卡泊芬净在制备抑制冠状病毒的产品中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及卡泊芬净在制备抑制冠状病毒的产品中的应用。

背景技术：

冠状病毒是一类带有囊膜的不分节段的正义rna病毒，能够感染多种哺乳动物和鸟类等宿主，其中包括sars-cov和mers-cov都被报道以蝙蝠作为其天然宿主。此前已知6种冠状病毒可以感染人，包括hcov-229e、hcov-nl63、hcov-oc43、hcov-hku1、sars-cov和mers-cov。

2020年2月11日，世界卫生组织正式命名此次疾病为“coronavirusdisease2019”，缩写为“covid-19”，即“2019冠状病毒疾病”。人感染2019新型冠状病毒后，可出现发热、咳嗽、气促和呼吸困难等，严重时可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前尚且没有针对新型冠状病毒有效的疫苗和特异性的药物，因此迫切需要研发抗冠状病毒药物。

醋酸卡泊芬净(cancidas)，fda已批准药物。卡泊芬净的结构式如式ⅰ所示(分子式为c52h88n10o15，分子量为1093.31，cas号为162808-62-0)，目前适用于成人患者和儿童患者(三个月及三个月以上)：经验性治疗中性粒细胞减少、伴发热病人的可疑真菌感染治疗对其它治疗无效或不能耐受的侵袭性曲霉菌病。

技术实现要素：

本发明的目的是提供卡泊芬净在制备抑制冠状病毒的产品中的应用。

第一方面，本发明要求保护(a)卡泊芬净或(b)其药学上可接受的盐或(c)以卡泊芬净或其药学上可接受的盐为主要成分的物质在如下任一中的应用：

(a1)制备抑制冠状病毒的产品，或抑制冠状病毒；

(a2)制备能够治疗或预防由于冠状病毒感染所致疾病的产品，或治疗或预防由于冠状病毒感染所致疾病；

(a3)制备能够改善由于冠状病毒感染所致症状的产品，或改善由于冠状病毒感染所致症状。

第二方面，本发明要求保护(a)卡泊芬净或(b)其药学上可接受的盐或(c)以卡泊芬净或其药学上可接受的盐为主要成分的物质在如下任一中的应用：

(b1)制备能够与冠状病毒nsp12蛋白结合的产品，或与冠状病毒nsp12蛋白结合；

(b2)制备能够抑制冠状病毒的rna聚合酶活性的产品，或抑制冠状病毒的rna聚合酶活性；

(b3)制备能够在细胞水平抑制冠状病毒的产品，或在细胞水平抑制冠状病毒。

在前文两方面中，所述冠状病毒可为能够感染人的冠状病毒。

进一步地，所述冠状病毒可为2019新型冠状病毒(即引起covid-19的冠状病毒)。

在本发明的具体实施方式中，所述冠状病毒具体为2019新型冠状病毒毒株betacov/wuhan/wh01/2019|epi_isl_406798。

在前文第一方面中，由于所述冠状病毒感染所致疾病为covid-19。

在前文第一方面中，所述由于冠状病毒感染所致症状为发热、咳嗽、气促和/或呼吸困难。

对于covid-19而言，有部分核酸检测阳性患者无明显不适的无症状感染者。

在本发明的具体实施方式中，前文两方面中所述卡泊芬净的药学上可接受的盐具体为醋酸卡泊芬净。当然也可以为醋酸卡泊芬净外卡泊芬净的药学上可接受的其他盐。

在本发明的具体实施方式中，前文第二方面中所述冠状病毒nsp12蛋白的氨基酸序列如seqidno.1或seqidno.1的第2-926位所示，或者与seqidno.1或seqidno.1的第2-926位具有95％以上同一性的序列。

在本发明的具体实施方式中，所述冠状病毒的rna聚合酶活性具体体现为所述冠状病毒的rna聚合酶的引物延伸活性。

在前文两方面中，所述产品具体可为药品。

第三方面，本发明要求保护一种产品。

本发明所要求保护的产品，其主要成分为卡泊芬净或其药学上可接受的盐；所述产品具有如下任一用途：

(a1)抑制冠状病毒；

(a2)治疗或预防由于冠状病毒感染所致疾病；

(a3)改善由于冠状病毒感染所致症状；

(b1)与冠状病毒nsp12蛋白结合；

(b2)抑制冠状病毒的rna聚合酶活性；

(b3)在细胞水平抑制冠状病毒。

其中，所述冠状病毒可为能够感染人的冠状病毒。

进一步地，所述冠状病毒可为2019新型冠状病毒(即引起covid-19的冠状病毒)。

在本发明的具体实施方式中，所述冠状病毒具体为2019新型冠状病毒毒株betacov/wuhan/wh01/2019|epi_isl_406798。

相应的，由于所述冠状病毒感染所致疾病为covid-19。

其中，所述由于冠状病毒感染所致症状为发热、咳嗽、气促和/或呼吸困难。

对于covid-19而言，有部分核酸检测阳性患者无明显不适的无症状感染者。

在本发明的具体实施方式中，所述卡泊芬净的药学上可接受的盐具体为醋酸卡泊芬净。当然也可以为醋酸卡泊芬净外卡泊芬净的药学上可接受的其他盐。

在本发明的具体实施方式中，所述冠状病毒nsp12蛋白的氨基酸序列如seqidno.1或seqidno.1的第2-926位所示，或者与seqidno.1或seqidno.1的第2-926位具有95％以上同一性的序列。

在本发明的具体实施方式中，所述冠状病毒的rna聚合酶活性具体体现为所述冠状病毒的rna聚合酶的引物延伸活性。

其中，所述产品具体可为药品。

卡泊芬净的结构式如式i所示。

实验证明，醋酸卡泊芬净能够与2019新型冠状病毒的nsp12蛋白结合、对2019新型冠状病毒的rna聚合酶活性具有抑制作用，细胞实验显示出对2019新型冠状病毒的抑制作用。本发明对于covid-19的防治具有重要意义。

附图说明

图1为纯化后的2019新型冠状病毒的nsp12蛋白。

图2为醋酸卡泊芬净与2019新型冠状病毒nsp12蛋白的结合情况。

图3为纯化后的nsp7l8蛋白。

图4为醋酸卡泊芬净对2019新型冠状病毒rna聚合酶引物延伸活性的抑制作用。

图5为细胞水平评价醋酸卡泊芬净对2019新型冠状病毒的抑制作用。

图6为醋酸卡泊芬净对vero细胞的毒性作用

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

醋酸卡泊芬净：上海陶素生化科技有限公司产品，编号为t1799。

实施例1、醋酸卡泊芬净与2019新型冠状病毒nsp12蛋白的结合

1、将2019新型冠状病毒的nsp12(nsp12氨基酸序列来自于gisaid:epi_isl_406798)，n端添加起始密码子，c端添加凝血酶酶切位点，6×his标签纯化标签序列以及2×strep标签序列(完整蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，第2-926位为nsp12氨基酸序列)，序列经昆虫细胞密码子优化(优化物种：insect)由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成并连接至pfastbac1载体(invitrogen^tm10360014)。优化后的基因序列如seqidno.2所示。蛋白的表达纯化方法参照文献(kirchdoerfer,r.n.,ward,a.b.structureofthesars-covnsp12polymeraseboundtonsp7andnsp8co-factors.natcommun10,2342(2019).https://doi.org/10.1038/s41467-019-10280-3)。纯化后的nsp12蛋白见图1，结果显示，分子量大小与预期相符，纯化后的nsp12蛋白纯度较高。通过10mmph4.0醋酸钠溶液溶解至100μg/ml，使用biacore8k(ge/通用电气)机器通过氨基偶联方法固定于cm5芯片(ge/通用电气，seriesssensorchipcm5)。

2、将醋酸卡泊芬净用去离子水溶解至10mm母液，分装冻存于-20℃。将醋酸卡泊芬净母液用pbst溶液(pbs缓冲液含0.05‰的吐温20，体积百分含量)2倍梯度逐级稀释为不同浓度(25μm、12.5μm、6.25μm、3.125μm、1.56μm、0.78μm)的待测溶液，每个浓度体积为100μl，同时设置0μm醋酸卡泊芬净作为阴性对照组。利用biacore8k(ge/通用电气)采用single-cyclekinetics方法，设置结合60s，解离300s，按照预制程序显示样品位置，将样品加入96孔板，检测不同浓度醋酸卡泊芬净与nsp12蛋白的结合。结果如图2所示，醋酸卡泊芬净能够与nsp12蛋白结合，利用biacore8k(ge/通用电气)内置程序single-cyclekinetics亲和力分析方法算得亲和力为50.7μm。

实施例2、醋酸卡泊芬净对2019新型冠状病毒rna聚合酶的引物延伸活性的抑制作用

1、将2019新型冠状病毒的nsp7和nsp8(nsp7和nsp8氨基酸序列来自于gisaid:epi_isl_406798)，nsp7和nsp8的氨基酸序列通过6×hislinker连接在一起，并且在nsp7氨基酸序列n端添加起始密码子。含有nsp7和nsp8的完整蛋白序列如seqidno.3所示，该蛋白命名为nsp7l8)。序列经密码子优化(优化物种：大肠杆菌)后连接pet21a载体。优化后的nsp7l8蛋白的基因序列如seqidno.4所示。蛋白的表达纯化方法参照文献lorenzosubissi,clarac.posthuma,axellecollet,jessikac.zevenhoven-dobbe,alexandere.gorbalenya,etiennedecroly,ericj.snijder,brunocanard,isabelleimbert,onesevereacuterespiratorysyndromecoronavirusproteincomplexintegratesprocessivernapolymeraseandexonucleaseactivities,proceedingsofthenationalacademyofsciencessep2014,111(37)e3900-e3909；doi:10.1073/pnas.1323705111。纯化后的nsp7l8蛋白见图3，结果显示，分子量大小与预期相符，纯化后的nsp7l8蛋白纯度较高。

2、利用depc水(碧云天，r0022)配制引物延伸活性测定所需反应缓冲液：10mmtris(ph8.0),10mmkcl,2mmmgcl2,1mmdtt。

3、用depc水(碧云天，r0022)分别将模板rna(由上海朗晶生物科技有限公司合成，5’-cuauccccaugugauuuuaauagcuucuuaggagaaugac-3’)与5’带fam标签的引物rna(由上海朗晶生物科技有限公司合成，5’-gucauucuccuaagaagcua-3’)溶解至100μm。

4、取等量的模板rna与5’带fam标签的引物rna于pcr管(axygen，yc-hc01010)中混合。将pcr管置于pcr仪(bio-gener)中70℃反应10min。反应结束后立即将pcr管置于冰上，即为退火的rna。

5、用步骤2中的反应缓冲液分别将醋酸卡泊芬净母液稀释至浓度为1mm，800μm，500μm，250μm，125μm，62.5μm和31.2μm。

6、将浓度为100mm的atp，gtp，ctp与utp(takara，货号分别为4041，4042，4043，4044)按照1:1:1:1混合，获得ntpmix。

7、在1.5mlep管(axygen，mct-150-c)中加入2.2μlnsp12蛋白(浓度为1mg/ml)与1μl药物(步骤5配制)混合，添加步骤2的反应缓冲液补充至总体积为10μl，室温孵育10min。然后添加nsp7l8蛋白(0.64μl，浓度为1mg/ml)，退火的rna(0.4μl，步骤4制备)，ntpmix(0.4μl，步骤6制备)，最后用步骤2的反应缓冲液补充至总体积20μl。其中nsp12蛋白终浓度为1μm，nsp7l8蛋白的终浓度为1μm，退火的rna终浓度为1μm，ntp的终浓度为500μm，药物的终浓度分别为1.56μm，3.12μm，6.25μm，12.5μm，25μm，40μm，50μm。并分别设置不添加药物，不添加药物与nsp12蛋白的两个对照组。

7、将加有反应体系的ep管置于30℃金属浴(miulab)中反应60min。向反应结束后的体系中加入等体积的甲酰胺上样缓冲液(coolaber，sl2224-5ml)。100℃煮样5min后12000rpm离心10min。通过20％丙烯酰胺凝胶电泳和化学发光荧光成像系统(vilerfusion)观察反应结果。

结果如图4所示，醋酸卡泊芬净在浓度为40μm和50μm时，均能够百分之百抑制2019新型冠状病毒聚合酶引物延伸活性，醋酸卡泊芬净在浓度为25μm时，能够部分抑制2019新型冠状病毒聚合酶引物延伸活性。

实施例3、细胞水平评价醋酸卡泊芬净对2019新型冠状病毒的抑制作用

1、使用dmem稀释2019新型冠状病毒(毒株-betacov/wuhan/wh01/2019|epi_isl_406798(参见gisaid数据库)，来自于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所)，使病毒剂量为100tcid50/100μl。

2、用dmem(gibco)培养基中加入2％血清(gibco)和双抗(青霉素和链霉素)配制成维持液。用维持液将醋酸卡泊芬净母液(10mm)5倍梯度稀释为不同浓度(100μm、20μm、4μm、0.8μm、0.16μm)，每个浓度设置4个复孔，每个孔每个浓度体积为200μl。同时设置0μm醋酸卡泊芬净(即200μl维持液)作为阴性对照组。

3、将状态良好的vero细胞(atcc,ccl-81)，0.25％胰蛋白酶消化，dmem(gibco)中加入10％fbs(gibco)配制成培养液，用培养液稀释细胞，制备密度为1×10⁵个/ml的细胞悬液，以每孔100μl均匀接种在96孔板中，37℃，5％co2培养箱环境中孵育过夜。待其长至90％-100％密度时，弃掉培养上清，pbs清洗2遍。

4、将步骤1配制的病毒液加至步骤3的96孔板细胞中，置于37℃，5％co2培养箱孵育2h，吸弃感染液，将步骤2配制的不同浓度梯度的药物加至孔内，置于37℃，5％co2培养箱孵育24h。

5、取步骤4的96孔板，吸取培养上清100μl/孔，至天龙生物科技有限公司的全自动核酸提取仪的配套提取板中，按照试剂盒说明书进行核酸提取。取核酸5μl进行rt-pcr体系配制(takara)以及qrt-pcr实验(靶标为orf1ab，roche480)。

6、用graphpad处理数据，计算出醋酸卡泊芬净对2019新型冠状病毒的ec50(半数效应浓度，即药效实验中能抑制50％病毒最大效应时的受试物浓度)。结果如图5所示，醋酸卡泊芬净对2019新型冠状病毒的ec50＝8.07μm，细胞水平上对2019新型冠状病毒具有抑制作用。

实施例4、醋酸卡泊芬净对vero细胞的毒性作用

1、状态良好的vero细胞(atcc,ccl-81)，0.25％胰蛋白酶消化，dmem(gibco)中加入10％fbs(gibco)配制成培养液，用培养液稀释细胞，制备密度为1×10⁵个/ml的细胞悬液，以每孔100μl均匀接种在96孔板中，37℃，5％co2培养箱环境中孵育过夜。

2、醋酸卡泊芬净母液用含双抗(青霉素和链霉素)的dmem(gibco)培养液10倍梯度稀释为不同终浓度(100μm、10μm、1μm、0.1μm、0.01μm、0.001μm、0.0001μm、0.00001μm)的待测溶液。实验分为空白对照组和各梯度浓度给药组。弃除96孔板中的细胞培养液，以每孔100μl加入待测药物和空白对照dmem培养液，每个浓度设置3个复孔。置于37℃，5％co2培养箱孵育24h。

3、将cck8试剂以每孔10μl加入到待检测细胞培养板中，继续孵育1-4h后，酶标仪以od450读取待测样品的吸光度值，并计算细胞活性。

结果如图6，显示醋酸卡泊芬净溶液在100μm浓度下对vero细胞没有细胞毒性。

<110>中国科学院微生物研究所；中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120>卡泊芬净在制备抑制冠状病毒的产品中的应用

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