依诺沙星在预防和/或治疗黄病毒感染中的应用的制作方法

本发明涉及病毒感染治疗领域，具体涉及依诺沙星在预防和/或治疗黄病毒感染中的应用。
背景技术：
：黄病毒属(flavivirus)是一大群具有包膜的单正链rna病毒。该类病毒通过吸血的节肢动物(蚊、蜱、白蛉等)传播而引起感染。过去曾归类为虫媒病毒。在我国主要流行的黄病毒有乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒和登革病毒。寨卡病毒(zikavirus，zikv)属于黄病毒科黄病毒属，主要包括非洲株和亚洲株两种类型，寨卡病毒亚洲毒株最近被证实与胎儿小头症有关。主要原因是该毒株可以感染未发育成熟的中枢神经系统，并且主要感染其中的神经前体细胞(neuralprecursorcells，npcs)，并最终导致此类细胞停止分化或死亡。依诺沙星(enoxacin)是第三代的氟喹诺酮类抗生素，具有广谱、强效杀菌作用，体外抗菌谱和抗菌活性与氟哌酸相似。临床主要用于对其敏感的革兰阴性菌和阳性菌引起的感染，如泌尿、肠道、呼吸道、外科、眼科、妇产科、皮肤科及五官科等感染性疾病。目前没有报道说明依诺沙星具有抗病毒作用。技术实现要素：本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种依诺沙星在预防和/或治疗黄病毒感染中的应用。为了实现上述目的，本发明第一方面提供了依诺沙星在制备用于预防和/或治疗黄病毒(特别是寨卡病毒)感染的药物中的应用，特别是在制备用于预防和/或治疗寨卡病毒感染引起的小头症的药物中的应用。本发明第二方面提供了一种用于预防和/或治疗黄病毒(特别是寨卡病毒)感染的药物组合物，该药物组合物含有依诺沙星和药学上可接受的辅料。本发明第三方面提供了用于预防和/或治疗黄病毒(特别是寨卡病毒)感染的依诺沙星。本发明第四方面提供了一种预防和/或治疗黄病毒(特别是寨卡病毒)感染的方法，该方法包括：将有效量的依诺沙星或有效量的上述药物组合物给药至患有寨卡病毒感染的受试者。通过使用依诺沙星，本发明能够有效预防和/或治疗黄病毒(特别是寨卡病毒)感染，抑制病毒基因组的复制，具有明确的抗病毒作用。特别地，依诺沙星能够有效阻断寨卡病毒引发的小头症病症的产生。附图说明图1为实施例1中依诺沙星抑制寨卡病毒在神经前体细胞上的感染的结果；图2为实施例2中依诺沙星抑制不同黄病毒在神经前体细胞上的复制的结果；图3为实施例3中依诺沙星抗寨卡病毒感染的ic50测试结果；图4为实施例4中依诺沙星在人脑类器官模型上阻断小头症产生的结果。具体实施方式在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。一方面，本发明提供了依诺沙星在制备用于预防和/或治疗黄病毒感染的药物中的应用。本发明中，依诺沙星也即1-乙基-6-氟-1,4-二氢-4-氧代-7-(-哌嗪基)-1,8-萘啶-3-羧酸，结构如下所示：上述依诺沙星能够有效(在体外)抑制黄病毒的复制，因此，换个角度而言，本发明还涉及依诺沙星在(在体外)抑制黄病毒复制中的应用，特别是依诺沙星于体外在人神经前体细胞上抑制黄病毒(特别是寨卡病毒)复制中的应用。于体外在人神经前体细胞上抑制黄病毒时，相对于每105个细胞，依诺沙星的用量可以为1.5-100nmol。此外，进一步的实验证明，依诺沙星能够阻断寨卡病毒引发的小头症病症的产生，因此，本发明提供了依诺沙星在制备用于预防和/或治疗寨卡病毒感染引起的小头症的药物中的应用。另一方面，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗黄病毒感染的药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有依诺沙星和药学上可接受的辅料。所述药物组合物中依诺沙星的含量可以为常规的选择，例如，可以为5-60重量％。术语“药学上可接受的”指的是并非为生物学上或并非其他方面不适宜的。术语“辅料”指的是存在于药物制剂中的并非活性成分的任何物质，包括稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、乳化剂、ph缓冲剂和防腐剂等。本发明中使用的辅料可以为各种常规用于制药的辅料。根据本发明的优选实施方式，所述药物组合物进一步含有有利于预防和/或治疗所述黄病毒感染的辅助药剂。所述辅助药剂可以为化药，如乙酰氨基酚等，也可以为其他具有上述疗效的药剂。再一方面，本发明提供了用于预防和/或治疗黄病毒感染的依诺沙星。此外，本发明提供了一种预防和/或治疗黄病毒感染的方法，特别是预防和/或治疗寨卡病毒感染引起的小头症的方法，其特征在于，该方法包括：将有效量的依诺沙星或有效量的如前所述的药物组合物给药至患有黄病毒(特别是寨卡病毒)感染的受试者。其中，“有效量”是指药物能够发挥作用的有效剂量。上述受试者可以为常见的受所述黄病毒感染的哺乳动物，特别是灵长类动物(如人或猴)或啮齿类动物(如鼠)，尤其是处于孕期的上述受试者。本发明中，依诺沙星或药物组合物可以以任意常规的方式进行给药，如局部给药。本领域技术人员可以根据给药的具体方式将依诺沙星或含有依诺沙星的药物组合物制备成不同的剂型。给药的剂量可以为本领域常规的剂量(有效量)，可以根据各种参数、尤其根据受试者的年龄、体重、性别和健康状况来确定。例如，对于成人，依诺沙星的口服用量可以为200-400mg/次。本发明中，上述黄病毒可以为常见的黄病毒属病毒，如乙型脑炎病毒(乙脑病毒)、森林脑炎病毒、登革病毒、西尼罗病毒、黄热病病毒或寨卡病毒。本发明的发明人发现，依诺沙星尤其适合于预防和/或治疗寨卡病毒感染，因此，所述黄病毒优选为寨卡病毒。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径得到。实施例1本实施例用来说明本发明使用的依诺沙星对寨卡病毒在神经前体细胞上的感染具有抑制作用。用依诺沙星(溶于二甲基亚砜(dmso)，购自北京伊诺凯科技有限公司，编号为d3855)处理人神经前体细胞(分化自人胚胎干细胞，购自美国wicll，编号为h9，下同)，处理体系中依诺沙星的浓度为100μm，细胞浓度为2×105个/ml，24小时后感染寨卡病毒(gz01株，genbank登录号为ku820898)，感染复数(moi)＝2。病毒孵育1小时后，换上新的含100μm的依诺沙星的培养液1ml(购自stemcell公司，包含neurocult-xfproliferationmediukit，货号05761；20ng/mlegf,货号78006；10ng/mlbfgf，货号78003；2μg/mlheparin，货号07980，下同)。48小时后，固定细胞，先孵育寨卡病毒包膜蛋白与细胞标记物的一抗：zikve蛋白(购自biofront,bf-1176-66-1mg,小鼠,1:1000)；sox2蛋白(购自r&d,af2018,山羊,1:1000)；tuj1蛋白(购自sigma,t2200,兔,1:1000)，再孵育对应一抗的荧光标记二抗(购自thermofisher)，通过间接免疫荧光的方法在显微镜下观察、统计病毒感染率，以dmso(未使用依诺沙星)处理的人神经前体细胞作为空白对照，结果见图1。从图1可以看出，加药组中寨卡病毒的感染得到有效抑制。实施例2本实施例用来说明依诺沙星对不同株黄病毒在神经前体细胞上的复制具有抑制作用。用依诺沙星(溶于dmso)处理人神经前体细胞，处理体系中依诺沙星的浓度为100μm，细胞浓度为105个/ml，24小时后感染寨卡病毒(sz01，fss13025，mr766株，genbank登录号分别为ku866423，ku955593和ay632535)，moi＝2。病毒孵育1小时后，换上新的含100μm的依诺沙星的培养液1ml。48小时后，取病毒上清，提取rna(使用的试剂盒购自美国赛默飞世尔科技，编号为12183018a，下同)，实时荧光定量pcr(引物参见表1，下同)检测病毒rna拷贝数，以dmso(未使用依诺沙星)处理的人神经前体细胞作为空白对照。按照如上相同的方法测试依诺沙星对乙脑病毒(genbank登录号为mh258848)和西尼罗病毒(genbank登录号为kc407666)在神经前体细胞上的复制的影响。结果见图2。从图2a可以看出，加药组寨卡病毒的复制得到有效抑制；从图2b可以看出，加药组乙脑病毒和西尼罗病毒的复制得到有效抑制。表1寨卡-fggtcagcgtcctctctaataaacgseqidno：1寨卡-rgcaccctagtgtccactttttccseqidno：2寨卡-探针fam-agccatgaccgacaccacaccgt-bq1seqidno：3乙脑-fgtttatctgtgtgaacttcttggcseqidno：4乙脑-rtttagtcatggttatcttccgttcseqidno：5乙脑-探针fam-agtatcgttgagaagaatcgagagattagtgc-bq1seqidno：6西尼罗-ftgagtagacggtgctgcctgcgseqidno：7西尼罗-rgtctcctctaacctctagtccseqidno：8西尼罗-探针fam-tctgcggagagtgcagtctgcgat-bq1seqidno：9实施例3本实施例用来说明依诺沙星抗寨卡病毒感染的ic50测试结果。2倍梯度稀释依诺沙星，使最终使用浓度从200μm到3.125μm。处理人神经前体细胞，处理体系中细胞浓度为2×105个/ml，24小时后感染寨卡病毒(gz01株)，moi＝2。病毒孵育1小时后，分别换上新的含梯度浓度依诺沙星的培养液1ml。48小时后，取病毒上清提取rna，实时荧光定量pcr检测病毒rna拷贝数，使用graphpad7.0软件处理统计得到ic50＝51.99，结果见图3。实施例4本实施例用来说明依诺沙星在人脑类器官模型上阻断小头症产生的效果。在人脑类器官模型(xuyuqian等，brain-region-specificorganoidsusingmini-bioreactorsformodelingzikvexposure，doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.04.032)培养的19、21、23天时加入依诺沙星使其在培养体系中的浓度为100μm(加药组)，以未使用依诺沙星处理的人脑类器官模型作为对照(未加药组)，在培养的20天感染5×105pfu的寨卡病毒(gz01株)，同时设置不使用寨卡病毒进行感染的未感染组，培养的25天对不同组类器官模型固定、切片、染色、观察，通过统计脑腔室皮层的厚度变化与人脑类器官模型球体的表面积大小变化，来观察是否产生小头症，结果见图4。从图4可以看出，加药组中寨卡包膜蛋白的阳性细胞比例显著低于未加药组；加药组的脑腔室皮层的厚度(图4a)与人脑类器官模型球体的表面积大小(图4b)与未感染组相近，说明依诺沙星能够有效阻断寨卡病毒引发的小头症。通过上述结果可以看出，本发明通过采用依诺沙星能够有效预防和/或治疗寨卡病毒感染，阻断寨卡病毒引发的小头症病症的产生。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。序列表<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院中国科学院武汉病毒研究所<120>依诺沙星在预防和/或治疗黄病毒感染中的应用<130>i53802jsy<141>2018-11-26<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>1ggtcagcgtcctctctaataaacg24<210>2<211>23<212>dna<213>artificialsequence<400>2gcaccctagtgtccactttttcc23<210>3<211>23<212>dna<213>artificialsequence<400>3agccatgaccgacaccacaccgt23<210>4<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>4gtttatctgtgtgaacttcttggc24<210>5<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>5tttagtcatggttatcttccgttc24<210>6<211>32<212>dna<213>artificialsequence<400>6agtatcgttgagaagaatcgagagattagtgc32<210>7<211>22<212>dna<213>artificialsequence<400>7tgagtagacggtgctgcctgcg22<210>8<211>21<212>dna<213>artificialsequence<400>8gtctcctctaacctctagtcc21<210>9<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>9tctgcggagagtgcagtctgcgat24当前第1页12