一种基于网络药理学分析马钱子活性成分镇痛作用的方法与流程

本发明涉及中药网络药理学分析技术领域，具体涉及一种基于网络药理学分析马钱子活性成分镇痛作用的方法。

背景技术：

中医学将病人当作一个具有不同状态的系统来进行治疗，具有悠久的历史，积累了大量的方剂。中医学的整体观念与网络药理学、网络生物学等前沿科技的核心思想具有相通之处，也符合了对肿瘤等复杂疾病进行系统性治疗的需求。“中药网络药理学”这一新领域的研究旨在从系统层次和分子水平揭示中药方剂的奥秘，促进中药研究从当前的“单一靶标，单一药物”模式转向“网络靶标，多成分药物”的新模式。近年来，中药网络药理学的一系列方法得以创建，包括基于网络的疾病基因预测、中药成分的靶标谱和药理活性预测、药物-基因-疾病的共模块分析、中药方剂多成分协同作用的大规模筛选、中药方剂的配伍规律和网络调节机理分析等。中药网络药理学能够为中医学从基于经验的医学迈向基于证据的医学提供新的途径，并能加速中药药物发现的进程，同时改进当前的药物研究策略。

马钱子为马钱科马钱属植物马钱子(strychnosnux-vomical.)的干燥成熟种子，味苦性温，大毒，归肝、脾经，具有通络止痛、散结消肿作用^[1]。马钱子碱是马钱子主要活性成分，它主要作用于外周和中枢神经，对急性和炎性疼痛效果显著。马钱子碱是马钱子镇痛作用的主要药效成分，同时也是毒性成分，治疗剂量接近致死剂量，目前临床上尚未应用其单一制剂。马钱子复方制剂虽然在临床上已广泛用于疼痛治疗，但也存在作用机制不清楚、反应慢、有毒副反应等问题，使用受到限制。因此，加大对马钱子镇痛作用的研究和分析可为马钱子碱镇痛药物的开发提供重要的指导和依据。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种基于网络药理学分析马钱子活性成分镇痛作用的方法，将复杂网络分析技术和大数据技术有效的结合起来，分析、计算出马钱子活性成分的潜在作用靶点，解决了目前马钱子研究周期长、缺乏系统性、研究目标单一等问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种基于网络药理学分析马钱子活性成分镇痛作用的方法，包括以下步骤：

s1、获取马钱子的化学成分与成分作用靶点：

以马钱子为关键词，利用batman-tcm数据库检索马钱子现有活性化合物及其靶向基因，根据研究目标，设定筛选标准，获得符合条件的马钱子活性化合物及其靶向基因；

s2、识别疾病作用靶点：

利用disgenet数据库获得与疼痛相关的虚拟目标靶标基因，然后与s1获得符合条件的马钱子活性化合物的靶向基因进行交集，所得的交集基因即为药物-疾病交集靶基因；

s3、构建马钱子与疾病网络，以及筛选核心节点：

将s1获得符合条件的马钱子活性化合物及其靶向基因、s2得到的药物-疾病交集靶基因输入cytoscape3.6.1软件中，利用cytoscape3.6.1软件建立马钱子镇痛“成分-靶点-疾病”网络图，同时计算网络图中的所有节点，确定节点筛选条件，选取核心节点进行后续分析；

s4、对核心节点进行富集分析而解析马钱子镇痛作用机制：

利用david生物分子功能注释系统，对核心节点进行go富集和kegg通路注释分析，预测靶点功能分布，并根据富集因子分析核心通路富集程度，解析马钱子镇痛作用机制。

所述的方法，s1中，所述的筛选标准为，阈值：scorecutoff>20、p<0.05。

所述的方法，s3中，通过cytoscape软件计算网络图中所有节点的拓扑参数，选取degree，betweenness，closeness参数作为核心节点的筛选条件，选取核心节点进行后续分析。

本发明具有以下有益效果：

本发明结合国内外权威的医学数据库，将马钱子研究方法系统化、流程化、规范化。本发明还降低了马钱子分析研究的成本，扩展了计算机网络先进技术在医疗领域的应用。本发明旨在建立全新的网络药理学研究方法，对马钱子及其其他中药的研究突破具有特别意义，为支撑和引领我国创新药物的研发与产业化提供基础。

本发明利用网络药理学技术分析马钱子镇痛有效活性成分、潜在靶点及通路，分析其具有“多成分-多靶点-多通路”镇痛作用及机制。利用batman-tcm分析平台获取马钱子活性成分及其潜在作用靶点；通过disgenet数据库获取与疼痛相关的虚拟目标靶标基因，交互处理得到马钱子镇痛作用关键靶点；采用cytoscape3.6.1构建马钱子关于镇痛的“成分-靶点-疾病”网络图，以呈现马钱子如何通过“多靶点、多途径、多层次”整合调控发挥药效。利用david(version6.8)对获取的马钱子镇痛靶点信息进行go富集和kegg通路注释分析；结果：马钱子中22个成分是通过chrm2、chrna7、htr2a、htr2c等26个与疼痛相关靶点，调控钙与cgmp-pkg信号通路等25条信号通路发挥镇痛作用。因此，本发明方法为阐释马钱子发挥镇痛作用的分子机制提供新思路，为进一步研发马钱子镇痛创新制剂奠定基础。

附图说明

图1为马钱子活性成分化合物-靶点蛋白网络关系图。其中：三角形代表化合物，椭圆形为靶点蛋白。

图2为马钱子“成分-靶点-(疾病)通路”网络图。

图3目标成分go富集分析-生物学过程。

图4目标成分go富集分析-细胞组分。

图5目标成分go富集分析-分子功能。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

一、基于网络药理学分析马钱子活性成分镇痛作用的方法

包括以下步骤：

s1、获取马钱子的化学成分与成分作用靶点：

以“马钱子”为关键词(如马钱子，英文为maqianzi)，使用网络爬虫技术，转发用户的查询请求到batman-tcm(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php/home/index/index)数据库中，从batman-tcm数据库检索到马钱子现有活性化合物及其靶向基因列表(基于化合物的结构对化合物与药物靶点之间可能的相互作用进行预测和分析，得到一个打分值，我们根据打分值的高低对潜在的靶点继续排序，选取一定数量的靶点进行后续研究)，用户选择需要分析的靶向基因列表，并为其设置相应的阈值，根据阈值(scorecutoff)>20、p<0.05(根据相应结果可调整)为筛选标准，获得符合条件的马钱子活性化合物及其靶向基因，形成相应的基因表并保存；

s2、识别疾病作用靶点：

使用网络爬虫技术，利用disgenet(http://www.disgenet.org/)数据库获得与疼痛相关的虚拟目标靶标基因，并根据此基因，与s1获得符合条件的马钱子活性化合物的靶向基因进行交集，所得的交集基因即为药物-疾病交集靶基因。

s3、构建马钱子与疾病网络，以及筛选核心节点：

将s1获得符合条件的马钱子活性化合物及其靶向基因、s2得到的药物-疾病交集靶基因输入cytoscape3.6.1软件中，利用cytoscape3.6.1软件建立马钱子镇痛“成分-靶点-疾病”网络图，网络是一种使复杂关系可视化的工具，目前我们已经知道了化合物与靶点之间关系，靶点与靶点之间的关系，就可以建立它们之间的关系网络。同时通过cytoscape软件计算网络图中的所有节点的拓扑参数，确定节点筛选条件：选取degree，betweenness，closeness等参数作为核心节点的筛选条件，选取一定数量的核心节点(即马钱子镇痛靶点信息)进行后续分析；

s4、对核心节点进行富集分析而解析马钱子镇痛作用机制：

利用david(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)生物分子功能注释系统，对核心节点(即马钱子镇痛靶点信息)进行go富集和kegg通路注释分析，预测靶点功能分布，并根据富集因子分析核心通路富集程度，解析马钱子镇痛作用机制。

功能富集分析是将基因或者靶点蛋白按照其功能来分类的，即将相似功能的基因放到一起，然后和生物学表型关联起来。go注释分为三大类：分子生物学功能(molecularfunction，mf)、生物学过程(biologicalprocess，bp)和细胞学组分(cellularcomponents，cc)，通过这三个功能大类，对一个基因的功能进行多方面的限定和描述。kegg是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的综合数据库。kegg下属keggpathway，专门存储不同物种中基因通路的信息。利用david生物分子功能注释系统获取马钱子镇痛靶点信息进行go富集和kegg通路注释分析，所述富集分析模块，用于根据区间划分模块中，得到的模块基因关系表，使用拓扑分析算法，对各个模块进行go富集分析和kegg富集分析，得到go和kegg分析的结果；包括模块列表和模块中的基因列表。根据中药成分作用靶点调节的生物过程及与疾病相关靶点的相互作用，解析中药的作用机制。

二、结果

2.1马钱子主要活性成分及潜在靶点信息

将batman-tcm分析的马钱子活性成分潜在靶点与disgenet数据库中搜集的相关靶点比对，筛选出22个活性成分、26个可能与马钱子治疗疼痛相关联靶点，结果见表1。

表1马钱子活性成分靶点数

tab.1targetnumbersformaqianziactiveingredients

如表1所示，马钱子主要活性成分包括：α-香树脂醇、葫芦酸、马钱子碱氮氧化物、normacusineb、异水蓼二醛、安息香碱、vomifoliol、mavacurine、lokundjoside、士的宁氮氧化物、2-羟甲基蒽醌、原藜芦碱a、伪莨菪醇、伪番木瓜碱、秋水仙素、去甲毛木防己碱、-5’-甲氧基异丙树脂醇、maytanbutacine、16-β-羟基-19s-vindolinine氮-氧化物、马钱子碱、β-colubrine、原番木鳖碱。图1呈现了马钱子活性成分化合物-靶点蛋白网络关系图。基于上述靶点对比筛选出的各靶点来源化合物数量发现，毒蕈碱型胆碱受体m2(chrm2)、烟碱型乙酰胆碱受体α7(chrna7)、5-羟色胺2a受体(htr2a)和5-羟色胺2c受体(htr2c)是马钱子22个活性成分中主要潜在作用靶点，而α-香树脂醇(α-amyrin)对应潜在靶点最多，达到53个。具体见表2。

表2马钱子活性成分部分靶点信息

tab.2partoftargetinformationformaqianziactiveingredients

2.2马钱子成分-靶点-疾病网络构建与分析

分析实验数据后构建马钱子“成分-靶点-信号通路”网络图，见图2，它由45个“节点”(13个成分，26个靶点及6种与疼痛有关疾病)和74条“边”构成：内环的6个椭圆分别为6种与疼痛有关疾病的标识，中间环的26个椭圆分别为26个靶点的标识，外环的13个三角形分别为13个成分的标识。“边”代表三者间相互作用。结果显示毒蕈碱型胆碱受体m2(chrm2)、烟碱型乙酰胆碱受体α7(chrna7)、5-羟色胺2a受体(htr2a)和5-羟色胺2c受体(htr2c)4个靶点的网络节点度排位靠前，为网络枢纽节点，表明其是马钱子镇痛的核心作用靶点(核心节点)。每种活性成分对应多个靶点，每个靶点又联系多种成分，体现了马钱子多成分、多靶点镇痛作用机理，同时通路间又通过共有靶点连接且非独立，进一步说明通路间是协同发挥相互作用。

2.3生物功能与通路分析

2.3.1go富集分析

将batman-tcm所得马钱子活性成分镇痛靶点以david进行go富集分析，获取生物学过程(biologicalprocess)、细胞组分(cellularcomponent)和分子功能(molecularfunction)富集结果，结果见图3-5。

由图3提示可知，生物学过程中的转运(transport)、信号转导(signaltransduction)和小分子代谢过程(smallmoleculemetabolicprocess)作用突出。

由图4提示可知，细胞组分中细胞(cell)和细胞质(cytoplasm)较重要。

由图5提示可知，分子功能中信号传感器活动(signaltransduceractivity)和跨膜转运(transmembranetransporteractivity)功效显著。

2.3.2kegg通路注释分析

kegg通路注释分析提示共25条相关信息通路与目标成分预测靶点有关。其中10条相关信息通路频率较高，分为7类：信号转导(signaltransduction)相关通路有2条：钙信号通路(calciumsignalingpathway)和cgmp-pkg信号通路(cgmp-pkgsignalingpathway)；与信号分子与相互作用(signalingmoleculesandinteraction)相关的通路有1条：神经活性配体-受体相互作用(neuroactiveligand-receptorinteraction)；与生物系统相关通路有5条：心肌收缩(cardiacmusclecontraction)、心肌细胞肾上腺素能信号转导(adrenergicsignalingincardiomyocytes)、胆汁分泌(bilesecretion)、胆碱能突触(cholinergicsynapse)和5-羟色胺能突触(serotonergicsynapse)；与生物成分代谢相关通路有2条：氧化磷酸化(oxidativephosphorylation)和视黄醇代谢(retinolmetabolism)。具体分析结果见表3。

表3目标成分相关通路的分类及信息

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综上所述，基于网络药理学分析马钱子活性成分镇痛作用的方法选出马钱子22个活性成分及26个可能与马钱子治疗疼痛相关联靶点，结果表明α-香树脂醇、葫芦酸、马钱子碱氮氧化物、士的宁氮氧化物、2-羟甲基蒽醌、原藜芦碱a、伪莨菪醇、伪番木瓜碱、秋水仙素、去甲毛木防己碱、马钱子碱、原番木鳖碱等是马钱子的主要活性成分。

马钱子生物碱为其主要镇痛成分，生物碱中含量较高的是士的宁和马钱子碱，二者含量占马钱子总生物碱80～90％，相较士的宁，马钱子碱毒性小而活性强。因此，马钱子碱镇痛效果明显优于吗啡，其主要通过中枢和外周两个途径，而非直接激动阿片受体增加大脑中枢神经递质分泌，抑制大脑皮层痛觉表达，它还作用于肾上腺素能受体等通路，麻痹感觉神经末梢，增加大脑功能区脑啡肽的含量、提高痛阈值及5-羟色胺致炎后镇痛率。马钱子碱与其氮氧化物具较强抗炎作用，能抑制外周炎症组织pge及大鼠血浆5-ht、炎症介质(致痛介质)释放，以降低感觉神经末梢对痛觉敏感性，减少敏痛因子对感觉神经末梢的刺激性，缓解疼痛。

“活性成分-靶点”网络分析结果显示：烟碱型乙酰胆碱受体(chrna4、chrna5、chrna7、chrna9、chrna10、chrnb2)、5-羟色胺受体(htr2a、htr2c、htr1b、htr1d、htr2b、htr1f、htr7)、前列腺素受体(ptgir、ptgfr、ptger1)以及毒蕈碱型胆碱受体(chrm2、chrm4)等是马钱子22个活性成分中主要潜在作用靶点，而α-香树脂醇(α-amyrin)对应潜在靶点最多，达到53个。结合以往分析经验得出，α-香树脂醇是马钱子发挥镇痛作用的另一重要成分。

烟碱型乙酰胆碱受体(nachr)是一种配体门控的离子通道蛋白，介导突触间信号快速传递，有报道^[16]nachr参与痛觉调制，其激活后可产生抗伤害效应。结合以往经验，烟碱受体激动剂对急性和慢性组织损伤均有镇痛作用，但对慢性疼痛药理效应更强。毒蕈碱型胆碱受体(machrs)激动剂也具有镇痛作用，亚型多为m2和m4受体的选择性结合物。5-羟色胺(5-ht)受体广泛分布于中枢和外周神经系统，正常生理状态下，易化和抑制通路保持平衡，病理状态下两种功能平衡被打破可导致痛觉感受和痛觉行为发生改变。因此，可以得出未来针对马钱子镇痛相关药理作用机制实验研究，可从chrm2、chrna7、htr2a和htr2c等26个潜在靶点着手。

通过网络药理学研究获得马钱子镇痛相关通路，包括：钙信号通路和cgmp-pkg信号通路。ca²⁺作为细胞内第二信使参与许多生理、生化反应，作用机制复杂。ca²⁺信号通路能激活trp通路，临床使用ca²⁺拮抗剂能有效缓解疼痛。no参与外周及中枢水平痛觉调节，机体受伤害性刺激后，初级传入释放兴奋性氨基酸促进ca²⁺内流。细胞内流的ca²⁺与钙调蛋白偶联共同作用于nos，产生no。no通过扩散作用于邻近细胞或直接作用所在细胞，结合到胞浆可溶型sgc血红素模体上，酶发生变构效应被激活，gtp转化为cgmp，进而激活cgmp依赖的pkg，使海马伤害感受性神经元兴奋，把伤害性信息进一步传向脑中枢。虽然钙信号通路和cgmp-pkg信号通路是药物镇痛重要信号通路，但目前对马钱子镇痛作用机制的研究仍未涉及它们，因此，基于本发明方法提示，其可作为马钱子镇痛的潜在通路深入探究。本发明结果显示马钱子“多成分-多靶点-多通路”镇痛作用特点，可为下一步明确马钱子活性成分的镇痛作用靶点及机制验证研究提供科学依据和研究基础。

以上实施例对本发明的产品及方法进行了详细介绍，本文中应用了具体例对本发明的主要步骤及实施方式进行了阐述，上述实施例只是帮助理解本发明的方法及核心原理。对于本领域的技术人员，依据本发明的核心原理，在具体实施中会对各条件和参数根据需要而变动，综上所述，本说明书不应理解为对本发明的限制。