咳速停糖浆在治疗冠状病毒感染引发的疾病中的应用的制作方法

本发明涉及一种咳速停糖浆的应用，特别是一种咳速停糖浆在治疗冠状病毒感染引发的疾病中的应用。
背景技术：
：咳速停糖浆是一种中成类的治疗咳嗽的药物，主要的成分有吉祥草、黄精、白伟参、桔梗、虎耳草、琵琶叶、麻黄、桑白皮和罂粟壳，其主要的用途是可以用来补气养阴，治疗平时感冒引起的咳嗽、嗓子疼、声音嘶哑、咽干，或者咳痰以及气喘。在武汉爆发的新型冠状病毒，属于β属的冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径为60-140mm，其基因特征与sarsr-cov和mersr-cov有明显区别。目前研究显示与蝙蝠sars样冠状病毒同源性达85％以上。体外分离培养时，2019-ncov96个小时左右即可在人呼吸道上皮细胞内发现，而在veroe6和huh-7细胞系中分离培养需约6天。其传染源主要是新型冠状病毒感染的患者，传播途径主要依靠呼吸道飞沫和接触传播，临床表现以发热、乏力、干咳为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹泻等症状，重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合症、脓毒性休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等。目前一般的治疗手段主要是以抗菌药物治疗和抗病毒治疗为主，由于目前没有确认有效的治疗药物，抗病毒治疗方法以试用α-干扰素雾化吸入、洛匹那韦/利托那韦或加用利巴韦林等方式为主；同时，本病属于中医疫病范畴，根据临床表现的不同，可以使用藿香正气胶囊、金花清感颗粒、连花清瘟胶囊、疏风解毒胶囊、防风通圣丸等进行治疗。然而，截止目前，公众所能获知的专利、文献、刊物等资料中，均未公开将咳速停糖浆用于治疗冠状病毒感染引发的疾病中的用途。技术实现要素：本发明的目的在于，提供一种咳速停糖浆在治疗冠状病毒感染引发的疾病中的应用。本发明可以有效抑制冠状病毒的生长，从而使得咳速停糖浆具有在治疗由冠状病毒感染引发的疾病中的新用途。本发明的技术方案：咳速停糖浆在治疗冠状病毒感染引发的疾病中的应用。前述的咳速停糖浆在治疗冠状病毒感染引发的疾病中的应用中，所述的咳速停糖浆对人类冠状病毒hcov-229e株具有抑制作用。前述的咳速停糖浆在治疗冠状病毒感染引发的疾病中的应用中，咳速停糖浆在治疗人类冠状病毒hcov-229e株感染引发的呼吸道感染疾病中的应用。前述的咳速停糖浆在治疗冠状病毒感染引发的疾病中的应用中，咳速停糖浆在治疗人类冠状病毒hcov-229e株感染引发的小鼠呼吸道感染疾病中的应用。前述的咳速停糖浆在治疗冠状病毒感染引发的疾病中的应用中，所述的咳速停糖浆对大鼠冠状病毒8190株具有抑制作用。前述的咳速停糖浆在治疗冠状病毒感染引发的疾病中的应用中，咳速停糖浆在治疗大鼠冠状病毒8190株感染引发的呼吸道感染疾病中的应用。前述的咳速停糖浆在治疗冠状病毒感染引发的疾病中的应用中，咳速停糖浆在治疗大鼠冠状病毒8190株感染引发的大鼠呼吸道感染疾病中的应用。前述的咳速停糖浆在治疗冠状病毒感染引发的疾病中的应用中，所述咳速停糖浆的临床用量为48-72ml/60kg/d。前述的咳速停糖浆在治疗冠状病毒感染引发的疾病中的应用中，所述咳速停糖浆的人临床用量为60ml/60kg/d。与现有技术相比，本发明可以有效抑制冠状病毒的生长，从而使得咳速停糖浆具有在治疗由冠状病毒感染引发的疾病中的新用途。使用咳速停糖浆在治疗由冠状病毒感染引发的疾病中具有良好的治疗效果，其药物疗效可通过咳速停糖浆抗冠状病毒的体外细胞实验以及咳速停糖浆在对治疗冠状病毒感染引发的疾病的实验动物模型的影响来表现。以下是本发明的实验例。试验场所：中国中医科学院中药研究所absl-2实验室试验日期：2020.02.10～02.17实验例1：咳速停糖浆抗冠状病毒的体外细胞实验1、试验材料1.1、细胞株：人肺癌细胞a549购自北京北纳创联生物技术研究院，本室传代，液氮保存备用。1.2、病毒株：人类冠状病毒(hcov-229e)，由中国医学科学院医药生物技术研究所提供，本实验室传代，-80℃冰箱保存备用1.3受试药物名称：咳速停糖浆批号：20191138规格：100ml/瓶用法用量：10ml-20ml/次，3次/日生产厂家：贵州百灵企业集团制药股份有限公司1.4、试验试剂1.5、试验仪器2、试验方法及结果2.1、药物制备2.2、药物对体外培养a549细胞的毒性试验将配制后浓度的药物用培养液做2倍倍比稀释，共7个稀释度，加到已长成单层的a549细胞培养板中，100μl/孔，每个稀释度做3个复孔，同时设正常细胞对照。将培养板置37℃，5％co2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，连续96h，确定细胞不出现明显病变的最低稀释倍数(最大无毒浓度tc0)，并按reed-muench法计算50％细胞毒性浓度(tc50)。表1.药物对体外培养a549细胞的毒性作用表2药物对体外培养a549细胞的毒性作用表1、2结果显示了药物的最大无毒浓度(tc0)，以下试验时采用tc0浓度以下的6个浓度进行。2.3、药物在体外培养a549细胞上对人类冠状病毒(hcov-229e)的抑制作用取已长成单层细胞的培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，接种hcov-229e病毒液，100tcid50，100μl/孔，置37℃5％co2培养箱中吸附1h后，依次加入无毒浓度以下7个稀释度的各药液，100μl/孔，同时设正常细胞对照和病毒对照。置37℃5％co2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，96小时后病毒对照组细胞病变为+++～～++++时记录试验结果；并取上清液检测病毒核酸和细胞活力。细胞病变按6级标准判断：－：细胞生长正常，无病变出现；±：细胞病变少于整个单层的10％；+：细胞病变约占整个单层细胞的25％以下；++：细胞病变约占整个单层细胞的50％以下；+++：细胞病变约占整个单层细胞的75％以下；++++：细胞病变约占整个单层细胞的75％以上。按reed-muench计算50％抑制浓度(ic50)和治疗指数(ti)，ti＝tc50/ic502.3.1、病毒核酸检测方法(rt-pcr法)：细胞中核酸裂解处理1)按照说明书将各个试剂配好备用；2)吸取560μl配制好的bufferavl-carrierrna至1.5ml的离心管中；3)加入140μl细胞培养上清液至第2)步准备好的管中，涡旋振荡15秒；4)室温下(15-25℃)孵育10分钟；5)快速离心以去除附着于内壁与内盖的水滴；6)加入560μl乙醇(96-100％)至样本中，短暂离心15秒混匀，混匀后，快速离心去除附着于内壁与内盖的水滴；7)小心吸取630μl上一步获得的溶液至qiaampminicolumn上(柱子放置于1个2毫升的收集管内)，小心不要碰到柱子的边缘，盖上盖子，6000xg(8000rpm)下离心1分钟。将qiaampminicolumn移至一个新的2ml收集管，丢弃带有流出液的旧管；8)小心打开盖子，重复第7步操作；9)小心打开盖子，加入500μlbufferaw1，盖上盖子，6000xg(8000rpm)下离心1分钟，将qiaampminicolumn移至一个新的2ml收集管，丢弃带有流出液的旧管；10)小心打开盖子，加入500μlbufferaw2，盖上盖子全速离心(20000xg；14000rpm)3分钟；11)将柱子放在一个干净的1.5ml的离心管，丢弃含有流出液的旧管，小心打开盖子，加60μl平衡好的bufferave至膜上，盖上盖子，室温下孵育一分钟，6000xg(8000rpm)离心1分钟，于-20℃1月或-80℃下保存1年。核酸测定：对照品核酸处理：depc-h2o作为阴性对照。阳性对照品进行10、100、1000倍梯度稀释。试剂配制：取n×18μlhcov-229e核酸荧光pcr检测混合液，n×1μl内部对照品，与n×1μlrt-pcr酶(n为反应管数)，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。加样：取上述混合液20μl置于pcr管中，然后将样品核酸提取液、depc-h2o、阳性对照品各5μl分别加入pcr管中，改进管盖，离心数秒使所有液体置于底部，立即进行pcr扩增反应。pcr扩增：反应管置于定量荧光pcr仪上，循环参数设置为：45℃×10min；95℃×15min；再按95℃×15sec→60℃×60sec，循环40次；单点荧光检测在60℃，反应体系为25μl。荧光通道检测选择：选用fam和hex/vic/joe通道。备注：使用abi系列pcr仪，请务必于passivereference和quencher处均选择“none”。计算方法通道ct值结果判断1famundet或40样本低于检测值限，报告为阴性2fam≦38报告为阳性3fam38～40复检一次，如仍为38～40，则报告为阴性2.3.2、细胞活力检测方法(cck8法)：检测原理：cck8检测试剂盒，是一种基于wst-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2h-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，wst-8可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定od值，间接反映活细胞数量。检测方法：将已接种hcov-229e病毒液并加入不同浓度各药液的a549细胞继续培养96h后，吸去上清液，向96孔板每孔加入含10％cck8溶液的dmem培养液100μl。将培养板在培养箱内继续孵育1小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度值。表3.药物在体外培养a549细胞上hcov-229e的抑制作用表4.药物在体外培养a549细胞上hcov-229e的抑制作用表3、4结果显示：药物在不同浓度下对hcov-229e致体外培养a549细胞病变有不同程度的抑制作用。表5.药物在体外培养a549细胞上hcov-229e的抑制作用表5结果显示：细胞对照组无hcov-229e病毒核酸表达；病毒感染后对照组可检测出hcov-229e病毒核酸表达；咳速停糖浆在原药液/128剂量时可明显降低hcov-229e病毒核酸表达。表6.药物在体外培养a549细胞上hcov-229e的抑制作用表6结果显示：细胞对照组活力为100％，说明细胞状态良好；病毒感染后对照组细胞活力明显降低，与cpe结果相吻合。3、小结采用人类冠状病毒229e(hcov-229e)感染a549细胞，通过观察药物的tc0、tc50、ic50、ti，病毒核酸表达量以及培养细胞活力，综合评价药物在体外对hcov-229e的抑制作用。结果显示：咳速停糖浆在体外对人类冠状病毒229e(hcov-229e)有明显抑制作用。实验例2：咳速停糖浆对新型冠状病毒(人类冠状病毒)肺炎疫毒袭肺小鼠病证结合模型的治疗作用。1实验材料1.1受试药物1.2、实验动物balb/c小鼠，spf级，体重13～15g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：scxk(京)2016-0011，合格证号：1100112011004807。实验中所有操作均遵循nih及北京市实验动物伦理委员会的规定，并经过中国中医科学院中药研究所动物伦理委员会批准。1.3、毒株及细胞1.3.1、病毒毒株：人类冠状病毒(hcov-229e)，由中国医学科学院医药生物技术研究所提供，本实验室传代，-80℃冰箱保存备用。1.3.2、细胞株：人肺癌细胞a549购自北京北纳创联生物技术研究院，本室传代，液氮保存备用。1.4试验试剂乙醚，批号20150417，国药集团化学试剂有限公司；mouseil6valukinetmelisakit，批号：951928，美国bio-techne公司；mouseil10valukinetmelisakit，批号：185314，美国bio-techne公司。mousetnf-αelisakit，批号：266117，美国bio-techne公司。mouseinf-γelisakit，批号：352764，美国bio-techne公司。percp-cyanine5.5标记抗小鼠cd4(rm4-5)，批号：65-0042，美国tonbobiosciences。apc标记抗小鼠cd8a(53-6.7)，批号：20-0081，美国tonbobiosciences。fitc标记抗小鼠cd3e(145-2c11)，批号：35-0031，美国tonbobiosciences。pe标记抗小鼠cd19(1d3)，批号：50-0193，美国tonbobiosciences。humancoronavirus(hcov-229e)realtimert-pcrkit，批号：p20191201，上海之江生物科技股份有限公司。qiaamp病毒rna纯化试剂盒，163052733，凯杰企业管理上海有限公司。1.5、仪器设备msc1.8a2型生物安全柜(美国thermo公司)，msc1.2a2型生物安全柜(美国thermo公司)，yp1002电子天平(上海越平科学仪器有限公司)，ar1140电子分析天平(美国ohaus公司)，al204电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，zj-4独立送风隔离笼具(苏州冯氏实验动物设备有限公司)，rxz-380b型智能人工气候箱(宁波江南仪器厂)，thermo-371co2培养箱(美国thermo公司)，sw-cj-2fd型洁净工作台(airtech技术有限公司)，centrifuge5430型低温高速离心机(eppendorf公司)，quantstudio5型real-timepcrinstrument(appliedbiosystems公司)，enspire型多功能酶标仪(德国perkinelmer公司)，accuric6plus型流式细胞仪(美国bd公司)；eg1140h型石蜡包埋机，德国leica；hm355s型全自动轮转式切片机，德国microm；xl5010型自动染色机，德国autostainer；dm2500型显微数字照像生物显微镜，德国leica；dmlb-hc型自动光学照相生物显微镜，德国leica；ivc小鼠饲养笼，苏州教学笼具厂产品。2、实验方法2.1、实验剂量设计咳速停糖浆：人临床用量为60ml/60kg/d，即1ml/kg体重；试验时小鼠用量分别设22ml/kg/d、11ml/kg/d二个剂量，分别相当于临床2倍及等倍剂量。2.2、病毒传代取已长成单层a549、mrc-5或mdck细胞的25cm2培养瓶，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，加入hcov-229e的病毒液200μl，置37℃5％co2培养箱中培，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，72-96h，直至80％细胞出现明显病变(cpe)后，将细胞培养瓶置于-80℃低温冰箱冻存，病毒液反复冻融3次后，用于检测病毒毒力。2.3、病毒滴度测定取已长成单层a549、mrc-5或mdck细胞的培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，按10倍稀释接种不同滴度的hcov-229e病毒液，10-1-10-8共8个稀释度，100μl/孔，每个浓度4个复孔，同时设正常细胞对照。置37℃5％co2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，72-96h记录各孔的细胞病变情况。按reed-muench计算50％细胞病变浓度(tcid50)2.4、造模方法及给药取balb/c小鼠48只，spf级，体重14±1g，雌雄各半，按体重等级随机分为正常对照组、hcov-229e感染组、寒湿模型对照组、冠状病毒肺炎寒湿疫毒袭肺小鼠病证结合模型组(简称寒湿+229e感染组)、咳速停糖浆大剂量、咳速停糖浆小剂量组，每组8只。除正常对照组和hcov-229e感染组外，其余小鼠每天持续置于90±3％相对湿度，无风，温度4±2℃的人工气候箱中，4小时刺激后取出，连续7天。除正常对照组和寒湿模型对照组外，其余小鼠于寒湿刺激第5天、第6天，用乙醚轻度麻醉后，以100tcid50hcov-229e病毒液滴鼻感染，50μl/只。第1次感染当天开始灌胃给药，0.2ml/10g，每日1次，连续3天，正常对照组、寒湿模型对照组、229e感染模型组、寒湿+229e感染组在同等情况下给予生理盐水。感染第4天称重后眼眶取血，滴至生理盐水中备测淋巴细胞分型比例；其余血离心取血清，-20℃保存检测胃泌素(gas)、胃动素(mtl)；解剖取肺脏称重，计算肺指数及抑制率；取部分肺组织-80℃留存备用，检测病毒载量和炎性细胞因子。2.5、计算及检测方法2.5.1、肺指数及抑制率肺指数(g/100g体重)＝[肺湿重(g)/体重(g)]×1002.5.2、肺组织中hcov-229e核酸检测(rt-pcr法)核酸裂解处理小鼠解剖后将肺组织分装置于-80℃低温冰箱中保存；将小鼠肺组织从-80℃低温冰箱中取出，置于洁净的研钵中，倒入少量液氮并使用研杵将其研磨成粉末，收集粉末于1.5ml离心管中并立即加入1mltrizolreagent，轻弹管底，尽快混合样品至重悬；室温水平放置离心管，孵育20min；4℃，12000rpm，离心10min；将澄清上清液移入新的1.5ml离心管中；加入0.2ml氯仿，盖紧管盖，用力摇动离心管15s，室温孵育2-3min至液体分层；4℃，12000rpm，离心15min；h)将透明上清液小心移入新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min；4℃，12000rpm，离心10min；j)弃去上清，用1ml75％乙醇轻洗沉淀(使白色沉淀轻轻飘起)；4℃，7500rpm，离心5min；吸尽上清液，短暂干燥rna沉淀5-10min；m)用20μldepc水溶解沉淀，﹣80℃低温冰箱保存。核酸测定对照品核酸处理：depc-h2o作为阴性对照。阳性对照品进行10、100、1000倍梯度稀释。试剂配制：取n×18μlhcov-229e核酸荧光pcr检测混合液，n×1μl内部对照品，与n×1μlrt-pcr酶(n为反应管数)，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。加样：取上述混合液20μl置于pcr管中，然后将样品核酸提取液、depc-h2o、阳性对照品各5μl分别加入pcr管中，改进管盖，离心数秒使所有液体置于底部，立即进行pcr扩增反应。pcr扩增：反应管煮鱼定量荧光pcr仪上，循环参数设置为：45℃×10min；95℃×15min；再按95℃×15sec→60℃×60sec，循环40次；单点荧光检测在60℃，反应体系为25μl。荧光通道检测选择：选用fam和hex/vic/joe通道。备注：使用abi系列pcr仪，请务必于passivereference和quencher处均选择“none”。统计方法及实验结果。计算方法通道ct值结果判断1famundet或40样本低于检测值限，报告为阴性2fam≦38报告为阳性3fam38～40复检一次，如仍为38～40，则报告为阴性2.5.3、小鼠血清中gas、mtl及肺组织炎性因子检测(elisa法，按试剂盒说明书操作)解剖后将小鼠血浆放置在室温静置30min，2000xg离心10min，吸取上清至新的ep管内-20℃保存。检测时按照试剂盒说明书，将血清稀释液(40μl稀释液+10μl血清样本)、50μl梯度稀释的标准品一同加入平衡至室温的微孔板中，轻晃微孔板混匀样品，除空白孔外每孔加入100μl酶标试剂，应封板胶纸将微孔板所有反应空覆盖后，室温孵育2h，用洗液洗板5次，并于最后一次用吸水纸拍尽板内的液体。在每孔中分别加入50μl的显色底物a和50μl显色底物b，37℃避光孵育15min后每孔加入50μl终止液后，用酶标仪检测450nm的吸光度。样品收集及储存组织匀浆液样本：小鼠取肺组织称重后，收集小鼠肺组织，-4℃保存。称量50mg肺组织加入500μl生理盐水后，使用超声细胞破碎仪匀浆组织，使用低温高速离心机-4℃1000xg离心10分钟。吸取上清液之后分装，保存于-80℃冰箱贮存备用。避免反复冻融。样本准备工作：样本用稀释剂2倍稀释后进行检测，即50μl血清+50μl稀释剂。从已平衡至室温的密封袋中取出微孔板，分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品加入相应孔中，每孔100μl。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时。用洗液洗板，重复操作4次。最后一次洗板结束，将板倒置，在吸水纸拍干所有残留液体；在每个微孔内加入100μl酶标检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时。重复第4步洗板操作，在每个微孔内加入100μl显色底物，室温孵育30分钟。注意避光。在每个微孔内加入100μl终止液后30分钟内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值。计算结果。2.5.4、小鼠外周血t淋巴细胞亚群及b淋巴细胞比例检测(流式细胞仪检测)离心机4℃预冷。小鼠摘眼球取血，向装有10ml1×pbs的15ml离心管中加入3滴血(约150μl)，1600rpm，5min，室温离心；用移液管小心弃去上清，每管加入1ml红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温裂解约5-10min至液体从浑浊变澄清，加入10mlpbs终止裂解，2000rpm，5min，4℃离心，弃上清(如果还有较多红细胞可重复进行步骤4)。细胞沉淀用10mlpbs重悬，2000rpm，5min，4℃离心，弃上清，用200μl封闭液(含5％fbs的pbs)重悬，并将细胞悬液转移至1.5mlep管中，4℃封闭30min。避光于封闭液中配制流式抗体如下：fitc标记抗小鼠cd3e、pe标记抗小鼠cd19，percp-cy5.5标记抗小鼠cd4、apc标记抗小鼠cd8a，每一管细胞的配制体积为：抗体各0.3μl，封闭液50μl。细胞悬液2000rpm，5min，4℃离心，弃上清。加入流式抗体，每管50μl，4℃避光染色30min，加入1mlpbs，2000rpm，5min，4℃离心，弃上清。用200μl含2％fbs的pbs重悬细胞，转移至流式管中，上机检测(如不能及时上机检测，可用pbs将4％多聚甲醛固定液稀释为2％，重悬细胞，每管体积为200μl，4℃避光保存过夜)。2.5.5、肺组织病理学检查(病理报告附后)取小鼠肺组织，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，切片，he染色，中性树胶封片，显微镜下观察、照相。光学显微镜下观察小鼠肺部有无病理形态学改变，进行组间比较。3、实验结果3.1、药物对人类冠状病毒肺炎疫毒袭肺病证结合小鼠模型肺指数及抑制率的影响药物对冠状病毒肺炎寒湿疫毒袭肺小鼠病证结合模型(寒湿+229e感染组)的治疗作用注：与正常对照组比较##p<0.01；与hcov-229e感染模型组比较^^p<0.01；与寒湿郁肺模型组(寒湿+229e感染组)比较**p<0.01。寒湿+229e感染造成人类冠状病毒肺炎疫毒袭肺病症结合小鼠模型组肺指数明显增加，将咳速停糖浆灌胃给药3天后，2个剂量组肺指数均明显降低，与寒湿疫毒袭肺模型组(寒湿+229e感染组)比较有显著性差异(p<0.01)，肺指数抑制率为79.64％、72.95％，且有良好的量效相关性。说明咳速停糖浆对冠状病毒肺炎寒湿疫毒袭肺小鼠病证结合模型有明显的治疗作用。详见图1所示，图1:a.正常组；b.寒湿组；c.hcov-229e感染组；d.冠状病毒肺炎寒湿疫毒袭肺小鼠病证结合模型组；e.咳速停糖浆高剂量组；f.咳速停糖浆低剂量组；与正常组比较1)p<0.01；与冠状病毒肺炎寒湿疫毒袭肺小鼠病证结合模型组比较2)p<0.013.2、药物对人类冠状病毒肺炎疫毒袭肺病证结合小鼠模型血清中胃肠肽含量的影响药物对冠状病毒肺炎寒湿疫毒袭肺小鼠病证结合模型(寒湿+229e感染组)的治疗作用注：与正常对照组比较，##p<0.01；与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01寒湿+229e感染组小鼠血清中mtl含量显著增高，gas含量显著降低，与正常对照组比较有显著性差异(p<0.01)；咳速停糖浆在不同剂量下可不同程度调节mtl和gas的生成，咳速停糖浆两个剂量mtl含量与模型对照组比较有显著性差异(p<0.01)。详见图2和图3所示。3.3、药物对冠状病毒肺炎疫毒袭肺病证结合小鼠模型肺组织中病毒载量的影响药物对冠状病毒肺炎寒湿疫毒袭肺小鼠病证结合模型(寒湿+229e感染组)的治疗作用注：与正常对照组比较，##p<0.01；与229e感染模型组比较^^p<0.01；与寒湿疫毒袭肺模型对照组(寒湿+229e感染组)比较，**p<0.01正常对照组动物肺组织中无hcov-229e核酸表达；采用hcov-229e感染小鼠后，小鼠肺组织中有明显核酸表达；咳速停糖浆在小剂量下可明显降低肺组织中病毒核酸表达量。结果如图4所示。3.4、药物对冠状病毒肺炎疫毒袭肺病证结合小鼠模型外周血中免疫细胞百分比的影响(结果如图5和6所示)药物对冠状病毒肺炎寒湿疫毒袭肺小鼠病证结合模型的治疗作用注：与正常对照组比较，##p<0.01；与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.013.5、药物对冠状病毒肺炎疫毒袭肺病证结合小鼠模型肺组织中炎性因子的影响药物对冠状病毒肺炎寒湿疫毒袭肺小鼠病证结合模型的治疗作用注：与正常对照组比较，##p<0.01；与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01寒湿+229e感染组小鼠肺组织炎性因子il-6、il-10及tnf-a均明显增高，与正常对照组比较有显著性差异(p<0.01)；咳速停糖浆在不同剂量下均能降低炎性因子的生成，与模型对照组比较有显著性差异(p<0.01)。结果如图7所示。综上，本次实验采用具有宣肺化痰法的药物咳速停糖浆治疗冠状病毒肺炎疫毒袭肺病证结合小鼠模型，采取人类冠状病毒hcov-229e感染+寒湿条件刺激复合因素制备冠状病毒肺炎疫毒袭肺病证结合小鼠模型，通过观察小鼠肺组织炎症变化、病毒载量及炎性因子；血清胃肠肽指标及外周血免疫细胞百分比的变化，综合评价药物的治疗作用。实验研究显示：人类冠状病毒肺炎疫毒袭肺病证结合小鼠模型的肺指数及核酸病毒载量明显升高，与正常对照组相比有显著性差异(p<0.01)，该结果表明人类冠状病毒肺炎疫毒袭肺病证结合小鼠模型成功。咳速停糖浆两个剂量组能明显降低感染小鼠的肺指数，咳速停糖浆在小剂量下可明显降低肺组织中病毒核酸表达量，与模型对照组相比有显著性差异(p<0.01)，表明咳速停糖浆有减轻小鼠肺部炎症损伤及病毒核酸表达的作用。在免疫机制方面，细胞免疫t细胞中，cd8+t细胞可直接杀伤病毒感染的细胞，cd4+t细胞可辅助b细胞活化；体液免疫b细胞可活化成为浆细胞，产生抗体从而发挥对病毒的杀伤作用。本次实验中小鼠外周血淋巴细胞亚群百分比显示：模型小鼠外周血中免疫细胞cd4+t细胞、cd8+t细胞及b细胞的百分比显著降低；咳速停糖浆有调节小鼠免疫t、b细胞比例的作用。细胞因子风暴(cytokinestorm)是指机体在感染微生物后引起体液中多种细胞因子(tnf-α、il-1、il-6、il-12、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、mcp-1和il-8等)迅速大量产生，引起急性呼吸窘迫综合征和多脏器衰竭。本次实验研究发现，寒湿+229e感染组小鼠肺组织炎性因子il-6、il-10及tnf-a均明显增高，与正常对照组比较有显著性差异(p<0.01)；咳速停糖浆在不同剂量下均能降低炎性因子的生成，与模型对照组比较有显著性差异(p<0.01)，表明咳速停糖浆有减轻细胞因子风暴的作用。免疫炎性机制综合分析：人类冠状病毒经上呼吸道感染机体后，导致病毒在肺组织中大量增值，模型组小鼠肺组织释放大量的巨噬细胞和nk细胞，导致炎性因子il-6、il-10及tnf-a过度激活，同时，模型组外周血中的cd4+t细胞、cd8+t细胞及b细胞的百分比与模型组比较显著降低，推测是由于小鼠肺组织中病毒大量复制，造成过量的免疫细胞从外周血中进入肺组织导致t、b细胞过度活化，活化的cd4+t细胞、cd8+t细胞及b细胞进一步导致炎性因子il-6、il-10及tnf-a在肺组织中过度释放，最终导致细胞因子风暴的产生，与冠状病毒感染的临床报道相似。当药物进入机体后，可明显降低给药小鼠肺组织中的炎性因子il-6、il-10及tnf-a表达，表明咳速停糖浆可在一定程度上调节机体的免疫机能，减轻肺组织损伤。附图说明图1是咳速停糖浆对小鼠肺指数的影响图；图2是咳速停糖浆对小鼠血清中gas含量的影响结果图；图3是咳速停糖浆对小鼠血清中mtl含量的影响结果图；图4是咳速停糖浆对小鼠肺组织中核酸表达量的影响结果图；图5是咳速停糖浆对小鼠外周血中免疫细胞百分比的影响结果图；图6是咳速停糖浆对小鼠外周血中免疫细胞百分比流式图；图7是咳速停糖浆对小鼠肺组织中炎性因子含量的影响结果图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。实施例1。咳速停糖浆在治疗冠状病毒感染引发的疾病中的应用。所述咳速停糖浆的临床用量为48-72ml/60kg/d。优选为：咳速停糖浆的人临床用量为60ml/60kg/d。口服，一次10-20ml，一日三次，禁忌：儿童、孕妇、哺乳期妇女禁用；糖尿病患者禁服。注意事项：1、忌烟、酒及辛辣、生冷、油腻食物。2、不宜在服药期间同时服用滋补性中药。3、有支气管扩张、肺脓疡、肺心病、肺结核患者出现咳嗽时应去医院就诊。4、高血压、心脏病患者慎服。5、本品如有沉淀，摇匀后服用。6、严格按用法用量服用，年老体弱者应在医师指导下服用。7、本品不宜长期服用，服药3天症状无缓解，应去医院就诊。8、对本品过敏者禁用，过敏体质者慎用。9、本品性状发生改变时禁止使用。10、请将本品放在儿童不能接触的地方。11、如正在使用其他药品，使用本品前请咨询医师或药师。12、运动员慎用。实施例2。咳速停糖浆在治疗人类冠状病毒(hcov-229e株)感染引发的疾病中的应用。所述的咳速停糖浆对人类冠状病毒hcov-229e株具有抑制作用。所述咳速停糖浆的临床用量为48-72ml/60kg/d。优选为：咳速停糖浆的人临床用量为60ml/60kg/d。口服，一次10-20ml，一日三次，禁忌：儿童、孕妇、哺乳期妇女禁用；糖尿病患者禁服。注意事项：1、忌烟、酒及辛辣、生冷、油腻食物。2、不宜在服药期间同时服用滋补性中药。3、有支气管扩张、肺脓疡、肺心病、肺结核患者出现咳嗽时应去医院就诊。4、高血压、心脏病患者慎服。5、本品如有沉淀，摇匀后服用。6、严格按用法用量服用，年老体弱者应在医师指导下服用。7、本品不宜长期服用，服药3天症状无缓解，应去医院就诊。8、对本品过敏者禁用，过敏体质者慎用。9、本品性状发生改变时禁止使用。10、请将本品放在儿童不能接触的地方。11、如正在使用其他药品，使用本品前请咨询医师或药师。12、运动员慎用。实施例3。咳速停糖浆在治疗人类冠状病毒hcov-229e株感染引发的呼吸道感染疾病中的应用。所述咳速停糖浆的临床用量为48-72ml/60kg/d。优选为：咳速停糖浆的人临床用量为60ml/60kg/d。口服，一次10-20ml，一日三次，禁忌：儿童、孕妇、哺乳期妇女禁用；糖尿病患者禁服。注意事项：1、忌烟、酒及辛辣、生冷、油腻食物。2、不宜在服药期间同时服用滋补性中药。3、有支气管扩张、肺脓疡、肺心病、肺结核患者出现咳嗽时应去医院就诊。4、高血压、心脏病患者慎服。5、本品如有沉淀，摇匀后服用。6、严格按用法用量服用，年老体弱者应在医师指导下服用。7、本品不宜长期服用，服药3天症状无缓解，应去医院就诊。8、对本品过敏者禁用，过敏体质者慎用。9、本品性状发生改变时禁止使用。10、请将本品放在儿童不能接触的地方。11、如正在使用其他药品，使用本品前请咨询医师或药师。12、运动员慎用。实施例4。咳速停糖浆在治疗人类冠状病毒hcov-229e株感染引发的小鼠呼吸道感染疾病中的应用。所述咳速停糖浆的临床用量为48-72ml/60kg/d。优选为：咳速停糖浆的临床用量为60ml/60kg/d。口服，一次10-20ml，一日三次。实施例5。咳速停糖浆在治疗大鼠冠状病毒8190株感染引发的疾病中的应用。所述的咳速停糖浆对大鼠冠状病毒8190株具有抑制作用。所述咳速停糖浆的临床用量为48-72ml/60kg/d。优选为：咳速停糖浆的人临床用量为60ml/60kg/d。口服，一次10-20ml，一日三次，禁忌：儿童、孕妇、哺乳期妇女禁用；糖尿病患者禁服。注意事项：1、忌烟、酒及辛辣、生冷、油腻食物。2、不宜在服药期间同时服用滋补性中药。3、有支气管扩张、肺脓疡、肺心病、肺结核患者出现咳嗽时应去医院就诊。4、高血压、心脏病患者慎服。5、本品如有沉淀，摇匀后服用。6、严格按用法用量服用，年老体弱者应在医师指导下服用。7、本品不宜长期服用，服药3天症状无缓解，应去医院就诊。8、对本品过敏者禁用，过敏体质者慎用。9、本品性状发生改变时禁止使用。10、请将本品放在儿童不能接触的地方。11、如正在使用其他药品，使用本品前请咨询医师或药师。12、运动员慎用。实施例6。咳速停糖浆在治疗大鼠冠状病毒8190株感染引发的呼吸道感染疾病中的应用。所述咳速停糖浆的临床用量为48-72ml/60kg/d。优选为：咳速停糖浆的人临床用量为60ml/60kg/d。口服，一次10-20ml，一日三次，禁忌：儿童、孕妇、哺乳期妇女禁用；糖尿病患者禁服。注意事项：1、忌烟、酒及辛辣、生冷、油腻食物。2、不宜在服药期间同时服用滋补性中药。3、有支气管扩张、肺脓疡、肺心病、肺结核患者出现咳嗽时应去医院就诊。4、高血压、心脏病患者慎服。5、本品如有沉淀，摇匀后服用。6、严格按用法用量服用，年老体弱者应在医师指导下服用。7、本品不宜长期服用，服药3天症状无缓解，应去医院就诊。8、对本品过敏者禁用，过敏体质者慎用。9、本品性状发生改变时禁止使用。10、请将本品放在儿童不能接触的地方。11、如正在使用其他药品，使用本品前请咨询医师或药师。12、运动员慎用。实施例7。咳速停糖浆在治疗大鼠冠状病毒8190株感染引发的大鼠呼吸道感染疾病中的应用。所述咳速停糖浆的临床用量为48-72ml/60kg/d。优选为：咳速停糖浆的临床用量为60ml/60kg/d。口服，一次10-20ml，一日三次。当前第1页12