一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ACE2疫苗的制作方法

文档序号:25951313发布日期:2021-07-20 17:07阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ace2疫苗,其特征在于,以ace2基因重组益生菌表达的ace2蛋白及其诱导的抗-ace2预防冠状病毒感染,包括构建表达ace2基因的重组载体并转化食品级酸奶益生菌,筛选表达ace2基因的益生菌株,包被成微胶囊,配制于乳制品,使食用后的益生菌定植于靶组织繁殖并持续表达ace2蛋白,随后ace2蛋白刺激宿主产生抗-ace2,其中ace2蛋白起封闭冠状病毒受体结合区s1-rbd的作用,抗-ace2起封闭宿主细胞表面冠状病毒受体ace2的作用,表达在益生菌表面的ace2可与宿主细胞竞争吸附冠状病毒,从而阻断冠状病毒通过s1-rbd与ace2受体的结合感染宿主。

2.根据权利要求1所述的一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ace2疫苗,其特征在于,所述载体包括用于递送ace2基因的干细胞、干细胞系、纳米粒、人工载体;所述益生菌包括乳球菌、粪链球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、拉曼乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、沙门氏菌、伤寒沙门氏菌ty21a血清型变异株。

3.根据权利要求1、2所述的一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ace2疫苗,其特征在于,所述益生菌是指以非抗生素抗性基因为筛选标志的半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌。

4.根据权利要求1所述的一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ace2疫苗,其特征在于,所述表达ace2基因的重组载体是指克隆了复制子、启动子、多克隆位点、ace2基因和半乳糖苷酶基因的ace2-lacf双表达半乳糖苷酶互补型质粒。

5.根据权利要求1所述的一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ace2疫苗,其特征在于,所述益生菌株是指以半乳糖苷酶为筛选标志并表达ace2基因的嗜酸乳杆菌。

6.根据权利要求1所述的一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ace2疫苗,其特征在于,所述包被成微胶囊是指将ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌和w/v为3.0%cacl2、0.4%海藻酸钠、12.5%微孔淀粉、0.1%tween-80配制的混合液制成微胶囊。

7.根据权利要求1所述的一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ace2疫苗,其特征在于,所述载体或质粒包括pnz8148、pleiss、pmg36e、pbbr1mcs-5、pbbr1mcs-6、prv610、plem415、phy300plk、nz9000、mg1363、pbargpe1、pnz8149、pan7-1、pbht1、pve5523、ppg611.1、ppg612.1、pma5、phcmc05、pgfp22、pgfp315、php13、php13-43、phy-43、pwb980、paox1、mg1363、pnz8148、nz9000、pnz9530、pmg36e、pklac1、gg799、pyd1、eby100、pyes2、pyes2-flag、pyes2nta、ntb、ntc、pyes3ct、pyip5、pyrp7、padh2、prsh41、pdc315、pdf15、pug6、pesc-his、bfd14、bfd15、pdnr1、p334、pdr195、prs316,prs316ha、yeplac112、ycplac33、yeplac195、yeplac181、yip211、pyx212、pyx212-vhb、ppg1或ppg2。

8.根据权利要求1所述的一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ace2疫苗,其特征在于,所述以ace2基因重组益生菌表达的ace2蛋白的抗感染作用还包括以s1-rbd基因、il-10基因与胞外锚定质粒或分泌型质粒构建重组质粒,进而转化益生菌株,使重组益生菌株持续表达s1-rbd、il-10所起的抗冠状病毒感染作用。

9.根据权利要求1所述的一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ace2疫苗,其特征在于,包括以ace2基因、s1-rbd基因、il-10基因、益生菌、分泌型载体或质粒、胞外区基因和胞壁基因进行优选组合,构建表达相应分泌型蛋白、益生菌表面蛋白和/或益生菌内蛋白的载体,然后转化益生菌,制成口服或喷雾接种疫苗。

10.根据权利要求1所述的一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ace2疫苗,其特征在于,按以下步骤制备:

(1)构建半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌:将嗜酸乳杆菌中半乳糖苷酶基因lacf的pcr扩增产物连接到克隆载体pmd-19t,构建重组子pmd-19t-lacf,然后将该重组子中包含lacf两端同源重组序列和pmd-19t序列的pcr扩增产物连接至质粒载体puc-19,构建的lacf1-pmd-19t-lacf2-puc-19与lacf移码突变体即δlacf的pcr扩增产物进行酶切、连接,使δlacf序列替换pmd-19t,实现lacf无义序列的替换,然后将经过t-a克隆的δlacf亚克隆到敲除载体pbr322,构建pbr322-δlacf,经鉴定后电转化至嗜酸乳杆菌,筛选出不分解乳糖的lacf缺陷型嗜酸乳杆菌,并行southern鉴定。

(2)构建半乳糖苷酶互补型质粒pplac-lacf:以乳酸菌质粒pnz9530为模板,扩增其复制子repa-repc和nisin的启动子pnis,并合成mcs多克隆位点,将repa-repc、pnis和mcs连接至骨架质粒pplac,同时将lacf基因克隆至该质粒,构建以非抗生素抗性基因lacf为选择标记的食品级半乳糖苷酶互补型质粒lacf-pplac,并转化上述构建的lacf缺陷型嗜酸乳杆菌,筛选能使lacf-突变株恢复乳糖利用能力的半乳糖苷酶互补型质粒。

(3)构建ace2-lacf双表达半乳糖苷酶互补型质粒:设计引物,加酶切序列,扩增含有酶切位点的ace2基因,将ace2基因克隆至半乳糖苷酶互补型质粒lacf+质粒,构建同时表达ace2和lacf基因的ace2-lacf双表达半乳糖苷酶互补型质粒ace2-lacf-pplac。

(4)构建ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌:将ace2-lacf双表达半乳糖苷酶互补型质粒ace2-lacf-pplac转化半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌,构建同时表达ace2基因和半乳糖苷酶基因的重组嗜酸乳杆菌,命名为ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌/以重组嗜酸乳杆菌为载体的新冠病毒ace2疫苗,其中ace2基因表达的ace2蛋白为新冠病毒的受体,具有中和病毒rbd的作用;ace2蛋白刺激宿主产生的抗体具有中和宿主细胞表面ace2受体的作用,两者均能抵抗新冠病毒感染;而半乳糖苷酶基因lacf为非抗生素抗性基因的食品级筛选标志,以通过乳糖培养基筛选能表达ace2基因的无抗生素抗性基因转移风险的目的益生菌株。

(5)以海藻酸钠包被ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌,制备能抵抗胃液作用的微胶囊。

(6)以ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌或以海藻酸钠包被的ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌微胶囊替代现有技术的嗜酸乳杆菌,制备抗新冠病毒感染的乳制品。


技术总结
一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ACE2疫苗,其特征在于,构建表达ACE2和半乳糖苷酶的重组载体并转化半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌,获得过表达ACE2并以半乳糖苷酶为筛选标志的基因重组嗜酸乳杆菌,以替换传统发酵菌制备乳制品,或以海藻酸钠包被成抵抗胃液的微胶囊配制乳制品,当吃乳制品或喝酸奶时,其中的嗜酸乳杆菌到达并定植于肠道,在乳糖诱导下持续表达ACE2蛋白,进而ACE2蛋白刺激宿主产生抗‑ACE2,其中ACE2蛋白能封闭冠状病毒受体结合区,抗‑ACE2能封闭宿主细胞ACE2受体,表达在益生菌体表面的ACE2能竞争吸附冠状病毒,三者共同预防病毒感染,而且ACE2有益于氨基酸吸收和保护心血管,益生菌有益于肠道微生态,是与病毒抗原、抗体无关的食品级新型疫苗。

技术研发人员:翁炳焕
受保护的技术使用者:翁炳焕
技术研发日:2021.04.09
技术公布日:2021.07.20
当前第2页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1