制备复杂器官的专用组合模具及其制备肝脏前体的方法与流程

本发明属于器官制造领域，涉及一种含多通道肝组织复杂三维结构人工制造技术，特别涉及一种采用仿生学方法制备肝小叶结构的组合模具，及利用合成高分子材料、细胞基质材料等制备复杂组织器官的工艺方法，超出了目前组织工程技术领域。

背景技术：

肝脏在人体中有着重要地位，具有人体存活所必须的多种重要的功能。肝脏不仅可以解毒，也能分泌胆汁参与消化活动，还能储存肝糖和进行物质代谢活动。肝功能衰竭会严重的影响人类的健康，甚至危及生命。肝脏移植是治疗晚期肝病的较好的办法，但是存在许多问题，如肝脏移植的供体缺乏，费用高昂，术后需要长期使用免疫抑制剂造成抵抗力下降等。为了解决这种终末期器官损伤类疾病的问题，组织工程应运而生，并迅速成为了国内外研究的热点。组织工程（tissueengineering），是由美国国家科学基金会在1987年正式提出和确立的，是一门以细胞生物学、材料科学和工程学相结合，进行体外或体内构建具有和天然组织类似结构和功能的用于修复人体病损的组织、甚至器官的新兴学科。

近年来，组织工程已迅速扩展到许多领域。主要在结构相对简单的骨和皮肤等少数几个领域取得了一些成就，而对一些复杂器官的研究迟迟难以取得突破。以人工肝脏组织制造为例，肝脏中存在有大量丰富的血管、胆管等管状网络。血管网络为组成肝脏的各部分组织细胞提供氧气和营养的同时将代谢废物排出体外，保证各种生理功能正常运行。研究表明，肝细胞在毛细血管周围100～200μm的范围内才容易存活，否则很快会因缺血而死亡，缺乏足够精细的血管网络将很难实现体积较大的组织的构建。胆管结构可使肝脏制造出的胆汁通过其流出肝脏，进入消化系统之中。如果不能在人工肝组织中很好地实现这些管状网络的构建，那么制造出的肝脏产品可能会不能维持肝脏正常的组织结构，也可能不会顺利地实现肝脏功能。目前，血管、胆管网络的构建已成为生物型人工肝脏制造领域的主要研究热点。其中在肝脏制造过程中，常用的构建血管的方法主要有使用相应的生长因子缓慢促进血管不同组织层形成，多细胞联合培养形成血管结构，利用生物反应器和微流体通道等技术形成血管以及基于先进成型技术的血管化组织直接构建等。

发明专利（申请号为201110448154.3）《基于一种组合模具的复杂器官前体的制备方法》中提供了一种多分支及多层结构的复杂组织器官前体的制备方法，利用组合模具分层灌注来形成含有多分支结构的复杂器官组织前体。该发明的缺点在于采用直接拆模的方式，在脱模时实心多分支内模具由于其形状不规则会破坏已经成型的细胞基质层，该制备方法对模具内部形状及粗糙度要求较高。同时由于交联剂或聚合剂与高分子溶液材料接触面过少，会容易影响交联或聚合效果，继而影响细胞基质层的成形效果。

发明专利（申请号为201210324600.4）《利用旋转组合模具制备纺锤状复杂器官前体的方法》中提出了一种利用旋转组合模具制备纺锤体状的复杂器官前体的方法。理论上可以通过模具的旋转形成带多分支管状通路的纺锤体状的复杂器官，但缺点在于模具的旋转速度不同，纺锤体成型高度就不同，对于不同组合模具，其旋转速度难以进行定量限制，所以难以确定纺锤体的具体成型形状。这种组合模具目前只用于含一组分支通道的纺锤体状器官前体的成形，且在拔除内模具时易造成含细胞基质材料结构的破坏。

发明专利（申请号为201510419730.x）《一种制备带多分支通道的组织器官前体的方法及专用模具》中提出了一种制备带多分支通道的组织器官前体的专用模具，其缺点在于中间操作步骤复杂，大小管道间易错位。粘稠度稍高的水凝胶溶液很难充满整个内腔，分支内模具不可拆卸，从细胞基质层中取出时会对已成形的结构造成破坏。

发明专利（申请号为201910682212.5）《可拆卸式专用模具及制备多分支通道复杂器官前体的方法》中提出了一种制备多分支通道的复杂器官前体的专用模具以及方法。该专用模具内部分支模具可拆卸的，从细胞基质层取出时不会对已成形的结构造成破坏。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种仿肝小叶结构的可拆卸式组合模具及采用该专业模具制备带多通道复杂肝脏器官前体的方法。利用仿生学原理模仿肝小叶结构并设计多级外模具，可以得到具有中间大通道和周围许多小通道的具有不同细胞基质层的肝组织结构。有望实现带有多通道的血管、胆管化复杂肝脏前体的体外快速制造。

本发明的技术方案如下。

一种用于制备复杂器官的专用组合模具，其特征在于：所述专用组合模具包括底座模具、中间支架模具、多个通道模具和至少一级的外模具；所述底座模具底面为平面、凹面或者凸面，中间有可以固定中间支架模具的孔，并采用多层台阶形状，阶梯数和外模具级数相同；中间支架模具上有多个对应通道模具的安装孔，长度高于外模具的长度，便于拆卸；通道模具的尺寸和数目与中间支架上对应的安装孔的尺寸和数目相同；外模具的外围尺寸和底座模具对应的阶梯的尺寸完全相同，下一级外模具的内腔和上一级外模具的内腔平滑过渡，且外模具的内腔具有和预设组织器官相同的轮廓。

所述的一种用于制备复杂器官的专用组合模具，其特征在于：所述的专用组合模具采用仿生学方法模仿肝小叶的结构，可固定在底座模具中心的中间支架模具可模仿肝小叶中间的静脉血管，多个通道模具可模仿围绕中间静脉血管的小血管和小胆管结构。

所述的一种用于制备复杂器官的专用组合模具，其特征在于：所述的底座模具，中间支架模具，通道模具和外模具的材料为无生物毒性的合成高分子材料（如合成纤维、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、光敏树枝或聚氨酯等）或者金属材料。

所述的一种用于制备复杂肝器官的专用组合模具，其特征在于：通道模具的直径范围在0.1mm～5mm；中间支架模具的直径根据通道模具直径的变化进行调整；底座模具的台阶从中间向两边逐级升高，台阶的级数为1～20；底座模具外形及各级台阶截面为圆型、椭圆型。

所述的一种专用组合模具制备肝脏前体的方法，其特征在于该方法包括如下步骤。

（1）提取或购买动物或人细胞制成细胞悬浮液，细胞悬浮液密度为1×10³～5×10⁷个/ml，制备质量百分浓度为1％～30％的天然高分子水凝胶溶液作为基质溶液，将基质溶液与细胞悬浮液按体积比1～9：9～1混合制成含细胞的基质溶液，可通过改变选择的细胞类型和基质溶液类型得到多种含有一种（或多种不同）细胞的基质溶液，将合成高分子材料溶于有机溶剂中制成质量百分浓度为1％～30％的合成高分子溶液。

（2）在所有的通道模具上涂覆一层含细胞（如内皮细胞，胆管上皮细胞等）的基质溶液，采用使用物理、化学交联或聚合等方法进行交联得到一层管状细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。

（3）将专用模具的各个组成部分进行组装：将（2）中已经进行交联处理的通道模具固定在中间支架模具上对应的凹槽内，再将中央支架模具固定在底座模具的中央凹槽内。将内环外模具安装到底模具的内侧阶梯上，将一种含有细胞（如肝细胞）的基质溶液通过顶部加料口加到模具内腔中使基质溶液充分填满整个内腔。使用物理、化学交联或聚合等方法制成第一层细胞基质层。

（4）去除内环外模具，用镊子拔出所有安装的通道模具，将较大的中环外模具安装到底模具的相应阶梯上，通过顶部加料口向中环内模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入第二种含有细胞的基质溶液，并进行交联，制成第二层细胞基质层。

（5）去除中环外模具，安装外环外模具到底模具相应阶梯上，重复步骤（4）的加料步骤制备出第三层细胞基质层。

（6）将外环外模具和中间支架模具去除，取出已形成的带有中央大通道和周围多个小通道的细胞基质层，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，获得相对完整的多通道肝器官前体。

（7）在得到的肝脏前体的外部涂覆一层合成高分子溶液,然后用细胞培养液或pbs萃取合成高分子溶液中的溶剂，形成外层合成高分子材料层,增加肝组织前体的机械强度。

所述的一种专用组合模具制备肝脏前体的方法，其特征在于：水凝胶溶液一般可采用胶原蛋白、琼脂糖、纤维蛋白原、海藻酸钠、丝素蛋白、明胶、透明质酸、壳聚糖、粘连蛋白、凝血酶、聚乙二醇、普朗尼克等材料中的一种或者几种，以多种材料相互混合得到的水凝胶溶液效果较佳。

所述的一种组合模具制备肝脏前体的方法，其特征在于：用于制备合成高分子溶液的合成高分子材料采用聚乳酸、聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚羟基酸酯、聚己内酯、聚乙二醇和乳酸与乙醇酸共聚物中的一种或几种材料的复合物，用于溶解合成高分子材料的有机溶剂采用异丙醇、1，4-二氧六环、乙二醇或四乙二醇；用于溶解所述天然高分子材料的溶剂采用水、pbs溶液、生理盐水、3－羟甲基氨基甲烷盐酸溶液、ph＝6～8的0.09m氯化钠或细胞培养液。

所述的一种组合模具制备肝脏前体的方法，其特征在于：可以成型多层含有不同细胞的细胞基质层，完成多种细胞组织的组装。

所述的一种组合模具制备肝脏前体的方法，其特征在于：在细胞基质溶液中可加入内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肝细胞生长因子等细胞生长因子中的一种或几种，以及肝素、紫杉醇或硫酸化壳聚糖等抗凝血因子中的一种或几种，细胞生长因子及抗凝血因子体积占总溶液的体积百分比为0.001％～0.1％。

本发明采用仿生学方法模仿肝小叶的结构设计出的多通道可拆分组合模具可制备内部带有模仿中间静脉血管的大通道和周围模仿毛细血管和胆管的小通道的复杂肝组织前体。多级外模具的设计可以通过分层灌注得到不同的细胞基质层，内部通道可通过细胞-水凝胶的诱导形成血管、胆管结构，外层合成高分子材料能提高所得肝组织前体的机械性能。

附图说明

图1是专用模具的整体剖面图。

图2是专用模具的整体剖面拆分图。

图3a是底模具的俯视图。

图3b是底模具图3a的a-a剖面图。

图4是专用模具的整体俯视图。

图5a和图5b是中间内模具结构示意图。

图6是带多通道网络的复杂器官前体成型图。（以三种不同细胞基质层的器官前体为例）。

图7专用模具整体示意图。（为了观看方便，一半的外模具没有出现在图中）。

在图中：101-中间支架模具；102-通道模具；201-内环外模具；202-中环外模具；203-外环外模具；301-底座模具；402-第一层细胞基质层；403-第二层细胞基质层；404-第三层细胞基质层。

具体实施方法

如图1-7所示，本发明提供的一种仿肝小叶结构的多通道组合模具制备带通道网络的复杂肝组织前体，其具体工艺步骤如下。

（1）提取或购买动物或人细胞制成细胞悬浮液，细胞悬浮液密度为1×10³～5×10⁷个/ml，制备质量百分浓度为1％～30％的天然高分子水凝胶溶液作为基质溶液，将基质溶液与细胞悬浮液按体积比1～9：9～1混合制成含细胞的基质溶液，可通过改变选择的细胞类型和基质溶液类型得到多种含有一种（或多种不同）细胞的基质溶液，将合成高分子材料溶于有机溶剂中制成质量百分浓度为1％～30％的合成高分子溶液。

（2）在所有的通道模具上涂覆一层含细胞（如内皮细胞，胆管上皮细胞等）的基质溶液，采用使用物理、化学交联或聚合等方法进行交联得到一层管状细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。

（3）将专用模具的各个组成部分进行组装：将（2）中已经进行交联处理的通道模具固定在中间支架模具上对应的凹槽内，再将中央支架模具固定在底座模具的中央凹槽内。将内环外模具安装到底模具的内侧阶梯上，将一种含有细胞（如肝细胞）的基质溶液通过顶部加料口加到模具内腔中使基质溶液充分填满整个内腔。使用物理、化学交联或聚合等方法制成第一层细胞基质层。

（4）去除内环外模具，用镊子拔出所有安装的通道模具，将较大的中环外模具安装到底模具的相应阶梯上，通过顶部加料口向中环内模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入第二种含有细胞的基质溶液，并进行交联，制成第二层细胞基质层。

（5）去除中环外模具，安装外环外模具到底模具相应阶梯上，重复步骤（4）的加料步骤制备出第三层细胞基质层。

（6）将外环外模具和中间支架模具去除，取出已形成的带有中央大通道和周围多个小通道的细胞基质层，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，获得相对完整的多通道肝器官前体。

（7）在得到的多通道肝器官前体的外部涂覆一层合成高分子溶液,然后用细胞培养液或pbs萃取合成高分子溶液中的溶剂，形成外层合成高分子材料层，增加肝组织前体的机械强度。

本发明的优选方案是配制的水凝胶溶液的天然高分子材料通常采用胶原蛋白、琼脂糖、纤维蛋白原、海藻酸钠、丝素蛋白、明胶、透明质酸、壳聚糖、粘连蛋白、凝血酶、聚乙二醇、普朗尼克等材料中的一种或者几种，以多种材料相互混合得到的水凝胶溶液效果较佳。用于增加机械强度的合成高分子材料通常采用聚乳酸、聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚羟基酸酯、聚己内酯、聚乙二醇和乳酸与乙醇酸共聚物中的一种或几种材料的复合物。用于溶解合成高分子材料的有机溶剂采用异丙醇、1，4-二氧六环、乙二醇或四乙二醇。在萃取部分用于溶解所述天然高分子材料的溶剂采用水、pbs溶液、生理盐水、3－羟甲基氨基甲烷盐酸溶液、ph＝6～8的0.09m氯化钠或细胞培养液。在细胞基质溶液中可加入内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肝细胞生长因子等细胞生长因子中的一种或几种，以及肝素、紫杉醇或硫酸化壳聚糖等抗凝血因子中的一种或几种，细胞生长因子及抗凝血因子体积占总溶液的体积百分比为0.001％～0.1％。

底座模具，中间支架模具，通道模具和外模具的材料采用无生物毒性的合成高分子材料（如合成纤维、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、光敏树枝或聚氨酯等）或者金属材料。通道模具的直径范围在0.1mm～5mm；中间支架模具的直径根据通道模具直径的变化进行调整，中间支架模具上有多个对应通道模具的安装孔，和对应的通道模具的尺寸和数目相同。底座模具底面为平面、凹面或者凸面，中间有可以固定中间支架模具的孔，并采用多层台阶形状，阶梯数和外模具级数相同，底座模具的台阶从中间向两边逐级升高，台阶的级数为1～20；底座模具外形及各级台阶截面为圆型。

实施例1：制备带多通道血管网络的肝脏前体。

（1）使用光敏树脂制备含二级台阶的底模具、中央支架模具、20个通道模具和外环模具。

（2）配制1%纤维蛋白原水凝胶溶液，配备浓度为5%（w/v）的plga/四乙二醇(tetraglycol)溶液作为合成高分子溶液，并加入1%（w/v）的肝素。

（3）在所有的通道模具上涂覆一层内皮细胞和纤维蛋白原的混合物，该基质溶液的细胞密度为1×10⁷个/ml，基质溶液中加入内皮细胞生长因子，使用凝血酶溶液（20iu/ml）交联2min得到一层管状细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。

（4）将专用模具的各个组成部分进行组装：将（3）中已经进行交联处理的通道模具固定在中间支架模具上对应的凹槽内，再将中央支架模具固定在底座模具的中央凹槽内。将内环外模具安装到底模具的内侧阶梯上，通过顶部加料口将细胞密度为1×10⁷个/ml的肝细胞、肝干细胞和纤维蛋白原的混合基质溶液加到模具内腔中使基质溶液充分填满整个内腔。基质溶液中加入肝细胞生长因子（hgf0.5ng/ml），使用凝血酶溶液（20iu/ml）交联2min制成第一层细胞基质层。

（5）去除内环外模具，用镊子拔出所有安装的通道模具，将外环外模具安装到底模具的相应阶梯上，通过顶部加料口向外环模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入肝细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞和纤维蛋白原混合的基质溶液，细胞密度为1×10⁷个/ml，基质溶液中加入肝细胞生长因子（hgf0.5ng/ml），使用凝血酶溶液（20iu/ml）交联2min，制成第二层细胞基质层。

（6）将外环外模具和中间支架模具去除，取出已形成的细胞基质层，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，获得相对完整的多血管网络肝器官前体。

（7）在得到的多血管网络肝组织前体的外部涂覆一层配制好的plga溶液,然后用细胞培养液进行萃取，形成外层合成高分子材料层,增加肝组织前体的机械强度。

实施例2：制备带多通道胆管网络的肝组织前体。

（1）使用聚四氟乙烯制备含三级台阶的底模具、中央支架模具、16个通道模具和外环模具。

（2）将5%明胶、2%海藻酸钠共混溶于pbs溶液中作为基质溶液，配备5%的聚氨酯/乙二醇溶液，加入1%（w/v）的肝素。

（3）在所有的通道模具上涂覆一层胆管上皮细胞和基质溶液的混合物，该基质溶液的细胞密度为1×10⁶个/ml，使用2%氯化钙溶液进行交联得到一层管状细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。

（4）将专用模具的各个组成部分进行组装：将（3）中已经进行交联处理的通道模具固定在中间支架模具上对应的凹槽内，再将中央支架模具固定在底座模具的中央凹槽内。将内环外模具安装到底模具的内侧阶梯上，通过顶部加料口将细胞密度为1×10⁷个/ml的肝细胞、脂肪干细胞和基质溶液的混合物加到模具内腔中使基质溶液充分填满整个内腔。基质溶液中加入肝细胞生长因子（hgf0.5ng/ml），使用2%氯化钙溶液进行交联制成第一层细胞基质层。

（5）去除内环外模具，用镊子拔出所有安装的通道模具，将中环外模具安装到底模具的相应阶梯上，通过顶部加料口向中环模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入肝干细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞和基质溶液的混合物，细胞密度为1×10⁷个/ml，基质溶液中加入肝细胞生长因子（hgf0.5ng/ml），使用2%氯化钙溶液进行交联制成第二层细胞基质层。

（6）去除中环外模具，将外环外模具安装到底模具的相应阶梯上，通过顶部加料口向外环模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入脂肪干细胞和基质溶液的混合物，细胞密度为1×10⁷个/ml，基质溶液中加入肝细胞生长因子（hgf0.5ng/ml），使用2%氯化钙溶液进行交联制成第三层细胞基质层。

（7）将外环外模具和中间支架模具去除，取出已形成的细胞基质层，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，获得相对完整的多胆管网络肝器官前体。

（8）在得到的多胆管网络肝组织前体的外部涂覆一层配制好的聚氨酯溶液,然后用pbs溶液进行萃取，形成外层合成高分子材料层,增加肝组织前体的机械强度。

实施例3：制备带多通道血管、胆管网络的可植入肝组织前体。

（1）使用硅橡胶制备含三级台阶的底模具、中央支架模具、20个通道模具和外环模具。

（2）配制10%的明胶溶液作为基质溶液，配备20%的聚乳酸/异丙醇溶液，加入1%（w/v）的肝素。

（3）在一半的通道模具上涂覆一层胆管上皮细胞和基质溶液的混合物，在另一半的通道模具上涂敷一层内皮细胞，平滑肌细胞和基质溶液的混合物，基质溶液中细胞的密度为1×10⁷个/ml，使用物理交联方法在37℃下放置10分钟，使胶原与细胞混合物结构稳定，得到一层管状细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。

（4）将专用模具的各个组成部分进行组装：将（3）中已经进行交联处理的通道模具固定在中间支架模具上对应的凹槽内，再将中央支架模具固定在底座模具的中央凹槽内。将内环外模具安装到底模具的内侧阶梯上，通过顶部加料口将细胞密度为1×10⁷个/ml的肝细胞、肝干细胞和基质溶液的混合物加到模具内腔中使基质溶液充分填满整个内腔。基质溶液中加入肝细胞生长因子（hgf0.5ng/ml），使用物理交联方法在37℃下放置10分钟，使胶原与细胞混合物结构稳定，制成第一层细胞基质层。

（5）去除内环外模具，用镊子拔出所有安装的通道模具，将中环外模具安装到底模具的相应阶梯上，通过顶部加料口向中环模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入肝细胞、肝星状细胞和基质溶液的混合物，细胞密度为1×10⁷个/ml，基质溶液中加入肝细胞生长因子（hgf0.5ng/ml），使用物理交联方法在37℃下放置10分钟，使胶原与细胞混合物结构稳定，制成第二层细胞基质层。

（6）去除中环外模具，将外环外模具安装到底模具的相应阶梯上，通过顶部加料口向外环模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入肝细胞、肝窦内皮细胞和基质溶液的混合物，细胞密度为1×10⁷个/ml，基质溶液中加入肝细胞生长因子（hgf0.5ng/ml），使用物理交联方法在37℃下放置10分钟，使胶原与细胞混合物结构稳定，制成第三层细胞基质层。

（7）将外环外模具和中间支架模具去除，取出已形成的细胞基质层，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，获得相对完整的多胆管网络肝器官前体。

（8）在得到的多胆管网络肝组织前体的外部涂覆一层配制好的聚乳酸溶液,然后用细胞培养液进行萃取，形成外层合成高分子材料层,增加肝组织前体的机械强度。

实施例4：制备带多通道血管、胆管网络的可植入肝脏前体。

（1）使用聚四氟乙烯制备含三级台阶的底模具、中央支架模具、24个通道模具和外环模具。

（2）配制2%纤维蛋白原和2%海藻酸钠混合溶液作为基质溶液，配备30%聚酯/四异二醇溶液，加入1%（w/v）的肝素。

（3）在8个通道模具上涂覆一层胆管上皮细胞、脂肪干细胞和基质溶液的混合物，在其余16个通道模具上涂敷一层内皮细胞，平滑肌细胞，脂肪干细胞和基质溶液的混合物，基质溶液中细胞的密度为1×10⁷个/ml，使用凝血酶和氯化钙溶液进行交联，得到一层管状细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。

（4）将专用模具的各个组成部分进行组装：将（3）中已经进行交联处理的通道模具固定在中间支架模具上对应的凹槽内，再将中央支架模具固定在底座模具的中央凹槽内。将内环外模具安装到底模具的内侧阶梯上，通过顶部加料口将细胞密度为1×10⁷个/ml的肝细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞、肝干细胞和基质溶液的混合物加到模具内腔中使基质溶液充分填满整个内腔。基质溶液中加入肝细胞生长因子（hgf0.5ng/ml），使用凝血酶和氯化钙溶液进行交联，制成第一层细胞基质层。

（5）去除内环外模具，用镊子拔出所有安装的通道模具，将中环外模具安装到底模具的相应阶梯上，通过顶部加料口向中环模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入肝细胞、脂肪干细胞和基质溶液的混合物，细胞密度为1×10⁷个/ml，基质溶液中加入肝细胞生长因子（hgf0.5ng/ml），使用凝血酶和氯化钙溶液进行交联，制成第二层细胞基质层。

（6）去除中环外模具，将外环外模具安装到底模具的相应阶梯上，通过顶部加料口向外环模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入脂肪干细胞和基质溶液的混合物，细胞密度为1×10⁷个/ml，基质溶液中加入肝细胞生长因子（hgf0.5ng/ml），使用凝血酶和氯化钙溶液进行交联，制成第三层细胞基质层。

（7）将外环外模具和中间支架模具去除，取出已形成的细胞基质层，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，获得相对完整的多胆管和血管网络肝器官前体。

（8）在得到的多胆管网络肝组织前体的外部涂覆一层配制好的聚酯溶液,然后用pbs溶液进行萃取，形成外层合成高分子材料层,增加肝组织前体的机械强度。