牛磺酸脱氧胆酸钠在防治失重性肌萎缩中的应用的制作方法

技术领域：

本发明涉及化合物牛磺酸脱氧胆酸钠的新用途，具体涉及牛磺酸脱氧胆酸钠在制备预防和治疗失重性肌萎缩的药物中的应用。

背景技术：
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牛磺酸脱氧胆酸钠(式i)是已知化学结构的化合物，英文名sodiumtaurourdodeoxycholate，分子式c26h44no6sna，cas登录号35807-85-3。

牛磺酸脱氧胆酸钠(以下亦简称其缩写：tudca)是内源胆汁酸的衍生物，天然存在于人体肠道中。

牛磺酸脱氧胆酸钠具有抑制内质网应激反应的药理活性，被广泛应用于基础科研实验中。有报道认为tudca可以提升肥胖人群骨骼肌的胰岛素敏感性，增强骨骼肌对葡萄糖的摄取等(karsetal.,2010；racitietal.,2010)。临床上，tudca应用于治疗人体胆汁淤积性肝病(kaplanandgershwin,2005；pouponetal.,1999)。

但迄今为止，未见有关牛磺酸脱氧胆酸钠对失重性肌萎缩作用的报道。

骨骼肌按照本身的代谢类型特性可分为慢肌和快肌，分别由慢肌纤维蛋白和快肌纤维蛋白组成。慢肌又称为红肌，以有氧代谢为主；快肌也称白肌，以无氧酵解代谢为主。骨骼肌中快、慢肌纤维蛋白含量的变化对肌萎缩的发生、发展具有重要的调控作用，即慢肌纤维蛋白含量的增加，可提高机体运动耐力，对肌萎缩疾病的发生具有预防和对抗作用。由此，通过增加慢肌纤维或和减少快肌纤维可预防和治疗骨骼肌萎缩。

失重性肌萎缩不同于某些疾病引起的肌萎缩。航天飞行以及地面模拟失重模型(长期卧床、尾悬吊、制动等)导致的失重性肌萎缩模型，会导致骨骼肌蛋白质代谢失衡，即骨骼肌蛋白合成减少而降解增加，表现为骨骼肌重量明显减轻、肌纤维横截面积的减小、肌纤维类型转变(即慢肌纤维减少而快肌纤维增加)等特征性改变。

目前已公认，骨骼肌特异的萎缩因子atrogin-1以及murf1表达的增加，是引起骨骼肌蛋白降解大于合成、骨骼肌重量丢失、肌纤维横截面积减小以及肌纤维类型相关蛋白改变的重要原因(bodinesc,etal.science,294:1704-1708,2001；folettavc,etal.pflugersarch-eurjphysiol,461:325–335,2011)。

因此，找到抑制肌萎缩特异因子atrogin-1以及murf1表达的物质，或者可以增加慢肌纤维或和减少快肌纤维的物质，可以制备用于预防和治疗失重性骨骼肌萎缩的药物。

技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种抑制肌萎缩特异因子atrogin-1及murf1的表达，并且能够增加肌萎缩后慢肌纤维表达、同时抑制快肌纤维的药物。

本发明首次发现，牛磺酸脱氧胆酸钠能够达到上述发明目的。

本发明用以下三个实验充分证实了牛磺酸脱氧胆酸钠的新功能，均采用了国际公认的肌萎缩实验方法和检验标准：

1、牛磺酸脱氧胆酸钠可以减轻失重诱导的肌肉重量丢失

为验证牛磺酸脱氧胆酸钠对失重性肌萎缩的抑制效应，我们以8周龄雄性c57bl/6小鼠为实验对象，按照体重均一原则(即每组小鼠平均体重无显著差别)分为地面对照组，尾悬吊7天组，尾悬吊7天同时牛磺酸脱氧胆酸钠250mg/公斤/天)灌胃组，采用国际公认的尾悬吊方法(gregoryr.adams,etal.japplphysiol95:2185–2201,2003)，尾悬吊7天诱导肌萎缩形成,期间地面对照组和尾悬吊7天组每天灌胃同等体积蒸馏水。尾悬吊7天结束后，取地面对照组、尾悬吊7天组、尾悬吊7天同时牛磺酸脱氧胆酸钠处理组小鼠后肢背侧萎缩最为严重的抗重力肌-比目鱼肌，称重后对比分析比目鱼肌重量变化。

实验结果表明，与对照组相比，尾悬吊7天小鼠比目鱼肌重量下降约30％(**p<0.01)，而牛磺酸脱氧胆酸钠处理组小鼠比目鱼肌重量下降约21.8％；与尾悬吊7天小鼠相比，牛磺酸脱氧胆酸钠处理后比目鱼肌重量丢失程度减轻(*p<0.05)；证明在整体动物水平上，牛磺酸脱氧胆酸钠也发挥了对失重性肌萎缩的抑制作用。

详见实验一。

2、牛磺酸脱氧胆酸钠可以抑制肌萎缩特异因子atrogin-1及murf1表达

本实验通过提取地面对照组、尾悬吊7天组、尾悬吊7天同时牛磺酸脱氧胆酸钠处理组小鼠比目鱼肌rna，反转录后用实时定量realtimepcr方法分析了牛磺酸脱氧胆酸钠对肌萎缩特异因子atrogin-1及murf1mrna表达的影响。

实验结果表明，与对照组相比，尾悬吊7天小鼠比目鱼肌内atrogin-1及murf1mrna表达显著上调，而牛磺酸脱氧胆酸钠处理后明显抑制了模拟失重诱导的肌萎缩特异因子atrogin-1及murf1mrna的表达增加。证明牛磺酸脱氧胆酸钠可抑制肌萎缩特异因子atrogin-1及murf1mrna表达，具有预防和治疗失重性肌萎缩发生的作用。

详见实验二。

3、牛磺酸脱氧胆酸钠可以抑制模拟失重诱导的肌纤维类型的转变(通过影响慢肌纤维(myhc-iia)和快肌纤维(myhc-iib)表达)

本实验通过提取地面对照组、尾悬吊7天组、尾悬吊7天同时牛磺酸脱氧胆酸钠处理组小鼠比目鱼肌rna，反转录后用实时定量realtimepcr方法分析了牛磺酸脱氧胆酸钠对慢肌纤维myhc-iia及快肌纤维myhc-iibmrna表达的影响。

实验结果表明，与对照组相比，尾悬吊7天小鼠比目鱼肌内myhc-iiamrna表达显著下降，myhc-iibmrna表达显著增加，即慢肌纤维减少而快肌纤维增加；而牛磺酸脱氧胆酸钠处理后明显抑制了模拟失重诱导的慢肌纤维myhc-iiamrna表达的下降和快肌纤维myhc-iibmrna表达的增加。证明牛磺酸脱氧胆酸钠可抑制模拟失重诱导的肌纤维类型的转变，具有预防和治疗失重性肌萎缩发生的作用。

详见实验三。

本发明的有益效果：

抑制肌萎缩特异因子的表达以及增加肌肉中慢肌纤维的含量，是防止和改善失重性肌萎缩的先决条件。本发明通过实验首次发现和证实，牛磺酸脱氧胆酸钠具有以下作用：

1、缓解失重诱导的肌肉重量丢失；

2、抑制肌萎缩特异因子表达；

3、抑制慢肌纤维(myhc-iia)表达减少和快肌纤维(myhc-iib)表达增加的作用。

因此，无论是整体动物水平，还是基因水平上，本发明都证明了牛磺酸脱氧胆酸钠可用于制备预防和治疗失重性肌萎缩的药物。

四、附图说明

图1是牛磺酸脱氧胆酸钠对尾悬吊模拟失重诱导的比目鱼肌重量变化的影响比较结果。

图2是实时定量realtimepcr检测牛磺酸脱氧胆酸钠对尾悬吊模拟失重诱导的肌萎缩特异因子atrogin-1和murf1mrna表达的影响比较结果。

图3是实时定量realtimepcr检测牛磺酸脱氧胆酸钠对尾悬吊模拟失重诱导的慢肌纤维myhc-iia和快肌纤维myhc-iib表达的影响比较结果。

具体实施方式

以下实验中所用的实验动物及材料来源如下：

实验动物：雄性c57小鼠购自北京维通利华动物中心，生产许可证号：scxk(京)2020-0001；实验动物质量合格证号：0261086。

受试药物：牛磺酸脱氧胆酸钠，购买自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司,纯度:97％(tlc)。

其它材料来源：

trizol、反转录酶购自invitrogen公司；

sybr购自abi公司；

主要仪器设备：abistep-oneplusrealtimepcr仪，电子天平，尾吊笼。

实验一：牛磺酸脱氧胆酸钠对失重性肌萎缩小鼠比目鱼肌重量变化的影响

1.实验目的：

考察牛磺酸脱氧胆酸钠对整体动物失重性肌萎缩比目鱼肌重量变化的影响。

2.实验方法：

采用尾悬吊7天诱导小鼠骨骼肌萎缩，通过对比地面对照组、尾悬吊组、尾悬吊同时牛磺酸脱氧胆酸钠处理组小鼠后肢背侧比目鱼肌重量，分析牛磺酸脱氧胆酸钠处理对尾悬吊模拟失重诱导的比目鱼肌重量变化的影响。

2.1尾悬吊小鼠肌萎缩模型的制备

8周龄雄性c57bl/6小鼠为实验对象，按照体重均一原则(即每组小鼠平均体重无显著差别)分为地面对照组，尾悬吊7天组，尾悬吊7天同时牛磺酸脱氧胆酸钠250mg/公斤/天)灌胃组，尾悬吊组小鼠按照国际公认的小鼠尾悬吊方法(gregoryr.adams,etal.japplphysiol95:2185–2201,2003)，使小鼠后肢刚好离地，身体与地面的倾斜角度大约为30°。小鼠可以在鼠笼内头低位自由活动、摄食和饮水。动物均单笼饲养，室温保持在23±2℃，每日保持12小时光照。分别尾悬吊7天诱导肌萎缩形成。

2.2牛磺酸脱氧胆酸钠灌胃处理小鼠

将牛磺酸脱氧胆酸钠按照终浓度50毫克/毫升溶于蒸馏水中至,以250mg/公斤/天的有效药理剂量对尾悬吊小鼠进行灌胃，每天灌胃一次，其余组小鼠灌胃同等体积蒸馏水作为对照。

2.3尾悬吊结束后比目鱼肌取材及称重

尾悬吊结束后，所有小鼠均按照标准流程取材，戊巴比妥那麻醉后脱颈猝死小鼠，小鼠俯卧位，75％酒精棉球擦拭后肢背侧，剪开跟腱外侧皮肤，用皮镊充分暴露后肢背侧肌肉，剪断背侧跟腱后，仔细分离比目鱼肌，并剪掉多余脂肪和筋膜，然后电子天平称重。

3.数据分析方法

数据以平均值±标准差表示，数据分析采用组间方差分析。**p<0.01，*p<0.05表示具有显著性统计学差异。

4.实验结果

如图1所示。与对照组相比，尾悬吊7天小鼠比目鱼肌重量下降约30％(**p<0.01)，而牛磺酸脱氧胆酸钠处理组小鼠比目鱼肌重量下降约21.8％，与尾悬吊7天小鼠相比，牛磺酸脱氧胆酸钠处理后比目鱼肌重量丢失程度减轻(*p<0.05)。

5.实验结论

牛磺酸脱氧胆酸钠可显著抑制失重性肌萎缩小鼠的比目鱼肌萎缩。

实验二：牛磺酸脱氧胆酸钠对肌萎缩特异因子atrogin-1和murf1mrna表达的影响1.实验目的：

考察牛磺酸脱氧胆酸钠对失重性肌萎缩形成过程中肌萎缩特异因子atrogin-1和murf1mrna表达水平的影响。

2.实验方法：

通过提取地面对照组、尾悬吊组、尾悬吊同时牛磺酸脱氧胆酸钠处理组小鼠比目鱼肌rna，用实时定量realtimepcr的方法，检测牛磺酸脱氧胆酸钠对失重性肌萎缩形成过程中肌萎缩特异因子atrogin-1和murf1mrna表达水平。

2.1rna的提取、检测与定量

a、裂解:每只小鼠左右两侧比目鱼肌均放入组织匀浆器，加入1毫升trizol，充分将组织匀浆磨碎，室温防治半小时充分裂解。

b、各相分离：按0.2ml氯仿/1mltrizol的比例加入氯仿，盖紧剧烈混匀15秒，室温放置2-3分钟。4℃，12000g离心15分钟。之后吸取上清水相置于另一新的ep管中。

c、沉淀rna:按0.5ml异丙醇/1mltrizol的比例，向吸取的水相中加入异丙醇，颠倒混匀，室温放置15分钟。4℃，12000g离心10分钟得到rna沉淀。

d、漂洗rna:弃去上清，按1ml75％乙醇/1mltrizol的比例，加入75％的乙醇洗涤rna沉淀两次，然后4℃，7500g离心沉淀5分钟，弃去上清。

e、重溶rna：室温空气中干燥rna沉淀5-10分钟，以适量depc水溶解rna沉淀,55℃-60℃水溶10分钟。

f、rna纯度检测及定量：取1μlrna溶液加入99μldepc水中混匀，用紫外分光光度计测定a260/a280的比值和浓度。

2.2反转录反应

25μl反应体系操作步骤：

b轻甩后,70℃10min,放-20℃3～5min,轻甩。

d42℃90min,95℃10min

e合成的cdna于–20c保存备用。

2.3引物设计

根据ncbi数据库序列利用dnaman软件设计引物，然后根据退火温度和序列特异性选择合适的引物进行合成(见表1)。

表1目的基因atrogin1、murf1及内参gapdh引物序列

2.4realtimepcr检测目的基因的表达

50μl反应体系操作步骤：

pcr反应条件：94℃变性5分钟。94℃40秒，62℃15秒，72℃20秒，40个循环。72℃延伸10分钟。

3.数据分析方法

数据以平均值±标准差表示，数据分析采用组间方差分析。**p<0.01，*p<0.05表示具有显著性统计学差异。

4.实验结果

如图2所示。与地面对照组相比，尾悬吊7天小鼠比目鱼肌内atrogin-1及murf1mrna表达分别上调2.36倍(**p<0.01)和4.04倍(**p<0.01)，而牛磺酸脱氧胆酸钠处理组atrogin-1及murf1mrna表达上调幅度较小，与尾悬吊7天小鼠相比，牛磺酸脱氧胆酸钠明显抑制了模拟失重诱导的肌萎缩特异因子atrogin-1(**p<0.01)及murf1(*p<0.05)mrna的表达增加。

5.实验结论

牛磺酸脱氧胆酸钠可显著抑制尾悬吊模拟失重诱导的肌萎缩特异因子atrogin-1及murf1mrna表达,对抗失重性肌萎缩。

实验三：牛磺酸脱氧胆酸钠对尾悬吊模拟失重诱导的慢肌纤维(myhc-iia)和快肌纤维(myhc-iib)表达的影响

1.实验目的：

分析牛磺酸脱氧胆酸钠对失重性肌萎缩形成过程中慢肌纤维(myhc-iia)和快肌纤维(myhc-iib)表达的影响。

2.实验方法：

通过提取地面对照组、尾悬吊组、尾悬吊同时牛磺酸脱氧胆酸钠处理组小鼠比目鱼肌rna，用实时定量realtimepcr的方法，测定牛磺酸脱氧胆酸钠对失重性肌萎缩形成过程中慢肌纤维(myhc-iia)和快肌纤维(myhc-iib)的表达。

2.1rna的提取、检测与定量

a、裂解:每只小鼠左右两侧比目鱼肌均放入组织匀浆器，加入1毫升trizol，充分将组织匀浆磨碎，室温防治半小时充分裂解。

b、各相分离：按0.2ml氯仿/1mltrizol的比例加入氯仿，盖紧剧烈混匀15秒，室温放置2-3分钟。4℃，12000g离心15分钟。之后吸取上清水相置于另一新的ep管中。

c、沉淀rna:按0.5ml异丙醇/1mltrizol的比例，向吸取的水相中加入异丙醇，颠倒混匀，室温放置15分钟。4℃，12000g离心10分钟得到rna沉淀。

d、漂洗rna:弃去上清，按1ml75％乙醇/1mltrizol的比例，加入75％的乙醇洗涤rna沉淀两次，然后4℃，7500g离心沉淀5分钟，弃去上清。

e、重溶rna：室温空气中干燥rna沉淀5-10分钟，以适量depc水溶解rna沉淀,55℃-60℃水溶10分钟。

f、rna纯度检测及定量：取1μlrna溶液加入99μldepc水中混匀，用紫外分光光度计测定a260/a280的比值和浓度。

2.2反转录反应

25μl反应体系操作步骤：

b轻甩后,70℃10min,放-20℃3～5min,轻甩。

d42℃90min,95℃10min

e合成的cdna于–20c保存备用。

2.3引物设计

根据ncbi数据库序列利用dnaman软件设计引物，然后根据退火温度和序列特异性选择合适的引物进行合成(见表2)。

表2目的基因myhc-iia、myhc-iib及内参gapdh引物序列

2.4realtimepcr检测atrogin1mrna的表达

50μl反应体系操作步骤：

pcr反应条件：94℃变性5分钟。94℃40秒，62℃15秒，72℃20秒，40个循环。72℃延伸10分钟。

3.数据分析方法

数据以平均值±标准差表示，数据分析采用组间方差分析。**p<0.01，*p<0.05表示具有显著性统计学差异。

4.实验结果

如图3所示。与地面对照组相比，尾悬吊7天小鼠比目鱼肌内慢肌纤维myhc-iiamrna表达下降超过90％(**p<0.01)，快肌纤维myhc-iibmrna表达上调6.84倍(**p<0.01)；而牛磺酸脱氧胆酸钠处理后明显抑制了模拟失重诱导的慢肌纤维myhc-iiamrna表达的下降和快肌纤维myhc-iibmrna表达的增加。

5.实验结论

牛磺酸脱氧胆酸钠可抑制尾悬吊模拟失重诱导的慢肌纤维的减少和快肌纤维的增加，发挥预防和治疗失重性肌萎缩发生的作用。