一种海参甾醇硫酸酯在抗动脉粥样硬化制品中的应用的制作方法

技术领域：

本发明涉及食品营养技术领域，尤其涉及一种海参甾醇硫酸酯在抗动脉粥样硬化制品中的应用。

背景技术：
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动脉粥样硬化是一种大动脉疾病，特征在于大动脉中脂质和纤维元素的积累，随着人民生活水平的提高，心脑血管疾病的发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势。流行病学研究揭示了动脉粥样硬化被认为是一种多因素疾病。海参作为我国传统的药食两用的海珍品，已被证实有多种营养功效。海参甾醇硫酸酯是海参中存在的天然固醇类物质。海参甾醇硫酸酯和植物甾醇均与胆固醇的结构相似，但它们的功能却完全不同。高胆固醇水平是众所周知的心血管疾病的危险因素，但是植物甾醇能作为一种功效成分达到降胆固醇水平、抗动脉粥样硬化的目的。而目前对于海参甾醇硫酸酯对动脉粥样硬化类心血管疾病的改善作用尚无报道。

技术实现要素：
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本发明要解决的技术问题是海参中存在的天然固醇类物质海参甾醇硫酸酯是否能够改善动脉粥样硬化类心血管疾病。

为解决上述问题，本发明提供了一种海参甾醇硫酸酯在抗动脉粥样硬化制品中的应用，扩大了海参甾醇硫酸酯的应用范围，也为抗动脉粥样硬化制品提供了新的有效成分。

为达到上述目的，本发明具体由以下技术方案实现：

一种海参甾醇硫酸酯在抗动脉粥样硬化制品中的应用。海参甾醇硫酸酯有更高的抗动脉粥样硬化的活性，可能是因为支链c-3上的硫酸基团及c-17上不同的碳氢侧链所致。

进一步的，所述海参甾醇硫酸酯为从海参中提取的甾醇硫酸酯。

进一步的，所述海参甾醇硫酸酯的制备方法如下：

(1)将海参体壁经真空冷冻干燥粉碎后，磨成粉末(250目)；

(2)取上述粉末，加入一定体积的乙醇，保持料液比为1:10-1:15(m/v)，室温条件下持续搅拌浸提24h，获得浸提液，浸提三次，合并浸提液后经减压浓缩得到海参脂质粗提物；当料液比低于1:10(m/v)，导致提取不完全，海参甾醇硫酸酯并不能完全浸出，高于1:15(m/v)，导致试剂的浪费。

(3)称取200-300目硅胶于110℃活化10-12h后室温冷却；采用干法装柱，用氯仿将硅胶溶解，超声除去气泡后装入柱中，待硅胶完全沉降后用3倍体积的氯仿压柱，使得柱中的硅胶更加紧密，硅胶柱中的气泡被排出，如果硅胶不够紧密或有气泡存在容易导致物质的分离面弯曲，分离度降低甚至多种物质分不开，使得海参甾醇硫酸酯的得率降低。取适量的海参脂质粗提物用适量的氯仿溶解后与硅胶混合均匀，快速的倒进硅胶柱当中，用硅胶柱层析的方法进行纯化。

进一步的，硅胶柱层析的方法步骤如下：用氯仿：甲醇(7～9:1，v/v)的混合液洗3个柱体积，再用氯仿：甲醇(4～5:1，v/v)洗1个柱体积，收集洗脱液，洗脱液逐一经过薄层硅胶板层析(tlc)，展开剂为氯仿：甲醇：水(80:15:1，v/v/v)，并用90％硫酸乙醇显色剂进行显色后确认组分，合并收集的洗脱液，减压浓缩除去有机试剂即为海参甾醇硫酸酯。

进一步的，所述海参为北大西洋瓜参。

一种含有上述海参甾醇硫酸酯的微胶囊，其制备方法包括以下步骤：

(1)微胶囊壁材的制备：称取适量的麦芽糊精和阿拉伯胶，按照固液比(g:g:l)为(0.4～0.8):(0.6～0.8):8的比例分散在水中至完全溶解，室温水化5～10h，得到壁材溶液；固液比低了会导致水分过多，稀溶液中高分子以线团的形式分散，分子之间离得很远无法形成稳定的三维空间结构，使得芯材的包埋率降低，而固液比过高会导致溶液的黏度过大，不易将芯材混匀，难以处理；

(2)微胶囊芯材制备：称取一定量的海参甾醇硫酸酯，按照固液比(g:g)为(0.4～0.8):0.8的比例将其分散于植物油中并充分溶解；比例过高导致海参甾醇硫酸酯无法充分溶解，比例过低导致芯材中海参甾醇硫酸酯的荷载量过低，同时造成植物油的浪费；

(3)混合：在搅拌条件下，将芯材与壁材按照质量比为(5～10):100的比例将制得的芯材逐滴加入到所制得的壁材溶液中，搅拌混合均匀后得到混合溶液；比例过低导致芯材中海参甾醇硫酸酯的荷载量降低，过高导致海参甾醇硫酸酯的包埋率降低；

(4)胶囊化：将制得的混合溶液经过均质和高压微射流处理，形成微乳，将得到的微乳进行喷雾干燥处理，得到一种海参甾醇硫酸酯微胶囊。喷雾干燥法简单操作，综合成本低，包埋量大且生产能力高，工艺简单，适宜连续化、自动化的工业化大生产。

海参甾醇硫酸酯微胶囊制备过程中，海参甾醇硫酸酯的损失率控制在5-10％。

进一步的，所述步骤(2)的植物油为大豆油。

一种上述海参甾醇硫酸酯微胶囊在食品、保健品及药品添加剂中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明从海参中提取制备了海参甾醇硫酸酯，最后证实海参甾醇硫酸酯对动脉粥样硬化的改善作用。

(2)本发明通过动物实验验证了，与植物甾醇相比，海参甾醇硫酸酯能明显的抑制动脉粥样硬化的发展，说明其有效预防、改善或者治疗动脉粥样硬化。

(3)本发明将海参甾醇硫酸酯微胶囊化，提供的海参甾醇硫酸酯微胶囊具有治疗动脉粥样硬化的效果，可以用于制备治疗或者预防动脉粥样硬化类疾病的保健药品以及药物等。

附图说明

图1为海参甾醇硫酸酯的化学结构图。

图2为海参甾醇硫酸酯和植物甾醇对小鼠动脉粥样硬化斑块面积的改善效果图。

图3为海参甾醇硫酸酯和植物甾醇对小鼠血清脂质的影响。

图4为海参甾醇硫酸酯和植物甾醇对小鼠肝脏脂质代谢的影响。

图5为海参甾醇硫酸酯微胶囊对小鼠动脉粥样硬化斑块面积的改善效果图。

图6为海参甾醇硫酸酯微胶囊对小鼠血清脂质的影响。

图7为海参甾醇硫酸酯微胶囊对小鼠肝脏脂质的影响。

具体实施方式：

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：海参甾醇硫酸酯的制备

海参甾醇硫酸酯的结构式见图1，制备过程如下：

(1)北大西洋瓜参的体壁经真空冷冻干燥粉碎后，磨成粉末(250目)；

(2)取海参干粉，加入一定体积的乙醇，保持料液比为1:10(m/v)，室温条件下持续搅拌浸提24h，获得浸提液，浸提三次，合并浸提液后经减压浓缩得到海参脂质粗提物；

(3)称取硅胶200-300目于110℃活化10h后室温冷却；采用干法装柱，用氯仿将硅胶溶解，超声除去气泡后装入柱中，待硅胶完全沉降后用3倍体积的氯仿压柱，使得柱中的硅胶更加紧密；取适量的海参脂质粗提物用适量的氯仿溶解后与硅胶混合均匀，快速的倒进硅胶柱当中，用氯仿：甲醇(7:1，v/v)的混合液洗3个柱体积，再用氯仿：甲醇(4:1，v/v)洗1个柱体积，收集洗脱液，洗脱液逐一经过薄层硅胶板层析(tlc)，展开剂为氯仿：甲醇：水(80:15:1，v/v/v)，并用90％硫酸乙醇显色剂进行显色后确认组分，合并收集的洗脱液，减压浓缩除去有机试剂即为海参甾醇硫酸酯。

实施例2：海参甾醇硫酸酯的制备

(1)将海参体壁经真空冷冻干燥粉碎后，磨成粉末(250目)；

(2)取上述粉末，加入一定体积的乙醇，保持料液比为1:12(m/v)，室温条件下持续搅拌浸提24h，获得浸提液，浸提三次，合并浸提液后经减压浓缩得到海参脂质粗提物；

(3)称取200-300目硅胶于110℃活化12h后室温冷却；采用干法装柱，用氯仿将硅胶溶解，超声除去气泡后装入柱中，待硅胶完全沉降后用3倍体积的氯仿压柱，使得柱中的硅胶更加紧密，硅胶柱中的气泡被排出，取适量的海参脂质粗提物用适量的氯仿溶解后与硅胶混合均匀，快速的倒进硅胶柱当中，用硅胶柱层析的方法进行纯化。

进一步的，硅胶柱层析的方法步骤如下：用氯仿：甲醇(8:1，v/v)的混合液洗3个柱体积，再用氯仿：甲醇(5:1，v/v)洗1个柱体积，收集洗脱液，洗脱液逐一经过薄层硅胶板层析(tlc)，展开剂为氯仿：甲醇：水(80:15:1，v/v/v)，并用90％硫酸乙醇显色剂进行显色后确认组分，合并收集的洗脱液，减压浓缩除去有机试剂即为海参甾醇硫酸酯。

实施例3：海参甾醇硫酸酯的制备

(1)将海参体壁经真空冷冻干燥粉碎后，磨成粉末(250目)；

(2)取上述粉末，加入一定体积的乙醇，保持料液比为1:15(m/v)，室温条件下持续搅拌浸提24h，获得浸提液，浸提三次，合并浸提液后经减压浓缩得到海参脂质粗提物；

(3)称取200-300目硅胶于110℃活化12h后室温冷却；采用干法装柱，用氯仿将硅胶溶解，超声除去气泡后装入柱中，待硅胶完全沉降后用3倍体积的氯仿压柱，使得柱中的硅胶更加紧密，硅胶柱中的气泡被排出，取适量的海参脂质粗提物用适量的氯仿溶解后与硅胶混合均匀，快速的倒进硅胶柱当中，用硅胶柱层析的方法进行纯化。

进一步的，硅胶柱层析的方法步骤如下：用氯仿：甲醇(8:1，v/v)的混合液洗3个柱体积，再用氯仿：甲醇(5:1，v/v)洗1个柱体积，收集洗脱液，洗脱液逐一经过薄层硅胶板层析(tlc)，展开剂为氯仿：甲醇：水(80:15:1，v/v/v)，并用90％硫酸乙醇显色剂进行显色后确认组分，合并收集的洗脱液，减压浓缩除去有机试剂即为海参甾醇硫酸酯。

实施例4：海参甾醇硫酸酯和植物甾醇的抗动脉粥样硬化作用

1.实验材料

植物甾醇购于陕西帕尼尔生物科技有限公司，是为β-谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇的混合物。

apoe-/-小鼠(c57bl/6j小鼠)，雄性，spf级，9-10周龄，体重20-22g，购自南京青紫兰科技有限公司，许可证号：scxk(苏)2010-0006。

2.实验方法

(1)动物喂养

apoe-/-小鼠适应性喂养一周后，按照体重将小鼠分为3组，模型对照组、海参甾醇硫酸酯组、植物甾醇组，每组8只，分别喂食相应的饲料，饲料按照ain-93m动物饲料配方并加以改良，实验组分别添加1％的海参甾醇硫酸酯和植物甾醇。小鼠自由摄食和饮水，在室温23±2℃，12:12h明暗交替，湿度65±15％的条件下进行喂养，每天更换动物饲料以及记录摄食量，每隔一天记录体重，在此条件下连续喂养8周。

(2)动脉粥样硬化斑块面积分析

将小鼠的肝脏剥离，用眼科剪将心脏右心耳剪开使少量的血液流出，然后用10ml注射器吸取生理盐水，冲洗剩余在心脏和主动脉中的血液，生理盐水冲洗3次后改用4％的中性甲醛冲洗，将心脏和主动脉固定，中性甲醛冲洗3次。最后将心脏和整条主动脉剥离，使用眼科剪剪去粘附在主动脉上的脂肪以及结缔组织，将主动脉放入苏丹红染液中，在37℃条件下染色10min，用超纯水冲洗掉管壁上多余的染液，直至主动脉的管壁呈现透明状。最后用眼科剪将整条主动脉纵向剪开，用针灸针将主动脉固定于泡沫板上，观察脂质蓄积情况，并用数码相机采集主动脉图像。

(3)血脂的测定

按照试剂盒说明书对血清的tc、tg和hdl-c进行测定

(4)肝脂的测定

称取0.25g肝脏，加入8ml甲醇，16ml氯仿匀浆，将匀浆液转移至25ml容量瓶中，用氯仿：甲醇(2:1，v/v)定容至25ml，塞紧塞子将匀浆液混匀，用保鲜膜封口。将定容好的容量瓶放在37℃的水浴摇床内放置45min。取出容量瓶，用漏斗将匀浆液过滤至25ml的具塞量筒中。按照氯仿：甲醇：水＝10:5:3的比例加入超纯水，盖紧塞子，混匀后用保鲜膜封口，室温静置过夜。过夜后将溶液的最上层弃掉，保留中层以及下层，将中层和下层倒入旋瓶中进行真空浓缩，干燥后用石油醚定容至25ml，定容后的液体即为肝脏脂质溶液，将其分装，并保存于-20℃冰箱。

取1ml肝脂溶液，用氮气将其吹干后加入50μl的triton-异丙醇溶液，按照试剂盒说明书对肝脏脂质tc、tg进行测定。

(5)real-timepcr检测肝脏组织脂质代谢相关基因表达

称取0.1g肝脏组织，加入1mltrizol在冰浴条件下快速匀浆转移至1.5ml灭酶离心管中，室温静置5min后加入0.2ml氯仿，充分混匀后静置10min。在4℃、12000r/min的条件下离心15min，取500μl上清液转移至新的1.5ml灭酶离心管中，加入500μl的异丙醇后充分混匀。静置10min后4℃、12000r/min离心15min，弃去上层液体，保留底部沉淀。加入75％冰乙醇溶液缓慢吹打，之后于4℃、10000r/min离心15min，弃去上层清液，加入适量的depc水溶解沉淀，即为肝脏rna样品。利用琼脂糖凝胶电泳检测所提rna是否降解，并用nanodrop2000读取a260/280比值测定rna浓度。

稀释肝脏样品rna至适宜浓度,取2μgrna加入随机引物2μl,并加入depc水补足至12.5μl。70℃金属浴5min之后冰浴冷却，加入5μl5×buffer，1.25μldntp，0.625μlrnaseinhibitor，1μlm-mlv逆转录酶和4.625μldepc水后放入pcr仪中，于30℃、10min；37℃、60min；90℃、5min和4℃条件下反转得到25ulcdna。

将cdna稀释到合适的浓度，按照faststartuniveralsybrgreenmaster(rox)说明书的要求加入2.5μl样品cdna、0.75μl上游引物、0.75μl下游引物、12.5μlsybr和8.5μldepc水，形成25μl的反应体系，反应条件为：95℃预变性10min，然后持续95℃变性10s，60℃低温退火20s，72℃延伸30s为一个循环周期，运行45个循环。pcr扩增反应完成以后，分析溶解曲线，确定产物的单一性。目的基因表达量测定时以18smrna表达量作为内参。所使用引物序列均经过blast验证，并由上海生工生物工程有限公司合成，所用到的引物序列如下:

18s(forward,5’-gtaacccgttgaaccccatt-3’；reverse,5’-ccatccaatcggtagtagcg-3’)；nr1h3，(forward,5'-ccttcagaacccacagagatcc-3'；reverse,5'-acgctgcatagctcgttcc-3')；abca1(forward,5’-tagcagcaccgtgtcttgtc-3’；reverse,5’-tacggcagcacataggtcag-3’)；abcg8(forward,5’-gacatctggcacccctatctac-3’；reverse,5’-gttcctttgcctcagctttc-3’)；abcg5(forward,5’-tctccgcgtccagaacaac-3’；reverse,5’-cattgagcatgccggtgtat-3’)；srebf2，(forward,5′-gcagtggtggtagtggtagca-3′；reverse,5′-gtgggaactgaggtgggagaaa-3′)；hmgcr(forward,5’-ggctggtgagttgtccttgat-3’；reverse,5’-tctaaagagccagaaaccaagc-3’)；

acat2，ldlr(forward,5’-gaggaactggcggctgaa-3’；reverse,5’-gtgctggatggggaggtct-3’)；vldlr(forward,5′-ctgcagggactggagtgatgag-3′,reverse5′-gcagattcctggattttggca-3’)

(6)统计学处理

实验数据以x±sem表示，用spss18.0软件进行tukey’stest分析，以p<0.05为有显著差异。

3结果分析：

海参甾醇硫酸酯对于降低小鼠动脉粥样硬化斑块面积的影响如图2所示，结果显示，与模型组相比，海参甾醇硫酸酯能够显著降低小鼠动脉粥样硬化的斑块面积，且与植物甾醇相比，效果更佳。图3血清脂质结果表明，与植物甾醇相比，海参甾醇硫酸酯可以显著降低血清胆固醇含量。同时，植物甾醇与海参甾醇硫酸酯均可以降低血清甘油三酯的含量，但无显著性变化，血清高密度脂蛋白也无显著性变化。肝脏脂质结果表明，与模型组相比，海参甾醇硫酸酯和植物甾醇均可降低肝脏胆固醇和甘油三酯水平，并且海参甾醇硫酸酯的效果更加显著。图4的结果发现，海参甾醇硫酸酯可以显著上调abcg8来促进胆固醇的外排，使得肝脏内的胆固醇含量降低，同时显著上调nr1h3使得胆固醇水平保持稳定。海参甾醇和植物甾醇硫酸酯均可显著上调ldlr的水平，进而减少了胆固醇的内源性合成，同时vldlr的水平显著升高，增加了肝脏以及外周组织对胆固醇的吸收利用，使得血脂水平降低，而且海参甾醇硫酸酯的效果要优于植物甾醇。以上结果提示海参甾醇硫酸酯能够预防、治疗或改善动脉粥样硬化。海参甾醇硫酸酯与植物甾醇结构相似，不同的是植物甾醇的c-3上为羟基，而海参甾醇硫酸酯c-3上为硫酸基团。此外，海参甾醇硫酸酯与植物甾醇在c-17上连接的碳氢侧链也不同。因此，海参甾醇硫酸酯抗动脉粥样硬化的效果优于植物甾醇可能是由于c-3硫酸基团及c-17上不同的碳氢侧链所致。植物甾醇能够降低胆固醇含量是因为其具有与胆固醇类似的结构，能够与胆固醇竞争结合载体，从而降低血液中总胆固醇和甘油三酯含量，具有抗动脉粥样硬化的作用；而海参甾醇硫酸酯一方面因为其c-3硫酸基团及c-17上不同的碳氢侧链使得其更易与载体结合从而降低胆固醇的含量，另一方面海参甾醇硫酸酯由于结构的特殊性可以显著上调abcg8来促进胆固醇的外排，并且能够显著上调vldlr来增加肝脏及外周组织对胆固醇的吸收利用，进一步的降低胆固醇，从而实现抗动脉粥样硬化的作用。

实施例5：海参甾醇硫酸酯微胶囊的制备

一种海参甾醇硫酸酯微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

(1)海参甾醇硫酸酯的制备与实施例1相同；

(2)微胶囊壁材的制备：称取适量的麦芽糊精和阿拉伯胶，按照固液比0.4:0.6:8的比例分散在水中至完全溶解，室温水化5h，得到壁材溶液；

(3)微胶囊芯材制备：称取一定量的海参甾醇硫酸酯，按照固液比(g:g)为0.4:0.8的比例将其分散于植物油中并充分溶解；

(4)混合：在搅拌条件下，将芯材与壁材按照质量比为5:100的比例将制得的芯材逐滴加入到所制得的壁材溶液中，搅拌混合均匀后得到混合溶液；

(5)胶囊化：将制得的混合溶液经过均质和高压微射流处理，形成微乳，将得到的微乳进行喷雾干燥处理，得到一种海参甾醇硫酸酯微胶囊。

实施例6：海参甾醇硫酸酯微胶囊的制备

(1)海参甾醇硫酸酯的制备与实施例1相同；

(2)微胶囊壁材的制备：称取适量的麦芽糊精和阿拉伯胶，按照固液比0.6:0.8:8的比例分散在水中至完全溶解，室温水化8h，得到壁材溶液；

(3)微胶囊芯材制备：称取一定量的海参甾醇硫酸酯，按照固液比(g:g)为0.6:0.8的比例将其分散于植物油中并充分溶解；

(4)混合：在搅拌条件下，将芯材与壁材按照质量比为8:100的比例将制得的芯材逐滴加入到所制得的壁材溶液中，搅拌混合均匀后得到混合溶液；

(5)胶囊化：将制得的混合溶液经过均质和高压微射流处理，形成微乳，将得到的微乳进行喷雾干燥处理，得到一种海参甾醇硫酸酯微胶囊。

实施例7：海参甾醇硫酸酯微胶囊的制备

(1)海参甾醇硫酸酯的制备与实施例1相同；

(2)微胶囊壁材的制备：称取适量的麦芽糊精和阿拉伯胶，按照固液比0.8:0.7:8的比例分散在水中至完全溶解，室温水化10h，得到壁材溶液；

(3)微胶囊芯材制备：称取一定量的海参甾醇硫酸酯，按照固液比(g:g)为0.8:0.8的比例将其分散于植物油中并充分溶解；

(4)混合：在搅拌条件下，将芯材与壁材按照质量比为10:100的比例将制得的芯材逐滴加入到所制得的壁材溶液中，搅拌混合均匀后得到混合溶液；

(5)胶囊化：将制得的混合溶液经过均质和高压微射流处理，形成微乳，将得到的微乳进行喷雾干燥处理，得到一种海参甾醇硫酸酯微胶囊。

实施例8：海参甾醇硫酸酯微胶囊的抗动脉粥样硬化作用

1.实验材料

apoe-/-小鼠(c57bl/6j小鼠)，雄性，spf级，9-10周龄，体重20-22g，购自南京青紫兰科技有限公司，许可证号：scxk(苏)2010-0006。

2.实验方法

(1)动物分组和饲养

apoe-/-小鼠适应性喂养一周后，按照体重将小鼠分为2组，模型对照组和海参甾醇硫酸酯微胶囊组，每组8只。两组分别喂食4个周高脂饲料，诱导其小鼠形成肥胖模型。饲料按照ain-93m配方进行配制。之后对小鼠进行受试物干预，模型对照组在喂食高脂饲料的基础上每天灌胃生理盐水，海参甾醇硫酸酯微胶囊组在喂食高脂饲料的基础上每天灌胃海参甾醇硫酸酯微胶囊2粒。海参甾醇硫酸酯微胶囊用蒸馏水溶解后经口灌胃，连续灌胃4个周。小鼠自由摄食和饮水，在室温23±2℃，12:12h明暗交替，湿度65±15％的条件下进行喂养，每天更换动物饲料以及记录摄食量，每隔一天记录体重。

(2)动脉粥样硬化斑块面积分析

将小鼠肝脏摘取之后，用眼科剪将右心耳剪开至少量血液流出，注射器由左心室插入，用pbs冲洗滞留在心脏和主动脉中的血液，待血液冲洗完全之后，改用4％的中性甲醛冲洗，固定心脏和主动脉。最后剥离整条主动脉和心脏，使用眼科剪去除黏附在动脉周围的脂肪和结缔组织，于油红o染液中染色10min，用60％异丙醇溶液洗去血管壁上的多余染液，至动脉壁呈透明状为止。最后用眼科剪将整条主动脉纵向剖开，用针灸针固定在泡沫板上，观察脂质堆积情况，用数码相机采集图像。

(3)血脂的测定

按照试剂盒说明书对血清的tc、tg和hdl-c进行测定

(4)肝脂的测定

称取0.25g肝脏，加入8ml甲醇，16ml氯仿匀浆，将匀浆液转移至25ml容量瓶中，用氯仿：甲醇(2:1，v/v)定容至25ml，塞紧塞子将匀浆液混匀，用保鲜膜封口。将定容好的容量瓶放在37℃的水浴摇床内放置45min。取出容量瓶，用漏斗将匀浆液过滤至25ml的具塞量筒中。按照氯仿：甲醇：水＝10:5:3的比例加入超纯水，盖紧塞子，混匀后用保鲜膜封口，室温静置过夜。过夜后将溶液的最上层弃掉，保留中层以及下层，将中层和下层倒入旋瓶中进行真空浓缩，干燥后用石油醚定容至25ml，定容后的液体即为肝脏脂质溶液，将其分装，并保存于-20℃冰箱。

取1ml肝脂溶液，用氮气将其吹干后加入50μl的triton-异丙醇溶液，按照试剂盒说明书对肝脏脂质tc、tg进行测定。

(5)统计学处理

实验数据以x±sem表示，采用spss18.0软件进行tukey’stest分析，以p<0.05为有显著差异。

3.实验结果

海参甾醇硫酸酯微胶囊对于降低小鼠动脉粥样硬化斑块面积的影响如图5所示，结果显示，与模型组相比，海参甾醇硫酸酯微胶囊能够显著降低小鼠动脉粥样硬化的斑块面积，图6血清脂质结果表明，海参甾醇硫酸酯微胶囊可以显著降低血清胆固醇和甘油三酯含量，图7的肝脏脂质结果表明，与模型组相比，海参甾醇硫酸酯微胶囊可显著降低肝脏胆固醇和甘油三酯水平。以上结果提示海参甾醇硫酸酯微胶囊能够预防、治疗或改善动脉粥样硬化。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但是实施方式并不受上述实施例限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、替代、修饰、简化、组合，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。