5到10元或5到6元)杂芳基。
[0432]
在实施例中，n22为0到100的整数。在实施例中，n22为0到90的整数。在实施例中，n22为0到80的整数。在实施例中，n22为0到70的整数。在实施例中，n22为0到60的整数。在实施例中，n22为0到50的整数。在实施例中，n22为0到40的整数。在实施例中，n22为0到30的整数。在实施例中，n22为0到20的整数。在实施例中，n22为0到10的整数。在实施例中，n22为5到100的整数。在实施例中，n22为15到100的整数。在实施例中，n22为25到100的整数。在实施例中，n22为35到100的整数。在实施例中，n22为45到100的整数。在实施例中，n22为55到100的整数。在实施例中，n22为65到100的整数。在实施例中，n22为75到100的整数。在实施例中，n22为85到100的整数。在实施例中，n22为95到100的整数。在实施例中，n22为0。在实施例中，n22为1。在实施例中，n22为2。在实施例中，n22为3。在实施例中，n22为4。在实施例中，n22为5。在实施例中，n22为6。在实施例中，n22为7。在实施例中，n22为8。在实施例中，n22为9。在实施例中，n22为10。在实施例中，n22为11。在实施例中，n22为12。在实施例中，n22为13。在实施例中，n22为14。在实施例中，n22为15。在实施例中，n22为16。在实施例中，n22为17。在实施例中，n22为18。在实施例中，n22为19。在实施例中，n22为20。在实施例中，n22为21。在实施例中，n22为22。在实施例中，n22为23。在实施例中，n22为24。在实施例中，
n22为25。在实施例中，n22为26。在实施例中，n22为27。在实施例中，n22为28。在实施例中，n22为29。在实施例中，n22为30。在实施例中，n22为31。在实施例中，n22为32。在实施例中，n22为33。在实施例中，n22为34。在实施例中，n22为35。在实施例中，n22为36。在实施例中，n22为37。在实施例中，n22为38。在实施例中，n22为39。在实施例中，n22为40。在实施例中，n22为41。在实施例中，n22为42。在实施例中，n22为43。在实施例中，n22为44。在实施例中，n22为45。在实施例中，n22为46。在实施例中，n22为47。在实施例中，n22为48。在实施例中，n22为49。在实施例中，n22为50。在实施例中，n22为51。在实施例中，n22为52。在实施例中，n22为53。在实施例中，n22为54。在实施例中，n22为55。在实施例中，n22为56。在实施例中，n22为57。在实施例中，n22为58。在实施例中，n22为59。在实施例中，n22为60。在实施例中，n22为61。在实施例中，n22为62。在实施例中，n22为63。在实施例中，n22为64。在实施例中，n22为65。在实施例中，n22为66。在实施例中，n22为67。在实施例中，n22为68。在实施例中，n22为69。在实施例中，n22为70。在实施例中，n22为71。在实施例中，n22为72。在实施例中，n22为73。在实施例中，n22为74。在实施例中，n22为75。在实施例中，n22为76。在实施例中，n22为77。在实施例中，n22为78。在实施例中，n22为79。在实施例中，n22为80。在实施例中，n22为81。在实施例中，n22为82。在实施例中，n22为83。在实施例中，n22为84。在实施例中，n22为85。在实施例中，n22为86。在实施例中，n22为87。在实施例中，n22为88。在实施例中，n22为89。在实施例中，n22为90。在实施例中，n22为91。在实施例中，n22为92。在实施例中，n22为93。在实施例中，n22为94。在实施例中，n22为95。在实施例中，n22为96。在实施例中，n22为97。在实施例中，n22为98。在实施例中，n22为99。在实施例中，n22为100。
[0433]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0434][0435]
其中n21为5，r
201
为油基，n22为5，r
202
为壬烯基，且n为7。
[0436]
在实施例中，所述核酸为信使rna(mrna)、小分子干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微rna(mirna)、导向rna(grna)、crispr rna(crrna)、转录活化rna(tracrrna)、质粒dna(pdna)、微环dna、基因组dna(gnda)。在实施例中，所述核酸包括编码嵌合抗原受体(car)的序列。
[0437]
在一个方面，本发明提供一种纳米粒子组合物，其包括多个如本文所提供(包括其实施例)的细胞穿透复合物。
[0438]
在一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包括如本文所提供(包括其实施例)的复合物和药学上可接受的载剂。
[0439]
在一个方面，本发明提供将核酸转染到细胞中的方法，所述方法包括使细胞与如本文所提供(包括其实施例)的复合物接触。
[0440]
在实施例中，使阳离子两性聚合物在细胞内降解，从而形成降解产物。在实施例中，降解产物为被取代或未被取代的二酮哌嗪。
[0441]
在实施例中，所述核酸包括编码car的信使rna(mrna)。
[0442]
在实施例中，所述方法进一步包括使mrna在细胞中表达。在实施例中，所述细胞为真核细胞。在实施例中，所述细胞为哺乳动物或人类细胞。在实施例中，所述细胞形成生物体的一部分。在实施例中，所述生物体为人类。在实施例中，所述细胞为淋巴细胞或骨髓细胞。在实施例中，所述细胞为t细胞。在实施例中，所述细胞为骨髓细胞。
[0443]
在一方面，本发明提供一种诱导有需要的个体的免疫反应的方法，所述方法包括投与有效量的如本文所提供(包括其实施例)的复合物。在实施例中，所述免疫反应为抗癌免疫反应。
[0444]
在一方面，提供一种治疗有需要的个体的癌症的方法。所述方法包括投与有效量的本文所提供(包括其实施例)的复合物。在实施例中，所述投与包括静脉内注射或皮下注射。
[0445]
在一个方面，提供一种将编码嵌合抗原受体(car)的核酸转染到细胞中的方法。所述方法包括使细胞与包括非共价结合到阳离子两性聚合物的核酸的细胞穿透复合物接触，阳离子两性聚合物包括ph敏感分解域和亲脂性聚合物域，且所述核酸包括编码嵌合抗原受体的序列。
[0446]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0447]
r
1a
‑
[l1‑
[(lp1)
z1
‑
(im)
z2
‑
(lp2)
z3
]
z4
‑
l2‑
r
2a
]
z5
[0448]
其中
[0449]
r
1a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0450]
r
2a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0451]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[0452]
lp1和lp2独立地为一键或亲脂性聚合物域，其中lp1或lp2中的至少一个为亲脂性聚合物域；im为ph敏感分解域；z5为1到10的整数；z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和z2为2到100的整数。
[0453]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0454]
其中环a为被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；cart具有下式：
‑
l1‑
[(lp1)
z1
‑
(im)
z2
‑
(lp2)
z3
]
z4
‑
l2‑
r
2a
[0455]
其中，
[0456]
r
2a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0457]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
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‑
、
‑
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‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[0458]
lp1和lp2独立地为一键或亲脂性聚合物域，其中lp1或lp2中的至少一个为亲脂性聚合物域；
[0459]
im为ph敏感分解域；z5为1到10的整数；z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和z2为2到100的整数。
[0460]
在实施例中，环a为被取代或未被取代的芳基。在实施例中，环a为被取代或未被取代的苯基。在实施例中，环a为被取代或未被取代的芳基。在实施例中，环a为被取代或未被取代的苯基或萘基。在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0461]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0462]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0463]
其中cart1、cart2和cart3独立地为本文所定义的cart。
[0464]
在实施例中，l1为
‑
ch2‑
o
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂
烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基。
[0465]
在实施例中，ph敏感分解域具有下式：
[0466][0467]
其中n为2或更大的整数。
[0468]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0469]
r
1a
‑
[l1‑
[(lp1)
z1
‑
(lp2)
z3
‑
(im)
z2
]
z4
‑
l2‑
r
2a
]
z5
[0470]
其中
[0471]
r
1a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
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cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0472]
r
2a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
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‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
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chi2、
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ch2cl、
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ch2br、
‑
ch2f、
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ch2i、
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cn、
‑
oh、
‑
nh2、
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cooh、
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conh2、
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no2、
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sh、
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so3h、
‑
so4h、
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so2nh2、
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nhnh2、
‑
onh2、
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nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
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nhso2h、
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nhc(o)h、
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nhc(o)oh、
‑
nhoh、
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occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
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ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
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och2i、
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och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0473]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
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、
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s
‑
、
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nh
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‑
、
‑
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‑
、
‑
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、
‑
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‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[0474]
lp1和lp2独立地为亲脂性聚合物域；
[0475]
im为ph敏感分解域；z5为1到10的整数；z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和z2为2到100的整数。
[0476]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0477][0478]
其中环a为被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0479]
cart具有下式：
‑
l1‑
[(lp1)
z1
‑
(lp2)
z3
‑
(im)
z2
]
z4
‑
l2‑
r
2a
[0480]
其中，
[0481]
r
2a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
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chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
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ch2f、
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ch2i、
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‑
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‑
so4h、
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so2nh2、
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nhnh2、
‑
onh2、
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nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0482]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
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s
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、
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nh
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、
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‑
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nhc(o)
‑
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、
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‑
、
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nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；lp1和lp2独立地为亲脂性聚合物域；
[0483]
im为ph敏感分解域；z5为1到10的整数；z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和z2为2到100的整数。
[0484]
在实施例中，环a为被取代或未被取代的芳基。在实施例中，环a为被取代或未被取代的苯基。在实施例中，环a为被取代或未被取代的芳基。在实施例中，环a为被取代或未被取代的苯基或萘基。
[0485]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0486]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0487]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0488]
其中cart1、cart2和cart3独立地为本文所定义的cart。
[0489]
在实施例中，z5为1到3的整数。在实施例中，z5为1或3。在实施例中，z5为1。在实施例中，z5为3。在实施例中，r
2a
为氢。在实施例中，l2为一键。
[0490]
在实施例中，ph敏感分解域具有下式：
[0491]
其中n为2或更大的整数。在实施例中，n为2到50范
围内的整数。在实施例中，n为7。
[0492]
在实施例中，亲脂性聚合物域具有下式：
[0493][0494]
其中n2为1到100的整数；r
20
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0495]
在实施例中，lp1具有下式：
[0496][0497]
其中n21为0到100的整数；r
201
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。在实施例中，n21为5和r
201
为未被取代的c
18
烯基。
[0498]
在实施例中，lp2具有下式：
[0499]
其中n22为1到100的整数；r
202
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0500]
在实施例中，n22为5和r
202
为未被取代的c9烯基。
[0501]
在实施例中，所述细胞为真核细胞。在实施例中，所述细胞为哺乳动物或人类细胞。在实施例中，所述细胞形成生物体的一部分。在实施例中，所述生物体为人类。在实施例中，所述细胞为淋巴细胞或骨髓细胞。在实施例中，所述细胞为t细胞。在实施例中，所述细胞为骨髓细胞。
[0502]
在一个方面，提供了一种阳离子两性聚合物。阳离子两性聚合物具有下式：
[0503]
r
1a
‑
[l1‑
[(lp1)
z1
‑
(lp2)
z3
‑
(im)
z2
]
z4
‑
l2‑
r
2a
]
z5
[0504]
其中
[0505]
r
1a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0506]
r
2a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0507]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[0508]
lp1和lp2独立地为亲脂性聚合物域；im为ph敏感分解域；z5为1到10的整数；z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和z2为2到100的整数。
[0509]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0510][0511]
其中
[0512]
环a为被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；cart具有下式：
‑
l1‑
[(lp1)
z1
‑
(lp2)
z3
‑
(im)
z2
]
z4
‑
l2‑
r
2a
[0513]
其中，
[0514]
r
2a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0515]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代
或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[0516]
lp1和lp2独立地为亲脂性聚合物域；im为ph敏感分解域；z5为1到10的整数；z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和z2为2到100的整数。在实施例中，环a为被取代或未被取代的芳基。在实施例中，环a为被取代或未被取代的苯基。在实施例中，环a为被取代或未被取代的芳基。在实施例中，环a为被取代或未被取代的苯基或萘基。
[0517]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0518]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0519]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0520][0521]
其中cart1、cart2和cart3独立地为本文所定义的cart。
[0522]
在实施例中，z5为1到3的整数。在实施例中，z5为1或3。在实施例中，z5为1。在实施例中，z5为3。在实施例中，r
2a
为氢。在实施例中，l2为一键。
[0523]
在实施例中，ph敏感分解域具有下式：
[0524]
其中n为2或更大的整数。在实施例中，n为2到50范围内的整数。在实施例中，n为7。
[0525]
在实施例中，亲脂性聚合物域具有下式：
[0526][0527]
其中n2为1到100的整数；r
20
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0528]
在实施例中，lp1具有下式：
[0529]
其中n21为1到100的整数；
[0530]
r
201
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0531]
在实施例中，n21为5和r
201
为未被取代的c
18
烯基。在实施例中，未被取代的c
18
烯基为油基。
[0532]
在实施例中，lp2具有下式：
[0533]
其中n22为1到100的整数；
[0534]
r
202
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。在实施例中，n22为5和r
202
为未被取代的c9烯基。在实施例中，未被取代的c9烯基为壬烯基。
[0535]
在实施例中，阳离子两性聚合物具有下式：
[0536][0537]
其中n21为5，r
201
为油基，n22为5，r
202
为壬烯基，且n为7。
[0538]
在一方面，提供一种将编码受体蛋白质的核酸转染到个体的细胞中的方法。所述方法包括向个体投与细胞穿透复合物，所述细胞穿透复合物包括结合到化合物的编码受体蛋白质的核酸，其中所述化合物在递送到所述细胞中之后降解，从而将编码受体蛋白质的核酸转染到个体的细胞中。本文中提及的“受体蛋白质”是由其表面上的细胞表达且能够结合配体的蛋白质。受体蛋白质的非限制性实例包括嵌合抗原受体、t细胞受体、b细胞受体、生长因子受体和细胞因子受体。在实施例中，所述受体蛋白质为嵌合抗原受体。在实施例中，所述受体蛋白质为t细胞受体。在实施例中，所述受体蛋白质为抗体。在实施例中，所述受体蛋白质是抗il10。在实施例中，所述受体蛋白质是抗pd1。在实施例中，所述受体蛋白质是抗pdl1。在实施例中，所述受体蛋白质是抗tgfβ。在实施例中，所述受体蛋白质是抗tnfα。在实施例中，所述受体蛋白质是抗il
‑
6。
[0539]
在一方面，提供一种将编码分泌的蛋白质的核酸转染到个体的细胞中的方法。所述方法包括向个体投与细胞穿透复合物，所述细胞穿透复合物包括结合到化合物的编码分泌的蛋白质的核酸，其中所述化合物在递送到细胞中之后降解，从而将编码分泌的蛋白质的核酸转染到个体的细胞中。本文中提及的“分泌的蛋白质”是由细胞分泌到细胞外环境的蛋白质。分泌的蛋白质的非限制性实例包括生长因子或细胞介素。在实施例中，分泌的蛋白质为白细胞介素。在实施例中，分泌的蛋白质为il
‑
12。在实施例中，分泌的蛋白质为il
‑
15。在实施例中，分泌的蛋白质为il
‑
18。在实施例中，分泌的蛋白质为il
‑
3。在实施例中，分泌的蛋白质为il
‑
21。在实施例中，分泌的蛋白质为il
‑
7。在实施例中，分泌的蛋白质为il
‑
9。在实施例中，分泌的蛋白质为ifng。在实施例中，分泌的蛋白质为il
‑
1r拮抗剂。
[0540]
在另一方面，提供一种将编码t细胞受体(tcr)的核酸转染到个体的细胞中的方法。所述方法包括向个体投与细胞穿透复合物，所述细胞穿透复合物包括结合到化合物的编码tcr的核酸，其中所述化合物在递送到所述细胞中之后降解，从而将编码tcr的核酸转染到个体的细胞中。
[0541]
在另一方面，提供一种将编码嵌合抗原受体(car)的核酸转染到个体的细胞中的方法。所述方法包括向个体投与细胞穿透复合物，所述细胞穿透复合物包括结合到化合物的编码car的核酸，其中所述化合物在递送到所述细胞中之后降解，从而将编码car的核酸转染到个体的细胞中。
[0542]
在实施例中，所述细胞受体为t细胞受体(tcr)。在实施例中，所述细胞受体为嵌合抗原受体(car)。在实施例中，car为路易斯y抗原car(即，与路易斯y抗原结合的嵌合抗原受体)。在实施例中，所述car是抗cd44v6 car。在实施例中，所述car是抗nkg2d配体car。在实施例中，所述car是抗叶酸受体βcar。在实施例中，所述car是抗cd38car。在实施例中，所述car是抗cd20 car。在实施例中，所述car是抗cd22 car。在实施例中，所述car是抗flt3 car。在实施例中，所述car是抗cd7 car。在实施例中，所述car是抗cd33 car。在实施例中，
所述car是抗cd123 car。在实施例中，所述car是抗clec12a car。
[0543]
在实施例中，所述化合物为阳离子两性聚合物化合物。在实施例中，所述化合物为本文所提供(包括其实施例)的化合物。在实施例中，所述核酸为mrna。在实施例中，所述核酸为dna。在实施例中，所述car为抗cd19 car。在实施例中，所述核酸进一步编码效应子增强蛋白质。效应子增强蛋白质可以分泌如本文所提供的蛋白质或受体蛋白质。(例如，il
‑
12，抗pd1)。在实施例中，核酸为多种核酸。其中本文提供的核酸为多种核酸，本文所提供的复合物可以包括结合到本文所提供(包括其实施例)的化合物的超过一种核酸(2、3、4、5、6、7或更多)。在实施例中，所述核酸为多顺反子核酸。
[0544]
在实施例中，所述细胞为骨髓细胞或淋巴细胞。在实施例中，所述细胞为骨髓细胞。在实施例中，所述细胞为淋巴细胞。在实施例中，所述细胞为t细胞、b细胞或自然杀手细胞。在实施例中，所述细胞为t细胞。在实施例中，所述细胞为b细胞。在实施例中，所述细胞为自然杀伤细胞。在实施例中，所述细胞为巨噬细胞、嗜酸性粒细胞或嗜中性粒细胞。在实施例中，所述细胞为巨噬细胞。在实施例中，所述细胞为嗜酸性细胞。在实施例中，所述细胞为嗜中性白细胞。在实施例中，所述投与为静脉内、皮下或瘤内投与。在实施例中，所述投与为静脉内投与。在实施例中，所述投与为皮下投与。在实施例中，所述投与为瘤内投与。
[0545]
实例
[0546]
实例1：
[0547]
一般方法和实验
[0548]
材料
[0549]
除非另外指出，否则试剂都是购自西格玛奥德里奇且按原样使用。全部根据文献程序制备1
‑
(3,5
‑
双
‑
三氟甲基
‑
苯基)
‑3‑
环己基
‑
硫脲(《大分子(macromolecules)》39(23):7863
‑
7871)、mtc
‑
胍单体(《美国化学学会杂志(j am chem soc)》131(45):16401
‑
16403)、mtc
‑
十二烷基单体(《美国国家科学院院刊(proc natl acad sci)》109(33):13171
‑
13176)、mtc
‑
哌啶单体(《化学通讯(chem commun)》(1):114
‑
116)、n
‑
boc吗啉酮单体(《美国化学学会杂志(j am chem soc)》136(26):9252
‑
9255)及丹酰基醇(《美国化学学会杂志》131(45):16401
‑
16403)。除非另外指出，否则所有商业溶剂及试剂不经进一步纯化即使用。使用氮气压力使二氯甲烷(ch2cl2)及四氢呋喃(thf)穿过氧化铝干燥柱(solv
‑
tek公司)。从飞世尔科技公司得到石油醚、戊烷、己烷、乙酸乙酯(etoac)和甲醇(meoh)。氘化溶剂购自剑桥同位素实验室。再生纤维素透析膜(6标准rc；mwco 1000)购自光谱实验室公司。
[0550]
mrna
[0551]
在所有以下实例中，egfp mrna(5mec，ψ，l
‑
6101)、fluc mrna(5mec，ψ，l
‑
6107)、ova mrna(5mec，ψ，l
‑
7210)和cy5
‑
egfp mrna(5mec，ψ，l
‑
6402)购自trilink biotechnologies公司。
[0552]
仪器
[0553]
通过malvern zetasizer nano zs90上的动态光散射测量粒度。在bd lsrii facs分析仪(斯坦福大学共享facs设施(stanford university shared facs facility))上进行流式细胞测量术分析。使用具有40x hc pl apo、cs2油性物镜(斯坦福大学细胞科学成像设施(stanford university cell sciences imaging facility))的leica sp8白光共焦
显微镜进行激光扫描共聚焦显微镜法。生物发光使用电荷耦合装置(ccd)相机(ivis 100，加利福尼亚州阿拉米达，xenogen公司)来测量，且使用动态图像软件(living image software)(珀金埃尔默(perkin
‑
elmer))分析。在具有x
‑
cite 120q广域激发光源和gfp过滤器组的zeiss axio观测器z1上进行落射荧光显微法。用coolsnap hq2相机获取图像，且将其转移到计算机进行图像分析。
[0554]
细胞系
[0555]
将hela、j774、hepg2及hek
‑
293细胞维持于补充有10％胎牛血清(fbs)及1％青霉素/链霉素的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(dmem)中。使cho细胞维持于补充有10％fbs和1％青霉素/链霉素的f12培养基中。所有细胞在37℃下在5％co2氛围中生长。在约80％汇合下传代细胞。
[0556]
根据以下方法制备间充质干细胞(psc)：huang等人(《矫形外科转化杂志(j.orthopaedic trans.)》3(1):26
‑
33)。简单来说，从两只8周龄的雌性cd1小鼠切除股骨，且从骨头外部去除组织。随后用无菌剪刀切开骨头的末端。使用3ml注射器和25g针头在经10cm组织培养物处理的皮氏培养皿中用含有青霉素/链霉素的dmem 10％胎牛血清将骨髓从四根骨里冲洗出。破坏骨髓且通过移液分散，但不过滤或以其它方式操控。将培养皿培育6天，接着产生特征单层。随后用pbs洗涤培养物两次，且在37℃下用0.25％胰蛋白酶(gibco)胰蛋白酶化5分钟。随后收集细胞，且将其转移到75cm2组织培养烧瓶中，且培育3天，直到达到90％汇合。培养物可以再维持两代，但在四代后生长大大减少。对于转染，将细胞在24孔板中以1.2
×
104/孔接种。
[0557]
实例2：
[0558]
单体的合成
[0559]
在一些实例中，不同阳离子分解域的cart由新内酯或碳酸酯单体产生。描述前驱体和单体的合成的实例：
[0560]
实例2.1.合成2
‑
氧代吗啉
‑4‑
羧酸叔丁酯(n
‑
boc吗啉酮)：
[0561]
在这些实例中，合成n
‑
boc吗啉酮单体根据以下文献改编：chung等人《美国化学会志(j.am.chem.soc.)》,2013,135(20),7593
‑
7602
[0562][0563]
合成2
‑
氧代吗啉
‑4‑
羧酸叔丁酯：将2.086g(10.2mmol)双(2
‑
羟基乙基)氨基甲酸叔丁酯溶解于75ml ch3cn中，且用氧气鼓泡5分钟。添加398mg(0.38mmol)的[(新亚铜试剂)pd(oac)]2(otf)2，引起形成深红色溶液。将反应物置于60℃的油浴中，且氧气鼓泡通过反应混合物，通过tlc(1:1己烷:etoac)监测。在24小时之后，将263mg(0.25mmol)的[(neo)pd(otf)(ac)]2添加到反应中。在48小时之后，将额外426mg(0.41mmol)的[(新亚铜试剂)pd(oac)]2(otf)2添加到反应物中。在总共72小时之后，停止氧气流动且使反应物冷却到室温。将反应混合物浓缩到5
‑
10ml，产生黑色非粘性混合物且装载到sio2塞上，用1:1己烷:etoac洗脱。浓缩得到1.766g黄色油状物(8.78mmol，86.4％)，其在静置时固化。将此粗产物溶解
于10ml et2o中，接着添加20ml己烷且储存于
‑
30℃下过夜。通过过滤收集沉淀，用戊烷洗涤，得到1.54g白色粉末(7.67mmol，76％产率)。1h nmr(500mhz、cdcl3):δ4.41(br,2h),4.26(s,2h),3.66(t,2h),1.47(s,9h)。
13
c nmr(125mhz、cd3cl):δ28.24,40.63,45.49,67.19,81.33,153.49,166.63。hrms(m/z)：m+，对于c9h
15
no4na的计算值224.0893；实验值，224.0896。
[0564]
实例2.2.合成7
‑
氧代
‑
1,4
‑
氧氮杂环庚烷
‑4‑
羧酸叔丁酯(7
‑
lact)：
[0565][0566]
向火焰干燥的烧瓶中装入4
‑
氧代哌啶
‑1‑
羧酸叔丁酯(205.8mg，1.03mmol)和dcm(10ml)随后在0℃下搅拌15分钟。以两部分形式添加mcpba(600.1mg，2.9mmol)于dcm(5ml)中，随后使其升温到室温。18小时后，将反应混合物转移到分液漏斗且用饱和nacho3(20ml
×
3)洗涤，随后用na2so4干燥且过滤。在减压下去除溶剂，得到317.0mg白色固体。进行硅胶色谱，用9：1dcm:etoac洗脱。浓缩相关洗脱份，得到151.0mg(0.71mmol，68.9％产率)白色固体。1h nmr(500mhz,cd3cl):δ4.21(s,2h),3.82(s,2h),3.65(s,2h),2.81(s,2h),1.46(s,9h)。
13
c nmr(101mhz,cd3cl):δ173.9,154.4,81.1,69.5,47.3,41.3,37.6,28.4
[0567]
实例2.3.合成(2
‑
(双(2
‑
羟基乙基)氨基)
‑2‑
氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯
[0568][0569]
向火焰干燥的烧瓶中装入二乙醇胺(225mg，2.15mmol)和(叔丁氧基羰基)甘氨酸甲酯(370mg，1.95mmol)随后在75℃下在加热浴中搅拌。在18小时之后，使反应通过硅胶塞，用丙酮洗脱。在减压下去除溶剂，得到505.1mg浅黄色油状物(1.93mmol，99％产率)。1hnmr(500mhz、cd3cl):δ5.7
‑
5.6(br,1h),3.99(d,2h),3.78
‑
3.65(m,4h),3.53
‑
3.35(m,4h),3.05(br,1h)。
13
c nmr(101mhz、cd3cl):δ170.4,156.3,79.9,60.0,51.1,42.4,28.3
[0570]
实例2.4.合成(2
‑
氧代
‑2‑
(2
‑
氧代吗啉)乙基)氨基甲酸叔丁酯(甘氨酸单体)：
[0571][0572]
向火焰干燥的烧瓶中装入二醇(450mg，1.72mmol)及乙腈(12ml)随后用空气鼓泡5
分钟。将pd(neo)oac(84.1mg，0.16mmol，9.4mol％)添加到反应物中，且使其在恒定气流下在50℃下搅拌。18小时后，浓缩反应物，用etoac(30ml)湿磨，随后过滤，得到220mg泡沫状的橙色残余物。进行硅胶色谱，用100％etoac洗脱。浓缩相关洗脱份，得到53.1mg(0.205mmol，12％产率)的澄清油状物，其在静置后固化。1h nmr(500mhz、cd3cl):δ5.45
‑
5.3(br,1h),4.5
‑
4.45(q,2h),4.28
‑
4.4(d,2h),4.0
‑
3.93(dd,2h),3.85
‑
3.7(dt,2h),1.45(s,9h)
13
c nmr(125mhz、cd3cl):δ167.7,166.1,164.8,155.8,80.2,66.9,65.9,45.8,44.1,42.4,41.2,39.3,28.3,15.316
[0573]
实例2.5.合成7
‑
gly(酮)：
[0574][0575]
向装有含羟基苯并三唑(600mg，4.4mmol)、edc
‑
hcl(453mg，2.9mmol)、(叔丁氧基羰基)甘氨酸(520mg)的10ml thf中添加tea(500ul)且使其搅拌20分钟。以一部分形式添加4
‑
哌啶酮
‑
hcl
‑
单水合物(462mg，3.0mmol)于thf:h2o的10:1混合物(11ml总)。使反应物搅拌过夜。在减压下浓缩反应物，随后溶解于15ml etoac中且用acoh(500ul)于h2o(10ml)中洗涤，用15ml etoac萃取水相。合并的有机层随后用nahco3(2x20ml)和盐水(1x 20ml)洗涤，随后用mgso4干燥在减压下浓缩，得到375mg白色结晶粉末(50％产率)，其不经进一步纯化即使用。
[0576]
实例2.6.合成7
‑
gly单体
[0577][0578]7‑
gly单体：向装有n
‑
甘氨酰基(boc)4
‑
哌啶酮(28mg，0.11mmol)的烧瓶中添加含mcpba(60mg，0.35mmol)的5ml dcm。使反应物在0℃下搅拌2小时，随后将含mcpba(20mg，0.12mmol)的2ml dcm的另一部分添加到反应混合物中且使其搅拌过夜。在减压下浓缩反应物，随后溶解于10ml etoac中且用nahco(4x 10ml)洗涤，随后用mgso4干燥。粗产物使用9:1etoac:dcm溶剂系统通过sio2色谱来纯化。在减压下浓缩相关洗脱份，得到21mg产物(71％产率)。
[0579]
实例2.7.合成8元碳酸酯类单体
[0580][0581]
8元碳酸酯类单体：这些实例经由报导于以下中的文献程序制备：《美国化学会志(j.am.chem.soc.)》2015,137,13851
‑
13860
[0582]
实例2.8.合成(2
‑
氧代四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑3‑
基)氨基甲酸叔丁酯(mglut)
[0583][0584]
合成(2
‑
氧代四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑3‑
基)氨基甲酸叔丁酯(mglut)：将1.078g(4.9mmol)(s)
‑
(
‑
)
‑2‑
(boc
‑
氨基))
‑
1,5
‑
戊二醇溶解于10ml ch3cn(0.49m)中且用空气鼓泡5分钟。添加0.233g(0.45mmol)的[(neo)pd(otf)(oac)]2，使澄清溶液变成橙色，其变暗成黑色。在45℃下使反应物置于油浴中，且鼓泡空气通过反应混合物。通过1h nmr监测反应，发现乳醇峰在5.1ppm下消失。在44小时的过程中，按反应进程计，将总共0.310g(0.6mmol，12mol％)的[(neo)pd(otf)(oac)]2逐份添加到反应中。在44小时在1h nmr下，展现出反应完成。停止气流，且使反应物冷却到室温。浓缩反应混合物，且将残余物溶解于50ml etoac中且超声处理，随后通过硅藻土塞过滤，随后浓缩，得到0.940g粉红橙色油状物，其在静置时固化。进行硅胶色谱，用4:1dcm:etoac洗脱。浓缩相关洗脱份，得到0.480g(2.23mmol)白色固体(46％产率)。光谱数据符合先前报告。xie,x.和stahl,s.s.《美国化学会志(j.am.chem.soc.)》,2015,137(11):3767
‑
3770
[0585]
实例2.9.合成磷酸酯类单体
[0586][0587]
磷酸酯类单体：一些实例包括磷酸酯或磷酸酯类阳离子分解域的合成。在此的一个实例中，根据先前文献程序合成所需单体(mckinlay,c.j.等人《美国化学会志(j.am.chem.soc.)》2016,138(10),3510
‑
3517,wo2017083637 a1)。简单来说，(对于实例2
‑
(6
‑
双
‑
boc胍基己氧基)
‑
1,3,2
‑
二氧杂磷杂环戊烷
‑2‑
氧化物)：在惰性n2氛围下(手套箱)将2
‑
氯
‑
1,3,2
‑
二氧杂磷杂环戊烷
‑2‑
氧化物(797mg，5.59mmol，1.25当量)称量到舒伦克瓶中。在氮气下将其放在冰上，并且添加thf((75ml)。在单独瓶中，将己醇(7.16g，20.0mmol，1当量)溶解于thf(10ml)中且添加三乙胺(2.8ml，20mmol，1当量)。在10分钟的过程中，经由注射器将小瓶内容物逐滴添加到舒伦克瓶中，且使其反应20小时。在反应之后，将产物在垫上过滤。将粗产物溶解于少量(5ml)thf中且用20ml无水戊烷湿磨。使产物在
‑
55℃
冰箱中成油状析出过夜。去除戊烷层且在真空下干燥10小时，得到呈淡黄色油状物的纯产物(79％产率)。根据以下标准程序合成且去保护此单体。
[0588]
实例3：
[0589]
cart的聚合
[0590]
通用程序
[0591]
向单体和引发剂于甲苯中的溶液中添加dbu:tu共催化系统的溶液。搅拌反应物2小时，随后添加呈固体状的具有分解域的单体，且随后搅拌2小时。反应物用乙酸(或苯甲酸)淬灭，随后透析于针对meoh的dcm。在透析之后，在减压下去除溶剂，得到纯的寡聚物。随后使用tfa/dcm或hcl/et2o对寡聚物去保护，得到两性cart。将cart在dmso中稀释到2.0mm，且随后在不进一步纯化的情况下用于转染研究。
[0592][0593]
包括使用tfa/dcm或hcl et2o去保护
[0594]
tfa去保护的实例：向溶解于1.0ml无水dcm中的10.5mg寡聚物添加100ul tfa。将反应物搅拌8小时。在减压下去除溶剂，得到呈残余物形式的10.3mg cart(tfa盐)。
[0595]
hcl去保护的实例：以两部分形式向15mg受保护的cart中添加含2.0m hcl的et2o(总共2ml)。将反应物搅拌18小时，随后在减压下浓缩，得到呈残余物形式的12.1mg cart(hcl盐)。
[0596]
引发剂的实例：单功能醇(即苯甲醇，1
‑
芘丁醇)peg、荧光染料(丹磺醯基、bhq、bdk)、多功能醇(三苯甲醇、peg二醇)、靶向配体(生物素、叶酸)和共轭配体(生物素)。
[0597]
根据以下文献报告中所述改编亲本吗啉酮类cart：mckinlay等人《美国国家科学院院刊》,2017,e448
‑
e456
[0598][0599]
制备共寡聚物d
n
:a
m
.对于代表性合成d13:a11：
[0600]
向火焰干燥的小瓶中装入mtc
‑
十二烷基单体5(33.2mg，0.1mmol)、丹磺醯基引发
剂3(3.9mg，0.013mmol)和50μl ch2cl2。将含二氮杂双环十一烯(dbu)(0.8mg，0.005mmol)和硫脲催化剂(tu)(2.0mg，0.005mmol)的50μl ch2cl2添加到反应瓶中且使其搅拌。在2h之后，将呈固体状的n
‑
boc单体(22.3mg，0.11mmol)添加到小瓶中，且使反应物搅拌3h。在总计5h之后，将反应物用五滴acoh淬灭，随后在减压下浓缩。将粗物质相对于meoh(1.0
‑
kda透析包)在ch2cl2中透析。浓缩得到37.9mg浅绿色残余物。通过1hnmr的端基分析(2.8ppm)显示dp 13:11。
[0601]
向溶解于0.8ml无水dcm中的23.5mg寡聚物中添加20ul tfa。将反应物搅拌18小时。在减压下去除溶剂，得到23.1mg cart作为残余物。
[0602]
acl类cart
[0603]
不同的阳离子分解域的cart的实例如下：
[0604][0605]
向火焰干燥的小瓶中装入十二烷基
‑
mtc(33.0mg，0.1mmol)和1
‑
芘丁醇(2.3mg，0.0083mmol)和50μl甲苯。将含dbu(0.76mg，0.005mmol)和tu(1.85mg，0.005mmol)的50μl甲苯添加到反应瓶中且使其搅拌。在2小时之后，添加呈固体状的7
‑
lact(实例1.2)(21.5mg，0.1mmol)，且搅拌反应物。在再搅拌2小时之后，用一滴乙酸淬灭反应物。将粗物质相对于meoh(1.0kda透析包)在dcm中透析。在减压下浓缩得到41mg(76％产率)。
[0606]
向溶解于1.0ml无水dcm中的10.5mg寡聚物中添加100ul tfa。将反应物搅拌8小时。在减压下去除溶剂，得到10.3mg cart作为残余物。
[0607]6‑
gly类cart
[0608][0609]
向火焰干燥的小瓶中装入十二烷基
‑
mtc(32.8mg，0.1mmol)及1
‑
芘丁醇(2.3mg，0.0083mmol)及50μl dcm。将含dbu(0.76mg，0.005mmol)和tu(1.85mg，0.005mmol)的50μl dcm添加到反应瓶中且使其搅拌。在2小时之后，添加呈固体状的(2
‑
氧代
‑2‑
(2
‑
氧代吗啉)乙基)氨基甲酸叔丁酯(36mg，0.14mmol)，且搅拌反应物。在再搅拌2小时之后，用一滴乙酸淬灭反应物。将粗物质相对于meoh(1.0kda透析包)在dcm中透析。在减压下浓缩，得到47mg(68％产率)。
[0610]
向溶解于1.0ml无水dcm中的11.1mg寡聚物中添加100ul tfa。将反应物搅拌8小
时。在减压下去除溶剂，得到呈残余物形式的11mg cart。
[0611]7‑
gly类cart
[0612][0613]
向火焰干燥的小瓶中装入十二烷基
‑
mtc(32.2mg，0.1mmol)和苯甲醇(0.9mg，0.0083mmol)和50μl甲苯。将含dbu(0.76mg，0.005mmol)和tu(1.85mg，0.005mmol)的50μl甲苯添加到反应瓶中且使其搅拌。在2小时之后，添加呈固体状的(2
‑
氧代
‑2‑
(7
‑
氧代
‑
1,4
‑
氧氮杂环庚烷
‑4‑
基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(32.1mg，0.1mmol)，且搅拌反应物。在再搅拌2小时之后，用一滴乙酸淬灭反应物。将粗物质相对于meoh(1.0kda透析包)在dcm中透析。在减压下浓缩，得到49mg(77％产率)。
[0614]
向溶解于2.0ml无水dcm中的21mg寡聚物中添加200ul tfa。将反应物搅拌8小时。在减压下去除溶剂，得到呈澄清黄色残余物形式的21.3mg cart。
[0615]
carb类cart
[0616][0617]
向火焰干燥的小瓶中装入十二烷基
‑
mtc(33.1mg，0.1mmol)及5
‑
(二甲氨基)
‑
n
‑
(2
‑
羟基乙基)萘
‑1‑
磺酰胺(丹酰基醇)(2.8mg，0.0083mmol)和50dcm。将含dbu(0.76mg，0.005mmol)和tu(1.85mg，0.005mmol)的50μl dcm添加到反应瓶中且使其搅拌。在2小时之后，添加呈固体状的8
‑
carb(23.2mg，0.1mmol)。在再搅拌2小时之后，用一滴乙酸淬灭反应物。将粗物质相对于meoh(1.0kda透析包)在dcm中透析。在减压下浓缩，得到54.1mg(96％产率)。
[0618]
向溶解于1.0ml无水dcm中的12mg寡聚物中添加100ul tfa。将反应物搅拌9小时。在减压下去除溶剂，得到呈残余物形式的12mg cart。
[0619]
glu类cart
[0620]
[0621]
向火焰干燥的小瓶中装入十二烷基
‑
mtc(15.5mg，0.05mmol)和苯甲醇(0.5mg，0.004mmol)和50dcm。将含dbu(0.4mg，0.0025mmol)和tu(0.9mg，0.0025mmol)的50μl dcm添加到反应瓶中且使其搅拌。在2小时之后，添加呈固体状的(2
‑
氧代四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑3‑
基)氨基甲酸叔丁酯(m
glut
)(18.1mg，0.084mmol)。在再搅拌2小时之后，用一滴乙酸淬灭反应物。将粗物质相对于meoh(1.0kda透析包)在dcm中透析。在减压下浓缩，得到17.9mg(51％产率)。
[0622]
向溶解于1.0ml无水dcm中的9.0mg寡聚物中添加100ul tfa。将反应物搅拌9小时。在减压下去除溶剂，得到呈残余物形式的9.0mg cart。
[0623]
通过这些方法合成的cart的额外实例详述于下表中：
[0624][0625][0626]
实例4：
[0627]
cart/核酸复合物
[0628]
在一些实例中，通过将具有0.59μl cart(来自于dmso中的2mm储备液)的5.71μl不含rnase的pbs(用1n hcl调节到ph 5.5)和egfp mrna(来自于pbs中的0.2μg/μl储备液，ph 7.4)混合以实现10:1/
‑
cart/mrna比率来制备cart/mrna聚合复合物。在处理或分析之前，在室温下培育这些cart/mrna复合物20秒。
[0629]
在比较实例中，对应量的其它cart用于等于相同10:1+/
‑
电荷比率。
[0630]
粒度和ζ电位的dls表征
[0631]
某些实例展现的动态光散射(dls)可以用于分析cartd
13
:a
11
和形成于其与egfpmrna之间的聚电解质复合物。在ph5.5下，所得聚合复合物的流体动力学直径为254
±
10nm。当将这些聚合复合物添加到细胞培养基中时，在两小时内出现从254nm到512nm的流体动力学直径的变化。
[0632]
当将cart/mrna复合物添加到无缓冲的水时，在全部两小时实验内大小保持在257
±
24nm下。
[0633]
ζ电位测量结果与粒度数据一致，其中表面电荷在+33
±
7mv下开始且在两小时内发展成
‑
30
±
3mv。这符合阳离子铵重排成中性酰胺，由于相关寡核苷酸而使表面主要为阴离子性的。虽然不受理论束缚，但对于均寡聚物(分钟)和mrna聚合复合物(小时)的重排速率的差异似乎反映了α
‑
氨基酯材料在缓冲的水性环境中的稳定性的复合依赖性增加。这使得cart/mrna复合物能够在细胞内降解之前在ph7.4下在治疗上相关的时间标度上保持稳定。
[0634]
作为比较实例，当由非分解转运蛋白d
13
:g
12
形成复合物时(图7b)，还形成了250nm的粒子。然而，这些粒子的大小和ζ电位并不随时间变化，指示不发生降解。
[0635]
作为比较实例，所调配的聚合复合物的大小为非货物依赖性的。当由萤光素酶(fluc)mrna(为egfp(fluc＝1929nt相对于egfp＝996nt)的长度的约两倍)形成聚合复合物，且在ph7.4下添加到细胞培养基中时，所述聚合复合物展现出与用egfpmrna形成的相同的行为，表明cart启用的递送可能是通用的，以多种mrna大小工作。
[0636]
确切地说，对于这些实例，使用500ngegfpmrna以10:1(阳离子:阴离子)电荷比率制备mrna/共寡聚物复合物且添加至120μl不含rnasepbsph5.5、7.4或中性不含rnase的水。将溶液立即转移到一次性透明塑料比色杯且测量大小。在初始时间(1min)和以15min间隔历经2h进行尺寸测量。所报告的大小为z平均。ζ电位测量结果通过将经调配用于dls的mrna:共寡聚物复合物稀释到800μl水中、转移到ζ细胞(dts1060)且测量ζ电位。报告的所有值是三个试验运行的最小值的平均值。误差表示为
±
sd。在一些其它实例中，阳离子与阴离子之间的比率可以是约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10、约1:11、约1:12、约1:13、约1:14、约1:15、约1:16、约1:17、约1:18、约1:19、约1:20、约1:30或更高。在一些其它实例中，阴离子与阳离子之间的比率可以是约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10、约1:11、约1:12、约1:13、约1:14、约1:15、约1:16、约1:17、约1:18、约1:19、约1:20、约1:30或更高。
[0637]
实例5：
[0638]
cart的mrna递送egfpmrna递送和在多个细胞系中的表达
[0639]
在一些实例中，cart，d
13
:a
11
提供在具有>99％转染效率和较高平均荧光强度的hela细胞中极佳的egfp表达。(图9a、b、d)
[0640]
举例来说，cart，d
13
:a
11
的转染，将hela细胞以40,000个细胞/孔接种于24孔板中且使其粘附过夜。通过混合不含rnase的pbsph5.5和egfpmrna与来自dmso储备溶液的各种量的寡聚物来制备寡聚物/mrna聚合复合物，以获得特定共寡聚物/mrna比率(优化到理论阳离子:阴离子的比率10:1，8.4μl总体积)。在处理之前在室温下培育复合物20秒。根据
制造商的说明书在optimem中制备lipofectamine
tm
2000对照。用无血清的dmem洗涤细胞且将mrna/lipo溶液添加到200μl/孔和125ng mrna/孔的最终体积中。在用无血清dmem洗涤之后，将2.5μl的mrna/共寡聚物复合物添加到200μl的总体积，所有条件一式三份地进行，最终mrna浓度为125ng/孔。将细胞在37℃下培育8小时，随后用胰蛋白酶
‑
edta(0.05％)在37℃下进行胰蛋白酶化10分钟。添加含血清的dmem，且将各孔的内容物离心，去除上清液，且将经粒化的细胞再分散于pbs(125μl)中且转移到facs管中，且在流式细胞仪分析器上(lsr
‑
ii.uv，斯坦福大学(stanford university))读取。呈现的数据(图9)为来自所分析的10,000个细胞的几何平均荧光信号。对于转染效率，将未处理的细胞门控为无egfp表达，且所呈现的数据为用比未经处理的细胞更高的egfp表达分析的10,000个细胞的百分比。误差表示为
±
sd。注意：所有其它细胞系如上在其相应培养基中使用。对于hepg2细胞，将5mm edta添加到用于再悬浮细胞球粒以便流式细胞测量术的pbs中。
[0641]
具有较长嵌段长度(d
18
:a
17
)的第二cart提供更高转染效率(>90％)但具有更低平均转染值(图9a)。在比较实例中，由α
‑
氨基酯均寡聚物a
13
形成的复合物诱导无egfp表达，其表明对于寡核苷酸递送，疏水性域是必需的。作为另一比较实例，当用脂染胺调配的mrna处理hela细胞时，观察到仅适度水平的egfp表达，且仅约50％的细胞展现出荧光。
[0642]
在一些其它实例中，为了优化cart d
13
:a
11
的递送参数，阳离子寡聚物与阴离子mrna的电荷比在1:1至50:1(+/
‑
)范围内变化，且确定所得egfp荧光(图9c)。值报告为铵阳离子的摩尔数与磷酸根阴离子的摩尔数的理论(+/
‑
)电荷比，假设完全胺质子化和磷酸根去质子化。egfp表达显示出对电荷比的大致抛物线依赖性，其中由以10:1(+/
‑
)电荷比形成的复合物产生的最大egfp荧光。此值高于在用于sirna递送的富含胍的寡聚碳酸酯复合物下观察到的值，其以4.8:1的电荷比最优地执行。落射荧光显微法进一步用于确认流式细胞测量术结果(图9d)。用cart/mrna复合物处理的hela细胞在几乎所有可观察的细胞中显示出显著荧光。相比之下，用脂染胺处理的细胞展现出部分egfp表达，而剩余其它未转染。
[0643]
在其它实例中，在一组细胞系中分析通过cart，d
13
:a
11
递送之后egfp mrna表达，包括通常被视为难以转染的那些细胞系。除hela细胞以外，通过用由egfp mrna形成的cart复合物处理将mrna表达与以下中的脂染胺的mrna表达进行比较：鼠类巨噬细胞(j774)、人类胚肾(hek
‑
293)、中国仓鼠卵巢(cho)和人类肝细胞癌(hepg2)细胞(图6a)。在所测试的所有细胞系中，使用cart d
13
:a
11
表达egfp的细胞的百分比>90％，而用脂染胺处理仅在22到55％的细胞中诱导表达(图11a)。这表明此递送系统对于多种人类和非人类细胞类型是通用的。除永生化细胞系以外，还在具有较高转染效率(>85％)的原代cd1小鼠衍生的间充质干细胞(msc)中观察到mrna表达。
[0644]
其它实例已在包括以下的其它细胞系中表现出cart活性(对于转染来说，其具有更多的挑战性)：杰卡特t细胞(11％用cart转染相对于7％用于脂染胺)、原代t细胞(6％转染相对于0％用于lipo)以及3t3成纤维细胞(70％用于cart相对于59％用于lipo)和滋养层干细胞(19％用于cart相对于69％用于lipo)。
[0645]
在一些实例中，还使用不同长度的mrna(如较大萤火虫萤光素酶(fluc)mrna)观察到通过cart d
13
:a
11
的一致mrna转染，实质上胜过脂染胺>3倍(图11b)。类似于在egfp mrna下观察到的趋势，10:1(阳离子:阴离子)比率产生最高含量的fluc生物发光，尽管mrna长度有差异，指示递送效率在很大程度上与货物大小无关。
[0646]
对于这些实例，将hela细胞在黑色96孔板中接种10,000个细胞/孔且使其粘附过夜。如上文使用fluc mrna(最终浓度为50μl总体积中的50ng mrna/孔)制备mrna聚合复合物和lipofectamine
tm
2000对照物。所有条件都以六次重复进行。细胞经由在37℃下处理8h来培育，随后去除培养基，且将含100μl的d
‑
萤光素溶液(300μg/ml)的dmem添加到细胞中。使用ivis 50或ivis 200(珀金埃尔默的xenogen产品线)电荷耦合装置相机及动态图像软件来测量所得发光。数据表示三个实验的平均值，其中误差表示为
±
sd。
[0647]
电荷可变型分解域
[0648]
通过递送egfp mrna和cy5标记的egfp mrna的混合物，mrna内化和表达的分析可以去耦合且同时定量；cy5荧光指示内化mrna(无关于定位)，且egfp荧光指示mrna的胞质释放和后续表达。此方法揭露了通过比较两种寡聚物的细胞摄取和mrna表达与cart d
13
:a
11
:非分解性、含胍d
13
:g
12
和非分解性、含铵d
13
:pip
13
主链结构和阳离子类型的影响。
[0649]
在这些实例中，当用cart，d
13
:a
11
调配cy
‑
5mrna时，观察到细胞内cy5和egfp荧光两者的较高水平(图10b、d)。作为比较实例，当使用非分解性含胍d
13
:g
12
或非分解性含铵d
13
:pip
13
时，仅观察到cy5
‑
荧光。此实例指示所有三个mrna复合物由细胞内化，但不具有快速降解的主链，来源于d
13
:g
12
和d
13
:pip
13
的非分解性聚合复合物在实现可检测水平的翻译所必需的时间标度上不释放mrna。通过由含铵d
13
:pip
13
形成的复合物的egfp表达的缺乏进一步表明cart，d
13
:a
11
的功效并非简单地归因于铵对胍阳离子的静电结合亲和力的差异。确切地说，通过分解重排的阳离子电荷的特定、受控的损失对于功效来说是至关重要的。
[0650]
确切地说，在这些实例中，为了测量寡聚物/mrna聚合复合物的细胞摄取和释放，在最终浓度为62.5ng mrna/孔下使用经cy5标记的egfp mrna将hela细胞用如上所述制备的聚合复合物处理。制备细胞且通过流式细胞测量术分析egfp和cy5荧光两者，如上所述。
[0651]
额外实例确认在当前实施例中使用共聚焦显微镜法的分解的必要性。与无效转运蛋白(d
13
:g
12
)相比，cart介导的mrna释放和cart，d
13
:a
11
的胞内体逸出通过共聚焦显微镜，同时检测丹磺醯基转运蛋白、cy5
‑
mrna和四甲基罗丹明(tritc)
‑
葡聚糖
4400
，用于胞内体隔室的染色剂，而进一步确认。当在用cart d
13
:a
11
/cy5
‑
mrna复合物处理之后4小时对细胞成像时，观察到cy5和丹磺醯基荧光团两者的扩散荧光，指示那些材料成功逸出胞内体且从聚合复合物解离(图10d)。还观察到来自(tritc)
‑
葡聚糖
4400
的扩散荧光，其可能归因于胞内体破裂和捕获的葡聚糖的释放。作为比较实例，当细胞用非分解性d
13
:g
12
/cy5
‑
mrna复合物处理时，cy5和丹磺醯基荧光均保持点状和共局部化。这些信号还与点状tritc
‑
葡聚糖
4400
强烈重叠，指示胞内体包裹(图10d)。综合在一起，这些数据强烈地表明cart d
13
:a
11
的电荷可变型行为实现胞内体破裂和mrna释放，有助于这些材料的高性能用于mrna递送。
[0652]
确切地说，对于共聚焦显微镜实例：将hela细胞以10,000个细胞/孔接种于8室的玻璃底培养皿(nunc lab
‑
tek ii，赛默科技)中且使其粘附过夜。在处理之前，用无血清dmem洗涤细胞，且将200μl具有100μm tritc
‑
葡聚糖(sigma，平均摩尔wt.＝4,400)的无血清的dmem添加到每个孔中。cy5
‑
egfp mrna聚合复合物经如上制备(125ng mrna/孔的最终浓度)且将其添加到每个对应孔中。在37℃下培育细胞4小时，随后去除培养基且添加含有10mm hepes缓冲溶液的500μl的pbs。细胞使用针对dapi(丹磺醯基)、gfp、dsred(tritc
‑
葡聚糖)和cy5调谐的leica sp8白光共焦显微镜成像。
[0653]
cart的体内递送mrna
[0654]
在某些实例中，cart，如d
13
:a
11
已经在体内展现出极佳基因表达。在一个实例中，与萤光素酶mrna复合且肌肉内投与到balb/c小鼠中的cart d
13
:a
11
表现出较高水平的生物发光。作为比较实例，尚未与递送剂复合的mrna未展现出所得生物发光。此表达在4h时达到峰值，且在48h之后仍可观察到。在这些实例中，使7.5μg的萤光素酶mrna与d
13
:a
11
以10:1电荷比在75μl的pbs的总体积(ph 5.5)中复合且注射到balb/c小鼠的右大腿肌肉中(图11c、d)。
[0655]
在另一实例中，与萤光素酶mrna复合的d
13
:a
11
在经由静脉内尾部静脉注射投与时展现出较高水平的生物发光。较高水平表达持续24小时，其中在48小时之后可检测生物发光。生物发光主要在这些图像中局部化到脾脏和肝脏(图11e、f)。当静脉内投与裸mrna时未观测到生物发光信号。 对于所研究的所有小鼠，注射后立即或在处理后持续若干周未观察到毒性。
[0656]
作为额外实例，与cart o
11
:a9、d
12
:gly
10.5
和d
14
:a
‑
甲基
14.5
复合的fluc mrna的静脉内投与均在肝脏和/或脾脏中产生显著萤光素酶表达。在这些实例中，使7.5μg的萤光素酶mrna与cart以10:1电荷比在75μl的pbs的总体积(ph 5.5)中复合且注射到balb/c小鼠的尾部静脉中。
[0657]
在额外实例中，与萤光素酶mrna复合的d
13
:a
11
当经由瘤内注射投与时展现出较高水平的生物发光。在此实例中，使4μg的萤光素酶mrna与d
13
:a
11
以10:1电荷比在75μl的pbs的总体积(ph 5.5)中复合且注射到实体皮下a20淋巴瘤肿瘤的中心中。
[0658]
在额外实例中，与萤光素酶mrna复合的cart o
11
:a9、d
12
:gly
10.5
和d
14
:a
‑
甲基
14.5
当通过皮下注射投与时展现出较高水平的生物发光。在此实例中，使5μg的萤光素酶mrna与d
13
:a
11
以10:1电荷比在75μl的pbs的总体积(ph 5.5)中复合且注射到balb/c小鼠背部的皮肤下。
[0659]
作为比较实例，当现有技术d
12
:g
12
与fluc mrna复合时，未观察到所得生物发光。在此实例中，使5μg的萤光素酶mrna与d
13
:a
11
以10:1电荷比在75μl的pbs的总体积(ph5.5)中复合且注射到balb/c小鼠背部的皮肤下。
[0660]
使用新带电域的mrna递送和表达
[0661]
比较实例：使用由原始实施例展现的电荷可变型基元，合成不同化学结构的新单体和新cart寡聚物。这些cart展现出有效地封装且转染荧光标记的(cy5)mrna，其中一些变化(如d9:(7
‑
lact)
11
和d
12
:(7
‑
甘氨酸)
11
)产生比亲本d
13
:a
11
系统更高(1.1到1.2倍)的细胞内cy5荧光。这些cart(a
‑
me，a
‑
me
‑
co
‑
a)的一些变项表现出一些mrna表达。
[0662]
亲脂性聚合物域
[0663]
一些实例包括含有材料的亲脂性聚合物域(或可互换脂质嵌段)的变化的cart。申请人已证实，含有胆固醇、壬烯基、十八烷基、油基和亚油基侧链的以亲脂性聚合物域形式并入的cart的合成。当与egfp mrna复合时，这些变异体显示出油基和亚油基官能化的材料的不同性能，得到与十二烷基类系统类似的转染效率。
[0664]
一些工作表明脂质嵌段或亲脂性聚合物域变化影响粒度和ζ电位，如通过动态光散射所测量，亚油基和油基材料维持比十八烷基和十二烷基类cart更久的正ζ电位。
[0665]
新的引发剂
[0666]
一些实例已探索用于开环聚合的引发醇的变化，以便将额外功能性并入到cart
中。已探索的引发剂包括荧光团(丹磺醯基和bdk)、支链(3臂)部分、荧光淬灭剂(bhq)和生物素化衍生物。含有不同引发剂官能团的类似单体嵌段长度的cart一般展现出与原始实施例类似的egfp mrna转染效率。
[0667]
在一些实施例中，引发剂可以具有下式：
[0668][0669]
荧光引发剂已经用于通过流式细胞测量术和共聚焦显微镜独立地追踪货物(mrna)和转运蛋白(丹磺醯基或bdk)的摄取。淬灭引发剂已经用于监测荧光标记的mrna或mirna货物的释放，通过监测荧光从淬灭的粒子释放后的重新出现。
[0670]
初始结果表明，3臂引发剂可以将结构变化引入到cart/mrna粒子中(例如大小和ζ电位)，同时维持mrna转染效率。
[0671]
初始结果表明，生物素衍生的引发剂可以用于靶向癌细胞或通过生物素/抗生蛋白链菌素互补性连接额外的货物。
[0672]
实例6：
[0673]
相对离子
[0674]
先前实例涉及使用三氟乙酸的boc
‑
去保护，其引起到与阳离子的三氟乙酸根相对阴离子。申请人还已证实，在包括盐酸(hcl)的不同条件下去保护的cart的类似功效，得到氯离子相对离子。所得cart盐显示出与原始实施例几乎相同的转染效率/表达。
[0675]
实例7：
[0676]
mrna的组合
[0677]
在一些实施例中，多个mrna可以组合到单一cart复合物中。此的一个实例为cart d
13
:a
11
与egfp mrna和mcherry mrna的二元混合物的共调配物。在这些条件下，egfp与mcherry的所得比率反映了mrna转录物到复合物中的进料比。额外流式细胞测量分析表明所有细胞都是双倍正或双倍负的，表明将两种转录物并入相同cart/mrna粒子而非含有每一转录物的分离粒子中。通过在添加cart和处理之前简单混合两种转录物实现这种共调配物，且不需要额外优化。
[0678]
在另一实例中，通过将cart d
13
:a
11
/mrna复合物与egfp和fluc mrna的二元混合物共调配来展示多个mrna转录物的同时表达。这些聚合复合物以与调配物中的转录物的质量％成比例的水平诱导两种独特蛋白质的表达。
[0679]
实例8：
[0680]
其它寡核苷酸货物
[0681]
除了在mrna递送方面的工作以外，申请人还已探索了我们的各种cart系统用于递送其它核酸货物。sirna、mirna、微环dna和pdna的摄取和活性展示为适用于cart技术。对于这些货物中的许多，凭经验确定cart优化(例如电荷比、脂质域的长度/不饱和程度)。
[0682]
sirna
[0683]
包括未被取代的吗啉酮类(d
13
:a
11
)和7元甘氨酸官能化内酯(d
10
:(7
‑
gly)
11
)的多个cart已经证实了对sirna诱导的基因敲落具有较高功效水平。出人意料的是，表现出摄取荧光mrna但未产生mrna翻译的如(d
10
:(7
‑
gly)
11
)等系统通过以较低sirna剂量(例如5皮摩尔/孔)递送sirna，将仍然引起>85％基因敲落的蛋白质表达。
[0684]
比较实例：这两种cart递送剂显著优于由非释放转运蛋白(如d:g 4:4)组成的现有技术(参考文献wo2013036532 a1和《美国国家科学院院刊》2012,109(33),13171
‑
13176)，所述非释放转运蛋白在这些条件下仅表现出50％的基因敲落。
[0685]
具体来说，根据从(geihe等人《美国国家科学院院刊》2012,109(33),13171
‑
13176)修改的程序进行sirna基因敲落实验。将表达tdtomato/egfp的hacat细胞以10,000个细胞/孔接种于96孔板中且使其在37℃下培育18
‑
24小时。通过首先将2μl的25μm的cbl3sirna储备液与17.60μl ph 5.5的pbs预混合来制备sirna/cart复合物。将cart由2mm的dmso储备液添加到此中，以实现10:1的净阳离子:阴离子电荷比。将溶液混合20秒，之后将5μl添加到含有100μl无血清dmem的96孔板的3个孔中的每一个中，得到5皮摩尔/孔的sirna净浓度。使细胞与复合物一起培育4小时，在此时间之后将培养基用含血清的dmem替换且培育细胞48小时。在培育之后，细胞用pbs洗涤，胰蛋白酶化，且通过流式细胞测量术分析。用以下公式计算tdtom表达的标准化百分比：(平均荧光tdtom
处理的细胞
/平均荧光egfp
处理的细胞
)/(平均荧光tdtom
未处理的细胞
/平均荧光egfp
未处理的细胞
)x 100。
[0686]
mirna
[0687]
在一些实例中，核酸货物为荧光标记的mirna。流式细胞测量术分析显示，相较于其它转染方法，如脂染胺和聚(乳酸
‑
共
‑
乙醇酸)纳米粒子，使用cart d
13
:a
11
对经标记mirna有稳健的摄取。在这些实例中，mirna的摄取的最优电荷比是20:1(阳离子:阴离子)，其高于针对mrna(10:1)所观察到的。
[0688]
具体来说，使用经cy5标记的mirna测量mirna摄取。简单来说，将hela细胞以40,000个细胞/孔接种于24孔板中且使其在37℃下粘附过夜。通过首先将2.1μl的0.2μg/μlcy5
‑
mirna(序列：cy5
‑
upcpapacaucagucugauaapgpcpupa)的储备液与5.72μl ph5.5的pbs预混合来制备cart/mirna复合物。随后，在即将转染之前，将cart由2mm的dmso储备液添加到此中，以实现10:1的净阳离子:阴离子电荷比。将此混合20秒，之后将5μl添加到含有200μl无血清dmem的24孔板的3个孔中的每一个中，得到125ng/孔的最终mirna浓度。此在37℃下培育8小时。在此时间之后，细胞用pbs洗涤，胰蛋白酶化，并且通过流式细胞测量术确定细胞内cy5荧光。
[0689]
pdna
[0690]
在一些实例中，核酸货物为双链质粒dna(pdna)，而非前述rna货物。在这些情况下，cart显示出与如脂染胺的商业药剂相比改进的功效(约2.5倍)，引起更高的转染效率和中位荧光强度。具体来说，将编码ppkcδ
‑
gfp的质粒用作荧光报告子。在一些情况下，含有不同脂质嵌段或亲脂性聚合物域的cart比cart d
13
:a
11
对于质粒递送更有效，其中油基和亚油基官能化材料表现出最高的转染效率。
[0691]
cart/pdna复合物的粒度通常小于类似含mrna的粒子，对于大多数化合物，流体力学直径为90nm到110nm，且对于亚油基官能化cart，流体动力直径为390nm。ζ电位遵循与
mrna粒子相同的趋势，在约+40mv下开始，且随着电荷可变型重排发生而降低到
‑
40mv。
[0692]
转染的特定实验细节：例如利用cart o
11
:a9的转染，将cho细胞以40,000个细胞/孔接种于24孔板中且使其粘附过夜。pdna:cart复合物通过混合ph 5.5的pbs和ppkcδ
‑
gfp与来自dmso储备溶液的各种量的寡聚物来制备，以实现特定pdna/cart比率(优化为理论阳离子:阴离子比率为25:1，115μl总体积))。在处理之前在室温下培育复合物20秒。脂染胺2000对照物根据制造商说明书在optimem中制备。将细胞用无血清f
‑
12培养基洗涤且添加pdna/脂染胺溶液，得到最终体积为500μl/孔和679ng pdna/孔。在用无血清f
‑
12培养基洗涤之后，将37.5μl的pdna/cart复合物添加到三个孔中的每一个中，得到总体积为500μl且最终pdna浓度为674ng/孔。在37℃下培育细胞24小时，此时将所述培养基用含血清的f
‑
12培养基替换。将细胞再培育24h，且随后在37℃下用胰蛋白酶
‑
edta(0.25％)胰蛋白酶化5分钟。添加含血清的f
‑
12培养基且使每个孔的内含物离心。去除上清液且将经粒化的细胞再分散于pbs(200μl)中，转移到facs管中，且在流式细胞仪分析仪上(lsr
‑
ii.uv，斯坦福大学)读取。所呈现的数据为来自所分析的5,000到10,000个细胞的几何平均荧光信号。对于转染效率，将未处理的细胞门控为无egfp表达，且所呈现的数据为所分析的与未经处理的细胞相比egfp表达更高的细胞的百分比。误差表示为
±
sd。
[0693]
通过递送cart/p转座酶的稳定转染
[0694]
在一些实例中，可以同时递送多个质粒，如分别编码p萤光素酶(含有转座酶识别位点)和p转座酶的质粒的组合，得到目标萤光素酶基因的稳定表达。在6天之后，cart o
11
:a9显著优于脂染胺，其中生物发光水平增加大于10倍。
[0695]
对于这些实例，cho细胞在黑色96孔板中以每孔10,000个细胞接种且使cho细胞在37℃下粘附过夜。pdna:cart复合物通过首先将ph 5.5的pbs与470ng编码萤火虫萤光素酶和tdtomato两者的pdna或总共585ng相同质粒与p转座酶呈2:1比率的混合物进行预混合来制备。根据制造商的说明书，脂染胺对照在无血清optimem培养基中制成。在即将转染之前，将cart由2mm的dmso储备液添加到质粒/pbs溶液中，以实现5:1的净+/
‑
电荷比。在添加到细胞中之前，在室温下培育所得复合物20秒。用无血清f
‑
12培养基冲洗细胞，接着将7.3μl复合物添加到含有无血清培养基的96孔板的3个孔中的每一个中，得到最终体积为50μl/孔且pdna浓度为137或171ng/孔。将细胞经由在37℃下处理24小时来培育，此时将所述培养基用具有0.3mg/ml萤光素的100μl含血清的f
‑
12培养基替换。使用ivis 50或ivis 200(珀金埃尔默的xenogen产品线)电荷耦合装置相机及动态图像软件来测量所得生物发光。误差表示为
±
sd。在汇合后，使用0.25％胰蛋白酶将细胞传代到新孔中。
[0696]
其它实例已证实使用cart在多个质粒下的有效递送和稳定转染。在这些情况下，分别编码p萤光素酶(均赋予嘌呤霉素抗性且含有转座酶识别位点)和p转录酶的质粒的组合引起稳定表达目标萤光素酶基因以及嘌呤霉素抗性。对若干代的嘌呤霉素选择证实了稳定转染，其中生物发光相对于脂染胺增加两倍。
[0697]
对于这些实例，cho细胞在黑色96孔板中以每孔10,000个细胞接种且使cho细胞在37℃下粘附过夜。pdna:cart复合物通过将ph 5.5的pbs与编码萤火虫萤光素酶和tdtomato的585ng pluc
‑
tdtom/p转座酶混合物混合来制备。根据制造商的说明书，脂染胺2000对照在无血清optimem培养基中制备。在即将转染之前，将cart由2mm的dmso储备液添加到pdna/pbs溶液中，以实现5:1的净+/
‑
电荷比。将复合物在室温下培育20秒，其后添加到细胞中。用
无血清f
‑
12培养基冲洗细胞，接着将7.3μl复合物添加到含有无血清培养基的96孔板的3个孔中的每一个中，得到最终体积为50μl/孔且pdna浓度为171ng/孔。24小时后，将所述培养基用具有0.3mg/ml萤光素和6μg/ml嘌呤霉素的100μl含血清的f
‑
12培养基替换。使用ivis 50或ivis 200(珀金埃尔默的xenogen产品线)电荷耦合装置相机及动态图像软件每日对细胞成像。误差表示为
±
sd。使用20μl的0.25％胰蛋白酶/孔在处理结束后72小时使细胞传代。将细胞培育5分钟，且随后用80μl含血清的f
‑
12培养基稀释，得到最终体积为100μl/孔。从每个孔中，将30μl的细胞溶液添加到3个新孔中的每个孔中，且用具有0.3mg/ml萤光素及6μg/ml嘌呤霉素的70μl含血清的f
‑
12培养基稀释。将初始孔中剩余的10μl细胞溶液用具有0.3mg/ml萤光素及6μg/ml嘌呤霉素的90μl含血清的f
‑
12培养基稀释，得到最终体积为在每个孔中为100μl。
[0698]
微环dna
[0699]
其它实例已表明使用cart有效递送微环dna(mcdna)。在这些情况下，通过cart d
13
:a
11
及油基cart o
11
:a9将编码萤光素酶的微环dna递送到hela细胞中。这产生与脂染胺和聚乙烯亚胺(pei)调配物两者相比更高水平的萤光素酶表达(高约10倍)。
[0700]
具体来说，使用萤光素酶报告系统测量微环dna摄取和表达。简单来说，将hela细胞以15,000个细胞/孔接种于96孔板中且使其在37℃下粘附过夜。cart/微环dna复合物通过首先将含有萤火虫萤光素酶基因和组成型启动子的微环dna的2.1μl的0.2μg/μl储备液与5.71μl ph 5.5的pbs预混合来制备。脂染胺及pei对照根据制造商的说明书制成。随后，在即将转染之前，将cart由2mm的dmso储备液添加到此中，以实现10:1的净阳离子:阴离子电荷比(或待测试的任何其它电荷比)。将此混合20秒，之后将2.5μl添加到含有100μl无血清dmem的96孔板的6个孔中的每一个中，得到62.5ng/孔的最终微环dna浓度。此在37℃下培育8小时，随后将培养基用含有0.3mg/ml萤光素的含血清dmem替换，且使用ivis相机系统对细胞进行生物发光成像。
[0701]
实例9：
[0702]
crispr/cas9编辑
[0703]
在cart介导的转染的一些实例中，展示了通过特定crispr/cas9基因编辑成功地敲入目标基因。在此情况下，编码cas9的mrna与d
13
:a
11
连同靶向鼠类β
‑
肌动蛋白基因的非翻译区的sgrna共调配。还共调配的为含有萤光素酶或mcherry基因和来自β
‑
肌动蛋白基因的相同crispr裂解位点，且不含启动子的微环dna。使用此系统，仅当鼠类基因组和微环两者的cas9裂解引起微环载体插入β
‑
肌动蛋白非翻译区，使得其处于β
‑
肌动蛋白启动子的控制下，才会发生报告基因的表达。
[0704]
进行与荧光报告基因的cas9 mrna和sgrna构建体的共调配，以确保这些货物的存在不破坏cart的核酸递送。在此情况下，egfp mrna调配为具有cas9 mrna或sgrna的50％w/w混合物，或由50％egfp mrna、25％cas9 mrna和25％sgrna组成的调配物。在这两个实例中，细胞egfp荧光为完全由egfp mrna组成的调配物的约50％。用cart d
13
:a
11
和o
11
:a9两者获得此相同结果。这支持通过前述cart成功的crispr组分的共调配。dls的额外特征(根据标准程序)表明，用d
13
:a
11
或o
11
:a9和cas9 mrna与sgrna的混合物形成的粒子的大小为约173nm，其与针对其它mrna转录物所观察到的大小一致。
[0705]
当3t3鼠类成纤维细胞用如上文所调配的复合物与luc微环构建体处理时，观察到
显著的生物发光度数。当使用杂乱sgrna序列时，未观察到这种信号，证实其归因于萤光素酶基因特定插入到3t3基因组中。当使用调配物中较高比率的微环dna时，所得生物发光增加。另外，当复合物由含mcherry的微环形成且暴露于3t3成纤维细胞时，流式细胞测量术分析指示在约2％的目标群体中存在较强mcherry荧光，表示有效的基因组整合。
[0706]
具体来说，根据以下一般程序，crispr/cas9基因编辑在3t3成纤维细胞中。简单来说，将hela细胞以40,000个细胞/孔接种于24孔板中且使其在37℃下粘附过夜。cart/寡核苷酸复合物通过首先将含有萤火虫萤光素酶基因的134ng cas9 mrna、134ng sgrna和134ng微环dna的与22.8μl ph 5.5的pbs预混合来制备。随后，在即将转染之前，将cart由2mm的dmso储备液添加到此中，以实现10:1的净阳离子:阴离子电荷比。将此混合20秒，之后将7.5μl添加到含有400μl无血清dmem的24孔板的3个孔中的每一个中，得到40ng的各个组分的最终浓度。此在37℃下培育8小时。在此时间之后，培养基用含血清dmem替换且静置24到48小时。在培育之后，将培养基用具有0.3mg/ml萤光素的含血清dmem替换，且使用ivis相机系统对细胞成像用于生物发光。
[0707]
实例10：
[0708]
mrna接种
[0709]
在接种实例中，单独cart或与佐剂组合的cart(不存在mrna)都不会在代替抗原模型中诱导保护性抗肿瘤免疫性(图2)。具体来说，在这个实例中，用107个表达肿瘤特异性抗原(tsa)a20细胞同时接种6
‑
8周龄的小鼠且用单独206μg cart或206μg cart+50μg佐剂通过在与肿瘤不同的解剖部位下进行皮下注射来处理。每日测量肿瘤大小且使肿瘤直径>15mm的小鼠根据动物方案安乐死。对于这些对照组中的任一种，在接种的小鼠中未观察到寿命延长。cart不引发免疫反应。
[0710]
通过同时肿瘤暴露的预防接种
[0711]
在肿瘤接种之前或期间进行接种时，提供抗原特异性预防反应。这些研究表明，用含有tsa
‑
mrna+佐剂的cart进行接种(在共调配物实施例中或在接种时分开投与)在具有表达tsa的肿瘤细胞的小鼠模型中诱导保护性免疫性。用cart/tsa
‑
mrna处理提供保护，且使用免疫刺激佐剂提供增加的功效。用单独佐剂处理的小鼠快速地生长出大肿瘤，且根据动物方案处死。稳固反应是由单个剂量获得，不需要接种，且可以在继发性肿瘤挑战后恢复(图3)。
[0712]
具体来说，在这个实例中，用107个表达肿瘤特异性抗原(tsa)a20细胞同时接种6
‑
8周龄的小鼠且用cart+tsa
‑
mrna+佐剂(如先前所述调配)或单独佐剂通过在与肿瘤不同的解剖部位下进行皮下注射来处理。每隔一天测量肿瘤大小持续前30天。使肿瘤直径>15mm的小鼠安乐死。在召回反应实验中，用107个表达tsa的a20细胞再攻击来自cart+tsa
‑
mrna+佐剂处理组的存活小鼠。
[0713]
已建立的肿瘤的处理
[0714]
当在建立大型肿瘤之后投与cart/mrna+佐剂接种时，诱导抗原特异性治疗反应。在接种大型肿瘤之后七天，投与cart/mrna+佐剂的处理提供肿瘤消退和缓解两者(3x 3μgtsa
‑
mrna/cart复合物)。在这一研究(总计5只动物)中，显示小鼠肿瘤生长的进展显著减缓，而40％小鼠(2/5只小鼠)的肿瘤完全治愈，甚至在约60到90天之后。使用mrna/cart+佐剂的接种显著优于已建立的蛋白质接种策略，其在动物研究中已反复地表现出提供保护。
[0715]
具体来说，在这个实例中，将6
‑
8周龄的小鼠皮下接种107个表达肿瘤特异性抗原(tsa)的a20淋巴瘤细胞。当肿瘤大小达到150mm3，使小鼠用3μg tsa
‑
mrna+佐剂、佐剂独自或盐水溶液通过在与肿瘤不同的解剖部位下进行皮下注射复合的cart来处理三次(每次处理间隔四天)。每隔一天测量肿瘤大小持续前40天。使肿瘤直径>15mm的小鼠安乐死。
[0716]
瘤内接种
[0717]
瘤内注射cart/mrna复合物引起肿瘤消退。用cart复合的mrna处理的已建立的a20淋巴瘤肿瘤在肿瘤中的四种不同细胞群体的子集中产生蛋白质表达。被认为通过增强t细胞功能调节抗肿瘤免疫反应的候选物蛋白质展现出对经处理肿瘤的深远作用。值得注意的是，还在相同动物的远端未处理肿瘤上观察到延迟的生长速率的作用(图5)。这些发现表明，原位接种/扩增策略在转移性疾病中具有治疗潜力。
[0718]
具体来说，在这个实例中，将6
‑
8周龄的小鼠在两个不同解剖位置上皮下接种107个a20细胞。当肿瘤大小达到150mm3时，用cart+10μg免疫调节蛋白质mrna或盐水溶液的三个瘤内注射处理每只小鼠中的肿瘤之一。保持另一肿瘤未处理。每隔一天测量两种肿瘤持续前20天或直至肿瘤达到必须对小鼠安乐死的大小。
[0719]
实例11：
[0720]
电荷可变型可释放转运蛋白(cart)用于递送且释放信使rna
[0721]
此处提供步骤经济型合成和评估新的可调谐且显著有效的一类合成生物可降解材料电荷可变型可释放转运蛋白(cart)。根据一些实施例本文所提供的cart具有结构上独特的且通过前所未有的机制操作，最初充当复合物、保护和递送mrna的α
‑
氨基酯阳离子，且随后通过降解化、电荷中和分子内重排改变物理特性，以释放mrna用于细胞培养物和动物中的高度有效蛋白质翻译。此新的mrna递送技术可以广泛地适用于许多研究和治疗应用。
[0722]
信使rna(mrna)实现其所编码的蛋白质的体内合成，提供用于快速新兴类别的基因治疗药物的基础，其中可能将疾病处理为与癌症、遗传障碍和传染病不同的疾病。可以利用根据本文中的某些实施例的方法和组合物用于mrna编码的蛋白质的特定表达的用途以用于研究和成像应用，用于需要蛋白质替换或扩增的治疗性用途，和用于预防和免疫治疗适应症两者的新接种策略。
[0723]
根据本文所提供的一些实施例的电荷可变型可释放转运蛋白(cart)首先充当聚阳离子以短暂地复合且保护聚阴离子mrna，且随后快速地变换其阳离子电荷，且因此通过受控的自分解机制实现阴离子结合能力。
[0724]
作为某些实施例的一实例，提供经设计用于mrna的非共价复合、保护、细胞内递送和释放的cart作为新类别的材料的开发。这些cart由动态阳离子α
‑
氨基酯组成，其通过独特的自分解机制重排，将阳离子胺转化成中性酰胺。经由有机催化开环聚合(orop)和去保护且将mrna有效地复合到自组装聚电解质复合物中(经由肌肉内和静脉内投与在多个细胞类型和动物模型中递送和释放mrna)将材料步骤经济性地合成(两个步骤)。本文中的实例10进一步表明通过这些材料的mrna递送的功效归因于其独特的电荷可变型分子内重排，这引起稳固的胞内体逸出和胞质mrna释放。
[0725]
我们设计一类新的寡核苷酸递送媒剂，两性寡聚(碳酸酯
‑
b
‑
α
‑
氨基酯)，具有动态特性以解决与mrna递送相关的特定挑战。我们先前对sirna的研究表明，可以使用经设计以形成具有阴离子sirna双螺旋体的纳米级聚合复合物的含有亲脂性和阳离子嵌段两者的嵌
段共寡聚物达成高效递送。因为单链mrna显示比sirna和pdna短的细胞内半衰期，我们假设快速胞内体逸出和后续寡核苷酸释放对于有效表达将是至关重要的。为了解决这两个问题，我们设计并入有用以同时裂解寡聚物主链且将阳离子胺转化成中性酰胺的快速自分解阳离子嵌段的两性寡聚递送媒剂。在细胞摄取之后的主链降解假设增加胞内体中的渗透压，从而促进胞内体破裂。另外，此机制同时消除聚阴离子和聚阳离子组分的多部位和静电关联，促进胞质mrna释放和后续基因表达。
[0726]
我们先前已报告由n
‑
保护的吗啉
‑2‑
酮的orop合成聚(α
‑
氨基酯)(图7a，1)，随后研究其用于如本文所述的mrna递送的用途。官能化内酯单体易于由可商购的起始材料在两个较高产率步骤中产生。这些单体可以在有机催化条件下用伯醇引发剂开环化，得到聚(α
‑
氨基酯)，在链长度和分散度上具有精确控制。在去保护后，寡聚物具有水溶性(>0.5m)且在未缓冲水中稳定(在d2o中>2天)。然而，不同于众所周知的聚(β
‑
氨基酯)，在暴露于稍微碱性条件之后，其在<5分钟内经由受控自分解重排降解，此处用于通过静电相互作用之缺失来促进mrna释放。
[0727]
此降解的机制性研究表明铵阳离子的部分去质子化，允许经由5元过渡状态分子内环化到主链酯中(图7a)。在主链的初始收缩之后，邻近单体单元上的氮基团通过6元过渡状态进行第二环化，以形成羟基乙基甘氨酸(hegd，2)的小分子二聚体，梅纳反应的已知无毒代谢物。此重排异常地快速且高效；均寡聚物在ph 7.4下在t
1/2
<2分钟的情况下降解。此系统的独特反应性可以通过主链酯羰基的互补活化来解释，所述互补活化通过与所需亲核胺的羰基辅助去质子化同时进行的电感和氢键合相互作用。通过新形成的羟基乙基酰胺使6元过渡状态钝化有助于最终环化以形成hegd 2。虽然将分别报告对所述机制和此重排的变化的进一步调查，将聚阳离子寡聚物快速转化成电荷中性片段的此系统的独特动力学表示用于聚阴离子药物和探针递送的潜在可广泛利用的概念。
[0728]
我们设计用于递送具有十二烷醇官能化的亲脂性碳酸酯嵌段(附加到自分解α
‑
氨基酯的阳离子嵌段)的mrna的材料，其易于通过使用orop方法使吗啉
‑2‑
酮单体与环状碳酸酯共聚来实现(图7b)。
[0729]
此技术的有吸引力的方面为能够使用二嵌段共寡聚物中不同长度的亲脂性聚合物域(或脂质嵌段)调节性能。使用伯醇合成小系列寡聚递送媒剂以引发十二烷基碳酸酯嵌段的开环，接着添加和寡聚阳离子嵌段。使用此策略，合成含有平均13个脂质单体单元和11个阳离子单体单元(d
13
:a
11 7)的寡聚物、18个脂质和17个阳离子单元(d
18
:a
17 8)以及13个阳离子单元(a
13 9)的均寡聚物。每一新载体可以仅进行两个步骤来制成，所述过程仅需要几个小时。
[0730]
为了增加我们对这种重排的理解，这是因为其适用于cart递送媒剂，凝胶穿透色谱法(gpc)用于分析在生理ph下寡聚(碳酸酯
‑
b
‑
α
‑
氨基酯)的动力学。为了展示重排反应仅影响两性cart的阳离子结合部分，同时使亲脂性域完整，将模型共寡聚物pyr
‑
d
15
:a
12 10溶解于ph 7.4的pbs缓冲液中以实现重排(图8a)。一小时后，浓缩溶液且通过gpc分析(图8b)。将降解共寡聚物的gpc迹线与独立合成的pyr
‑
d
15
寡聚物11和pyr
‑
d
15
:a
12
嵌段
‑
共寡聚物在重排和boc
‑
去保护之前进行比较。正如所预期的，受保护的d
15
:a
12
嵌段
‑
共寡聚物的gpc迹线展现出比均寡聚物pyr
‑
d
15 11更高的分子量(分别为6.4kda和4.6kda)。然而，在暴露于ph 7.4pbs缓冲液之后，去保护的嵌段共寡聚物表现出与pyr
‑
d
15
脂质嵌段(4.6kda)几乎一致的
减弱分子量(4.3kda)，表明在生理ph下，cart的阳离子部分降解，而完全亲脂性嵌段保持完整。来自相同gpc数据的uv迹线指示，引发醇(在此情况下芘丁醇，但可以使用其它亲核醇、胺和硫醇)保持连接到亲脂性嵌段，使未来研究能够使用此醇来附加其他官能团，例如将cart靶向各种细胞和器官的配体。
[0731]
为了评估cart作为mrna递送媒剂的功效，选择增强的绿色荧光蛋白质(egfp)mrna作为模型报告基因。在治疗之后egfp荧光的流式细胞测量术分析允许同时定量平均蛋白质表达，以及表现出基线水平以上荧光的细胞分数(转染％)。在用cart复合物处理之后，将基因表达与作为阳性对照的商业药剂脂染胺2000(lipo)进行比较，以及已知对sirna递送尤其有效的两种化合物(d4:g
4 12和d
12
:g
12 13)。当根据制造商的说明书用脂染胺调配的mrna处理hela细胞时，观察到适度水平的基因表达(图9a)。然而，此条件仅产生约50％细胞转染，其中一半细胞群体未表现出egfp表达(图9b)。在星形对比中，我们设计的寡聚(碳酸酯
‑
b
‑
α
‑
氨基酯)cart，d
13
:a
11 7提供极佳egfp表达，以及显著>99％转染效率和较高平均荧光。具有更长嵌段长度的第二寡聚(碳酸酯
‑
b
‑
氨基酯)cart(d
18
:a
17 8)还提供较高转染效率(>90％)但提供较低的平均转染值。由α
‑
氨基酯均寡聚物(a
13 9)形成的复合物不诱导egfp表达。这还证实了疏水性与亲水性域之间的显著相分离使纳米粒子形成稳定化的前述观测结果，且增加的亲脂性促进膜缔合和摄取。与作为sirna递送剂的其效力相比，胍官能化的两性寡聚碳酸酯d4:g
4 12和d
12
:g
12 13未表现出mrna表达。因为这些材料在被动水解之外不含用于降解或货物释放的机制(t
1/2
>8小时)，这支持我们的假设，即与sirna相比，胞内体逸出和胞质释放必须在更快速的mrna递送的时间标度下发生。
[0732]
为了优化cart 7的递送参数，阳离子寡聚物与阴离子mrna的电荷比从1:1变化到50:1(+/
‑
)且确定所得egfp荧光(图9c)。值报告为铵阳离子的摩尔数与磷酸根阴离子的摩尔数的理论(+/
‑
)电荷比，假设完全胺质子化和磷酸根去质子化。egfp表达显示出对电荷比的大致抛物线依赖性，其中由以10:1(+/
‑
)电荷比形成的复合物产生的最大egfp荧光。此值高于在用于sirna递送(以4.8:1电荷比最佳地执行)的富含胍的寡聚碳酸酯复合物的情况下观察到的值，可能归因于铵阳离子与磷酸根阴离子的略微较低静电相互作用，δg＝
‑
0.575kcal/mol(对于胍离子)相对于
‑
0.417kcal/mol(对于铵离子)。所有进一步实验使用此优化的10:1(+/
‑
)电荷比进行。荧光显微法进一步用于确认流式细胞测量术结果(图9d)。用cart/mrna复合物处理的hela细胞在几乎所有可观察的细胞中显示出显著荧光。相比之下，用脂染胺处理的细胞表现出部分egfp表达，而剩余其它未转染。
[0733]
进行一系列实验以进一步理解分解重排机制，即我们假设，涉及寡聚(碳酸酯
‑
b
‑
α
‑
氨基酯)cart的性能，因为其适用于mrna递送。在类似于用于体外转染的条件下，动态光散射(dls)用于分析cart 7和形成于7与mrna之间的聚电解质络合物。当将含mrna的聚合复合物添加到细胞培养基时，其流体动力大小开始于254nm，但在两小时内缓慢增加到512nm。所观察到的大小增加反映了阳离子α
‑
氨基酯嵌段与中性酰胺的部分重排，引起相关脂质片段的聚集。这通过esi
‑
ms确认，所述esi
‑
ms显示hegd小分子的相对强度在相同时间标度上增加。当将mrna/cart粒子添加到未缓冲水中时，在全部两个小时实验的过程中，大小在254nm+/
‑
10nm下保持一致。此镜面产生不在这些条件下重排的α
‑
氨基酯均寡聚物。 ζ电位测量结果与粒度数据一致，其中表面电荷在高度阳离子+33mv下开始，调配后立即在两小时内达到
‑
30mv。这同样符合重排到中性酰胺且由于相关的寡核苷酸，表面主要是阴离子的阳
离子铵部分。粒度为非货物依赖性的。当由萤光素酶(fluc)mrna形成聚合复合物时，所述萤光素酶(fluc)mrna的长度为egfp的两倍(fluc＝1929nt相对于egfp＝996nt)且在ph 7.4下添加到细胞培养基中，粒子显示在273nm下开始的相同行为，且在两小时的过程中缓慢增加到444nm。这表明在相同cart下，大量寡核苷酸的未来递送是可能的。当不添加mrna货物时，寡聚(碳酸酯
‑
b
‑
氨基酯)cart归因于其两性结构而形成胶束。这些胶束在未缓冲水中保持稳定，大小为68nm。然而，当将这些胶束添加到细胞培养基(ph 7.4)中时，其快速形成可能不通过dls表征的聚集体。单独均寡聚物(t
1/2
＝2min)、寡聚(碳酸酯
‑
b
‑
氨基酯)胶束(30分钟内聚集到>500nm)与mrna/cart复合物(在2h之后聚集到500nm)的组合重排数据指示，与mrna的聚电解质络合假定通过降低去质子化且因此重排的速率而在水性环境中增加α
‑
氨基酯材料的稳定性。这使得这些材料能够在ph 7.4下在治疗上相关的时间标度上降解，同时保持足够稳定以用于在未缓冲条件下储存和调配。
[0734]
首先，为确定细胞进入的机制，cy5标记的egfp mrna用于将在4℃下的细胞摄取，已知抑制细胞内过程的条件，与在37℃下的正常摄取进行比较。当在这些条件下处理hela细胞时，观察到cy5
‑
mrna摄取的显著(85％)降低(图10a)。这符合预期的细胞内机制，所述细胞内机制的特征为250nm粒子。
[0735]
为了探究通过寡聚(碳酸酯
‑
b
‑
氨基酯)cart的自分解释放机制，将由用7处理产生的粒子摄取和基因表达与对mrna递送无效的阳离子寡聚物进行直接比较。通过递送egfpmrna与cy5标记的egfpmrna的混合物，mrna内化和基因表达可以去耦且同时定量；cy5荧光指示内化的mrna，而与胞内体逸出或释放无关，且egfp荧光表示mrna的胞内释放，从而实现翻译。我们使用此方法探究主链结构和阳离子类型对摄取和表达两者的影响，其通过制备具有与d
13
:a
11 cart 7相等长度的两种额外阳离子嵌段共寡聚物。对于细胞摄取和基因表达两者，直接比较三种寡聚物，含有分解铵的cart(d
13
:a
11 7)、非电荷可变型的含胍寡聚物(d
13
:g
12 13)和非电荷可变型的含铵寡聚物(d
13
:pip
13 14)。
[0736]
将寡聚物7、13和14以10:1(+/
‑
)比与cy5
‑
egfp mrna混合且将所得复合物添加到hela细胞中。虽然所有共寡聚物得到大致类似的mrna吸收水平，如通过cy5荧光定量(图10b)，但仅电荷可变型的d
13
:a
11
7引起可检测的egfp mrna表达。此数据指示，所有mrna复合物由细胞有效地内化，但不具有快速降解主链，非cart复合物从未逸出胞内体或其不在实现胞质egfp表达所必需的时间标度上释放mrna。缺乏由d
13
:pip
13 14(非分解性含铵寡聚物)形成的复合物的egfp表达进一步指示，造成这种释放的不仅仅是铵阳离子对胍阳离子的静电结合亲和力的差异。确切地说，阳离子电荷的特定受控损失和小分子的重排对于功效至关重要。
[0737]
在我们的寡聚(碳酸酯
‑
b
‑
α
‑
氨基酯)材料下观察到的电荷可变型机制可以中和mrna结合且触发hegd小分子的形成有助于胞内体逸出和/或mrna释放。为了进一步理解这一机制，用mrna/cart复合物和已知影响胞内体微环境的两种化合物共同处理hela细胞。刀豆素a(con a)为已表现出抑制胞内体酸化的特定v
‑
atpase抑制剂。当用这种或类似化合物进行共处理时，用于基因递送的其它含阳离子铵材料表现出急剧降低的胞内寡核苷酸浓度和后续基因表达，这归因于质子海绵效应的胞内体缓冲渗透断裂的降低。尽管如阳离子脂质纳米粒子和pei的化合物在用v
‑
atp酶抑制剂处理时在基因递送中显示10
‑
200倍降低，但我们的α
‑
氨基酯cart 7几乎不受con a处理的影响(图10c，21％降低，p＝0.177)。这表明胞
内体酸化和缓冲对于使用这一系统实现胞内体逸出或基因表达不是必需的。氯喹(chl)为已用于通过增加胞内体缓冲和断裂来增加基因递送的趋溶酶体剂。其它已表明，不并有缓冲功能的基因递送材料(例如甲基化的pei)显示出基因表达的显著增加(2
‑
3倍)，而例如pei的缓冲载体不受影响。我们的cart仅显示出表达的略微减小(22％减小，p＝0.469)，指示胞内体逸出不是寡聚(碳酸酯
‑
b
‑
氨基酯)cart在mrna递送方面的限制因素，可能因为由于解聚合和hegd(2)形成，已经发生通过渗透破裂的有效逸出。
[0738]
与样品无效递送媒剂(d
12
:g
12
，13)相比，通过寡聚(酯
‑
b
‑
氨基酯)cart的mrna释放和胞内体逃逸的作用可以通过共聚焦显微镜，且检测转运蛋白(使用附接的丹磺醯基荧光团3)、cy5
‑
mrna和四甲基罗丹明(tritc)
‑
葡聚糖
4400
，用于胞内体隔室的染色剂而进一步确认。当在用cart(7)/cy5
‑
mrna复合物处理之后4小时使细胞成像时，附接到转运蛋白的cy5信号和丹磺醯基(3)两者的荧光本质上都是扩散的，指示那些材料已成功逸出胞内体且从纳米粒子复合物解离(图10d，i)。丹磺醯基信号中所观测到的色斑(图10d，ii)可能由所释放的脂质嵌段的一些细胞内聚集产生。来自tritc的信号还展现出当胞内体破裂和释放包覆的葡聚糖时将产生的相对扩散荧光。然而，当细胞用非分解性d:g(13)/cy5
‑
mrna复合物处理时，cy5和丹磺醯基荧光都是极点状的，且共局部化(图10d，iii)。此荧光另外表现与点状tritc
‑
葡聚糖
4400
的强重叠，指示持续的胞内体包裹。综合在一起，这些数据强烈地表明，cart 7的电荷可变型行为负责其mrna递送的极佳性能。
[0739]
寡聚(碳酸酯
‑
b
‑
氨基酯)d
13
:a
11 7在其它应用中评估以探索用于mrna递送的cart的通用性。在一组细胞系中分析在cart 7的递送之后的egfp mrna表达，包括通常认为难以转染的那些细胞系。除先前在hela中进行的优化实验以外，通过用由0.125μg/孔的egfp mrna形成的cart复合物处理，将mrna表达与cho、hek
‑
293、人体肝细胞癌(hepg2)和鼠类巨噬细胞j774细胞中的脂染胺的表达进行比较(图11a)。在所测试的所有细胞系中，使用cart d
13
:a
11
7的转染效率>90％，而脂染胺诱导仅22
‑
55％。这表明此递送系统对于多种人类和非人类细胞系是通用的。cart介导的递送不仅在不同细胞系中一致，而且在mrna的不同长度下一致，如d
13
:a
11
(7)也是高度有效的，在递送萤火虫萤光素酶(fluc)mrna时，基本上胜过进行脂染胺(图11b)。类似于用egfp mrna观察到的趋势，10:1(+/
‑
)比率产生最高水平的fluc生物发光，尽管mrna长度有差异(1929相对于996nt)，指示递送效率在很大程度上与mrna长度无关。
[0740]
生物发光成像(bli)提供定量活动物中的mrna递送、表达和生物分布的强大工具。为了评估cart
‑
mrna复合物在投与的全身性途径和局部途径中的功效，我们使用bli评估麻醉的balb/c小鼠的cart复合的fluc mrna的静脉内和肌肉内注射。在每个小鼠中，将7.5μgmrna与cart d
13
:a
11 7复合且通过肌肉内注射到75μl pbs中的右大腿肌肉内投与。作为直接对照，在相对侧腹中注射7.5ug的裸mrna。全身性投与萤光素，且经72小时，在注射后一小时开始评估萤光素酶表达。当mrna与d
13
:a
11
递送时，在注射部位观察到较高水平的萤光素酶活性(图11c、d)。此表达在4h时达到峰值，且在72小时之后仍可观察到。然而，在所有五只小鼠中，裸mrna仅提供如通过光子通量所测量的较低水平的萤光素酶表达。
[0741]
当在相同剂量下经由静脉内尾部静脉注射投与复合物时，我们观察到最早注射后一小时的稳固腹部生物发光，在4h时达到峰值且指示我们的复合物主要定位且将mrna递送到脾脏，在肝脏中还可以检测到较高水平的生物发光(图11e、f)。较高水平的表达持续24小
时，在48小时之后可检测生物发光。此表达主要局部化于脾脏和肝脏中，平均23％的腹部光输出来自前者，70％来自后者。当在pbs中投与裸mrna时，未观测到萤光素酶生物发光。在所有注射的小鼠中，注射后立即或在处理后持续若干周未观察到毒性。
[0742]
经由体内投与途径递送功能mrna的能力对于递送技术至关重要。局部肌肉内注射可以是用于包括接种的许多疗法的优选投与途径，归因于易于投与且能够在皮肤和肌肉组织中获取原始树突状和抗原呈递细胞的能力。通过尾部静脉的mrna聚合复合物调配物的静脉内注射广泛地适用于全身性投与，其特定目标位于沿网状内皮系统(如肝、淋巴结和脾脏)或靶向实体肿瘤。由于那些组织中的较高水平的树突状和其它免疫细胞，因此脾脏定位对于涉及免疫疗法的未来研究尤其令人兴奋。肝脏定位可以用于治疗肝病。
[0743]
信使rna治疗剂有可能改变疾病治疗，尽管使用mrna的重要技术挑战仍是开发安全、通用和有效的递送方法。我们已经开发了用于mrna递送的独特、可调谐和步骤经济型策略，其通过前所未有的机制操作，以在极佳效率下将mrna有效地递送到细胞和动物。我们的方法在两步骤过程中使用orop和全局去保护来制备寡聚(碳酸酯
‑
b
‑
氨基酯)递送媒剂。在细胞内递送之后，这些电荷可变型材料经历显著的分子内重排，在其期间，阳离子胺转化成中性酰胺，以从其静电络合物中释放出阴离子mrna，且将核酸排出到细胞溶质中用于翻译。使用这些cart的mrna递送的有效性表示mrna递送的新策略，其产生细胞和动物两者中的功能性蛋白质表达。
[0744]
实例12：
[0745]
体内递送编码car的mrna或dna以治疗癌症
[0746]
材料除非另外指出，否则试剂都是购自西格玛奥德里奇且按原样使用。全部根据文献程序制备1
‑
(3,5
‑
双
‑
三氟甲基
‑
苯基)
‑3‑
环己基
‑
硫脲(1)、脂质官能化的单体(2,3)和boc
‑
吗啉酮单体(4)。再生纤维素透析膜(spectra/por 6标准rc；分子量截止酯1,000)购自光谱实验室公司。从生命技术(life technologies)获得脂染胺2000。mtt购自fluka。
[0747]
mrna.fluc mrna(5mec，ψ，l
‑
6107)和分泌的碱性磷酸酶(seap)(对照mrna)购自trilink生物技术。所有购买的mrna被封端且聚腺苷酸化且含有5
‑
甲氧基尿苷修饰。
[0748]
car
‑
19构建体：car
‑
19mrna通过将mcd19_28_z.1
‑
3序列克隆到pcdna3.1(+)质粒中而在内部产生。根据制造方案(新英格兰生物实验室)使用noti限制酶对质粒进行线性化且使用苯酚:氯仿萃取，随后进行醇沉淀。随后使用incognito
tm
t7 arca 5mc
‑
&y
‑
rna转录套组(cellscript)将mrna从线性化的质粒转录。
[0749]
仪器.在bd lsrii.uv facs分析仪(斯坦福大学共享facs设施)上进行流式细胞测量术分析。生物发光使用ccd相机(ivis 100；xenogen公司)来测量，且使用动态图像软件(perkinelmer)分析。
[0750]
细胞系使a20细胞维持于补充有10％fbs和1％青霉素/链霉素的rpmi中。非粘附细胞用添加1％聚(乙烯醇)(pva)处理以防止粘附。对于鼠类原代t细胞，由6至8周龄的balb/c小鼠的脾脏制备单细胞悬浮液。根据制造商的方案，使用pan t细胞分离套组ii(miltenyi biotec gmbh)从这些悬浮液中分离出未接触的t细胞。所有细胞在37℃下在5％co2氛围中生长。细胞在约80％汇合下传代。
[0751]
混合的脂质cart的制备：向装备有搅拌棒的烘箱干燥的1当量瓶在手套箱中在n2氛围下添加mtc油基(6当量，0.077mmol，31.1mg)和tu(0.05当量，0.0038mmol，1.4mg)。向此
添加呈1m甲苯溶液形式的苯甲醇(1当量，0.0128mmol，12.8μl)，接着再添加134μl的甲苯(1m w.r.t.m
boc
单体)。随后将催化1,8
‑
二氮杂双环[5.4.0]十一
‑7‑
烯(dbu)(1滴)添加到溶液中，且使反应物在手套箱中在室温下搅拌1小时。此时，将mtc壬烯基(6当量，0.077mmol，21.7mg)添加到反应中。在再搅拌一小时之后，将m
boc
(12.66当量，0.123mmol，27mg)添加到反应物中且再搅拌4小时，之后用苯甲酸淬灭。将反应物在甲醇(1.0kda透析包)中透析过夜。浓缩得到呈透明油状的受保护的共寡聚物s9。通过1h nmr端基分析和gpc在thf中的分散度来确定聚合度。在室温下在n2下在dcm中的10％tfa中的后续去保护过夜，得到cart o5‑
b
‑
n6:a9(9)。通过1h nmr(cd3od)确认完全保护基去除。
[0752]
体内mrna递送和流式细胞测量术cart
‑
mrna聚合复合物如上文所述在100μl的总体积中使用每只小鼠5μg mrna制备。将复合物在静脉内注射到雌性balb/c小鼠的尾部静脉中之前混合20秒。对于fluc表达：在7h之后，腹膜内注射150mg/kg d
‑
萤光素，且使用ivis成像系统ccd相机测量发光，且使用动态图像软件分析发光。为了从脾脏细胞中分离t细胞，杀死动物且通过使脾脏通过70
‑
μm细胞过滤器，接着用ack溶解缓冲液使血细胞溶解且用pbs洗涤两次来制备单细胞悬浮液。根据制造方案，使用pan t细胞分离套组(miltney biotec)分离t细胞。对于car19 mrna
‑
cart处理后脾脏细胞中的car19表达，将脾脏细胞分成两个染色组且染色cd8(apc)、cd4(pe)和b220(percp)或cd49d(apc)的荧光抗体。使用结合到fitc的小鼠抗大鼠κ链抗体检测car19构建体。使用太平洋蓝通道对lsr
‑
ii.uv(bd biosciences)进行分析。实验方案由斯坦福实验室动物护理管理组批准。
[0753]
体内生物发光为了生物发光评估，在注射和成像程序期间，将小鼠用异氟醚气体(2％异氟烷于氧气中，1l/min)麻醉。以150mg/kg的剂量进行d
‑
萤光素(生物合成ag)的腹膜内注射，为fluc酶提供饱和底物浓度(萤光素穿过血脑屏障)。使用体内配备有冷却的电荷耦合装置相机的光学成像系统(ivis 100；xenogen公司)在不透光室中对小鼠成像。在图像记录期间，吸入异氟醚的小鼠经由鼻锥递送，且其体温在相机系统的暗箱中维持在37℃。在萤光素投与之后10分钟与20分钟之间获取生物发光图像。小鼠通常在2分钟成像内从麻醉中恢复。
[0754]
小鼠和细胞系八至十二周龄的雌性balb/c小鼠购自jackson实验室且将其安置于斯坦福大学医学中心的实验动物设施中。所有实验均由斯坦福实验室动物护理管理组批准，且根据斯坦福大学动物设施及nih指导原则进行。
[0755]
使用car19 mrna
‑
cart对已建立的肿瘤进行瘤内处理。在腹部右侧皮下植入表达cd19的肿瘤。当肿瘤达到7mm到10mm的最大直径时，处理开始。使5ug car19 mrna
‑
cart瘤内注射到肿瘤中。每2到3天使用数字测径器(mitutoyo)监测肿瘤大小且表示为体积(长度
×
宽度
×
高度)。当肿瘤大小的最大直径达到1.5cm时，根据指导方针处死小鼠。
[0756]
使用car19 mrna
‑
cart对已建立的表达cd19的和cd19阴性肿瘤的iv治疗。在腹部右侧皮下植入表达cd19的和cd19阴性肿瘤。当肿瘤达到7mm到10mm的最大直径时，处理开始。5ug car19 mrna
‑
cart经静脉内注射。每2到3天使用数字测径器(mitutoyo)监测肿瘤大小且表示为体积(长度
×
宽度
×
高度)。当肿瘤大小的最大直径达到1.5cm时，根据指导方针处死小鼠。
[0757]
统计分析prism软件(graphpad；la jolla，ca)用于分析肿瘤生长且通过应用非参数曼
‑
惠特尼u测试来确定各组之间的差异的统计显著性。p值<0.05被认为是显著。使用卡
普兰
‑
迈耶方法用于存活分析。
[0758]
实例13：
[0759]
体内递送编码嵌合抗原受体(car)的mrna或dna来治疗癌症
[0760]
car
‑
t细胞疗法彻底改变了癌症疗法。car
‑
t细胞疗法的成果：car t细胞成功，而大多数其它疗法失败；极有效、快速且长效的抗肿瘤反应；使用抗cd19 car t细胞的极高反应速率，对于b
‑
all约90％，对于淋巴瘤约80％。当前市场：对于淋巴瘤，yescarta(axicabtagene ciloleucel)和kymriah(tisagenlecleucel)的成本为$373,000，对于白血病，kymriah(tisagenlecleucel)为$475,000。
[0761]
car
‑
t细胞疗法限制和缺点。技术约束：花费较长时间以产生；取决于car t细胞产物，通常约2
‑
6周；工程改造和培养t细胞极昂贵。在患者方面：需要血球分离术(收集免疫细胞的过程)，接着活动性生长侵袭性癌症患者的长时间等待期；患者必须接受用于淋巴细胞耗减的化学疗法以使得car t细胞有效；此化学疗法引起免疫系统的损伤，增加严重感染的风险；在投与之后，患者体内快速扩增的car t细胞通常引起危及生命的副作用；此快速扩增可能难以控制。
[0762]
原位car
‑
t细胞编程为far更好的策略。因为cart靶向脾脏，所以我们能够直接获得t细胞，我们希望用car编程。
[0763]
发明内容/权利要求书cart有效地将mrna递送到淋巴细胞，所述淋巴细胞随后表达功能性car
‑
19蛋白质；importantly，我们不限于t细胞，其它细胞表达car。cart与car
‑
19mrna之静脉内注射在仅单个剂量之后，可非常有效地减少肿瘤负担。不需要患者特定的定制。多个car特异性可以混合到一个单个剂量中。其它编码mrna的蛋白质(如编码细胞激素的mrna)可以易于与car构建体共调配以调节处理的作用。可以将编码mrna的抗炎性蛋白质(如il1受体拮抗剂)与car构建体共调配，以减弱不良影响，如细胞激素释放综合症。现成产品可立即提供给患者。不需要复杂和昂贵的细胞培养设施的“混合和发射”策略。不限于一个剂量，但可以重复直至达到所希望的作用。在25天之后100％存活(整个对照组在第15天处死)。car
‑
t细胞的体内mrna编程是前所未有的。这可以极大地促进已经革命性的疗法。
[0764]
实例14
[0765]
材料和方法
[0766]
材料除非另外指出，否则试剂都是购自西格玛奥德里奇且按原样使用。全部根据文献程序制备1
‑
(3,5
‑
双
‑
三氟甲基
‑
苯基)
‑3‑
环己基
‑
硫脲(1)、脂质官能化的单体(2,3)和boc
‑
吗啉酮单体(4)。再生纤维素透析膜(spectra/por 6标准rc；分子量截止酯1,000)购自光谱实验室公司。从生命技术(life technologies)获得脂染胺2000。mtt购自fluka。
[0767]
mrna.fluc mrna(5mec，ψ，l
‑
6107)和分泌的碱性磷酸酶(seap)(对照mrna)购自trilink生物技术。所有购买的mrna被封端且聚腺苷酸化且含有5
‑
甲氧基尿苷修饰。
[0768]
car
‑
19构建体：
[0769]
car
‑
19mrna通过将mcd19_28_z.1
‑
3序列克隆到pcdna3.1(+)质粒中而在内部产生。根据制造方案(新英格兰生物实验室)使用noti限制酶对质粒进行线性化且使用苯酚:氯仿萃取，随后进行醇沉淀。随后使用incognito
tm
t7 arca 5mc
‑
&y
‑
rna转录套组(cellscript)将mrna从线性化的质粒转录。
[0770]
仪器.在bd lsrii.uv facs分析仪(斯坦福大学共享facs设施)上进行流式细胞测
量术分析。生物发光使用ccd相机(ivis 100；xenogen公司)来测量，且使用动态图像软件(perkinelmer)分析。
[0771]
细胞系.使a20细胞维持于补充有10％fbs和1％青霉素/链霉素的rpmi中。非粘附细胞用添加1％聚(乙烯醇)(pva)处理以防止粘附。对于鼠类原代t细胞，由6至8周龄的balb/c小鼠的脾脏制备单细胞悬浮液。根据制造商的方案，使用pan t细胞分离套组ii(miltenyi biotec gmbh)从这些悬浮液中分离出未接触的t细胞。所有细胞在37℃下在5％co2氛围中生长。细胞在约80％汇合下传代。
[0772]
0.077mmol，31.1mg)和tu(0.05当量，0.0038mmol，1.4mg)。向此添加呈1m甲苯溶液形式的苯甲醇(1当量，0.0128mmol，12.8μl)，接着再添加134μl的甲苯(1m w.r.t.m
boc
单体)。随后将催化1,8
‑
二氮杂双环[5.4.0]十一
‑7‑
烯(dbu)(1滴)添加到溶液中，且使反应物在手套箱中在室温下搅拌1小时。此时，将mtc壬烯基(6当量，0.077mmol，21.7mg)添加到反应中。在再搅拌一小时之后，将m
boc
(12.66当量，0.123mmol，27mg)添加到反应物中且再搅拌4小时，之后用苯甲酸淬灭。将反应物在甲醇(1.0kda透析包)中透析过夜。浓缩得到呈透明油状的受保护的共寡聚物s9。通过1h nmr端基分析和gpc在thf中的分散度来确定聚合度。在室温下在n2下在dcm中的10％tfa中的后续去保护过夜，得到cart o5
‑
b
‑
n6:a9(9)。通过1h nmr(cd3od)确认完全保护基去除。
[0773]
体内mrna递送和流式细胞测量术cart
‑
mrna聚合复合物如上文所述在100μl的总体积中使用每只小鼠5μg mrna制备。将复合物在静脉内注射到雌性balb/c小鼠的尾部静脉中之前混合20秒。对于fluc表达：在7h之后，腹膜内注射150mg/kg d
‑
萤光素，且使用ivis成像系统ccd相机测量发光，且使用动态图像软件分析发光。为了从脾脏细胞中分离t细胞，杀死动物且通过使脾脏通过70
‑
μm细胞过滤器，接着用ack溶解缓冲液使血细胞溶解且用pbs洗涤两次来制备单细胞悬浮液。根据制造方案，使用pan t细胞分离套组(miltney biotec)分离t细胞。对于car19 mrna
‑
cart处理后脾脏细胞中的car19表达，将脾脏细胞分成两个染色组且染色cd8(apc)、cd4(pe)和b220(percp)或cd49d(apc)的荧光抗体。使用结合到fitc的小鼠抗大鼠κ链抗体检测car19构建体。使用太平洋蓝通道对lsr
‑
ii.uv(bd biosciences)进行分析。实验方案由斯坦福实验室动物护理管理组批准。
[0774]
体内生物发光
[0775]
以150mg/kg的剂量进行d
‑
萤光素(生物合成ag)的腹膜内注射，为fluc酶提供饱和底物浓度(萤光素穿过血脑屏障)。使用体内配备有冷却的电荷耦合装置相机的光学成像系统(ivis 100；xenogen公司)在不透光室中对小鼠成像。在图像记录期间，吸入异氟醚的小鼠经由鼻锥递送，且其体温在相机系统的暗箱中维持在37℃。在萤光素投与之后10分钟与20分钟之间获取生物发光图像。小鼠通常在2分钟成像内从麻醉中恢复。
[0776]
小鼠和细胞系
[0777]
八至十二周龄的雌性balb/c小鼠购自jackson实验室且将其安置于斯坦福大学医学中心的实验动物设施中。所有实验均由斯坦福实验室动物护理管理组批准，且根据斯坦福大学动物设施及nih指导原则进行。
[0778]
使用car19 mrna
‑
cart对已建立的肿瘤进行瘤内处理
[0779]
在腹部右侧皮下植入表达cd19的肿瘤。当肿瘤达到7mm到10mm的最大直径时，处理开始。使5ug car19 mrna
‑
cart瘤内注射到肿瘤中。每2到3天使用数字测径器(mitutoyo)监
测肿瘤大小且表示为体积(长度
×
宽度
×
高度)。当肿瘤大小的最大直径达到1.5cm时，根据指导方针处死小鼠。
[0780]
使用car19 mrna
‑
cart的已建立的表达cd19和cd19阴性肿瘤的iv处理
[0781]
在腹部右侧皮下植入表达cd19和cd19阴性肿瘤。当肿瘤达到7mm到10mm的最大直径时，处理开始。5ug car19 mrna
‑
cart经静脉内注射。每2到3天使用数字测径器(mitutoyo)监测肿瘤大小且表示为体积(长度
×
宽度
×
高度)。当肿瘤大小的最大直径达到1.5cm时，根据指导方针处死小鼠。
[0782]
统计分析
[0783]
prism软件(graphpad；la jolla，ca)用于分析肿瘤生长且通过应用非参数曼
‑
惠特尼u测试来确定各组之间的差异的统计显著性。p值<0.05被认为是显著。使用卡普兰
‑
迈耶方法用于存活分析。
[0784]
实例15：
[0785]
使用电荷可变型可释放转运蛋白(cart)原位产生表达嵌合抗原受体(car)的效应细胞
[0786]
使用cart的体内car19 mrna疗法
[0787]
概念.使用可以潜在地编码多个基因的mrna和/或dna在细胞内体内表达编码car的基因。使用此方法，基因工程改造不必在患者体外进行，不需要从患者中收获细胞，且无昂贵的患者细胞运输。本文所述的cart递送系统易于调配，提供体内稳固mrna表达，且是非免疫原性(非病毒)。重要的是，如图25的示意图中所示，系统可以体内递送且表达mrna(瞬时)和dna(稳定)。
[0788]
结果.原理论证研究使用编码抗小鼠cd19和抗人类cd19 car的cart递送的mrna完成，如图26中所示。包括双目标方法、新一代的car的表达和编码表面或分泌分子的mrna的共递送的新策略(其增强效应功能、减少副作用且抑制car抑制)将在使用cart的体内mrna疗法内实行。
[0789]
在全身性“投与”后，cart将货物递送到白细胞和单核细胞。
[0790]
申请人评估哪些细胞参与杀死表达cd19的目标细胞。结果显示观察到的作用为非t细胞依赖性的，如在图30c中所绘示。在car19 mrna
‑
cart处理的动物中仍观测到延长的整体存活期，甚至cd4、cd8和cd4+cd8 t细胞被耗尽。cart转染巨噬细胞和b细胞体内，且结果显示经car
‑
19构建体转染的白细胞(除t细胞外)杀死cd
‑
19+细胞。如图30a
‑
b所示，经分离的巨噬细胞和用car19 mrna
‑
cart处理的原生b细胞杀死表达cd19的目标细胞，因此表明细胞死亡不是体内car
‑
t细胞操纵。这些结果说明car
‑
t、car
‑
b、car
‑
mac且可能car
‑
nk可以杀死目标细胞。
[0791]
人类pbmc中的cart
‑
mrna人类化car
‑
19疗法显示出在人类临床试验中观察到的天然b细胞的预期杀死。
[0792]
在人类临床试验中，有效car t细胞疗法引起杀死原生表达cd19的细胞(b细胞不全)的脱离目标作用。当将cart
‑
mrna car19递送到人类pbmc时，申请人观察到表达cd19的细胞的临床上预期的耗尽。表达car19的循环细胞的水平增加与b细胞的水平降低相关。存活的b细胞通常比被杀死的b细胞表达更少的cd19。人类car
‑
19使pbmc中的b细胞消融，而不靶向cd19的mrna对b细胞无影响，如图31a
‑
31c所示。
[0793]
概述：用于car的cart
[0794]
car
‑
t细胞疗法已表现出再生癌症处理的不可预测的前景，然而，当前制造过程具有包括成本、时间、供应和规模的大量限制。使用全身性递送cart
‑
car
‑
mrna对免疫细胞进行原位/体内编程解决了许多这些问题。举例来说，使用cart的car
‑
mrna递送允许包装多个蛋白质，因此，可以用其它免疫调节组分调谐car以及创新和改进版本的car。此外，有效地全身递送编码car
‑
19的mrna，确切地说，且治疗靶向表达cd19的肿瘤。重要的是，mrna产生的car是短暂的且可以通过重复给药再生。本文所述的实验表明模型系统肿瘤被严格地展示为cd 19+或cd 19
‑
。car由t细胞、b细胞、巨噬细胞、nk细胞表达。因为不需要t细胞来杀死肿瘤，所以表达car
‑
19的b细胞、巨噬细胞和nk细胞也在治疗上相关。最后，申请人证实将car
‑
19mrna离体cart递送到表达cd19的人类细胞，从而证实其治疗功效。
[0795]
参考
[0796]
dove ap,pratt rc,lohmeijer bgg,waymouth rm,hedrick jl(2005)《硫脲类的双功能有机催化：活性聚合的超分子识别》《美国化学学会杂志》127:13798
‑
13799。
[0797]
mckinlay cj等人(2017)《用于活的动物中的mrna的递送和释放的电荷可变型可释放转运蛋白(cart)》《美国国家科学院院刊(proc natl acad sci usa)》114:e448
‑
e456。
[0798]
geihe ei等人(2012)《细胞中的sirna经设计的富含胍的两性寡聚碳酸酯分子转运蛋白复合、递送和释放》《美国国家科学院院刊(proc natl acad sci usa)》109:13171
‑
13176。
[0799]
blake tr,waymouth rm(2014)《吗啉酮的有机催化开环聚合：官能化聚酯的新策略》《美国化学学会杂志》136:9252
‑
9255.
[0800]
非正式序列表
[0801]
seq id no:1
[0802]
car cdna序列
[0803]
atgtatcgcatgcagctgctgagctgcattgcgctgagcctggcgctggtgaccaacagcgacatccagatgacccagtcccccgcttctctgagcacatccctgggcgagaccgtgacaatccagtgccaggctagcgaggatatctactccggcctggcctggtaccagcagaagcctggaaagtctccccagctgctgatctacggagcttccgacctgcaggatggagtgccttctaggttctctggaagcggctccggaacccagtactctctgaagatcaccagcatgcagacagaggacgagggcgtgtacttctgccagcagggactgacctacccaagaacatttggcggaggcacaaagctggagctgaagggaggaggaggctccggcggaggaggctctggaggaggaggcagcgaggtgcagctgcagcagagcggagctgagctggtgaggcctggaacctccgtgaagctgtcttgtaaggtgagcggcgacaccatcacattctactacatgcactttgtgaagcagaggcctggccagggactggagtggatcggaagaatcgacccagaggatgagtccacaaagtactctgagaagttcaagaacaaggccaccctgacagctgataccagctccaacacagcttacctgaagctgtctagcctgaccagcgaggacaccgccacatacttctgcatctacggaggctactactttgattactggggccagggagtgatggtgacagtgtcctctatcgagtttatgtacccccctccatacctggacaacgagagatccaacggcaccatcatccacatcaaggagaagcacctgtgccacacacagagctccccaaagctgttctgggctctggtggtggtggctggcgtgctgttttgctacggactgctggtgaccgtggccctgtgcgtgatctggacaaacagcaggagaaaccggggaggccagtccgattacatgaacatgaccccacggcgccctggactgacaaggaagccataccagccatacgctcctgctcgcgacttcgctgcttacaggccaagagccaagttcagcaggagcgccgagaccgctgctaacctgcaggaccccaaccagctgttcaacgagctgaacctgggcaggagagaggagtttgacgtgctggagaagaagcgggctcgcgatcccgagatggga
ggcaagcagcagcggcgcaggaaccctcaggagggcgtgtacaacgccctgcagaaggacaagatggccgaggcttactctgagatcggcaccaagggagagagacggcgcggcaagggacacgatggcctgttccagggactgagcaccgccacaaaggacacctttgatgctctgcacatgcagacactggcccctcggtga
[0804]
seq id no:2
[0805]
car cdna，其具有t7多聚酶促进剂位点和afliii限制位点：
[0806]
taatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaaggccaccatgtatcgcatgcagctgctgagctgcattgcgctgagcctggcgctggtgaccaacagcgacatccagatgacccagtcccccgcttctctgagcacatccctgggcgagaccgtgacaatccagtgccaggctagcgaggatatctactccggcctggcctggtaccagcagaagcctggaaagtctccccagctgctgatctacggagcttccgacctgcaggatggagtgccttctaggttctctggaagcggctccggaacccagtactctctgaagatcaccagcatgcagacagaggacgagggcgtgtacttctgccagcagggactgacctacccaagaacatttggcggaggcacaaagctggagctgaagggaggaggaggctccggcggaggaggctctggaggaggaggcagcgaggtgcagctgcagcagagcggagctgagctggtgaggcctggaacctccgtgaagctgtcttgtaaggtgagcggcgacaccatcacattctactacatgcactttgtgaagcagaggcctggccagggactggagtggatcggaagaatcgacccagaggatgagtccacaaagtactctgagaagttcaagaacaaggccaccctgacagctgataccagctccaacacagcttacctgaagctgtctagcctgaccagcgaggacaccgccacatacttctgcatctacggaggctactactttgattactggggccagggagtgatggtgacagtgtcctctatcgagtttatgtacccccctccatacctggacaacgagagatccaacggcaccatcatccacatcaaggagaagcacctgtgccacacacagagctccccaaagctgttctgggctctggtggtggtggctggcgtgctgttttgctacggactgctggtgaccgtggccctgtgcgtgatctggacaaacagcaggagaaaccggggaggccagtccgattacatgaacatgaccccacggcgccctggactgacaaggaagccataccagccatacgctcctgctcgcgacttcgctgcttacaggccaagagccaagttcagcaggagcgccgagaccgctgctaacctgcaggaccccaaccagctgttcaacgagctgaacctgggcaggagagaggagtttgacgtgctggagaagaagcgggctcgcgatcccgagatgggaggcaagcagcagcggcgcaggaaccctcaggagggcgtgtacaacgccctgcagaaggacaagatggccgaggcttactctgagatcggcaccaagggagagagacggcgcggcaagggacacgatggcctgttccagggactgagcaccgccacaaaggacacctttgatgctctgcacatgcagacactggcccctcggtga
[0807]
seq id no:3
[0808]
car cdna，其具有t7多聚酶促进剂位点和afliii 5`和bamhi 3`限制位点、2xb
‑
血球蛋白3`utr区和120聚a尾：
[0809]
taatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaaggccaccatgtatcgcatgcagctgctgagctgcattgcgctgagcctggcgctggtgaccaacagcgacatccagatgacccagtcccccgcttctctgagcacatccctgggcgagaccgtgacaatccagtgccaggctagcgaggatatctactccggcctggcctggtaccagcagaagcctggaaagtctccccagctgctgatctacggagcttccgacctgcaggatggagtgccttctaggttctctggaagcggctccggaacccagtactctctgaagatcaccagcatgcagacagaggacgagggcgtgtacttctgccagcagggactgacctacccaagaacatttggcggaggcacaaagctggagctgaagggaggaggaggctccggcggaggaggctctggaggaggaggcagcgaggtgcagctgcagcagagcggagctgagctggtgaggcctggaacctccgtgaagctgtcttgtaaggtgagcggcgacaccatcacattctactacatgcactttgtgaagcagaggcctggccagggactggagtggatcggaagaatcgacccagaggatgagtccacaaagtactctgagaagttcaagaacaaggccaccctgacagctgataccagctccaacacagcttacctgaagctgtctagcctgaccagcgaggacaccgccacatacttctgcatctacggaggctactactttgattactggggccagggagtgatggtgacagtgtcc
tctatcgagtttatgtacccccctccatacctggacaacgagagatccaacggcaccatcatccacatcaaggagaagcacctgtgccacacacagagctccccaaagctgttctgggctctggtggtggtggctggcgtgctgttttgctacggactgctggtgaccgtggccctgtgcgtgatctggacaaacagcaggagaaaccggggaggccagtccgattacatgaacatgaccccacggcgccctggactgacaaggaagccataccagccatacgctcctgctcgcgacttcgctgcttacaggccaagagccaagttcagcaggagcgccgagaccgctgctaacctgcaggaccccaaccagctgttcaacgagctgaacctgggcaggagagaggagtttgacgtgctggagaagaagcgggctcgcgatcccgagatgggaggcaagcagcagcggcgcaggaaccctcaggagggcgtgtacaacgccctgcagaaggacaagatggccgaggcttactctgagatcggcaccaagggagagagacggcgcggcaagggacacgatggcctgttccagggactgagcaccgccacaaaggacacctttgatgctctgcacatgcagacactggcccctcggtgaggatccgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagaa
[0810]
某些实施例
[0811]
实施例1
[0812]
一种细胞穿透复合物，其包含非共价结合到阳离子两性聚合物的核酸，所述阳离子两性聚合物包含ph敏感分解域。
[0813]
实施例2
[0814]
根据实施例1所述的细胞穿透复合物，其中所述阳离子两性聚合物包含ph敏感分解域和亲脂性聚合物域。
[0815]
实施例3
[0816]
根据实施例2所述的细胞穿透复合物，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[0817]
r1‑
[l1‑
[(lp1)
z1
‑
(im)
z2
‑
(lp2)
z3
]
z4
‑
l2‑
r2]
z5
[0818]
其中
[0819]
r1是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0820]
r2是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0821]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代
或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[0822]
lp1和lp2独立地为一键或亲脂性聚合物域，其中lp1或lp2中的至少一个为亲脂性聚合物域；
[0823]
im为所述ph敏感分解域；
[0824]
z5为1到10的整数；
[0825]
z1、z3和z4独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一种不为0；和
[0826]
z2为2到100的整数。
[0827]
实施例4
[0828]
根据实施例3所述的细胞穿透复合物，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[0829][0830]
其中
[0831]
环a为被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0832]
cart具有下式：
‑
l1‑
[(lp1)
z1
‑
(im)
z2
‑
(lp2)
z3
]
z4
‑
l2‑
r2[0833]
其中，
[0834]
r2是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0835]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[0836]
lp1和lp2独立地为一键或亲脂性聚合物域，其中lp1或lp2中的至少一个为亲脂性聚合物域；
[0837]
im为所述ph敏感分解域；
[0838]
z5为1到10的整数；
[0839]
z1、z3和z4独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一种不为0；和
[0840]
z2为2到100的整数。
[0841]
实施例5
[0842]
根据实施例4所述的细胞穿透复合物，其中环a为被取代或未被取代的芳基。
[0843]
实施例6
[0844]
根据实施例4所述的细胞穿透复合物，其中环a为被取代或未被取代的苯基。
[0845]
实施例7
[0846]
根据实施例4所述的细胞穿透复合物，其中环a为被取代或未被取代的芳基。
[0847]
实施例8
[0848]
根据实施例4所述的细胞穿透复合物，其中环a为被取代或未被取代的苯基或萘基。
[0849]
实施例9
[0850]
根据实施例4所述的细胞穿透复合物，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[0851][0852]
实施例10
[0853]
根据实施例4所述的细胞穿透复合物，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[0854][0855]
实施例11
[0856]
根据实施例4所述的细胞穿透复合物，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[0857][0858]
其中cart1、cart2和cart3独立地为根据实施例4所定义的cart。
[0859]
实施例12
[0860]
根据实施例4所述的细胞穿透复合物，其中l1‑
ch2‑
o
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基。
[0861]
实施例13
[0862]
根据实施例4所述的细胞穿透复合物，其中l1‑
ch2‑
o
‑
、、
[0863]
实施例14
[0864]
根据实施例4所述的细胞穿透复合物，其中z5为1到3的整数。
[0865]
实施例15
[0866]
根据实施例4所述的细胞穿透复合物，其中z5为1或3。
[0867]
实施例16
[0868]
根据实施例4所述的细胞穿透复合物，其中z5为1。
[0869]
实施例17
[0870]
根据实施例4所述的细胞穿透复合物，其中z5为3。
[0871]
实施例18
[0872]
根据实施例4所述的细胞穿透复合物，其中r2为氢。
[0873]
实施例19
[0874]
根据实施例3所述的细胞穿透复合物，其中l2为一键。
[0875]
实施例20
[0876]
根据实施例1所述的细胞穿透复合物，其中所述ph敏感分解域具有下式：
[0877][0878]
其中n为2或更大的整数。
[0879]
实施例21
[0880]
根据实施例20所述的细胞穿透复合物，其中n为2到50范围内的整数。
[0881]
实施例22
[0882]
根据实施例1所述的细胞穿透复合物，其中所述ph敏感分解域具有下式：
[0883][0884]
其中
[0885]
n为2或更大的整数；
[0886]
n1为0到50的整数；
[0887]
z为所述亲核部分；
[0888]
x1为一键、
‑
c(r5)(r6)
‑
、
‑
c(r5)(r6)
‑
c(r7)(r8)
‑
、
‑
o
‑
c(r5)(r6)
‑
或
‑
o
‑
c(r5)(r6)
‑
c(r7)(r8)
‑
；
[0889]
x2为
‑
o
‑
或
‑
s
‑
；且
[0890]
r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0891]
实施例23
[0892]
根据实施例1所述的细胞穿透复合物，其中所述ph敏感分解域具有下式：
[0893][0894]
其中
[0895]
n为2或更大的整数；
[0896]
z为所述亲核部分；
[0897]
x1为一键、
‑
c(r5)(r6)
‑
、
‑
c(r5)(r6)
‑
c(r7)(r8)
‑
、
‑
o
‑
c(r5)(r6)
‑
或
‑
o
‑
c(r5)(r6)
‑
c(r7)(r8)
‑
；
[0898]
x2为
‑
o
‑
或
‑
s
‑
；且
[0899]
r
1.1
、r
1.2
、r
2.1
、r
2.2
、r3、r4、r5、r6、r7和r8独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0900]
实施例24
[0901]
根据实施例1所述的细胞穿透复合物，其中所述ph敏感分解域具有下式：
[0902][0903]
其中n为2或更大的整数。
[0904]
实施例25
[0905]
根据实施例1所述的细胞穿透复合物，其中所述ph敏感分解域具有下式：
[0906][0907]
其中n为2或更大的整数。
[0908]
实施例26
[0909]
根据实施例1所述的细胞穿透复合物，其中所述ph敏感分解域具有下式：
[0910][0911]
n为2或更大的整数；
[0912]
n1为0到50的整数；
[0913]
x1为一键、
‑
o
‑
、
‑
nr5‑
、
‑
c(r5)(r6)
‑
或
‑
c(r5)(r6)
‑
c(r7)(r8)
‑
；
[0914]
x2为一键、
‑
o
‑
、
‑
c(r9)(r
10
)
‑
或
‑
c(r9)(r
10
)
‑
c(r
11
)(r
12
)
‑
；
[0915]
x4为一键、
‑
c(o)
‑
、
‑
p(o)(or
16
)2‑
、
‑
s(o)(or
17
)2‑
、
‑
c(r
16
)(r
17
)
‑
或
‑
c(r
16
)(r
17
)
‑
c(r
18
)(r
19
)
‑
；
[0916]
x5为亲核部分；和
[0917]
r1、r2、r5、r6、r7、r8、r9、r
10
、r
11
、r
12
、r
15
、r
16
、r
17
、r
18
和r
19
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0918]
实施例27
[0919]
根据实施例4所述的细胞穿透复合物，其中z为
‑
s
‑
、
‑
s
+
r
13
‑
、
‑
nr
13
‑
或
‑
n
+
(r
13
)(h)
‑
，其中r
13
为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0920]
实施例28
[0921]
根据实施例23所述的细胞穿透复合物，其中z为
‑
s
‑
、
‑
s
+
r
13
‑
、
‑
nr
13
‑
或
‑
n
+
(r
13
)(h)
‑
，其中r
13
为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0922]
实施例29
[0923]
根据实施例4所述的细胞穿透复合物，其中z为
[0924][0925]
其中
[0926]
x3为c(r
15
)或n；
[0927]
x4为一键、
‑
c(o)
‑
、
‑
p(o)(or
16
)2‑
、
‑
s(o)(or
17
)2‑
、
‑
c(r
16
)(r
17
)
‑
或
‑
c(r
16
)(r
17
)
‑
c
(r
18
)(r
19
)
‑
；
[0928]
x5为亲核部分；和
[0929]
r
13
、r
14
、r
15
、r
16
、r
17
、r
18
和r
19
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0930]
实施例30
[0931]
根据实施例23所述的细胞穿透复合物，其中z为
[0932][0933]
其中
[0934]
x3为c(r
15
)或n；
[0935]
x4为一键、
‑
c(o)
‑
、
‑
p(o)(or
16
)2‑
、
‑
s(o)(or
17
)2‑
、
‑
c(r
16
)(r
17
)
‑
或
‑
c(r
16
)(r
17
)
‑
c(r
18
)(r
19
)
‑
；
[0936]
x5为亲核部分；和
[0937]
r
13
、r
14
、r
15
、r
16
、r
17
、r
18
和r
19
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0938]
实施例31
[0939]
根据实施例29所述的细胞穿透复合物，其中x5为
‑
n
+
(r
13
)(h)
‑
，其中r
13
为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0940]
实施例32
[0941]
根据实施例2所述的细胞穿透复合物，其中所述亲脂性聚合物域具有下式：
[0942][0943]
其中
[0944]
n2为1到100的整数；
[0945]
r
20
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[0946]
实施例33
[0947]
根据实施例1所述的细胞穿透复合物，其中所述核酸为信使rna(mrna)、小分子干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微rna(mirna)、导向rna(grna)、crispr rna(crrna)、转录活化rna(tracrrna)、质粒dna(pdna)、微环dna、基因组dna(gnda)。
[0948]
实施例34
[0949]
一种纳米粒子组合物，其包含多个根据实施例1所述的细胞穿透复合物。
[0950]
实施例35
[0951]
一种具有下式的阳离子两性聚合物：
[0952]
r1‑
[l1‑
[(lp1)
z1
‑
(im)
z2
‑
(lp2)
z3
]
z4
‑
l2‑
r2]
z5
[0953]
其中
[0954]
r1是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0955]
r2是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0956]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[0957]
lp1和lp2独立地为一键或亲脂性聚合物域，其中lp1或lp2中的至少一个为亲脂性聚合物域；
[0958]
im为所述ph敏感分解域；
[0959]
z5为1到10的整数；
[0960]
z1、z3和z4独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一种不为0；和
[0961]
z2为2到100的整数。
[0962]
实施例36
[0963]
根据实施例1所述的阳离子两性聚合物，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[0964][0965]
其中
[0966]
环a为被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0967]
cart具有下式：
‑
l1‑
[(lp1)
z1
‑
(im)
z2
‑
(lp2)
z3
]
z4
‑
l2‑
r2[0968]
其中，
[0969]
r2是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[0970]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[0971]
lp1和lp2独立地为一键或亲脂性聚合物域，其中lp1或lp2中的至少一个为亲脂性聚合物域；
[0972]
im为所述ph敏感分解域；
[0973]
z5为1到10的整数；
[0974]
z1、z3和z4独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一种不为0；和
[0975]
z2为2到100的整数。
[0976]
实施例37
[0977]
一种将核酸转染到细胞中的方法，所述方法包含使细胞与根据实施例1所述的复合物接触，所述复合物包含非共价结合到阳离子两性聚合物的核酸。
[0978]
实施例38
[0979]
根据实施例37所述的方法，其进一步包含使所述阳离子两性聚合物在所述细胞内降解，从而形成降解产物。
[0980]
实施例39
[0981]
根据实施例38所述的方法，其中所述降解产物为被取代或未被取代的二酮哌嗪。
[0982]
实施例40
[0983]
根据实施例37所述的方法，其中所述核酸包含选自由以下组成的群组的一个或多个：信使rna(mrna)、小分子干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微rna(mirna)、导向rna(grna)、crispr rna(crrna)、转录活化rna(tracrrna)、质粒dna(pdna)、微环dna、基因组dna(gnda)。
[0984]
实施例41
[0985]
根据实施例40所述的方法，其进一步包含使所述mrna在所述细胞中表达。
[0986]
实施例42
[0987]
根据实施例37所述的方法，其中一个或多个基因产物的表达增加。
[0988]
实施例43
[0989]
根据实施例37所述的方法，其中一个或多个基因产物的表达降低。
[0990]
实施例44
[0991]
根据实施例37所述的方法，其中所述细胞为真核细胞。
[0992]
实施例45
[0993]
根据实施例37所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物或人类细胞。
[0994]
实施例46
[0995]
根据实施例37所述的方法，其中所述细胞形成生物体的一部分。
[0996]
实施例47
[0997]
根据实施例46所述的方法，其中所述生物体为人类。
[0998]
实施例48
[0999]
根据实施例37所述的方法，其中所述方法引起所述细胞中的基因编辑。
[1000]
实施例49
[1001]
根据实施例48所述的方法，其中所述核酸包含一个或多个载体，所述载体包含：
[1002]
a)编码crispr
‑
cas系统导向rna的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列与所述细胞的所述基因组中的目标序列混合，和
[1003]
b)编码cas9蛋白质的第二核苷酸序列，
[1004]
其中所述(a)和(b)位于相同或不同载体上。
[1005]
实施例50
[1006]
根据实施例48所述的方法，其中所述核酸包含crispr rna(crrna)。
[1007]
实施例51
[1008]
根据实施例50所述的方法，其中所述crrna在第一核苷酸序列的相同载体中。
[1009]
实施例52
[1010]
根据实施例48所述的方法，其中所述核酸包含转录活化rna(tracrrna)。
[1011]
实施例53
[1012]
根据实施例52所述的方法，其中所述tracrrna在所述第二核苷酸序列的相同载体中。
[1013]
实施例54
[1014]
根据实施例48所述的方法，其中所述cas9蛋白质为经密码子优化以表现与所述细胞中。
[1015]
实施例55
[1016]
根据实施例48所述的方法，其中所述核酸包含：
[1017]
a)编码转座酶的第一核苷酸序列；和
[1018]
b)包含由转座酶识别位点侧接的相关基因的核酸序列的第二核苷酸序列，
[1019]
其中所述(a)和(b)位于相同或不同载体上。
[1020]
实施例56
[1021]
根据实施例55所述的方法，其中所述转座酶识别和切除相关基因组序列。
[1022]
实施例57
[1023]
根据实施例55所述的方法，其中所述相关基因的所述核酸序列被整合到所述细胞的基因组中。
[1024]
实施例58
[1025]
根据实施例48所述的方法，其中所述基因编辑选自由以下组成的群组：dna缺失、基因破坏、dna插入、dna反转、点突变、dna替换、基因敲入和基因敲落。
[1026]
实施例59
[1027]
根据实施例37所述的方法，其中所述方法引起干细胞的诱导。
[1028]
实施例60
[1029]
一种诱导有需要的个体的免疫反应的方法，所述方法包含：
[1030]
向所述个体投与有效量的根据实施例1所述的复合物，所述复合物包含非共价结合到阳离子两性聚合物的核酸。
[1031]
实施例61
[1032]
根据实施例60所述的方法，其中所述疾病为传染病。
[1033]
实施例62
[1034]
根据实施例60所述的方法，其中所述疾病为癌症。
[1035]
实施例63
[1036]
根据实施例60所述的方法，其中所述个体先前诊断患有所述疾病。
[1037]
实施例64
[1038]
根据实施例60所述的方法，其中所述个体不具有与所述疾病相关的可检测症状。
[1039]
实施例65
[1040]
根据实施例60所述的方法，其中所述个体为人类。
[1041]
实施例66
[1042]
根据实施例60所述的方法，其中根据实施例1所述的复合物包括于包含药学上可接受的载剂的药物组合物中。
[1043]
实施例67
[1044]
根据实施例66所述的方法，其中所述药物组合物是癌症疫苗。
[1045]
实施例68
[1046]
根据实施例67所述的方法，其中所述个体不具有癌症且所述癌症疫苗诱导所述个体的免疫反应，其预防所述癌症的发生。
[1047]
实施例69
[1048]
根据实施例67所述的方法，其中所述个体已诊断患有所述癌症，且所述癌症疫苗诱导所述个体的免疫反应，其治疗所述癌症。
[1049]
实施例70
[1050]
根据实施例60所述的方法，其中所述核酸为信使rna(mrna)、小分子干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微rna(mirna)、导向rna(grna)、crispr rna(crrna)、转录活化rna(tracrrna)、质粒dna(pdna)、微环dna、基因组dna(gnda)。
[1051]
实施例71
[1052]
根据实施例60所述的方法，其中所述核酸被转染到所述个体的一个或多个细胞中。
[1053]
实施例72
[1054]
根据实施例71所述的方法，其中所述转染的核酸在所述个体中提供抗癌活性。
[1055]
实施例73
[1056]
根据实施例71所述的方法，其中所述核酸编码与癌症相关的一种或多种肽。
[1057]
实施例74
[1058]
根据实施例72所述的方法，其中所述抗癌活性选自由以下组成的群组：减少癌细胞数目、减少癌症大小、杀死癌细胞、减少和/或抑制癌转移和减少癌细胞生长和/或增殖。
[1059]
实施例75
[1060]
根据实施例66所述的方法，其中所述药学上可接受的载剂包含免疫佐剂。
[1061]
实施例76
[1062]
根据实施例60所述的方法，其中所述方法进一步包含：
[1063]
向所述个体投与有效量的一种或多种药物组合物，所述额外药物组合物包含抗癌剂和药学上可接受的载剂。
[1064]
实施例77
[1065]
一种细胞穿透复合物，其包含非共价结合到阳离子两性聚合物的核酸，所述阳离子两性聚合物包含ph敏感分解域。
[1066]
实施例78
[1067]
根据实施例77所述的细胞穿透复合物，其中所述阳离子两性聚合物包含ph敏感分解域和亲脂性聚合物域。
[1068]
实施例79
[1069]
根据实施例78所述的细胞穿透复合物，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1070]
h
‑
l1‑
[(lp1)
z1
‑
(im)
z2
‑
(lp2)
z3
]
z4
‑
l2‑
h(i)
[1071]
其中，
[1072]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[1073]
lp1和lp2独立地为一键或亲脂性聚合物域，其中lp1或lp2中的至少一个为亲脂性聚合物域；
[1074]
im为所述ph敏感分解域；
[1075]
z1、z3和z4独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一种不为0；和
[1076]
z2为2到100的整数。
[1077]
实施例80
[1078]
根据实施例77到79中的一项所述的细胞穿透复合物，其中所述ph敏感分解域具有下式：
[1079][1080]
其中
[1081]
n为2或更大的整数；
[1082]
n1为0到50的整数；
[1083]
z为所述亲核部分；
[1084]
x1为一键、
‑
c(r5)(r6)
‑
、
‑
c(r5)(r6)
‑
c(r7)(r8)
‑
、
‑
o
‑
c(r5)(r6)
‑
或
‑
o
‑
c(r5)(r6)
‑
c(r7)(r8)
‑
；
[1085]
x2为
‑
o
‑
或
‑
s
‑
；且
[1086]
r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[1087]
实施例81
[1088]
根据实施例77到80中的一项所述的细胞穿透复合物，其中所述ph敏感分解域具有下式：
[1089][1090]
其中
[1091]
n为2或更大的整数；
[1092]
z为所述亲核部分；
[1093]
x1为一键、
‑
c(r5)(r6)
‑
、
‑
c(r5)(r6)
‑
c(r7)(r8)
‑
、
‑
o
‑
c(r5)(r6)
‑
或
‑
o
‑
c(r5)(r6)
‑
c(r7)(r8)
‑
；
[1094]
x2为
‑
o
‑
或
‑
s
‑
；且
[1095]
r
1.1
、r
1.2
、r
2.1
、r
2.2
、r3、r4、r5、r6、r7和r8独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[1096]
实施例82
[1097]
根据实施例77到80中的一项所述的细胞穿透复合物，其中所述ph敏感分解域具有下式：
[1098][1099]
其中n为2或更大的整数。
[1100]
实施例83
[1101]
根据实施例77到82中的一项所述的细胞穿透复合物，其中所述ph敏感分解域具有
下式：
[1102][1103]
其中n为2或更大的整数。
[1104]
实施例84
[1105]
根据实施例77到82中的一项所述的细胞穿透复合物，其中所述ph敏感分解域具有下式：
[1106][1107]
n为2或更大的整数；
[1108]
n1为0到50的整数；
[1109]
x1为一键、
‑
o
‑
、
‑
nr5‑
、
‑
c(r5)(r6)
‑
或
‑
c(r5)(r6)
‑
c(r7)(r8)
‑
；
[1110]
x2为一键、
‑
o
‑
、
‑
c(r9)(r
10
)
‑
或
‑
c(r9)(r
10
)
‑
c(r
11
)(r
12
)
‑
；
[1111]
x4为一键、
‑
c(o)
‑
、
‑
p(o)(or
16
)2‑
、
‑
s(o)(or
17
)2‑
、
‑
c(r
16
)(r
17
)
‑
或
‑
c(r
16
)(r
17
)
‑
c(r
18
)(r
19
)
‑
；
[1112]
x5为亲核部分；和
[1113]
r1、r2、r5、r6、r7、r8、r9、r
10
、r
11
、r
12
、r
15
、r
16
、r
17
、r
18
和r
19
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[1114]
实施例85
[1115]
根据实施例77到80中的一项所述的细胞穿透复合物，其中所述ph敏感分解域具有下式：
[1116][1117]
其中n为2或更大的整数。
[1118]
实施例86
[1119]
根据实施例85所述的细胞穿透复合物，其中n为2到50范围内的整数。
[1120]
实施例87
[1121]
根据实施例78或79所述的细胞穿透复合物，其中z为
‑
s
‑
、
‑
s
+
r
13
‑
、
‑
nr
13
‑
或
‑
n
+
(r
13
)(h)
‑
，其中r
13
为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[1122]
实施例88
[1123]
根据实施例78或79所述的细胞穿透复合物，其中z为
[1124][1125]
其中
[1126]
x3为c(r
15
)或n；
[1127]
x4为一键、
‑
c(o)
‑
、
‑
p(o)(or
16
)2‑
、
‑
s(o)(or
17
)2‑
、
‑
c(r
16
)(r
17
)
‑
或
‑
c(r
16
)(r
17
)
‑
c(r
18
)(r
19
)
‑
；
[1128]
x5为亲核部分；和
[1129]
r
13
、r
14
、r
15
、r
16
、r
17
、r
18
和r
19
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[1130]
实施例89
[1131]
根据实施例88所述的细胞穿透复合物，其中x5为
‑
n
+
(r
13
)(h)
‑
，其中r
13
为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[1132]
实施例90
[1133]
根据实施例78
‑
89中的一项所述的细胞穿透复合物，其中所述亲脂性聚合物域具有下式：
[1134][1135]
其中
[1136]
n2为1到100的整数；
[1137]
r
20
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[1138]
实施例91
[1139]
根据实施例77到87中的一项所述的细胞穿透复合物，其中所述核酸为mrna、sirna、pdna、shrna或gdna。
[1140]
实施例92
[1141]
一种纳米粒子组合物，其包含多个根据实施例77到91中任一项所述的细胞穿透复合物。
[1142]
实施例93
[1143]
一种具有下式的阳离子两性聚合物：
[1144]
h
‑
l1‑
[(lp1)
z1
‑
(im)
z2
‑
(lp2)
z3
]
z4
‑
l2‑
h(i)
[1145]
其中：
[1146]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[1147]
lp1和lp2独立地为一键或亲脂性聚合物域，其中lp1或lp2中的至少一个为亲脂性聚合物域；
[1148]
im为所述ph敏感分解域；
[1149]
z1、z3和z4独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一种不为0；和
[1150]
z2为2到100的整数。
[1151]
实施例94
[1152]
一种将核酸转染到细胞中的方法，所述方法包含使细胞与根据实施例77到90在任一项所述的复合物接触。
[1153]
实施例95
[1154]
根据实施例94所述的方法，其进一步包含使所述阳离子两性聚合物在所述细胞内降解，从而形成降解产物。
[1155]
实施例96
[1156]
根据实施例95所述的方法，其中所述降解产物为被取代或未被取代的二酮哌嗪。
[1157]
实施例97
[1158]
根据实施例94到96中任一项所述的方法，其中所述核酸为mrna。
[1159]
实施例98
[1160]
根据实施例97所述的方法，其进一步包含使所述mrna在所述细胞中表达。
[1161]
实施例99
[1162]
根据实施例94到97中任一项所述的方法，其中所述细胞形成生物体的一部分。
[1163]
实施例100
[1164]
根据实施例99所述的方法，其中所述生物体为人类。
[1165]
p实施例
[1166]
p实施例1.一种细胞穿透复合物，其包含非共价结合到阳离子两性聚合物的核酸，所述阳离子两性聚合物包含ph敏感分解域和亲脂性聚合物域，
[1167]
其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1168]
r
1a
‑
[l1‑
[(lp1)
z1
‑
(lp2)
z3
‑
(im)
z2
]
z4
‑
l2‑
r
2a
]
z5
[1169]
其中
[1170]
r
1a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[1171]
r
2a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[1172]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[1173]
lp1和lp2独立地为亲脂性聚合物域；
[1174]
im为所述ph敏感分解域；
[1175]
z5为1到10的整数；
[1176]
z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和
[1177]
z2为2到100的整数。
[1178]
p实施例2.根据p实施例1所述的细胞穿透复合物，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1179][1180]
其中
[1181]
环a为被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[1182]
cart具有下式：
‑
l1‑
[(lp1)
z1
‑
(lp2)
z3
‑
(im)
z2
]
z4
‑
l2‑
r
2a
[1183]
其中，
[1184]
r
2a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或
未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[1185]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[1186]
lp1和lp2独立地为亲脂性聚合物域；
[1187]
im为所述ph敏感分解域；
[1188]
z5为1到10的整数；
[1189]
z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和
[1190]
z2为2到100的整数。
[1191]
p实施例3.根据p实施例2所述的细胞穿透复合物，其中环a为被取代或未被取代的芳基。
[1192]
p实施例4.根据p实施例2所述的细胞穿透复合物，其中环a为被取代或未被取代的苯基。
[1193]
p实施例5.根据p实施例2所述的细胞穿透复合物，其中环a为被取代或未被取代的芳基。
[1194]
p实施例6.根据p实施例2所述的细胞穿透复合物，其中环a为被取代或未被取代的苯基或萘基。
[1195]
p实施例7.根据p实施例1或2所述的细胞穿透复合物，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1196][1197]
p实施例8.根据p实施例1或2所述的细胞穿透复合物，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1198][1199]
p实施例9.根据p实施例1或2所述的细胞穿透复合物，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1200][1201]
其中cart1、cart2和cart3独立地为根据权利要求2所定义的cart。
[1202]
p实施例10.根据p实施例1或2所述的细胞穿透复合物，其中z5为1到3的整数。
[1203]
p实施例11.根据p实施例1或2所述的细胞穿透复合物，其中z5为1或3。
[1204]
p实施例12.根据p实施例1或2所述的细胞穿透复合物，其中z5为1。
[1205]
p实施例13.根据p实施例1或2所述的细胞穿透复合物，其中z5为3。
[1206]
p实施例14.根据p实施例1或2所述的细胞穿透复合物，其中r
2a
为氢。
[1207]
p实施例15.根据p实施例1或2所述的细胞穿透复合物，其中l2为一键。
[1208]
p实施例16.根据p实施例1所述的细胞穿透复合物，其中所述ph敏感分解域具有下式：
[1209][1210]
其中n为2或更大的整数。
[1211]
p实施例17.根据p实施例16所述的细胞穿透复合物，其中n为2到50范围内的整数。
[1212]
p实施例18.根据p实施例16所述的细胞穿透复合物，其中n为7。
[1213]
p实施例19.根据p实施例1或2所述的细胞穿透复合物，其中所述亲脂性聚合物域具有下式：
[1214][1215]
其中
[1216]
n2为1到100的整数；
[1217]
r
20
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[1218]
p实施例20.根据p实施例1
‑
19中任一项所述的细胞穿透复合物，其中lp1具有下式：
[1219][1220]
其中
[1221]
n21为1到100的整数；
[1222]
r
201
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[1223]
p实施例21.根据权利要求20所述的细胞穿透复合物，其中n21为5且r
201
为未被取代的c
18
烯基
[1224]
p实施例22.根据p实施例21所述的细胞穿透复合物，其中所述未被取代的c
18
烯基为油基。
[1225]
p实施例23.根据p实施例1
‑
22中任一项所述的细胞穿透复合物，其中lp2具有下式：
[1226][1227]
其中
[1228]
n22为1到100的整数；
[1229]
r
202
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[1230]
p实施例24.根据p实施例23所述的细胞穿透复合物，其中n22为5和r
202
为未被取代的c9烯基。
[1231]
p实施例25.根据p实施例24所述的细胞穿透复合物，其中所述未被取代的c9烯基为壬烯基。
[1232]
p实施例26.根据p实施例1
‑
25中任一项所述的细胞穿透复合物，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1233][1234]
其中n21为5，r
201
为油基，n22为5，r
202
为壬烯基，且n为7。
[1235]
p实施例27.根据p实施例1
‑
26中任一项所述的细胞穿透复合物，其中所述核酸为信使rna(mrna)、小分子干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微rna(mirna)、导向rna(grna)、crispr rna(crrna)、转录活化rna(tracrrna)、质粒dna(pdna)、微环dna、基因组dna(gnda)。
[1236]
p实施例28.根据p实施例1
‑
27中任一项所述的细胞穿透复合物，其中所述核酸包含编码嵌合抗原受体(car)的序列。
[1237]
p实施例29.一种纳米粒子组合物，其包含多个根据p实施例1
‑
28中任一项所述的细胞穿透复合物。
[1238]
p实施例30.一种药物组合物，包括根据p实施例1
‑
28中任一项所述的复合物和药学上可接受的载剂。
[1239]
p实施例31.一种将核酸转染到细胞中的方法，所述方法包含使细胞与根据p实施例1
‑
28中任一项所述的复合物接触。
[1240]
p实施例32.根据p实施例31所述的方法，其进一步包含使所述阳离子两性聚合物在所述细胞内降解，从而形成降解产物。
[1241]
p实施例33.根据实施例p实施例32所述的方法，其中所述降解产物为被取代或未被取代的二酮哌嗪。
[1242]
p实施例34.根据实施例p实施例31所述的方法，其中所述核酸包含编码car的信使rna(mrna)。
[1243]
p实施例35.根据实施例p实施例34所述的方法，其进一步包含使所述mrna在所述细胞中表达。
[1244]
p实施例36.根据实施例p实施例35所述的方法，其中所述细胞为真核细胞。
[1245]
p实施例37.根据p实施例35所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物或人类细胞。
[1246]
p实施例38.根据p实施例35所述的方法，其中所述细胞形成生物体的一部分。
[1247]
p实施例39.根据p实施例38所述的方法，其中所述生物体为人类。
[1248]
p实施例40.根据p实施例35
‑
39中任一项的权利要求所述的方法，其中所述细胞为淋巴细胞或骨髓细胞。
[1249]
p实施例41.根据p实施例35
‑
40中任一项的权利要求所述的方法，其中所述细胞为t细胞。
[1250]
p实施例42.根据p实施例35
‑
40中任一项的权利要求所述的方法，其中所述细胞为骨髓细胞。
[1251]
p实施例43.一种诱导有需要的个体的免疫反应的方法，所述方法包含向所述个体投与有效量的p实施例1到28中任一项所述的复合物。
[1252]
p实施例44.根据p实施例43所述的方法，其中所述免疫反应为抗癌免疫反应。
[1253]
p实施例45.一种治疗有需要的个体的癌症的方法，所述方法包含向所述个体投与有效量的p实施例1到28中任一项所述的复合物。
[1254]
p实施例46.根据权利要求p实施例43
‑
45中任一项所述的方法，其中所述投与包含静脉内注射或皮下注射。
[1255]
p实施例47.一种将编码嵌合抗原受体(car)的核酸转染到细胞中的方法，所述方法包含使细胞与包含非共价结合到阳离子两性聚合物的核酸的细胞穿透复合物接触，所述阳离子两性聚合物包含ph敏感分解域和亲脂性聚合物域，且所述核酸包含编码嵌合抗原受体的序列。
[1256]
p实施例48.根据p实施例47所述的方法，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1257]
r
1a
‑
[l1‑
[(lp1)
z1
‑
(im)
z2
‑
(lp2)
z3
]
z4
‑
l2‑
r
2a
]
z5
[1258]
其中
[1259]
r
1a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[1260]
r
2a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[1261]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[1262]
lp1和lp2独立地为一键或亲脂性聚合物域，其中lp1或lp2中的至少一个为亲脂性聚合物域；
[1263]
im为所述ph敏感分解域；
[1264]
z5为1到10的整数；
[1265]
z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和
[1266]
z2为2到100的整数。
[1267]
p实施例49.根据p实施例47或48所述的方法，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1268][1269]
其中
[1270]
环a为被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[1271]
cart具有下式：
‑
l1‑
[(lp1)
z1
‑
(im)
z2
‑
(lp2)
z3
]
z4
‑
l2‑
r
2a
[1272]
其中，
[1273]
r
2a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[1274]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[1275]
lp1和lp2独立地为一键或亲脂性聚合物域，其中lp1或lp2中的至少一个为亲脂性聚合物域；
[1276]
im为所述ph敏感分解域；
[1277]
z5为1到10的整数；
[1278]
z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和
[1279]
z2为2到100的整数。
[1280]
p实施例50.根据p实施例49所述的方法，其中环a为被取代或未被取代的芳基。
[1281]
p实施例51.根据p实施例49所述的方法，其中环a为被取代或未被取代的苯基。
[1282]
p实施例52.根据p实施例49所述的方法，其中环a为被取代或未被取代的芳基。
[1283]
p实施例53.根据p实施例49所述的方法，其中环a为被取代或未被取代的苯基或萘基。
[1284]
p实施例54.根据p实施例48或49所述的方法，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1285][1286]
p实施例55.根据p实施例48或49所述的方法，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1287][1288]
p实施例56.根据p实施例48或49所述的方法，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1289][1290]
其中cart1、cart2和cart3独立地为根据权利要求4所定义的cart。
[1291]
p实施例57.根据p实施例48或49所述的方法，其中l1为
‑
ch2‑
o
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基。
[1292]
p实施例58.根据p实施例47
‑
57中任一项所述的方法，其中所述ph敏感分解域具有下式：
[1293][1294]
其中n为2或更大的整数。
[1295]
p实施例59.根据p实施例47所述的方法，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1296]
r
1a
‑
[l1‑
[(lp1)
z1
‑
(lp2)
z3
‑
(im)
z2
]
z4
‑
l2‑
r
2a
]
z5
[1297]
其中
[1298]
r
1a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[1299]
r
2a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[1300]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或
被取代或未被取代的亚杂芳基；
[1301]
lp1和lp2独立地为亲脂性聚合物域；
[1302]
im为所述ph敏感分解域；
[1303]
z5为1到10的整数；
[1304]
z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和
[1305]
z2为2到100的整数。
[1306]
p实施例60.根据p实施例47或49所述的方法，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1307][1308]
其中
[1309]
环a为被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[1310]
cart具有下式：
‑
l1‑
[(lp1)
z1
‑
(lp2)
z3
‑
(im)
z2
]
z4
‑
l2‑
r
2a
[1311]
其中，
[1312]
r
2a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[1313]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[1314]
lp1和lp2独立地为亲脂性聚合物域；
[1315]
im为所述ph敏感分解域；
[1316]
z5为1到10的整数；
[1317]
z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和
[1318]
z2为2到100的整数。
[1319]
p实施例61.根据p实施例60所述的方法，其中环a为被取代或未被取代的芳基。
[1320]
p实施例62.根据p实施例60所述的方法，其中环a为被取代或未被取代的苯基。
[1321]
p实施例63.根据p实施例60所述的方法，其中环a为被取代或未被取代的芳基。
[1322]
p实施例64.根据p实施例60所述的方法，其中环a为被取代或未被取代的苯基或萘基。
[1323]
p实施例65.根据p实施例59
‑
64中任一项所述的方法，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1324][1325]
p实施例66.根据p实施例59
‑
65中任一项所述的方法，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1326][1327]
p实施例67.根据p实施例59
‑
66中任一项所述的方法，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1328][1329]
其中cart1、cart2和cart3独立地为根据p实施例4所定义的cart。
[1330]
p实施例68.根据p实施例59
‑
67中任一项所述的方法，其中z5为1到3的整数。
[1331]
p实施例69.根据p实施例59
‑
67中任一项所述的方法，其中z5为1或3。
[1332]
p实施例70.根据p实施例59
‑
67中任一项所述的方法，其中z5为1。
[1333]
p实施例71.根据p实施例59
‑
67中任一项所述的方法，其中z5为3。
[1334]
p实施例72.根据p实施例59
‑
71中任一项所述的方法，其中r
2a
为氢。
[1335]
p实施例73.根据p实施例59
‑
72中任一项所述的方法，其中l2为一键。
[1336]
p实施例74.根据p实施例59
‑
73中任一项所述的方法，其中所述ph敏感分解域具有下式：
[1337][1338]
其中n为2或更大的整数。
[1339]
p实施例75.根据p实施例74所述的方法，其中n为2到50范围内的整数。
[1340]
p实施例76.根据p实施例74所述的方法，其中n为7。
[1341]
p实施例77.根据p实施例59
‑
76中任一项所述的方法，其中所述亲脂性聚合物域具有下式：
[1342][1343]
其中
[1344]
n2为1到100的整数；
[1345]
r
20
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[1346]
p实施例78.根据p实施例59
‑
77中任一项所述的方法，其中lp1具有下式：
[1347][1348]
其中
[1349]
n21为1到100的整数；
[1350]
r
201
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[1351]
p实施例79.根据p实施例78所述的方法，其中n21为5和r
201
为未被取代的c
18
烯基。
[1352]
p实施例80.根据p实施例59
‑
77中任一项所述的方法，其中lp2具有下式：
[1353][1354]
其中
[1355]
n22为1到100的整数；
[1356]
r
202
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[1357]
p实施例81.根据p实施例80，其中n22为5和r
202
为未被取代的c9烯基。
[1358]
p实施例82.根据p实施例47
‑
81中任一项所述的方法，其中所述细胞为真核细胞。
[1359]
p实施例83.根据p实施例47
‑
81中任一项所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物或人类细胞。
[1360]
p实施例84.根据p实施例47
‑
81中任一项所述的方法，其中所述细胞形成生物体的一部分。
[1361]
p实施例85.根据p实施例47
‑
81中任一项所述的方法，其中所述生物体为人类。
[1362]
p实施例86.根据p实施例47
‑
81中任一项所述的方法，其中所述细胞为淋巴细胞或骨髓细胞。
[1363]
p实施例87.根据p实施例47
‑
81中任一项所述的方法，其中所述细胞为t细胞。
[1364]
p实施例88.根据p实施例47
‑
81中任一项所述的方法，其中所述细胞为骨髓细胞。
[1365]
p实施例89.一种具有下式的阳离子两性聚合物：
[1366]
r
1a
‑
[l1‑
[(lp1)
z1
‑
(lp2)
z3
‑
(im)
z2
]
z4
‑
l2‑
r
2a
]
z5
[1367]
其中
[1368]
r
1a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[1369]
r
2a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[1370]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[1371]
lp1和lp2独立地为亲脂性聚合物域；
[1372]
im为所述ph敏感分解域；
[1373]
z5为1到10的整数；
[1374]
z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和
[1375]
z2为2到100的整数。
[1376]
p实施例90.根据p实施例89所述的阳离子两性聚合物，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1377][1378]
其中
[1379]
环a为被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[1380]
cart具有下式：
‑
l1‑
[(lp1)
z1
‑
(lp2)
z3
‑
(im)
z2
]
z4
‑
l2‑
r
2a
[1381]
其中，
[1382]
r
2a
是氢、卤素、
‑
ccl3、
‑
cbr3、
‑
cf3、
‑
ci3、chcl2、
‑
chbr2、
‑
chf2、
‑
chi2、
‑
ch2cl、
‑
ch2br、
‑
ch2f、
‑
ch2i、
‑
cn、
‑
oh、
‑
nh2、
‑
cooh、
‑
conh2、
‑
no2、
‑
sh、
‑
so3h、
‑
so4h、
‑
so2nh2、
‑
nhnh2、
‑
onh2、
‑
nhc(o)nhnh2、
‑
nhc(o)nh2、
‑
nhso2h、
‑
nhc(o)h、
‑
nhc(o)oh、
‑
nhoh、
‑
occl3、
‑
ocf3、
‑
ocbr3、
‑
oci3、
‑
ochcl2、
‑
ochbr2、
‑
ochi2、
‑
ochf2、
‑
och2cl、
‑
och2br、
‑
och2i、
‑
och2f、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；
[1383]
l1和l2独立地为一键、
‑
c(o)o
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)nh
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；
[1384]
lp1和lp2独立地为亲脂性聚合物域；
[1385]
im为所述ph敏感分解域；
[1386]
z5为1到10的整数；
[1387]
z1和z3独立地为0到100的整数，其中z1或z3中的至少一个不是0；z4是1到100的整数，和
[1388]
z2为2到100的整数。
[1389]
p实施例91.根据p实施例90所述的阳离子两性聚合物，其中环a为被取代或未被取代的芳基。
[1390]
p实施例92.根据p实施例90所述的阳离子两性聚合物，其中环a为被取代或未被取代的苯基。
[1391]
p实施例93.根据p实施例90所述的阳离子两性聚合物，其中环a为被取代或未被取代的芳基。
[1392]
p实施例94.根据p实施例90所述的阳离子两性聚合物，其中环a为被取代或未被取代的苯基或萘基。
[1393]
p实施例95.根据p实施例89
‑
94中任一项所述的阳离子两性聚合物，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1394][1395]
p实施例96.根据p实施例89
‑
94中任一项所述的阳离子两性聚合物，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1396][1397]
p实施例97.根据p实施例89
‑
94中任一项所述的阳离子两性聚合物，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1398][1399]
其中cart1、cart2和cart3独立地为根据p实施例4所定义的cart。
[1400]
p实施例98.根据p实施例89
‑
97中任一项所述的阳离子两性聚合物，其中z5为1到3的整数。
[1401]
p实施例99.根据p实施例89
‑
97中任一项所述的阳离子两性聚合物，其中z5为1或3。
[1402]
p实施例100.根据p实施例89
‑
97中任一项所述的阳离子两性聚合物，其中z5为1。
[1403]
p实施例101.根据p实施例89
‑
97中任一项所述的阳离子两性聚合物，其中z5为3。
[1404]
p实施例102.根据p实施例89
‑
101中任一项所述的阳离子两性聚合物，其中r
2a
为氢。
[1405]
p实施例103.根据p实施例89
‑
102中任一项所述的阳离子两性聚合物，其中l2为一键。
[1406]
p实施例104.根据p实施例89
‑
103中任一项所述的阳离子两性聚合物，其中所述ph敏感分解域具有下式：
[1407][1408]
其中n为2或更大的整数。
[1409]
p实施例105.根据p实施例104所述的阳离子两性聚合物，其中n为2到50范围内的整数。
[1410]
p实施例106.根据p实施例105所述的阳离子两性聚合物，其中n为7。
[1411]
p实施例107.根据p实施例89
‑
106中任一项所述的阳离子两性聚合物，其中所述亲脂性聚合物域具有下式：
[1412][1413]
其中
[1414]
n2为1到100的整数；
[1415]
r
20
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[1416]
p实施例108.根据p实施例89
‑
107中任一项所述的阳离子两性聚合物，其中lp1具有下式：
[1417][1418]
其中
[1419]
n21为1到100的整数；
[1420]
r
201
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[1421]
p实施例109.根据p实施例108所述的阳离子两性聚合物，其中n21为5和r
201
为未被取代的c
18
烯基。
[1422]
p实施例110.根据p实施例109所述的阳离子两性聚合物，其中所述未被取代的c
18
烯基为油基。
[1423]
p实施例111.根据p实施例89
‑
110中任一项所述的阳离子两性聚合物，其中lp2具有下式：
[1424][1425]
其中
[1426]
n22为1到100的整数；
[1427]
r
202
独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。
[1428]
p实施例112.根据p实施例111所述的阳离子两性聚合物，其中n22为5和r
202
为未被取代的c9烯基。
[1429]
p实施例113.根据p实施例112所述的阳离子两性聚合物，其中所述未被取代的c9烯基为壬烯基。
[1430]
p实施例114.根据p实施例89
‑
113中任一项所述的阳离子两性聚合物，其中所述阳离子两性聚合物具有下式：
[1431][1432]
其中n21为5，r
201
为油基，n22为5，r
202
为壬烯基，且n为7。
[1433]
p实施例115.一种将编码受体蛋白质的核酸转染到个体的细胞中的方法，所述方法包含向个体投与包含结合到化合物的编码受体蛋白质的核酸的细胞穿透复合物，其中所述化合物在递送到所述细胞中之后降解，从而将编码受体蛋白质的核酸转染到个体的细胞中。
[1434]
p实施例116.根据p实施例115所述的方法，其中所述细胞受体为t细胞受体(tcr)。
[1435]
p实施例117.根据p实施例115所述的方法，其中所述细胞受体为嵌合抗原受体(car)。
[1436]
p实施例118.一种将编码t细胞受体(tcr)的核酸转染到个体的细胞中的方法，所述方法包含向个体投与包含结合到化合物的编码tcr的核酸的细胞穿透复合物，其中所述化合物在递送到所述细胞中之后降解，从而将编码tcr的核酸转染到个体的细胞中。
[1437]
p实施例119.一种将编码嵌合抗原受体(car)的核酸转染到个体的细胞中的方法，所述方法包含向个体投与包含结合到化合物的编码car的核酸的细胞穿透复合物，其中所述化合物在递送到所述细胞中之后降解，从而将编码car的核酸转染到个体的细胞中。
[1438]
p实施例120.根据权利要求p实施例115、118或119中任一项所述的方法，其中所述化合物为阳离子两性聚合物化合物。
[1439]
p实施例121.根据p实施例115、118或119中任一项所述的方法，其中所述化合物为根据89
‑
114实施例中任一项所述的化合物。
[1440]
p实施例122.根据p实施例115或118
‑
121中任一项所述的方法，其中所述核酸为mrna。
[1441]
p实施例123.根据p实施例115或118
‑
121中任一项所述的方法，其中所述核酸为dna。
[1442]
p实施例124.根据p实施例119
‑
123中任一项所述的方法，其中所述car为抗cd19car。
[1443]
p实施例125.根据p实施例115或118
‑
124中任一项所述的方法，其中所述核酸进一步编码效应增强蛋白质。
[1444]
p实施例126.根据p实施例115或118
‑
125中任一项所述的方法，其中所述核酸为多种核酸。
[1445]
p实施例127.根据p实施例115或118
‑
124中任一项所述的方法，其中所述细胞为骨髓细胞或淋巴细胞。
[1446]
p实施例128.根据p实施例115
‑
127中任一项所述的方法，其中所述细胞为t细胞、b细胞或自然杀手细胞。
[1447]
p实施例129.根据p实施例115
‑
127中任一项所述的方法，其中所述细胞为巨噬细胞、嗜酸性粒细胞或嗜中性粒细胞。
[1448]
p实施例130.根据p实施例115
‑
128中任一项所述的方法，其中所述投与为静脉内、皮下或瘤内投与。