一种抗双重打击淋巴瘤的联合用药物组合物及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗双重打击淋巴瘤的联合用药物组合物及其应用。

背景技术：

弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)是最常见的非霍奇金淋巴瘤(nhl)，约占nhl病例的25％。bcl2、bcl6和myc是dlbcl中最常见的突变基因。双重打击淋巴瘤(double-hitlymphomas,dhl)是一组伴有myc和bcl2或bcl6同时发生染色体易位的高级别b细胞淋巴瘤，以bcl2和myc基因易位最常见，占所有dhl的62％左右。2008年世界卫生组织(who)分类将dhl归为形态学、免疫表型等方面特征介于弥漫大b细胞淋巴瘤(blbcl)和伯基特淋巴瘤(bl)之间的不能分类的b细胞淋巴瘤(bclu)。尽管dhl发病率低，仅占b细胞淋巴瘤2％左右，但其临床行为具有高度侵袭性，化疗效果差，因此加强对dhl的认识对淋巴瘤的诊断与治疗起重要作用。dhl对传统化疗不敏感，无论是加强方案或含利妥昔单抗方案，效果均不理想，中位总生存期为0.2-1.5年。发病率低，缺乏国内外大型临床研究，目前尚无标准治疗方案，治疗方案包括chop(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松)、r-chop(利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱、多柔比星、泼尼松)、r-hypercvad(利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱、多柔比星、地塞米松)、高剂量化疗联合造血干细胞移植、姑息治疗等，何种化疗方案更佳，仍有争议。

目前临床的治疗方案对dhl并没有太大的作用。因此，开发出一种能够有效治疗dhl的策略是非常有意义的。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗双重打击淋巴瘤的联合用药物组合物及其应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种抗双重打击淋巴瘤的联合用药物组合物，所述联合用药物组合物包括药物venetoclax和药物chiauranib。

venetoclax(abt-199)是一种高效、有选择性和口服活性的bcl-2抑制剂，可以联合obinutuzumab治疗未经治疗的慢性淋巴细胞白血病(cll)成人患者。chiauranib(cs2164，西奥罗尼)是针对aurorab/vegfr/pdgfr/c-kit/csf1r靶点的高选择性抑制，能同时通过抑制肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞有丝分裂和调节肿瘤微环境三通路，发挥综合抗肿瘤作用，同时具有相对同类机制药物更优异的动物药效活性和良好的安全性，目前属于处于临床i/ii期(卵巢癌)。

本发明创造性地将药物venetoclax和药物chiauranib联合使用作为抗双重打击淋巴瘤的联合用药物组合物，其对多种dhl细胞株(例如tmd8、mca、ly19等)具有显著的杀伤作用，且呈浓度及时间依赖性，体内成瘤实验的研究结果也证明其能抑制dhl细胞在体内的生长，减轻肿瘤负荷和浸润程度，且无明显的毒副作用。

在本发明中，所述联合用药物组合物的剂型包括药剂学上可接受的任意一种剂型。例如片剂、散剂、混悬剂、胶囊剂、注射剂、喷雾剂、溶液剂、灌肠剂、乳剂、膜剂、栓剂、贴剂、滴鼻剂或滴丸剂等。

优选地，所述联合用药物组合物还包括药剂学上可接受药用辅料中的任意一种或至少两种的组合。

本发明所述联合用药物组合物可单独给药也可以与辅料搭配做成适当的剂型进行给药，所述辅料包括稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、ph调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。所述至少两种的组合例如稀释剂和粘合剂的组合、润湿剂和崩解剂的组合、增溶剂和渗透压调节剂的组合等，其他任意的组合方式便不在此一一赘述。

优选地，所述联合用药物组合物为单一的复方制剂。

优选地，所述联合用药物组合物为venetoclax制剂和chiauranib制剂两种单独的制剂的组合。

优选地，所述两种单独的制剂同时施用。

优选地，所述两种单独的制剂依次施用。

所述联合用药物组合物可以为单一的复方制剂形式，也可以为两种单独的制剂的组合；当为两种单独的制剂的组合时，其用药方式可以为同时施用，也可以为依次施用，例如可以先施用venetoclax，间隔一段时间再施用chiauranib，也可以先施用chiauranib，间隔一段时间再施用venetoclax，或者两种交替施用。

在本发明中，所述联合用药物组合物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药或经皮给药等。

优选地，所述联合用药物组合物为负载于药用载体上的联合用药物组合物。

优选地，所述药用载体包括脂质体、胶束、树枝状大分子、微球或微囊。

第二方面，本发明提供一种如上所述的联合用药物组合物在制备抗双重打击淋巴瘤药物中的应用。

第三方面，本发明提供一种如上所述的联合用药物组合物在制备双重打击淋巴瘤细胞增殖抑制剂中的应用。

第四方面，本发明提供一种如上所述的联合用药物组合物在制备双重打击淋巴瘤细胞凋亡诱导剂中的应用。

本发明所涉及的联合用药物组合物通过激活线粒体介导的内在途径诱导细胞凋亡，经联合用药物组合物处理后的线粒体膜电位明显降低，同时还影响bcl-2，bcl-xl，bax，puma和parp的表达水平。

第五方面，本发明提供一种如上所述的联合用药物组合物在制备双重打击淋巴瘤细胞pi3k-akt-mtor信号通路或dna损伤修复通路抑制剂中的应用。

本发明发现所述联合用药物组合物的抗双重打击淋巴瘤可能与抑制pi3k-akt-mtor通路或dna损伤修复通路有关。

第六方面，本发明提供一种新型的抗双重打击淋巴瘤联合疗法，所述联合疗法为venetoclax和chiauranib的联合疗法。此疗法比单一的venetoclax治疗或chiauranib治疗具有更强的抗双重打击淋巴瘤活性，能够更有效地抑制在体肿瘤的生长，为双重打击淋巴瘤的治疗提供了新的策略和思路。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明创造性地将药物venetoclax和药物chiauranib联合使用作为抗双重打击淋巴瘤的联合用药物组合物，其对多种dhl细胞株(例如tmd8、mca、ly19等)具有显著的杀伤作用，且呈浓度及时间依赖性，体内成瘤实验的研究结果也证明其能抑制dhl细胞在体内的生长，减轻肿瘤负荷和浸润程度，且无明显的毒副作用。

附图说明

图1是cck8法检测药物作用24h对mca细胞增殖抑制作用的结果图；

图2是cck8法检测药物作用24h对tmd8细胞增殖抑制作用的结果图；

图3是cck8法检测药物作用48h对mca细胞增殖抑制作用的结果图；

图4是cck8法检测药物作用48h对tmd8细胞增殖抑制作用的结果图；

图5是annexinv/pi试剂盒检测药物作用24h后诱导mca细胞的凋亡结果图；

图6是annexinv/pi试剂盒检测药物作用24h后诱导tmd8细胞的凋亡结果图；

图7是annexinv/pi试剂盒检测药物作用48h后诱导mca细胞的凋亡结果图；

图8是annexinv/pi试剂盒检测药物作用48h后诱导tmd8细胞的凋亡结果图；

图9是实施例3中各组小鼠及其取出的瘤体图；

图10是各组小鼠肿瘤的变化情况图(a为肿瘤体积变化情况图，b为肿瘤重量变化情况图)；

图11是各组小鼠体重的变化情况图；

图12是各组小鼠肿瘤组织的he染色结果图；

图13是各组药物作用于mca细胞24h后对pi3k-akt-mtor信号通路的表达水平影响结果图；

图14是各组药物作用于ly19细胞24h后对pi3k-akt-mtor信号通路的表达水平影响结果图；

图15是各组药物作用于mca细胞24h后线粒体膜电位的统计结果图；

图16是各组药物作用于mca细胞24h后对bcl-2，bcl-xl，bax，puma和parp的表达水平影响结果图；

图17是各组药物作用于ly19细胞24h后对bcl-2，bcl-xl，bax，puma和parp的表达水平影响结果图；

图18是各组药物作用于mca细胞24h后对γh2a.x和rad51蛋白的表达水平影响结果图；

图19是各组药物作用于ly19细胞24h后对γh2a.x和rad51蛋白的表达水平影响结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

联合用药物组合物对dhl细胞株增殖的抑制作用

取2×10⁴对数生长期的dhl细胞株tmd8、mca接种于96孔板，分别设置对照组(dmso)、不同浓度venetoclax组(nm级)、不同浓度的chiauranib组(μm级)、venetoclax联合chiauranib组作用24h和48h后，应用cck8试剂盒检测不同实验组dhl细胞的增殖情况，并利用compusyn软件做出两药联合后的联合指数(ci)，ci小于1表示有协同作用，ci大于1表示有拮抗作用，ci等于1表示有叠加作用，ci值越小表示两药对细胞毒性的协同作用越强。结果如图1(mca24h)、图2(tmd824h)、图3(mca48h)和图4(tmd848h)所示，由图可知：本发明所涉及的联合用药物组合物具有明显抑制dhl细胞增殖的作用，呈时间及浓度依赖性。

本发明所涉及的联合用药物组合物中chiauranib与venetoclax的联合指数值(ci)如表1和表2所示，由表1和表2数据可知：两药联合有一定的协同作用，尤其是药物处理48h后。

表1

表2

实施例2

联合用药物组合物对dhl细胞株的诱导凋亡作用

取2×10⁵对数生长期的dhl细胞株tmd8、mca接种于24孔板，分别设置对照组(dmso)、不同浓度venetoclax组(nm级)、不同浓度的chiauranib组(μm级)、venetoclax联合chiauranib组作用24h和48h后，应用annexinv/pi试剂盒检测dhl细胞的凋亡情况。结果如图5(mca24h)、图6(tmd824h)、图7(mca48h)和图8(tmd848h)所示，图中柱状图由图可知：本发明所涉及的联合用药物组合物具有明显的诱导dhl细胞凋亡的作用，呈时间及浓度依赖性。

实施例3

从动物水平验证联合用药物组合物在体内具有杀伤dhl的作用

1、实验方法

1)采用dhl细胞株构建裸鼠荷瘤模型

spf级裸鼠购自于上海斯莱克，年龄4-6周大小，雌雄各半，对小鼠所有操作均在无菌层流室内进行。将mca细胞悬浮于0.2ml含有0.5％fbs的培养基中(每0.2ml中含有5×10⁶个细胞)，接种于小鼠右前肢皮下，待肿瘤体积长至75-150mm³，可开始体内用药实验。

2)体内实验

分别设置对照组(试剂为生理盐水)、venetoclax组(20μg/g/day)、chiauranib组(40μg/g/day)、venetoclax联合chiauranib组，每天给药，持续两周，每两天监测小鼠的体重及肿瘤的大小。

3)用药结束后将小鼠直接安乐死，取瘤体拍照，如图9所示(由图可知：本发明所涉及的联合用药物组合物可以显著地抑制肿瘤在体内的生长)，并用于计算重量及病理切片。

2、实验结果

1)小鼠肿瘤的变化情况如图10所示(a为肿瘤体积变化情况，b为肿瘤重量变化情况)，由图可知：本发明所涉及的联合用药物组合物可以显著地抑制dhl细胞在体内的生长。

2)小鼠体重的变化情况如图11所示，由图可知：本发明所涉及的联合用药物组合物在体内对小鼠无明显的毒副作用，不改变小鼠的体重。

3)小鼠肿瘤的he染色结果如图12所示(200×)，由图可知：本发明所涉及的联合用药物组合物能减轻肿瘤负荷和浸润程度。

实施例4

运用wb法研究联合用药物组合物杀伤dhl细胞的作用机制

1)取对数生长期的mca和ly19细胞，分别设置对照组(试剂为dmso)，venetoclax组(20μm)，chiauranib组(10μm)，venetoclax(20μm)联合chiauranib(10μm)4组，作用24h后收细胞，然后提取蛋白用于westernblot检测pi3k-akt-mtor信号通路的表达水平。结果如图13(mca)和图14(ly19)所示，由图可知：本发明所涉及的联合用药物组合物作用于ly19细胞和mca细胞24h后抑制pi3k-akt-mtor信号通路实现药物杀伤作用。

2)取对数生长期的mca和ly19细胞，分别设置对照组(试剂为dmso)，venetoclax组(20μm)，chiauranib组(10μm)，venetoclax(20μm)联合chiauranib(10μm)4组，作用24h后收细胞，用jc-1染色后通过流式细胞术测量线粒体膜电位，结果如图15所示，然后提取蛋白用于westernblot检测线粒体介导的内在途径相关蛋白的表达水平。结果如图16(mca)和图17(ly19)所示。由图15-17可知：本发明所涉及的联合用药物组合物处理后线粒体膜电位明显降低，通过激活线粒体介导的内在途径诱导细胞凋亡。

3)取对数生长期的mca和ly19细胞，分别设置对照组(试剂为dmso)，venetoclax组(20μm)，chiauranib组(10μm)，venetoclax(20μm)联合chiauranib(10μm)4组，作用24h后收细胞，然后提取蛋白用于westernblot检测γh2a.x和rad51蛋白的表达水平。结果如图18(mca)和图19(ly19)所示。由图可知：本发明所涉及的联合用药物组合物作用于ly19细胞和mca细胞24h通过诱导dna损伤来诱导细胞凋亡。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种抗双重打击淋巴瘤的联合用药物组合物及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。