一种C60的新应用及其产品活性检测方法与流程

本发明涉及功能性产品领域，特别是涉及一种c60的新应用及其产品活性检测方法。

背景技术：

c60或carbon-60或fullerene(富勒烯)是由60个碳原子组成的分子量为720的球状结构物质(1、2、3)。1985年，天文学家在实验室利用高能量激光溅射放置在真空室环境中的石墨，偶然发现了这种外形类似足球的c60(1、2、3)。三位科学家1996年为此新材料的发明获诺贝尔化学奖。富勒烯是脂溶性物质，在引入羟基的数目20个以上时呈水溶性(1、2、3)。

文献研究表明c60强力吸收自由基、抑制化学毒物毒性、抗辐射、防紫外光伤害、防重金属细胞损伤，在化妆品、医疗器械和医药等领域均有实际和潜在应用(4、5)。c60首先作为一种极强的抗氧化物(11、12)，在皮肤美容、促进毛囊生长和抗衰老领域发挥作用(6、7、8、9、10)。因此，c60是抗氧化“天才生”(11、12)。法国科学家还将c60溶于橄榄油中，在老鼠10-17个月每两周喂一次(每公斤体重喂含有4毫克c60的橄榄油)，对照组老鼠17-38个月死亡，而试验组寿命则延长至59-66个月，期间无论体重，还是生理表现无一异常(13)。因此，c60非正式地在美国和欧盟的“保健食品”领域销售(14)。

文献研究表明橄榄油作为一种极强的抗氧化物对炎症性皮肤疾病、癌症和肠道疾病有治疗作用(11、12、15、16、17、18)。本文建立了新鲜提取中性粒细胞移走、吞噬和凋亡实验模型，研究了c60葡萄籽油调解人中性粒细胞移走、吞噬和凋亡的作用。本研究同时还建立了一种中性粒细胞移走、吞噬和凋亡相关c60抗炎活性的检测方法。最后，本研究通过人临床试用表明c60通过皮肤涂抹按摩给药的速度和效果神奇，建立了难以解释其机制的意外远程给药途径来治疗体表下深层疾病、深层内脏疾病和远离给药部位的疾病。

参考文献

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技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种c60(富勒烯)的新应用及其产品检测方法，新应用主要涉及c60在制备抗炎产品、美容产品、保健品的应用，本发明的c60(carbon-60)通过对人中性粒分泌tnf-ɑ的抑制作用以及通过对人中性粒细胞的抑制作用来达到抗炎和抗炎症性疼痛和瘙痒的作用；将c60作用于皮肤粘膜产生一定的抗炎或美容作用，且c60对人中性粒细胞吞噬异物具有轻度抑制作用；c60对人中性粒凋亡无明显作用。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种c60在制备抗炎产品中的应用，所述c60通过抑制细胞炎性因子tnf-ɑ分泌而发挥抗炎作用。

进一步地，所述c60抑制人中性粒细胞tnf-ɑ分泌。

进一步地，所述c60抑制人中性粒细胞移走。

进一步地，所述c60抑制人中性粒细胞吞噬异物颗粒。

进一步地，所述抗炎产品为溶于植物油的c60。所述植物油可以为葡萄籽油或橄榄油。

进一步地，所述抗炎产品中c60的使用浓度为2～4mg/ml；优选为3mg/ml。

进一步地，所述抗炎产品采用皮肤粘膜涂抹按摩和/或口腔内舌表面滴服的给药方式。

进一步地，所述抗炎产品为用于治疗中性粒细胞相关炎症性疾病的抗炎产品。

进一步地，所述中性粒细胞相关炎症性疾病包括顽固性皮肤瘙痒、结肠炎、蚊虫叮咬引发的瘙痒、痔疮、头部神经痛、带状疱疹引发的疼痛、慢性肌腱损伤、肌肉肌筋膜疼痛和/或关节疼痛。

进一步地，通过以上临床试用表明c60通过皮肤涂抹按摩给药的速度和效果神奇，建立了难以解释其机制的意外远距离给药途径来快速缓解和治疗体表下深层疾病、深层内脏疾病和远离给药部位的疾病。

所述的c60给药方式的史无前例速度和机制无法用现有技术解释和没有先例。

另一方面，提供一种c60在制备美容产品中的应用，其特征在于，所述c60溶于葡萄籽油作为头面部皮下溶脂和/或美白的产品，通过在皮肤表面涂抹并按摩的给药方式。

又一方面，提供一种c60在制备保健产品中的应用，所述c60溶于葡萄籽油的c60作为促进血压脉压差增加和心率加快的产品，通过在皮肤表面涂抹并按摩的给药方式。

再一方面，提供一种c60的给药方法，通过在皮肤表面涂抹并按摩溶于葡萄籽油的c60,所述c60作为抗炎产品、美容产品和/或保健产品和皮肤按摩产品。

进一步地，通过以上临床试用表明c60通过皮肤涂抹按摩给药的速度和效果神奇，建立了难以解释其机制的意外远距离给药途径来快速缓解和治疗体表下深层疾病、深层内脏疾病和远离给药部位的疾病。

再一方面，提供一种c60制剂的产品活性检测方法，采用新鲜提取的人或动物中性粒细胞进行tnf-ɑ分泌检测实验。

进一步地，采用人或动物中性粒细胞进行移走活性检测实验。

进一步地，采用人或动物中性粒细胞进行吞噬异物颗粒检测实验。

进一步地，采用c60治疗人中性粒细胞tnf-a分泌、移走、吞噬相关疾病的检测实验。

另一方面，提供一种c60在治疗中性粒细胞相关炎症性疾病的应用，所述c60通过抑制细胞炎性因子tnf-ɑ分泌治疗炎症疾病；

和/或，所述c60通过抑制人中性粒细胞移走治疗炎症疾病；

和/或，所述c60通过抑制人中性粒细胞吞噬异物颗粒治疗炎症疾病。

进一步地，所述中性粒细胞相关炎症性疾病包括顽固性皮肤瘙痒、结肠炎、蚊虫叮咬引发的瘙痒、痔疮、头部神经痛、带状疱疹引发的疼痛、慢性肌腱损伤、肌肉肌筋膜疼痛和/或关节疼痛。

进一步地，所述c60为溶于植物油的c60，采用皮肤粘膜涂抹和/或口腔内舌表面滴服的给药方式。

又一方面，提供一种c60在美容中的应用，通过在皮肤表面涂抹并按摩溶于葡萄籽油的c60，达到皮下溶脂或美白的目的。

还一方面，提供一种c60在改善血液循环方面的应用，通过在皮肤表面涂抹并按摩溶于葡萄籽油的c60一段时间，促进血压脉压差增加和心率加快。

采用这样的设计后，本发明至少具有以下优点：

本发明的新应用主要涉及c60在制备抗炎产品、美容产品、保健品的应用，本发明的c60(carbon-60)通过对人中性粒分泌tnf-ɑ的抑制作用来达到抗炎作用；将c60作用于皮肤产生一定的抗炎或美容作用，且c60对人中性粒细胞吞噬异物具有轻度抑制作用作用；c60对人中性粒凋亡无明显作用。本发明的c60产品在治疗顽固性皮肤瘙痒、结肠炎、蚊虫叮咬引发的瘙痒、痔疮、头部神经痛、带状疱疹引发的疼痛、慢性肌腱损伤、肌肉肌筋膜疼痛和/或关节疼痛等tnf-5相关疾病方面具有明显改善作用，并具有美白瘦脸的作用，同时能改善血液循环。本发明通过以上人临床试用表明c60通过皮肤涂抹按摩给药的速度和效果神奇，建立了难以解释其机制的意外远距离给药途径来快速缓解和治疗体表下深层疾病、深层内脏疾病和远离给药部位的疾病。

附图说明

上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

图1是本发明有(a)和没有(b)c60油混合含血清培养液包裹的培养表面的显微镜观察结果；

图2是本发明研究c60抑制中性粒释放tnf-α的一个实施例的结果示意图；

图3是本发明研究c60抑制中性粒细胞移走的一个实施例结果示意图；

图4是本发明研究c60轻度抑制中性粒细胞吞噬(n＝3)的效果实施例示意图；

图5是本发明研究c60对中性粒细胞凋亡的作用结果示意图。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域技术人员。

实施例1

目的：1.研究c60(carbon-60)对人中性粒分泌tnf-ɑ的作用；2.研究c60对人中性粒移走的作用；3.研究c60对人中性粒细胞吞噬异物的作用；4.研究c60对人中性粒凋亡的作用。

方法和材料

1.c60制备

纯度>99％的c60干粉从苏州大德碳纳米科技有限公司购买。然后，将c60干粉溶于葡萄籽油，室温下，置于磁力搅拌器中充分混合9天，制备3mg/ml的c60葡萄籽油。

2.1包裹方法

先制造c60浓度为3mg/ml的溶于葡萄籽c60油储存液，然后和含有1-10％胎牛血清fbs的细胞培养液在不断混合下配制足量浓度为20μg/ml的c60油，取100μl反复吹吸24孔培养板底部10次，吸出80μl，留下约20μl的c60油残留于24孔板培养板底部，包裹(coating)细胞培养表面，如图1所示。每孔加入200μl由1-10％胎牛血清fbs的1640细胞培养液重悬、糖密度梯度离心法新鲜提取的人静脉血中性粒细胞，使得c60油在培养液中的终浓度为2μg/ml。同样，空白对照使用等量体积葡萄籽油和含有1-10％胎牛血清fbs的细胞培养液，在不断混合下配制的液体，取100μl反复吹吸24孔培养板板底部10次，吸出80μl，留下约20μl残留于24孔培养板板底部，包裹(coating)细胞培养表面。注：此方法适用人中性粒细胞炎症因子tnf-α分泌、人中性粒细胞吞噬异物和人中性粒细胞凋亡。

如图1所示，有(panelleft)(a)和没有(panelright)(b)c60油混合含血清培养液包裹的培养表面的显微镜观察结果。panelright(b)所示细胞培养表面可见多处滴环状c60油滴泡。

2.2直接稀释方法

先制造c60浓度为3mg/ml的溶于葡萄籽c60油储存液，取10μl和990μl含有10％胎牛血清fbs的细胞培养液不断混合配制浓度为30μg/ml的c60油(标记为c1)，取c1200μl和100μl含有10％胎牛血清fbs的细胞培养液不断混合配制浓度为20μg/ml的c60油(标记为c2)，取c2100μl和900μl含有10％胎牛血清fbs的细胞培养液不断混合配制浓度为2μg/ml的c60油(标记为c3)，然后取100μlc3加入96孔板。注：此方法适用人中性粒细胞移走。

3.人静脉血中性粒细胞分离

健康志愿者共6人，年龄26±5岁，采血经长春嘉和外科医院医学伦理委员会批准和本人同意。本研究采用糖密度梯度离心法，既人静脉血白细胞分离试剂盒(内毒素<0.1eu)(天津灏洋华科生物科技有限公司)，分离静脉血。常温下采集人静脉血1800rpm离心25min，吸取多核细胞层(中性粒细胞为主)，充分裂解红细胞，反复清洗两次，用3ml含10％fbs的1640培养基重悬备用。采用白细胞分类染色液染色观察细胞形态，调整密度至1×10⁶个/ml，再备用。每次采集不同志愿者的血液排除个体差异和确保实验可重复。

4.新鲜提取的人中性粒细胞释放tnf-ɑ研究

先制造c60浓度为3mg/ml的溶于葡萄籽c60油储存液，然后使用等量体积的葡萄籽c60油和含有5％胎牛血清fbs的细胞培养液在不断混合下配制浓度20μg/ml的c60油，取100μl反复吹吸96孔培养板底部10次，吸出80μl，留下约20μl的c60油残留于96孔板培养板底部包裹(coating)细胞培养表面，如图1所示。加入200μl/孔的有5％肽牛血清fbs的1640细胞培养液重悬糖密度梯度离心法新鲜提取的人静脉血中性粒细胞，使c60油在培养液中的终浓度到2μg/ml。同样，空白对照使用等量体积葡萄籽油和含有5％胎牛血清fbs的细胞培养液在不断混合下配制的液体100μl反复吹吸96孔培养板板底部10次，吸出80μl，留下约20μl残留于96孔培养板板底部包裹(coating)细胞培养表面。将以上含有c60油包裹96孔板底部培养的人中性粒细胞24h后收取细胞液检测tnf-α水平。使用人体酶联免疫吸附测定试剂盒检测tnf-α含量，具体方法详见制造商的说明(tnf-αelisakit，美国r&dsystemdy210；il-6elisakit，华美csb-e04638h)。

5.新鲜提取的人中性粒细胞移走研究

(1)称取0.08g琼脂糖粉溶于10ml蒸馏水中，高压灭菌，放置恒温烘箱备用。(2)本研究采用糖密度梯度离心法，即人静脉血中性粒细胞分离试剂盒(内毒素<0.1eu，天津灏洋华科生物科技有限公司)，分离静脉血。常温下采集人静脉血520g离心20min，吸取多核细胞层(中性粒细胞为主)，充分裂解红细胞，反复清洗两次，新鲜提取的中性粒细胞用少量pbs培养基重悬，计数，染色看细胞形态。用1×r1640重悬调整细胞密度至3×10⁸个/ml备用。(3)将0.8％琼脂糖胶放入37℃水中保温，取500μl琼脂糖与等量2×r1640(20％fbs+1％青链霉素)；(4)分别取100μl上述混合液与100μl中性粒细胞悬液混合，置37℃水浴；(5)取预冷的96孔板，向冷却的96孔板各孔加入2μl中性粒细胞琼脂糖混合液，要求在孔底中心形成直径为2mm的微滴；(6)将铺好胶滴的96孔板放置4℃，15min；(7)配制含10％fbs、1ng/mllps+10％fbs、1nmfmlp+10％fbs、2μg/mlc60+10％fbs的r1640培养基；(8)待孔内琼脂糖微滴凝固后，将100μl上述试剂分别加入各孔，每组4个平行；(9)加盖后放入37℃恒温培养箱3h；(10)取出96孔板，置倒置显微镜下观察迁移距离并拍照记录，运用imagej软件计算细胞运动面积。

6.新鲜提取的人中性粒细胞吞噬异物研究

人中性粒细胞用含有10％fbs的rpmi-1640培养基，调整细胞密度至2×10⁶个/ml。每孔加入200μl细胞，接种于24孔板中，利用c60包裹的方法配置含10％fbs+oil、2μg/mlc60+10％fbs+oil、1ng/mllps+10％fbs+oil、1ng/mllps+2μg/mlc60+10％fbs+oil的r1640培养基，刺激中性粒细胞。直径2um乳胶珠，羧酸盐改性聚苯乙烯(l3030sigma-aldrich)每孔加入3.5μl，调节荧光颗粒密度为2×10⁷个/ml，建立中性粒细胞与荧光颗粒的最佳吞噬模型，37℃吞噬培养1h后，流式细胞仪(facscalibur美国pe公司)488nm波长激光器，收集波长为575nm的红色荧光，得出中性粒细胞的吞噬率，从而研究中性粒细胞的吞噬能力。实验完成后，再新鲜提取另外一人静脉血白细胞重复实验，确保实验结果可重复。

7.新鲜提取的人中性粒细胞凋亡研究

新鲜提取的人中性粒细胞使用人静脉血中性粒细胞分离试剂盒(内毒素<0.1eu)(天津灏洋华科生物科技有限公司)。人中性粒细胞凋亡研究使用annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒(c1062m-50，上海碧云天生物技术有限公司)染色。将分离得到的中性粒细胞用pbs重悬细胞和计数。将中性粒细胞密度均调整为1×10⁶个/ml，按表1安排葡萄籽油组、葡萄籽油+c60组和葡萄籽油+lps组。

表1.葡萄籽油组、葡萄籽油+c60组和葡萄籽油+lps组处理和安排。

各处理组在细胞培养箱培养3小时后使用annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒(c1062m-50)染色，包括：(1)将细胞吸出至离心管中，4℃1000g离心5min，将上清吸出来至离心管中，-20冻存，收集细胞，用pbs轻轻重悬细胞，4℃1000g离心5min，弃上清，加入195μlannexinv-fitc结合液重悬细胞；(2)加入5μlannexinv-fitc，轻轻混匀；(3)加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀；(4)室温(20-50℃)避光孵育15min，随后置于冰浴中。各组加入800μl预冷的pbs，使用流式细胞仪(facscalibur美国pe公司)488nm波长激光器，收集波长为488nm的绿色荧光、575nm的红色荧光，得出细胞凋亡率。

8.统计学分析

所有数据均用平均数±标准差或标准误表示，两组数据均采用批内两组t检验比较，p<0.05和p<0.01分别被认为差异具有明显统计学差异和非常明显统计学差异。细胞培养结果取三个值，至少重复2次。数据分析使用graphprism6.0，其结果用表或图表示。

结果如图2(注：葡萄籽油(oil)铺盖在细胞培养表面)所示：c60抑制中性粒tnf-α释放

本研究发现c60(1μg/ml)使tnf-α的含量降低26.6％(*p＜0.05)，c60(2μg/ml)能使tnf-α的含量降低67.5％(***p＜0.001)。随着c60含量的增加，tnf-α的释放持续降低。因此，c60呈剂量依赖型抑制中性粒细胞炎症因子tnf-α释放。

结果如图3和表2，在细胞移走试验中：胶滴内含有5％fbs，胶滴外含有10％fbs，葡萄籽油(oil)加入胶滴内。

表2.c60抑制中性粒细胞移走。

从图4可知(葡萄籽油(oil)铺盖在细胞培养表面)，c60能轻度抑制中性粒细胞吞噬(n＝3)。

从图5可知(葡萄籽油(oil)铺盖在细胞培养表面).c60对中性粒细胞凋亡无明显影响(n＝3)。

最后，以上研究结果表明溶解于葡萄籽油的c60直接通过培养液进入中性粒细胞产生作用。参考文献研究表明溶解于葡萄籽油的c60直接进入细胞膜和被中性粒细胞吞噬并带入血液循环。

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非特异性免疫反应炎症是双刃剑，既保护人体组织不受外物侵犯，又防止伤害自身组织造成疾病。c60纳米颗粒有可能吸引人中性粒细胞吞噬自己，使得中性粒细胞无力顾及伤害人体组织从而造成疾病，是其抗炎机制之一，见参考文献“catherineafromen,williamjkelley,margaretbfish,rehemanadili,jefferynoble,markjhoenerrhoff,michealholinstatandomololaeniola-adefeso,neutrophil-particleinteractioninbloodcirculationdriveparticleclearanceandalterneutrophilresponsesinacuteinflammation,2017,11(11):10797-10807”。以下实施例2将进一步研究溶于葡萄籽油的c60抗炎产品的临床效果。

结论：

本研究发现溶于葡萄籽油的c60抑制人中性粒细胞炎症因子tnf-α分泌。本研究进一步发现溶于葡萄籽油的c60抑制人中性粒细胞移走。本研究还进一步发现溶于葡萄籽油的c60轻微抑制人中性粒细胞异物吞噬功能。本研究最后发现溶于葡萄籽油的c60对人中性粒细胞凋亡没有作用。因此，溶于葡萄籽油的c60是一种治疗中性粒细胞相关炎症性疾病的候选药物。本研究同时建立了溶于葡萄籽油的c60对中性粒细胞tnf-α分泌、移走和吞噬相关的抗炎产品活性检测方法。

实施例2

目的：c60(carbon-60)治疗顽固性皮肤瘙痒。

背景：本段以下列出的参考文献表明皮肤炎症性瘙痒与tnf-ɑ和中性粒细胞相关，适用于c60治疗。

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方法：

本研究使用溶于葡萄籽油的c60(以下称c60油)治疗患有皮肤瘙痒病人88例(年龄58±6)，观察治疗当时(5分钟内)和治疗后3个月瘙痒症状和局部皮肤红肿硬的体征来替代活检患病部位tnf-ɑ和中性粒细胞增多的组织化学切片研究。溶于葡萄籽油的c60的具体使用方法为每次3ml(3mg/ml)皮肤大面积涂抹和充分按摩促进皮肤吸收，每天1-2次。

结果：

溶于葡萄籽油的c60涂抹和充分按摩1-5分钟后，100％病人开始缓解了瘙痒症状。

表3.c60油涂抹和充分按摩治疗皮肤瘙痒的效果。

本实验预料之外的结果是c60油治疗3个月后患有皮肤瘙痒病人88例(年龄58±6)中的患有结肠炎(大便次数>3次/日和便中有少量血)的22例病人(年龄62±4)的结肠炎症状体征均完全缓解。

表4.c60油涂抹和充分按摩治疗结肠炎的效果。

本研究预料之外的结果还有c60油治疗的患有皮肤瘙痒病人88例中的62例病人(年龄57±7)1个月治疗后脸型明显变小，颈后部皮下脂肪明显变薄和额面部皮下脂肪明显变薄无法捏起，表明c60油头面部皮下溶脂。注：以上结果由病人身边第三者客观判断和病人治疗前后照片比较获得。

表5.c60油涂抹和充分按摩颈后和额面部皮下溶脂的效果。

本研究预料预料之外的结果还有c60油治疗3个月后患有皮肤瘙痒病人88例(年龄58±6)中的72例病人(年龄58±7)的面部皮肤明显变白。注：此结果经病人身边第三者观察获得。

表6.c60油涂抹和充分按摩使额面部皮肤明显变白的效果。

本研究预料预料之外的结果还有c60油治疗3个月后患有皮肤瘙痒病人88例(年龄58±6)的血压脉压差增加(p<0.05)和心率加快(p<0.05)。这个结果提示c60油通过抑制人中性粒细胞移走和tnf-ɑ释放或其相关的移走抑制作用改善了人体组织血液循环和心脏传导。

表7.c60油涂抹和充分按摩3个月增加血压脉压差和加快心率的效果。

结论：(1)溶于葡萄籽油的c60治疗顽固性皮肤瘙痒；(2)溶于葡萄籽油的c60治疗结肠炎；(3)溶于葡萄籽油的c60皮肤涂抹和充分按摩促进头面颈部皮下溶脂；(4)溶于葡萄籽油的c60皮肤涂抹和充分按摩促进额面部皮肤美白；(5)溶于葡萄籽油的c60三个月皮肤涂抹和充分按摩促进血压脉压差增加和心率加快。这个结果提示c60油改善人体组织血液循环和心脏传导。

讨论：

本段以下列出的参考文献支持结肠炎与tnf-ɑ和中性粒细胞相关，适用于c60油治疗。

1.hassanc,zulloa,defrancescov,etal.tumornecrosisfactoralphainulcerativecolitisanddiverticulardiseaseassociatedcolitis[j].endocrine,metabolic&immunedisordersdrugtargets,2007,7(3):187-194.

2.kuehlaa,kakirmanh,janottam,etal.aggravationofdifferenttypesofexperimentalcolitisbydepletionoradhesionblockadeofneutrophils[j].gastroenterology,2007,133(6):1882-1892.

3.dinallov,marafinii,difuscod,etal.neutrophilextracellulartrapssustaininflammatorysignalsinulcerativecolitis[j].journalofcrohns&colitis,2019,13(6):772-784.

本段以下列出的参考文献支持头面部皮下溶脂与tnf-ɑ和中性粒细胞相关，适用于c60油治疗。

1.maurocr,ilonzog,nguyenbt,etal.attenuatedadiposopathyinperivascularadiposetissuecomparedwithsubcutaneoushumanadiposetissue[j].americanjournalofsurgery,2013,206(2):241-244.

2.rouaultc,pellegrinelliv,schilchr,etal.rolesofchemokineligand-2(cxcl2)andneutrophilsininfluencingendothelialcellfunctionandinflammationofhumanadiposetissue[j].endocrinology,2013,154(3):1069-1079.

3.raekallioj,viljantoj.regenerationofsubcutaneousconnectivetissueinchildren.ahistologicalstudywithapplicationofthecellsticdevice[j].journalofcutaneouspathology,1975,2(4):191-197.

4.hagmandk,larsoni,kuzmajn,etal.theshort-termandlong-termeffectsofbariatric/metabolicsurgeryonsubcutaneousadiposetissueinflammationinhumans[j].metabolism-clinicalandexperimental,2017,70:12-22.

本段以下列出的参考文献支持面部皮肤美白问题与tnf-ɑ和中性粒细胞相关，适用于c60油治疗。换句话说，皮肤炎症板块点影响皮肤美白，c60油抑制皮肤炎症。

1.marbledj,gordonkb,nickoloffbj.targetingtnfalpharapidlyreducesdensityofdendriticcellsandmacrophagesinpsoriaticplaqueswithrestorationofepidermalkeratinocytedifferentiation[j].journalofdermatologicalscience,2007,48(2):87-101.

2.wassermannhp.studiesonmelanin-labelledcellsinthehumanskinwindow[j].southafricanjournaloflaboratoryandclinicalmedicine.suid-afrikaansetydskrifvirlaboratorium-enkliniekwerk,1964,10:76-81.

值得注意的是以上临床研究结果表明c60油每天皮肤涂抹和充分按摩经皮肤快速进入体内，临床症状瘙痒最快1-5分钟开始缓解。c60油每天皮肤涂抹和充分按摩3个月治疗结肠炎。c60油每天皮肤涂抹和充分按摩1个月面部皮肤美白和面部溶脂。

本研究没有直接证据显示溶解于葡萄籽油中的c60进入细胞和体内的途径。文献研究表明溶解于橄榄油中c60直接进入细胞膜或被中性粒细胞吞噬带入血液循环或结合白蛋白在血液循环内流动(本段参考文献)。本研究还表明溶解于橄榄油中的c60直接通过培养液进入中性粒细胞产生作用，支持溶解于橄榄油中的c60通过血液进入体内组织产生作用(本段参考文献)。目前，我们不知道c60加入体内和细胞膜或细胞受体结合快速产生作用还是c60生产电信号快速干扰炎症性疼痛和瘙痒信号止痛止痒。总之，当前科学还没有能解释c60经皮肤进入体内并生产作用的神奇速度的报道。本研究通过上述人临床试用表明c60通过皮肤涂抹按摩给药的速度和效果神奇，建立了难以解释其机制的意外给药途径来快速缓解和治疗体表下深层疾病、深层内脏疾病和远离给药部位的疾病和问题。

本段参考文献：

1.juditsastre，ilariamannelli，ramonreigada,effectsoffullereneonlipidbilayersdisplayingdifferentliquidordering：acoarse-grainedmoleculardynamicsstudy,bba-generalsubjects1861(2017)2872-2882.

2.y.ha,l.e.katz,h.m.liljestrand,distributionoffullerenenanoparticlesbetweenwaterandsolidsupportedlipidmembranes:thermodynamicsandeffffectsofmembranecompositionondistribution,environ.sci.technol.49(2015)14546–14553.

3.a.ikeda,k.kiguchi,t.shigematsu,k.nobusawa,j.kikuchi,m.akiyama,location

of[60]fullereneincorporationinlipidmembranes,chem.commun.47(2011)12095–12097.

4.anthonydellinger，zhiguozhou，sarahk.norton，robertlenk，danielconrad，christopherl.kepley，phd,uptakeanddistributionoffullerenesinhumanmastcells，nanomedicine：nanotechnology，biology，andmedicine6(2010)575-582.

russka,elvatip,parsonagetl,dewsa,jarvisja,raym,schneiderb,smithpj,williamsonpt,violia,philbertma.c60fullerenelocalizationandmembraneinteractionsinraw264.7immortalizedmousemacrophages.nanoscale.2016；8(7):4134-44.https://doi.org/10.1039/c5nr07003a.注：russetal.(2016)suggestedthatc60fullerene’seffectonphagocytesignalingisachievedthroughendocytosis/pinocytosisaswellaspassivediffusionofthisnanostructure。

实施例3

目的：使用c60橄榄油舌下滴服治疗结肠炎。

方法：本研究采购美国c60橄榄油。本研究按美国lisabryant博士指导使用c60橄榄油舌下滴服。本研究治疗了蒙古国12例结肠炎病人。病人舌下滴服c60橄榄油，每次3ml(3mg/ml)，每日1-2次，共治疗3个月。

结果：

本实验预料之c60橄榄油治疗3个月后结肠炎病人12例(年龄50±4)的结肠炎症状和体征(腹部不适+大便次数>3次/日+便中有少量血)完全缓解。

表8.c60油舌下滴服治疗结肠炎的效果。

结论：本研究表明舌下滴服c60橄榄油3个月缓解结肠炎的症状和体征。

实施例4

目的：c60(carbon-60)治疗慢性肌腱损伤、肌肉肌筋膜疼痛和关节疼痛。

背景：本段以下列出的参考文献表明慢性肌腱损伤、肌肉肌筋膜疼痛和关节疼痛与tnf-ɑ和中性粒细胞相关，适用于c60治疗。

1.ernbergm,christidisn,ghafourib,etal.effectsof15weeksofresistanceexerciseonpro-inflammatorycytokinelevelsinthevastuslateralismuscleofpatientswithfibromyalgia[j].arthritisresearch&therapy,2016,18.

2.macintyredl,reidwd,lysterdm,etal.differenteffectsofstrenuouseccentricexerciseontheaccumulationofneutrophilsinmuscleinwomenandmen[j].europeanjournalofappliedphysiology,2000,81(1-2):47-53.

3.fredrikssonl,alstergrenp,kopps.tumornecrosisfactor-alphaintemporomandibularjointsynovialfluidpredictstreatmenteffectsonpainbyintra-articularglucocorticoidtreatment[j].mediatorsofinflammation,2006.

4.leemc,mccubbinja,christensenad,etal.g-csfreceptorblockadeamelioratesarthriticpainanddisease[j].journalofimmunology,2017,198(9):3565-3575.

5.medeiroslf,caumow,dussan-sarriaj,etal.effectofdeepintramuscularstimulationandtranscranialmagneticstimulationonneurophysiologicalbiomarkersinchronicmyofascialpainsyndrome[j].painmedicine,2016,17(1):122-135.

6.yoshidas,hagiwaray,tsuchiyam,etal.involvementofneutrophilsandinterleukin-18innociceptioninamousemodelofmusclepain[j].molecularpain,2018,14:10.

方法：

本研究使用溶于葡萄籽油的c60(以下称c60油)治疗患有慢性肌腱损伤(16例)、肌肉肌筋膜疼痛(16例)和关节疼痛(16例)的病人共48例(年龄52±8)，观察治疗当时(15分钟后)和治疗1天后疼痛缓解程度来替代活检患病部位tnf-ɑ和中性粒细胞增多的组织化学切片研究。溶于葡萄籽油的c60的具体使用方法为每次3ml(3mg/ml)疼痛点或附近或患处或附近皮肤大面积涂抹和充分按摩，每天2-3次。

结果：所有病人c60油治疗后，15分钟内疼痛开始缓解；2.所有病人c60油治疗1天内疼痛明显缓解，但没有完全消失；3.所有病人c60油在治疗7天后疼痛没有完全消失，但疼痛程度明显降低到可以忍受或达到注意不到的程度。

表9.c60油涂抹和充分按摩治疗慢性肌腱损伤、肌肉肌筋膜疼痛和关节疼痛的效果。

结论：溶解在葡萄籽油的c60对慢性肌腱损伤、肌肉肌筋膜疼痛和关节疼痛有止痛效果。

讨论：

值得注意的是以上临床研究结果表明溶解于葡萄籽油中的c60经皮肤涂抹和充分按摩快速进入皮肤到深层肌腱和关节，临床疼痛症状15分钟内开始缓解。本研究没有直接证据显示溶解于葡萄籽油中的c60进入细胞和体内的途径。文献研究表明溶解于橄榄油中c60直接进入细胞膜或被中性粒细胞吞噬带入血液循环或结合白蛋白在血液循环内流动(本段参考文献)。本研究还表明溶解于橄榄油中的c60直接通过培养液进入中性粒细胞产生作用，支持溶解于橄榄油中的c60通过血液进入体内组织产生作用(本段参考文献)。目前，我们不知道c60加入体内和细胞膜或细胞受体结合快速产生作用还是c60生产电信号快速干扰炎症性疼痛信号止痛。总之，我们当前还不能解释c60经皮肤进入深层体内组织并生产作用的神奇速度。本研究通过上述人临床试用表明c60通过皮肤涂抹按摩给药的速度和效果神奇，建立了难以解释其机制的意外给药途径来快速缓解和治疗体表下深层疾病、深层内脏疾病和远离给药部位的疾病。

本段参考文献：

1.juditsastre，ilariamannelli，ramonreigada,effectsoffullereneonlipidbilayersdisplayingdifferentliquidordering：acoarse-grainedmoleculardynamicsstudy,bba-generalsubjects1861(2017)2872-2882.

2.y.ha,l.e.katz,h.m.liljestrand,distributionoffullerenenanoparticlesbetweenwaterandsolidsupportedlipidmembranes:thermodynamicsandeffffectsofmembranecompositionondistribution,environ.sci.technol.49(2015)14546–14553.

3.a.ikeda,k.kiguchi,t.shigematsu,k.nobusawa,j.kikuchi,m.akiyama,location

of[60]fullereneincorporationinlipidmembranes,chem.commun.47(2011)12095–12097.

4.anthonydellinger，zhiguozhou，sarahk.norton，robertlenk，danielconrad，christopherl.kepley，phd,uptakeanddistributionoffullerenesinhumanmastcells，nanomedicine：nanotechnology，biology，andmedicine6(2010)575-582.

5.russka,elvatip,parsonagetl,dewsa,jarvisja,raym,schneiderb,smithpj,williamsonpt,violia,philbertma.c60fullerenelocalizationandmembraneinteractionsinraw264.7immortalizedmousemacrophages.nanoscale.2016；8(7):4134-44.https://doi.org/10.1039/c5nr07003a.注：russetal.(2016)suggestedthatc60fullerene’seffectonphagocytesignalingisachievedthroughendocytosis/pinocytosisaswellaspassivediffusionofthisnanostructure.

实施例5

目的2：carbon-60(c60)治疗蚊虫叮咬瘙痒。

背景：本段以下列出的参考文献表明蚊虫叮咬瘙痒与tnf-ɑ和中性粒细胞相关，适用于c60治疗。

本段参考文献：

1.bissonnetteey,rossignolpa,befusad.extractsofmosquitosalivaryglandinhibittumournecrosisfactoralphareleasefrommastcells[j].parasiteimmunology,1993,15(1):27-33.

2.wassermanha,singhs,champagnede.salivaoftheyellowfevermosquito,aedesaegypti,modulatesmurinelymphocytefunction[j].parasiteimmunology,2004,26(6-7):295-306.

3.demeurece,brahimik,hacinif,etal.anophelesmosquitobitesactivatecutaneousmastcellsleadingtoalocalinflammatoryresponseandlymphnodehyperplasia[j].journalofimmunology,2005,174(7):3932-3940.

方法：

本研究使用溶于葡萄籽油的c60(以下称c60油)治疗新鲜蚊虫叮咬瘙痒的正常人18例(年龄22±8)，观察治疗当时(1分钟内)瘙痒缓解程度来替代活检蚊虫叮咬瘙痒部位tnf-ɑ和中性粒细胞增多的组织化学切片研究。溶于葡萄籽油的c60的具体使用方法为每次1ml(3mg/ml)蚊虫叮咬瘙痒部位皮肤涂抹和充分按摩。

结果：

c60油治疗1分钟后所有受试者开始缓解新鲜蚊虫叮咬引发的瘙痒。c60油治疗10分钟后所有受试者完全终止新鲜蚊虫叮咬引发的瘙痒。c60油治疗10分钟后所有受试者新鲜蚊虫叮咬引发的皮肤红肿硬均减轻。

表10.c60油涂抹和充分按摩治疗慢性肌腱损伤、肌肉肌筋膜疼痛和关节疼痛的效果。

结论：c60油有效治疗新鲜蚊虫叮咬引发的瘙痒。

实施例6

目的：使用c60c(arbon-60)肛门涂抹给药方法治疗痔疮。

背景：本段以下列出的参考文献表明痔疮与tnf-ɑ和中性粒细胞相关，适用于c60治疗。

1.娄鑫,白明,田硕,魏湘萍,苗明三.生姜外用对大、小鼠痔疮模型的影响[j].中国实验方剂学杂志,2019,25(04):23-28.

2.buyukkocaku,caglayano,daphanc,etal.similareffectsofgeneralandspinalanaesthesiaonperioperativestressresponseinpatientsundergoinghaemorrhoidectomy[j].mediatorsofinflammation,2006:5.

3.cais,xiz,wangh,etal.clinicalefficacyofcefazolinandcefuroximeforpreventingwoundinfectionsaftergastrointestinalandhemorrhoidssurgeries[j].chinesejournalofnosocomiology,2016,26(7):1590-1592.

方法：

本研究使用溶于葡萄籽油的c60凡士林软膏(以下称c60油软膏)治疗痔疮病人28例(年龄42±12)，观察治疗后痔疮症状和体征(肛门不适瘙痒和大便带血)的缓解程度来替代活检痔疮部位tnf-ɑ和中性粒细胞增多的组织化学切片研究。c60油软膏的具体使用方法为每次2ml(3mg/ml)痔疮部位皮肤粘膜涂抹和按摩，每天2次，共治疗3天。

结果：

c60油软膏治疗后5分钟开始缓解痔疮的肛门不适和瘙痒。c60软膏治疗1天后大部分病人的肛门不适和瘙痒消失。c60软膏治疗3天后所有病人的大便带血现象消失。

表11.c60油软膏肛门涂抹按摩缓解痔疮的症状和体征的效果。

结论：使用carbon-60(c60)肛门涂抹按摩缓解痔疮的肛门不适瘙痒和根除大便带血现象。

实施例7

目的：c60(carbon-60)治疗头部(皮)神经痛(又称后头部神经痛)和带状疱疹引发的疼痛。

背景：头部(皮)神经痛(又称后头部神经痛)英文是occipitalneuralgiaorscalpneuralgia.带状疱疹引发的疼痛英文是postherpeticneuralgiacausedbyshinglesorherpes。头部(皮)神经痛(又称后头部神经痛)的特点是刺痛,调痛，电击痛那样的慢性疼痛，主要发生在上颈部,头后部，耳后部，一般在头的一侧。头部(皮)神经痛的疼痛范围与greaterandlesseroccipitalnerves神经分布一致，可以被受凉、受风、感冒、陈旧创伤、神经压迫、炎症和糖尿病等原因引起。局麻药品和皮质激素分别可以阻断和缓解头部(皮)神经痛。另外一种神经痛neuralgia是带状疱疹引发的皮肤神经疼痛(postherpeticneuralgiacausedbyshinglesorherpes)。

方法：

本研究使用溶于葡萄籽油的c60凡士林软膏(以下称c60油软膏)治疗有头部(皮)神经痛(又称后头部神经痛)和带状疱疹引发的疼痛的病人各16例)，观察治疗当时(3分钟后)和治疗8小时后疼痛缓解(既受试者自己明显感觉疼痛基本消失)程度。具体使用方法为根据疼痛面积一次涂抹和充分按摩2-6ml(3mg/ml)的c60油软膏的于疼痛点或患处皮肤。对照组为有不做治疗的头部(皮)神经痛(又称后头部神经痛)和带状疱疹引发的疼痛的病人各16例。

结果：(1)所有病人c60油软膏治疗3分钟后疼痛开始缓解或开始止痛；(2)14/16例头部(皮)神经痛的病人c60油软膏治疗8小时仍缓解疼痛或止痛；(3)9/16例带状疱疹引发的疼痛的病人c60油软膏治疗8小时仍缓解疼痛；(4)对照不做治疗的16例头部(皮)神经痛(又称后头部神经痛)和对照不做治疗的16例带状疱疹引发的疼痛的病人c60油软膏治疗3分钟和8小时后疼痛没有缓解；(5)其中1例61岁男性患有头部(皮)神经痛的病人还患有糖尿病和高血压，每天使用6ml(3mg/ml)的c60油软膏3天后发现血压和血糖均升高和停药3天后恢复(治疗前空腹血糖7.4±0.8mm，治疗后空腹血糖8.6±0.6mm/l，停用c60油软膏3天后空腹血糖7.5±0.4mm；治疗前舒张压86±4mmhg，治疗后舒张压96±2mmhg，停用c60油软膏3天后舒张压85±5mmhg)。

表12.carbon-60(c60)治疗头部(皮)神经痛和带状疱疹引发的疼痛的效果。

结论：(1)一次性c60油软膏患处皮肤涂抹和充分按摩快速缓解头部(皮)神经痛(又称后头部神经痛)和带状疱疹引发的疼痛，并且大部分(14/16和9/16)持续缓解8小时；(2)c60油软膏患处皮肤涂抹和充分按摩对糖尿病和高血压患者可能有升高血糖和血压的副作用。

讨论：

值得注意的是以上临床研究结果表明c60油软膏中的c60经皮肤涂抹和充分按摩快速进入皮肤，临床疼痛症状3分钟内开始缓解。本研究没有直接证据显示c60油软膏中的c60进入皮肤的途径。文献研究表明c60油软膏中的c60直接进入细胞膜或被中性粒细胞吞噬带入血液循环或结合白蛋白在血液循环内流动(本段参考文献)。目前，我们不知道c60油软膏中的c60进入体内和细胞膜或细胞受体结合快速产生作用还是c60生产电信号快速干扰炎症性疼痛信号止痛。总之，我们当前还不能解释c60经皮肤进入深层体内组织并生产作用的神奇速度。本研究通过上述人临床试用表明c60通过皮肤涂抹按摩给药的速度和效果神奇，建立了难以解释其机制的意外给药途径来快速缓解和治疗体表下深层疾病、深层内脏疾病和远离给药部位的疾病。

本段参考文献：

1.juditsastre，ilariamannelli，ramonreigada,effectsoffullereneonlipidbilayersdisplayingdifferentliquidordering：acoarse-grainedmoleculardynamicsstudy,bba-generalsubjects1861(2017)2872-2882.

2.y.ha,l.e.katz,h.m.liljestrand,distributionoffullerenenanoparticlesbetweenwaterandsolidsupportedlipidmembranes:thermodynamicsandeffffectsofmembranecompositionondistribution,environ.sci.technol.49(2015)14546–14553.

3.a.ikeda,k.kiguchi,t.shigematsu,k.nobusawa,j.kikuchi,m.akiyama,location

of[60]fullereneincorporationinlipidmembranes,chem.commun.47(2011)12095–12097.

4.anthonydellinger，zhiguozhou，sarahk.norton，robertlenk，danielconrad，christopherl.kepley，phd,uptakeanddistributionoffullerenesinhumanmastcells，nanomedicine：nanotechnology，biology，andmedicine6(2010)575-582.

russka,elvatip,parsonagetl,dewsa,jarvisja,raym,schneiderb,smithpj,williamsonpt,violia,philbertma.c60fullerenelocalizationandmembraneinteractionsinraw264.7immortalizedmousemacrophages.nanoscale.2016；8(7):4134-44.https://doi.org/10.1039/c5nr07003a.注：russetal.(2016)suggestedthatc60fullerene’seffectonphagocytesignalingisachievedthroughendocytosis/pinocytosisaswellaspassivediffusionofthisnanostructure.

实施例8

目的：研究c60(carbon-60)治疗外耳道瘙痒和减少耳垢产生的效果。

方法：本实施例采用自身对照+对照组的方法研究c60治疗人外耳道痒(itchinginearcanals)和减少耳垢(earwax)产生的效果。本实施例将24例有耳垢产生多和外耳道瘙痒的受试者分为2组，既c60油组(男6名，女6名，平均年龄52±5岁)和葡萄籽油组(男6名，女6名，平均年龄54±4岁)。受试者先使用棉签清除各组受试者的耳垢(一种淡黄色黏稠的分泌物)，然后将c60油使用棉签沾溶于葡萄籽油的c60(以下称c60油)或葡萄籽油涂抹外耳道深部每天治疗一次，连续治疗5天(以下称治疗)，记录涂抹后3分钟、24小时，7天和14天记录受试者外耳道瘙痒和使用小耳勺检查的耳垢产生情况。

结果：

表13.c60油和葡萄籽油治疗后受试者外耳道深部瘙痒和使用小耳勺检查的耳垢产生情况。

结论：1.c60油治疗外耳道痒有效，并减少耳垢产生；2.葡萄籽油涂抹治疗外耳道瘙痒无效，没有减少耳垢产生。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。