一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ACE2疫苗的制作方法

本发明涉及一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ace2疫苗，属于生物医学领域的传染病防治技术。

背景技术：

感染人类的冠状病毒主要包括sars-cov(引发重症急性呼吸综合征)、mers-cov(引发中东呼吸综合症)和sars-cov-2(新型冠状病毒，引发covid-19)，其共同的特点都是通过宿主细胞的血管紧张素转换酶2(ace2)引起感染。

新型冠状病毒是冠状病毒的一种，其主要结构包括单股正链核酸(ssrna)、刺突蛋白(s)、膜蛋白(m)、包膜蛋白(e)和核壳蛋白(n)，其中s蛋白在感染过程中被宿主蛋白酶切割成n端的s1亚基和c端的s2亚基，s1亚基由n端的结构域(s1-ntd)和受体结合域(s1-rbd)组成，s1-rbd负责识别并结合宿主细胞表面受体即ace2，s2亚基介导病毒包膜和宿主细胞膜之间的融合，使病毒进入宿主细胞引起感染。

目前新冠病毒疫苗主要以s蛋白或其rbd为靶点设计开发，包括基因重组疫苗、载体疫苗(腺病毒载体或减毒流感病毒载体)和核酸疫苗(mrna疫苗或dna疫苗)。其作用的共同机制是使宿主产生抗新冠病毒受体结合域(s1-rbd)抗体，当这种抗体与s1-rbd结合后，新冠病毒就不能通过s1-rbd识别并结合宿主细胞表面受体(ace2)，使之失去感染性。

综上，新冠病毒的s1-rbd能与宿主细胞表面受体ace2结合，并通过s1-rbd与ace2结合感染宿主细胞；现有技术的新冠病毒疫苗通过刺激宿主产生抗新冠病毒s1-rbd的抗体而起免疫作用，即通过疫苗接种产生的特异性抗体与s1-rbd结合来阻断s1-rbd与宿主细胞表面受体ace2结合，从而达到预防的目的。但未见通过疫苗接种产生的ace2与s1-rbd结合来阻断s1-rbd与宿主细胞表面受体ace2结合从而达到免疫预防的报道。

现有疫苗接种后如果某些体质产生低滴度抗体、非中和抗体或亚中和抗体，就有产生抗体依赖性感染增强(antibodydependentenhancement，ade)的风险，ade指病毒感染后产生的特异性抗体对病毒感染不但没有起到抑制作用反而起促进作用。文献报道ade是sarscov和merscov入侵免疫细胞的重要方式，发现高浓度sarscov抗血清可中和sarscov感染，高度稀释后的抗血清则触发ade，因sars-cov-2与sarscov和merscov均属于β冠状病毒，推测sars-cov-2也可能存在ade，而不产生上述抗体的本发明则没有ade风险。

现有疫苗的载体，如目前应用最广泛的人腺病毒5型(ad5)载体，虽然其细胞毒性和免疫源性减弱、外源基因表达时效提高、可感染的细胞多而应用广，但易引起非特异性感染而不适用于靶向治疗。ad5不与宿主细胞dna整合，所以易被网状内皮细胞吞噬，使目的基因表达不稳定。同时由于ad5无法复制，会使体内重组病毒越来越少，所以不适用于慢性疾病的长期治疗。ad5本质为病毒，仍具有免疫源性和细胞毒性，宿主对病毒载体的免疫应答会干扰对目的抗原的免疫应答，大多数正常人已受过腺病毒感染，对病毒载体的预存免疫也会干扰疫苗的免疫效果，而以益生菌为载体的ace2疫苗则没有腺病毒载体的副作用，且ace2是一种i型跨膜糖蛋白，n端在胞膜外，通过单次跨膜锚定在细胞表面，c端在细胞膜内，对氨基酸的吸收和心血管等器官的保护均具有重要的作用。

乳酸菌(lacticacidbacteria，lab)是定植于肠道的益生菌之一，主要包括乳球菌、嗜酸乳杆菌(乳杆菌)和双歧杆菌等。lab能改善肠道微生态环境，具有抗肿瘤、抗炎、抗过敏、帮助消化、免疫调节、产生氨基酸及多种维生素等作用。嗜酸乳杆菌被作为第三代乳酸发酵菌被应用于面包、酸奶、奶酪等乳制品的生产，并具有耐酸、耐胆盐和免疫佐剂的特性，是理想的基因工程活载体疫苗的表达系统，能源源不断地表达和分泌外源目的抗原，文献报道像抗原、酶类、细胞因子、抗体、过敏原等一系列外源蛋白均可在lab中重组表达。但lab的抗原表达载体常带有抗生素抗性基因，使用于人或动物体内易发生抗性基因转移而带来生物安全问题，目前亦未见以抗生素抗性基因改良的嗜酸乳杆菌为载体和发酵菌种制备以口服酸奶接种的冠状病毒ace2疫苗的报道。

技术实现要素：

为了开发一种无需病毒基因、病毒抗原和病毒抗体参与的不同于现有技术的新型抗冠状病毒疫苗，本发明人提出了本发明。

本发明的目的是要提供一种以ace2基因重组酸奶益生菌表达的ace2蛋白及其诱导的ace2抗体预防新冠病毒感染的ace2疫苗及其制备方法和用途。

本发明的目的通过以下技术方案实施：构建能同时过表达ace2基因和半乳糖苷酶(lacf)基因的重组载体(ace2-lacf-pplac)并转染lacf缺陷型嗜酸乳杆菌，获得过表达ace2并以lacf为筛选标志的基因重组ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌，进而将该重组菌包被成抵抗胃液作用的微胶囊，然后将该重组菌或其微胶囊替换现有技术的发酵菌，配制乳制品，口服后释放的重组益生菌定植于肠道繁殖，在乳糖诱导下持续表达抗新冠病毒的ace2蛋白。

首先，构建半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌：敲除嗜酸乳杆菌中的lacf基因，构建以非抗生素抗性基因(lacf)为筛选标记的lacf缺陷型嗜酸乳杆菌，其方法包括将嗜酸乳杆菌中lacf基因的pcr扩增产物连接到克隆载体pmd-19t，构建重组子pmd-19t-lacf，然后将该重组子中包含lacf两端同源重组序列(lacf1、lacf2)和pmd-19t序列的pcr扩增产物连接至载体puc-19，构建重组子lacf1-pmd-19t-lacf2-puc-19，将该重组子与经感受态菌转化、质粒提取、pcr扩增和酶切的移码突变体lacf(δlacf)的pcr扩增产物进行酶切、连接，使δlacf序列替换pmd-19t，实现lacf无义序列的替换，然后将经过t-a克隆、酶切的δlacf亚克隆到敲除载体pbr322，构建pbr322-δlacf，经鉴定后电转化至嗜酸乳杆菌，进行同源重组，使突变序列(δlacf)整合到菌体的染色体上，替换掉靶基因laef，然后筛选出不分解乳糖的lacf缺陷型嗜酸乳杆菌(lacf^-突变株)，并行southern鉴定。

进而，构建半乳糖苷酶互补型质粒(pplac-lacf)：以乳酸菌质粒(pnz9530)为模板，扩增其复制子(repa-repc)和nisin的启动子(pnis)，并合成mcs多克隆位点，将repa-repc、pnis和mcs连接至载体pmd-19-t，同时将从重组子pmd-19t-lacf扩增的lacf基因克隆至载体pmd-19-t，构建以非抗生素抗性基因lacf为选择标记的食品级半乳糖苷酶互补型质粒(lacf-pplac)，并转化上述构建的lacf缺陷型嗜酸乳杆菌，筛选能使lacf^-突变株恢复乳糖利用能力的半乳糖苷酶互补型质粒(lacf-pplac)。

进而，构建ace2-lacf双表达半乳糖苷酶互补型质粒：设计引物，加酶切序列，扩增含有酶切位点的ace2基因，将ace2基因敲入半乳糖苷酶互补型质粒，构建同时表达ace2和lacf基因的ace2-lacf双表达半乳糖苷酶互补型质粒(ace2-lacf-pplac质粒)。

进而，构建ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌：将ace2-lacf双表达半乳糖苷酶互补型质粒(ace2-lacf-pplac)转染半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌，构建同时表达ace2基因和半乳糖苷酶基因的重组嗜酸乳杆菌(命名为ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌/以嗜酸乳杆菌为载体的新冠病毒ace2疫苗)，其中ace2基因表达的ace2蛋白为新冠病毒的受体，具有中和病毒rbd的作用；ace2蛋白刺激宿主产生的抗体具有中和宿主细胞表面ace2受体的作用，两者均能抵抗新冠病毒感染；而半乳糖苷酶基因(lacf)为非抗生素抗性基因的食品级筛选标志，以通过乳糖培养基筛选能表达ace2基因的无抗生性转移风险的目的益生菌株。

进而，以海藻酸钠包被ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌，制备能抵抗胃液作用的微胶囊。

进而，以ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌或以海藻酸钠包被的ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌微胶囊替代现有技术的发酵菌或嗜酸乳杆菌，制备抗新冠病毒感染的乳制品。

进而，优选ace2基因、益生菌载体、克隆载体或表达载体，进行最佳匹配，构建各种高效表达ace2分泌蛋白、益生菌表面蛋白及其内部蛋白的以益生菌为载体的ace2疫苗，如将ace2基因与乳酸菌内源pepn基因连接，使其融合表达定位于乳酸菌细胞壁表面的pepn蛋白，然后制成各种微胶囊及乳制品，服用后刺激宿主产生抗-ace2。

本发明的有益效果在于：首次利用ace2基因表达的ace2蛋白能封闭新冠病毒s1-rbd以及ace2蛋白刺激宿主产生的抗-ace2能封闭宿主细胞ace2受体的机制，建立以ace2基因表达的ace2蛋白中和新冠病毒s1-rbd以及以ace2蛋白诱导的抗-ace2抗体中和宿主细胞表面ace2受体从而阻断新冠病毒通过ace2受体感染的新型ace2疫苗制备技术方案。

首先，本发明以有益健康的益生菌为载体递送ace2基因，食用益生菌具有改善肠道免疫功能、帮助消化吸收、降胆固醇、抗过敏、抗幽门螺旋杆菌感染等作用以及产生泛酸、尼克酸、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素k及短链脂肪酸、抗氧化剂、氨基酸等有益物质：而现有技术如以腺病毒5型(ad5)为载体递送抗体产生基因(mrna)，ad5的本质为病毒，不但没有益生菌产生有益物质的功能，而且大多数宿主已受过腺病毒感染，对腺病毒的预存免疫会干扰腺病毒载体疫苗的免疫效果。

进而，本发明通过益生菌中ace2基因的表达发挥疫苗作用：口服或喷雾接种本发明的酸奶益生菌载体疫苗后，益生菌定植于靶组织繁殖并表达ace2蛋白，随后ace2蛋白刺激机体产生抗-ace2抗体，其中ace2蛋白因能封闭冠状病毒受体结合区s1-rbd而能预防病毒感染，抗-ace2抗体因能封闭宿主细胞表面的ace2受体而能竞争抑制病毒感染，而且表达的ace2对氨基酸的转运、吸收和心血管等器官的保护也具有重要的作用；而现有技术的疫苗通过产生抗病毒抗体而发挥疫苗的作用，所以本发明不同于现有技术的疫苗。

进而，过表达ace2的益生菌载体能预防病毒感染：益生菌载体因表达的ace2可分泌在菌体表面而能与宿主细胞竞争吸附冠状病毒，从而竞争抑制病毒感染宿主细胞；而现有技术的腺病毒载体却没有吸附冠状病毒及竞争抑制病毒感染的作用。

进而，本发明无抗体依赖性感染增强的副作用：在医学上有一种现象被称为抗体依赖性感染增强(antibodydependentenhancement，ade)，ade主要指病毒感染后产生的特异性抗体对病毒感染不但不起抑制作用反而起促进作用，ade还可以诱发病毒通过胎盘引起母婴垂直传播，文献报道ade普遍存在于呼吸道合胞病毒、登革病毒、sarscov、merscov等多科属病毒感染中，sars-cov-2、sarscov和merscov均属于β冠状病毒，有文献推测sars-cov-2也可能存在ade，如sars-cov-2感染者的二次感染、垂直传播都有过报道，所以，当接种疫苗后，某些体质可能因产生低滴度抗体、非中和抗体或亚中和抗体而发生ade；而本发明在接种后不产生抗病毒抗体，所以没有ade的副作用。

进而，现有技术的疫苗均通过特异性抗体阻断病毒感染，其功效会受到病毒变异或不同毒株的影响，但变异病毒或不同毒株始终通过其s1-rbd与宿主细胞ace2受体结合感染，所以本发明基于s1-rbd与ace2结合机制制备的疫苗不受病毒变异和毒株种类的影响。

附图说明

图1是本发明的酸奶益生菌载体冠状病毒ace2疫苗的制备及应用示意图。

图2是vero细胞受到病毒攻击后的病变效应(cytopathiceffect，cpe)示意图。

在图1中，1是经pcr扩增和酶切的半乳糖苷酶基因(lacf)；2是克隆载体(pmd-19t)；3是重组载体；4是重组载体3的pcr扩增产物，包含左端的lacf1、中间的pmd-19t和右端的lacf2；5是半乳糖苷酶基因突变体(lacf移码突变，δlacf)；6是重组敲除载体；7是嗜酸乳杆菌；8是半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌；9是半乳糖苷酶基因；10是ace2基因；11是ace2-lacf双表达半乳糖苷酶互补型质粒；12是ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌；13是ace2蛋白；14是冠状病毒s1-rbd；15是宿主细胞表面的ace2受体；16是抗-ace2抗体。

图1表示，半乳糖苷酶基因(lacf)1的pcr扩增产物和克隆载体(pmd-19t)2经酶切后连接成重组载体3，经感受态细胞转化、扩增、阳性克隆筛选、鉴定、质粒提取和pcr扩增后，得到包含lacf两端同源重组序列和pmd-19t序列的重组载体3的pcr扩增产物4，然后将pcr扩增产物4、半乳糖苷酶基因突变体(δlacf)5以及敲除载体pbr322进行酶切，连接成重组敲除载体6，此时pcr扩增产物4中的pmd-19t已被δlacf取代，即重组敲除载体6中包含了敲除载体pbr322、lacf1、δlacf和lacf2，经感受态细胞转化、扩增、阳性克隆筛选和鉴定后提取质粒，电转化到嗜酸乳杆菌7，使嗜酸乳杆菌7中的半乳糖苷酶被δlacf替换，转变为不分解乳糖从而不能在含乳糖培养基上生长的以半乳糖苷酶为筛选标志的半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌8。然后将半乳糖苷酶基因(lacf)9和ace2基因10的pcr扩增产物进行酶切，并连接到已经克隆了启动子、复制子和多克隆位点的载体pmd-19-t，构建ace2-lacf双表达半乳糖苷酶互补型质粒(ace2-lacf-pplac)11，将该质粒11转化半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌8后，得到能表达ace2基因并恢复乳糖分解能力的ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌12，即构建了能表达ace2蛋白的无抗生素抗性基因转移风险的食品级嗜酸乳杆菌12，而未成功转染或成功转染后丢失ace2表达互补型质粒11的嗜酸乳杆菌均因半乳糖苷酶缺陷而无法在含乳糖的培养基上生长。ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌12中ace2基因表达的ace2蛋白13与宿主细胞中ace2基因表达的ace2蛋白15同为冠状病毒表面s1-rbd(受体结合区)14的受体，冠状病毒通过s1-rbd与宿主细胞表面的ace2蛋白(受体)15结合而侵袭、感染宿主细胞。ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌12表达的游离型ace2蛋白13通过与冠状病毒s1-rbd结合而阻断冠状病毒s1-rbd与宿主细胞表面的ace2受体结合，从而起中和病毒、预防感染的作用。ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌12表达在菌体表面的结合型ace2蛋白能与宿主细胞竞争性吸附冠状病毒，从而起竞争抑制冠状病毒侵袭、感染宿主细胞的作用。ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌12表达的ace2蛋白可在2-3周后刺激宿主产生抗-ace2抗体16，抗-ace2抗体16可通过封闭宿主细胞表面的ace2受体15而阻断冠状病毒感染。可进而将ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌12作为发酵菌配制于乳制品中，或制成抵抗胃液的ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌微胶囊后配制于酸奶等乳制品中，用于口服接种，使ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌成为正常的益生菌群在肠道长期增殖，发挥益生和抗冠状病毒感染的作用。

在图2中，vero细胞与新冠病毒共同培养时，病毒通过其受体结合区(s1-rbd)与vero细胞表面的ace2受体结合而进入细胞内繁殖，使vero细胞成团脱落、漂浮死亡。

具体实施方式

下面结合图1和图2，举例对本发明的具体实施方法作详细的描述，但这些范例性的描述并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。

1.半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌的构建

敲除嗜酸乳杆菌中的半乳糖苷酶基因(lacf)，构建以lacf为筛选标记的lacf缺陷型嗜酸乳杆菌(lacf^-突变株)，使之不能分解乳糖从而不能在含乳糖的培养基中生长。

将嗜酸乳杆菌基因组中lacf基因的pcr扩增产物连接到克隆载体pmd-19t，构建重组子，然后将该重组子中包含lacf两端同源重组序列和pmd-19t序列的pcr扩增产物连接至质粒载体puc-19，并与突变体lacf的pcr扩增产物进行酶切、连接，使突变体lacf序列替换pmd-19t，实现lacf无义序列的替换(puc-19：δlacf)。将经过t-a克隆的δlacf亚克隆到敲除载体pbr322，鉴定后电转化至嗜酸乳杆菌，筛选出lacf^-突变株，并行southern鉴定。

1.1.嗜酸乳杆菌质粒和dna的提取

1.1.1.将嗜酸乳杆菌接种在mrs液体培养基(取胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、柠檬酸二铵2g、磷酸氢二钾2g、琼脂20g溶解入蒸馏水800ml中，冷却至50℃，以冰醋酸调节ph为6.0-6.5，加入mgso4·7h2o0.58g、mnso4·4h2o0.25g、葡萄糖20g以及吐温801.0ml，最后溶于1000ml，121℃灭菌备用)中，37℃静置培养36小时，收集2-5ml菌液，预先用溶菌酶处理细胞壁，方法是将溶菌酶溶于ph8.0的te缓冲液中，浓度为10mg/ml，将收集的菌液重悬于100μl上述溶菌酶溶液中，37℃作用5～10分钟。

1.1.2.向吸附柱中加入500μl的lb液体培养基(称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠，加双蒸水完全溶解后，用5mol/l的氢氧化钠调节ph至7.0，再定容至总体积1l，高压灭菌后备用；100mllb液体培养基加入29琼脂，灭菌后备用)，12000xg离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，取1.5～5ml菌液室温12000xg离心1min，去上清，加250μl溶液i(含rnasea)，振荡器震荡至菌体完全悬浮，加入250μl溶液ii，颠倒温匀，离心管4～6次，获得澄清的裂解液。

1.1.3.室温孵育2min，加350μl溶液iii，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温12000xg离心10min，小心吸取上清，移至洁净的装配容积2ml离心管的吸收柱中。尽量不要吸入沉淀和细胞碎片，室温12000xg离心1min，至裂解液完全通过吸收柱。

1.1.4弃滤过液，加500μlbufferhb，12000xg离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质，保证dna的纯度，弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μlwashbuffer清洗吸收柱，12000xg离心1min，再加750μlwashbuffer清洗吸收柱。

1.1.5将吸收柱12000xg离心2min，去除乙醇，将吸收柱放入1.5ml离心管，加50μl无菌te缓冲液，置室温2min，12000xg离心2min，将质粒或dna溶液收集到离心管中。

1.2.重组载体pmd-19-lacf的构建

1.2.1.lacf基因引物设计

根据ncbi的乳酸菌靶基因设计lacf引物，leftprimer：aggaaataaaatgacacaarratcacg；rightprimer：cttgaacatcccaacctttca，在两引物的5’端分别加上psti和ecori限制性内切酶序列，合成引物并以双蒸水溶解上下游引物，使其浓度约为20nmol/ml。

1.2.2.lacf基因的pcr扩增

以嗜酸乳杆菌基因组dna为模板扩增lacf基因，pcr扩增体系为ddh2o：36.5μl；10xbuffer：5.0μl；dntps：3.0μl；p1：1.0μl；p2：1.0μl；模版dna：2.0μl；ventpolymerase：0.5μl；总体积为50μl。将以上各组分充分混匀，94℃变性2min按下列参数重复30个循环：94℃15s，60℃20s，72℃1min；72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析后，按有关公司pcr纯化试剂盒说明书进行纯化。

1.2.3.感受态细胞的制备

①从4℃保存的平板中挑取一个e.colitop10f’单菌落，转到含有2mllb培养基的试管中，37℃，190rpm摇过夜，取菌液300μl接种至30mllb培养基中，37℃190rpm摇2.5h(菌液稍浑浊)(od600＝0.2-0.4)，培养物置冰浴10-15min，使培养物冷却至0℃。

②无菌条件下将细菌转移至一个灭菌后用冰预冷的50ml离心管中，4℃离心，4000rpm，10min，回收菌体，加入用冰预冷的0.1mol/l氯化钙15ml重悬菌体。

③冰浴30min，5000rpm4℃离心10min，去上清，倒置于滤纸1min，加入预冷的0.1mol/l氯化钙1ml，重悬菌体，每管分装200μl，置4℃冰箱12-24h即可用于转化。

1.2.4.lacf基因与pmd19-t的连接

①根据pmd19-t载体试剂盒说明书进行连接，首先在在洁净的200μleppendorf管中依次加入solutioni10.0μl，pmd19-t1.0μl，dna片段9.0μl，混匀，16℃连接过夜。

②取20μl连接过夜的载体溶液，取感受态细胞置冰上解冻30min，加入2μl质粒载体，放入冰浴中30min，转入42℃水浴90s(绝不能摇晃ep管，温度一定要调好)，再置冰浴2min，加入预热至37℃的lb液体培养基800μl，轻柔混匀，然后在37℃，150rpm振荡培养1h。

③取100μl已转化的感受态细胞均匀铺于含有40μlx-gal，7μltptg，含amp的lb板上，待平板中的液体吸收后，倒置平板，37℃恒温培养过夜，将平板取出，置于4℃冰箱放置3-4h，使充分显色，在蓝斑附近挑选无突变性的阳性克隆白色菌落10个过夜培养后作质粒提取，质粒提取的详细步骤同前。

④重组载体的酶切鉴定：将上述提取的质粒置洁净的200μleppendorf管中，用psti和ecori进行双酶切，酶切体系为重组载体6.0μl，10xhkbuffer2.0μl，psti和ecori各1.0μl，ddh2o10.0μl，混匀后，37℃反应3h，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后观察结果，将经酶切鉴定后的阳性重组子菌液进行测序鉴定。

1.3.lacf基因敲除载体的构建

1.3.1.引物设计

根据重组载体pmd-19-lacf设计引物(包括lacf基因两端的同源重组序列及pmd19-t载体)，leftprimer：gacccgatractaatrcgact；rightprimer：ttagccagcaatgacaatcgc。

1.3.2.pcr扩增lacf1-pmd19-t-lacf2

以构建的重组载体pmd-19-lacf为模板，利用上述引物扩增目的片段，包括lacf基因两端的小片段同源重组序列(命名为lacf1、lacf2)及pmd19-t载体片段，扩增体系为ddh2o：36.5μl、10xbuffer：5.0μl、dntps：4.0μl、p1：1.0μl、p2：1.0μl、模版dna：2.0μl、ventpolymerase：0.5μl、总体积：50.0μl。将以上各组分充分混匀，94℃变性2min；按下列参数重复30个循环：94℃15s，60℃20s，72℃1min；72℃延伸10min，4℃保存，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，用pcr纯化试剂盒纯化，具体操作参照试剂盒说明。

1.3.3.lacf敲除载体(pbr322-δlacf)的构建

将扩增的目的片段(lacf1-pmd19-t-lacf2)与puc-19载体连接(连接体系同上)，并转化至e.colitop10f’感受态细胞(操作同上)，提取质粒(lacf1-pmd19-t-lacf2-puc-19)，用noti分别酶切lacf1-pmd19-t-lacf2-puc-19和突变体lacf(δlacf)的pcr产物，两者纯化回收后进行连接，使δlacf替换lacf1-pmd19-t-lacf2-puc-19中的pmd19-t片段，实现lacf无义序列的替换，并做pcr、psti和ecori双酶切鉴定(体系同上)，然后将酶切片段(δlacf)连接回pmd19-t载体(连接过程同上)，并用psti、ecori双酶切鉴定，继之将酶切片段(δlacf)连接到pbr322敲除载体并进行酶切鉴定，构建pbr322-δlacf(图1)。

1.4.半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌的构建与鉴定

1.4.1.嗜酸乳杆菌感受态细胞的制备

①从-80℃冰箱中取出嗜酸乳杆菌，接种于mrs琼脂平板，在37℃培养箱中培养18h，传代3次，取单菌落接种于30mlmrs液体培养基中，并于37℃静置培养36h。

②将培养物转移到含有1％甘氨酸的30mlmrs培养液中，37℃静置培养4-5h，至od值约为0.4-0.6(嗜酸乳杆菌生长平台早期)，将培养物置于冰浴中10～20min，使细菌停止生长。

③收集菌体：低温离心7000×g，4℃离心15min，弃上清收集菌体。

④将菌体在冰上放置10min，加入与培养液等体积的0℃电击缓冲液重悬细菌，4000xg，4℃离心30min，弃上清，收集菌体，并重复操作。

⑤去除残留液体，加入100-200μl预冷的电击缓冲液重悬菌体，感受态细胞在30min内用于电转化。

1.4.2.电转化

①将浓度约为100ng/μl的质粒dna(pbr322-δlacf)2μl加入含有40μl感受态细胞的预冷的无菌电极杯(内径为0.2cm)中，轻轻敲击电极杯，确保液体位于杯底部，冰浴5min。

②电击的操作步骤按电击仪的要求进行，电击时选择的参数：电压为1.8kv，电容为25μf，电阻为200欧释放电脉冲。电击完成后，敲除质粒pbr322-δlacf被转化至嗜酸乳杆菌，发生同源重组，使突变序列(δlacf)整合到菌体的染色体上，替换靶基因laef。

③细胞缓冲液用高渗mrs培养基(加无菌10％的蔗糖)稀释到800μl，37℃孵育5h，取100μl菌液，加入含5μg/ml四环素mrs平板上，用无菌玻璃棒将细菌均匀涂布到平板表面，待平板干燥后，倒置在37℃温箱中培养48～72h，观察平板上转化子情况，挑选数个阳性转化子作下一步的鉴定。

1.4.3.半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌的筛选

①影印接种法：将丝绒包在直径小于平皿的圆柱台上，固定为影印接种工具，灭菌备用。将待测的菌液涂布于完全培养基表面上培养，待长出菌落后，用影印接种工具在此平板上轻按一下，然后在另一基础培养基平板上轻轻按一下。经培养后，基础培养基上长出的菌落与母平板上的菌落位置相对应，比较影印平板与母平板上的菌落生长情况，即可在相应位置的母平板上筛选出半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌(突变型)菌落。

②在m17培养基(取植物蛋白胨5.0g，酵母提取物5.0g，聚蛋白胨5.0g，抗坏血酸0.5g，牛肉浸膏2.5g，β-甘油磷酸二钠19g，琼脂15g，mgso47h2o0.01g，蒸馏水1000ml，高压灭菌15min，冷却备用)中添加0.5％葡萄糖，作为碳源，此为完全培养基，将上一步挑选到的菌株接种在该培养基上，37℃培养48～72h，观察平板上细菌的生长情况。然后利用影印接种法，将生长出的菌落转印至基础培养基(m17培养基中添加0.5％的乳糖作为唯一的碳源)上，筛选lacf^-突变株(半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌不能在含乳糖培养基中生长)

1.4.4.southern法鉴定(按说明书操作)

①提取突变株的基因组dna，用限制性内切酶xbai酶切基因组dna过夜。

②将酶切产物电泳分离，电转印，步骤如下：将胶平放于干净投影胶片上，裁剪一张与胶相同大小的尼龙膜或nc膜，用0.5×tbe浸湿后平铺在胶表面，用玻棒除去凝胶和膜之间的气泡，裁剪6张同样尺寸的滤纸，用0.5×tbe浸湿后平铺于膜上，用玻棒去除气泡，在胶的另一面同样铺上6层0.5×tbe浸湿的滤纸，除气泡，将“滤纸-尼龙膜(nc膜)-凝胶-滤纸”转印装置移入电转印仪中，使膜面向阳极，凝胶面向阴极，室温下，100ma转印60min。

③取出膜在2×ssc中浸泡20min，将膜dna面朝上置于滤纸上，再覆盖一张滤纸，60℃烤膜30min。将膜放入杂交管内，加预杂交液，60℃封闭4-6h。倒出预杂交液，加杂交液，60℃杂交过夜，再将膜放在bufferi(2×ssc、0.1％sds)中，室温洗2次，每次摇动10min，再在bufferii(0.5×ssc、0.1％sds)中漂洗2次，每次摇动20min，筛选lacf^-突变株。

2.半乳糖苷酶互补型质粒(pplac)的构建

以提取的乳酸菌质粒(pnz9530)为模板，扩增其复制子(repa-repc)和nisin的启动子(pnis)，并合成mcs多克隆位点，连接至pmd-19-t载体，同时将lacf克隆至该载体，构建以lacf为选择标记的半乳糖苷酶互补型质粒(pplac)，将该质粒转化上述构建的lacf缺陷型嗜酸乳杆菌(lacf^-突变株)，使之恢复野生型嗜酸乳杆菌的利用乳糖能力。

2.1.乳酸菌复制子区(repa-repc)的扩增

以pnz9530质粒为模板，设计复制子区(repa-repc)引物进行pcr扩增，leftprimer：cgttcagaggagcaaccttc；rightprimer：tgagtctggatctgcacagg，扩增体系为ddh2o：36.5μl、10xbuffer：5.0μl、dntps：4.0μl、p1：1.0μl、p2：1.0μl、模版dna：2.0μl、ventpolymerase：0.5μl、总体积：50.0μl。将各组分充分混匀，94℃变性2min。按下列参数重复30个循环：94℃15s，60℃20s，72℃1min；72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，用pcr试剂盒纯化回收，将repa-repc克隆到pmd-19-t载体，酶切鉴定。

2.2.nisin启动子pins的扩增

以pnz9530质粒为模板，设计特异的引物，扩增nisin启动子pins，leftprimer：tcttcacccagagcctcact；rightprimer：accccgttctgacttccttt，pcr扩增体系同上，扩增产物电泳鉴定并回收。为了连接pins和repa-repc两个片段，设计2对引物，分别命名为pinsl-repl(l：tcttcacccagagcctcact；r：tcatgggcatcgttcagaggagcaaccttc)和repr-pinsr(l：tgagtctggatctgcacagg；r：cgaagggggtaccccgttctgacttccttt)，以回收纯化的pins和repa-repc为模板，采用pinsl-repl进行第一轮扩增。取1.0μl扩增产物作为模板，加入新的引物，对repr-pinsr进行第二轮pcr扩增。由于2种引物对的5’末端均有一段10余个碱基组成的反向互补序列，因此，经过2轮pcr扩增后，pins和repr-pinsr片段被连接成环状。

2.3.多克隆位点(mcs)合成

设计包含ncoi、psti、sphi、kpni、spei、xbai、saci酶切位点的mcs正反义链，其包含的序列长度如下：f-ggcactcaccatgggtactgcaggcatgcggtaccactagttctagagagctcaagct；r-agcttgagctctctagaactagtggtaccgcatgcctgcagtacccatggtgagtgcc，交公司合成，经过退火处理，酶切后连接至上述pmd-19-t载体，并选取其中psti、sphi做单酶切鉴定。

2.4.lacf克隆转化

从本发明构建的重组质粒pmd-19-t-lacf中扩增出lacf基因，并连接至上述已克隆连接repa-repc、pins和mcs的pmd-19-t载体，构建半乳糖苷酶互补型质粒(pplac)，将该质粒电转化(步骤同前)至lacf缺陷型嗜酸乳杆菌株，然后提取质粒直接电泳观察条带，并以质粒为模板进行pcr扩增以及筛选能在含5％乳糖的m17培养基上恢复了生长的菌株。

3.ace2过表达的半乳糖苷酶互补型质粒的构建

将ace2基因敲入上述构建的半乳糖苷酶互补型质粒(pplac)，构建同时表达ace2基因和半乳糖苷酶基因的ace2过表达半乳糖苷酶互补型质粒(ace2-lacf-pplac)。

3.1.ace2基因引物设计及pcr扩增

根据genbank的人ace2mrna序列优化密码子、设计pcr引物，扩增人ace2的外端引物：f1(fout)5’-gatggagtaccgactggagtc-3’，r1(rout)5’-ctaatatcgatggaggcataa-3’，产物547bp。内端引物：f2(fin)5’-gaggaggatgtgcgagtggcta-3’，r2(rin)5’-ccaaccactatcactcccatca-3’，产物269bp。人β-actin的扩增引物序列：f5’-gctcgtcgtcgacaacggctc-3’，r5’-caaacatgatctgggtcatcttct-3’，产物353bp。或者扩增hace2基因的上游引物cmv-f：5’-cgcaaatgggcggtaggcgtg-3，下游引物ef1-rn：5’-gccagtacacgacatcactt-3’，β-actin的上游和下游引物分别为5’-tggacttcgagcaagagatgg-3’、5’-atctccttctgcatcctgtcg-3’。

然后根据pmd-19-t载体的多克隆位点(mcs)所包含的ncoi、psti、sphi、kpni、spei、xbai、saci酶切位点，选择其中2个酶切位点(psti和sphi)，在ace2引物中添加psti和sphi的酶切序列，以设计的ace2基因引物扩增质粒pc-dna3.1-hygro(+)-mace2或组织样本中的ace2，pcr条件：94℃5min，然后94℃变性30s、55℃退火30s、68℃延伸5min，循环30次，最后于68℃延伸10min。

3.2.ace2过表达半乳糖苷酶互补型质粒(ace2-lacf-pplac)的构建

琼脂糖凝胶电泳回收ace2基因的pcr产物的目的条带，并连接上述构建的pmd-19-t载体，转化e.colidh5α感受态细胞，重组菌株dh5α-pmd19-t-ace2涂布于含氨苄青霉素(10μg/ml)的lb固体培养基上，置于37℃培养箱培养过夜，选择阳性克隆，提取质粒，经pcr及psti和sphi双酶切鉴定后送公司测序验证，筛选含ace2-lacf⁺质粒的菌株。

4.以嗜酸乳杆菌为载体的新冠病毒ace2疫苗的制备

将ace2过表达半乳糖苷酶互补型质粒(ace2-lacf-pplac)转染半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌，构建同时表达ace2基因和半乳糖苷酶基因的重组嗜酸乳杆菌(命名为ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌，即为以嗜酸乳杆菌为载体的新冠病毒ace2疫苗)。其中ace2基因表达的ace2蛋白为新冠病毒的受体，具有中和病毒rbd的作用；ace2蛋白刺激宿主产生的抗体具有中和宿主细胞表面ace2受体的作用，两者均有抗新冠病毒感染的作用；而半乳糖苷酶基因(lacf)为非抗生素抗性的食品级筛选标志，其表达可使半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌(lacf^-突变株)恢复在乳糖培养基中生长的能力。

4.1.半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌感受态细胞的制备

①从-80℃冰箱中取出lacf^-嗜酸乳杆菌，接种于mrs琼脂平板，在37℃培养箱中培养18h，传代3次，取单菌落接种于30mlmrs液体培养基中，并于37℃静置培养36h。

②将培养物转移到含有1％甘氨酸的30mlmrs培养液中，37℃静置培养4-5h，至od值约为0.4-0.6(嗜酸乳杆菌生长平台早期)，将培养物置冰浴中10～20min，使细菌停止生长。

③收集菌体：低温离心7000×g，4℃离心15min，弃上清收集菌体。

④将菌体在冰上放置10min，加入与培养液等体积的0℃电击缓冲液重悬细菌，4000xg，4℃离心30min，弃上清，收集菌体，并重复操作。

⑤去除残留液体，加入100-200μl预冷的电击缓冲液重悬菌体，lacf^-嗜酸乳杆菌(lacf^-突变株)感受态细胞在30min内用于电转化。

4.2.电转化

①将浓度约为100ng/μl的ace2-lacf-pplac2μl加入含有40μl感受态细胞的预冷的无菌电极杯(内径为0.2cm)中，轻轻敲击电极杯，确保液体位于杯底部，冰浴5min。

②电击的操作步骤按电击仪的要求进行，电击时选择的参数：电压为1.8kv，电容为25μf，电阻为200欧释放电脉冲，电击完成后，细胞缓冲液用高渗的mrs培养基(加无菌10％的乳糖)稀释到800μl，37℃孵育5h，取100μl菌液，加入含5μg/ml四环素mrs平板上，用无菌玻璃涂布棒将细菌均匀涂布到平板表面。

③待平板干燥后，倒置在37℃温箱中培养48～72h，观察平板上转化子(ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌)情况，挑选数个阳性转化子作下一步的鉴定。

4.3.ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌的鉴定

4.3.1.鉴定重组质粒

①质粒大小：对阳性克隆进行质粒提取，通过质粒与空载体的大小比较，进行初步判断。

②southern法(按说明书操作)：取ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌的基因组dna，用psti和sphi酶切基因组dna过夜。将酶切产物电泳分离，电转印，步骤如下：将胶平放于干净投影胶片上，裁剪一张与胶相同大小的尼龙膜或nc膜，用0.5×tbe浸湿后平铺在胶表面，用玻棒除去凝胶和膜之间的气泡，裁剪6张同样尺寸的滤纸，用0.5×tbe浸湿后平铺于膜上，用玻棒去除气泡，在胶的另一面同样铺上6层0.5×tbe浸湿的滤纸，除气泡，将“滤纸-尼龙膜(nc膜)-凝胶-滤纸”转印装置移入电转印仪中，使膜面向阳极，凝胶面向阴极，室温下，100ma转印60min。取出膜在2×ssc中浸泡20min，将膜dna面朝上置于滤纸上，再覆盖一张滤纸，60℃烤膜30min。杂交和洗膜：将膜放入杂交管内，加预杂交液，60℃封闭4-6h。加杂交液，60℃杂交过夜，再将膜放在bufferi(2×ssc、0.1％sds)中，室温洗2次，每次摇动10min，再在bufferii(0.5×ssc、0.1％sds)中漂洗2次，每次摇动20min。

③参照文献，以pcr、酶切、测序鉴定质粒。

4.3.2.鉴定lacf基因表达

①影印接种法：将丝绒包在直径小于平皿的圆柱台上，固定为影印接种工具，灭菌备用。将待测的菌液涂布于完全培养基表面上培养，待长出菌落后，用影印接种工具在此平板上轻按一下，然后在另一基础培养基平板上轻轻按一下。经培养后，基础培养基上长出的菌落与母平板上的菌落位置相对应，比较影印平板与母平板上的菌落生长情况，即可在相应位置的母平板上筛选出表达lacf(ace2-lacf双表达)的嗜酸乳杆菌菌落。

②乳糖利用法：在m17培养基中添加0.5％葡萄糖，作为碳源，此为完全培养基，将上一步挑选到的菌株接种在该培养基上，37℃培养48～72h，观察平板上细菌的生长情况。然后利用影印接种法，将生长出的菌落转印至m17培养基(m17培养基中添加0.5％的乳糖作为唯一的碳源)上，筛选出目的菌株(半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌不能在含乳糖培养基中生长，而成功转染了ace2-lacf-pplac质粒的嗜酸乳杆菌能生长)

4.3.3.鉴定ace2基因表达

①ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌的ace2蛋白提取：以0.5％乳糖为唯一碳源的m17培养基培养嗜酸乳杆菌，然后提取ace2蛋白。

嗜酸乳杆菌分泌蛋白的提取方法：离心分离培养基上清，通过蛋白浓缩管按1∶10的比例进行浓缩，浓缩后的上清与5×蛋白loadingbuffer混匀，煮沸10min。

嗜酸乳杆菌表面蛋白的提取方法：离心分离菌体，pbs洗涤2次后，用终浓度为2％的sds、1％的巯基乙醇将菌体重悬，70℃水浴作用10min，12000g，4℃，离心10min，取上清与5×蛋白loadingbuffer混匀，煮沸10min。

嗜酸乳杆菌内部蛋白的提取方法：离心分离菌体，pbs洗涤2次后，用原体积pbs重悬菌体；利用细胞超声破碎仪对菌体进行超声破碎，具体程序如下：功率40％，超声5s，间隔5s，超声15min。将超声破碎后的样品，12000g，4℃，离心10min，上清和沉淀分离，沉淀保存至-70℃备用，上清与5×蛋白loadingbuffer混匀，煮沸10min。

②sds-page及westernblot检测目的蛋白

sds-page：以预染蛋白maker为标准对照，取20ul制备好的嗜酸乳杆菌目的蛋白样品和空载体对照进行sds-page检测(5％的浓缩胶和12％分离胶)，电泳结束后考马斯亮蓝染色。

westernblot：取20ul制备好的目的蛋白样品和空载体对照进行sds-page，以半干转膜仪，15v恒压50min将目的蛋白转印于尼龙膜上，以5％的脱脂乳室温封闭1h，鼠源单抗(1∶2000)为一抗，红外标记山羊抗鼠igg(1∶5000)为二抗，做westernblot检测。

③ace2蛋白表达位置的检测：将所得ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌的分泌蛋白，表面蛋白及内部蛋白进行sds-page电泳，并进行westernblot检测(方法同上)。

④ace2蛋白表达含量的测定：将目的蛋白进行sds-page电泳，考马氏亮蓝染色后，利用薄层凝胶扫描仪对各条带进行灰度值分析，得到目的条带占总蛋白的百分比；按bca总蛋白检测试剂盒说明书对样品总蛋白进行定量。

⑤ace2蛋白稳定性的测定：为检测菌内ace2蛋白的稳定性，分别在12h、24h、48h、72h、96h、120h进行取样，并通过westernblot(方法同前)检测重组蛋白的代谢变化。

5.以嗜酸乳杆菌为载体的新冠病毒ace2疫苗微胶囊的制备及表征

制备能抵抗胃液作用的以海藻酸钠包被ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌的微胶囊。

5.1.ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌微胶囊的制备

称取海藻酸钠粉末(acrosorganics公司)溶于生理盐水中，制成海藻酸钠溶液备用，将适量的ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌液与上述海藻酸钠溶液混合，缓慢搅拌，使其混合均匀后，于室温下通过喷雾干燥器(buchilabortechnik公司)的蠕动泵将含ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌的海藻酸钠溶液带入设备中，在一定气速作用下，将上述溶液切成小液滴，通过喷嘴喷入浓度为1％wt的氯化钙水溶液中，在300rpm的搅拌下固化液滴，随后，离心洗涤除去多余的氯化钙和未固化的液滴，将收集的微胶囊悬浮在生理盐水中备用。

可在乳清培养基中添加0.6％低聚异麦芽糖、0.6％黄豆粉、10％胡萝卜汁、0.5％caco3，使用20％柠檬酸钠，将培养基调节为ph6.2，37℃静置培养嗜酸乳杆菌，培养20小时的活菌数可达1.20×10⁹cfu/ml。将培养的嗜酸乳杆菌以3.0％(w/v)cacl2溶液(含12.5％微孔淀粉)、0.4％(w/v)海藻酸钠溶液(含0.1％tween-80)、成膜反应时间为15min，通过上述工艺制备微胶囊，通常其微胶囊活菌数为1.6×108cfu/g，包埋产率为92.3％(可以10％脱脂乳粉、4.0％海藻糖、2.0％甘油、3.0％谷氨酸钠、0.2％vc经真空冷冻干燥法将嗜酸乳杆菌制成冻干发酵剂，真空包装，4℃冰箱储存备用)。

5.2.ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌微胶囊的表征

5.2.1.微胶囊粒径及分布测定

微胶囊的粒径大小及其分布采用激光粒度仪(美国coulter公司)进行测定，即将一定量的微球悬浮于去离子水中，超声分散后将其滴加到激光粒度仪的样品池中进行体积平均粒径及粒径分布的测定，按激光粒度仪的检测说明，计算微胶囊的粒径大小及其分布。

5.2.2.微胶囊的形貌观察

采用具有拍摄功能的光学显微镜对微胶囊的形态进行观察、拍照及记录，具体过程如下：使用滴管滴加少量样品于载玻片上，轻轻盖上盖玻片，先在低倍镜下找到合适的视野，再转换到高倍镜进行微胶囊形态观察，同时用wv-cp230/g摄像头(日本panasonic公司)将样品状态拍摄记录，通过形态观察初步评价微胶囊的质量。

5.2.3.微胶囊包埋率测定

将ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌微胶囊置于浓度为0.2mol/l的无菌柠檬酸钠溶液中，在37℃、100rpm条件下将微胶囊裂解30min。待微胶囊完全裂解后，离心收集菌体，重悬于生理盐水中。用生理盐水梯度稀释菌液，分别吸取200μl各浓度梯度菌液涂布于mrs平板中，用无菌涂布器涂布均匀，各稀释浓度做3个重复测定平板，并留下一个平板作空白对照。然后将平板倒置于37℃厌氧培养箱中静置培养48h，观察菌落生长情况，计数菌落。

5.2.4.微胶囊在模拟胃肠环境的释放

按“5.2.3”方法测得微胶囊中的含菌量。将微胶囊浸泡在模拟胃液中，于37℃、100rpm下置于摇床中，然后离心，收集上清中微胶囊在模拟胃肠环境下释放出的嗜酸乳杆菌。上清液用于涂板计数，各稀释浓度做3个重复测定平板。向沉淀中加入模拟肠液，37℃环境下放置在摇床中100rpm，每隔2h离心，收集上清液，用于涂板计数，各稀释浓度做3个重复测定平板，并向沉淀中继续补充模拟肠液，计算微胶囊中含有的活菌数(cfu/ml)。

5.2.5.口服微胶囊在小鼠体内分布

使用cy7-nhs荧光染料标记嗜酸乳杆菌，并制备载嗜酸乳杆菌微胶囊，采用标记的嗜酸乳杆菌及载嗜酸乳杆菌微胶囊给小鼠灌胃给药，采用多功能活体成像系统，对小鼠灌胃后0h、2h、4h、8h、10h和12h的胃肠道进行图像采集，研究载嗜酸乳杆菌微胶囊和嗜酸乳杆菌菌液口服后在小鼠胃肠的分布。

5.2.6.微胶囊免疫调节作用的体内评价

参照有关文献，选择雌性spf级balb/c小鼠(鼠龄为6-8周)，分为空白对照组、菌液组、载菌微胶囊(低、中、高剂量)组，每组20只，分别以生理盐水(20ml/kg)、菌液(10¹⁰cfu/d)、嗜酸乳杆菌微胶囊(10⁸cfu/d、10⁹cfu/d、10¹⁰cfu/d)连续灌胃0-14天，然后分别在第0、7、14和21天检测小鼠摄食量和体重、粪便内微生物菌群、肠道上皮细胞增殖水平、胸腺指数、淋巴细胞激活、脾脏巨噬细胞吞噬活性、血清抗体水平、血清细胞因子分泌水平、外周血t淋巴细胞亚群以及嗜酸乳杆菌调节肠道微生态后对口服免疫效应的影响(检测肠黏膜iga抗体水平、小鼠肠道上皮细胞增殖水平、肠洗液中ccl2的分泌水平、肠组织细胞表面分子cd11c与共刺激因子cd86的表达水平)，进行统计学分析(以p＜0.05为显著性差异界限)。

6.以口服乳制品预防新冠病毒感染的ace2疫苗制备

以所制ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌、ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌冻干发酵剂或ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌微胶囊替代现有技术的嗜酸乳杆菌或其他发酵菌，制备酸奶、胶囊、片剂、粉剂、口服液、保健品等抗新冠病毒感染的发酵乳制品，如在牛奶中接种ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌，在合适的温度(如40℃-42℃)下大量繁殖(发酵)，把牛奶中的乳糖分解成乳酸，酸度逐渐下降，当达到ph4.6左右的时候，牛奶中的酪蛋白就会缓慢地沉降下来，形成细腻的凝冻，整体溶液的粘度也会增加，就形成了酸奶。通常饭后2小时胃酸被稀释，胃内的酸碱度(ph值3-5)较适合乳酸菌生长，是喝酸奶的最佳时间，此时的ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌，特别是微胶囊包裹的ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌不易被胃酸杀死而进入肠道定植、繁殖，在乳糖的诱导下，重组菌中的ace2基因表达ace2蛋白，随后ace2蛋白刺激机体产生抗-ace2抗体，其中ace2蛋白因能封闭冠状病毒受体结合区s1-rbd而能防止病毒感染，抗-ace2抗体因能封闭宿主细胞表面的ace2受体而能竞争抑制病毒感染。此外嗜酸乳杆菌作为正常菌群进入肠道后，具有改善肠道免疫功能、帮助消化吸收、降胆固醇、抗过敏、抗幽门螺旋杆菌感染等作用以及产生泛酸、尼克酸、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素k及短链脂肪酸、抗氧化剂、氨基酸等有益物质。

本发明的载体包括用于递送ace2基因的干细胞、干细胞系、纳米粒、微生物及人工载体；本发明的益生菌株包括但不限于乳球菌、粪链球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、拉曼乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、长双歧杆菌、金双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、沙门氏菌以及以亚硝基胍诱导伤寒沙门氏菌非定点突变得到的ty21a血清型变异株；本发明的载体或质粒还包括但不限于乳酸菌表达载体如pnz8148、pleiss、pmg36e、pbbr1mcs-5、pbbr1mcs-6、prv610、plem415、phy300plk、nz9000、mg1363、pbargpe1、pan7-1、pbht1、pbig2rhph2-gfp-gus、pnz8149及其分泌型表达载体如pve5523、ppg611.1、ppg612.1、胞外锚定质粒ppg1、分泌型质粒ppg2；枯草芽孢杆菌载体如pma5、phcmc05、pgfp22、pgfp315、php13、php13-43、phy-43、pwb980、paox1、mg1363、pnz8148、nz9000、pnz9530、pmg36e；乳酸酵母表达载体如pklac1、gg799；酿酒酵母表面展示系统如pyd1、eby100；酿酒酵母表达载体如pyes2、pyes2-flag、pyes2nta、ntb、ntc、pyes3ct、pyip5、pyrp7、padh2、prsh41、pdc315、pdf15、pug6、pesc-his、bfd14、bfd15、pdnr1、p334、pdr195、prs316，prs316ha、yeplac112、ycplac33、ycplac22-egfp、yeplac195、yeplac181、yip211、pyx212、pyx212-vhb。

本发明的接种方式包括但不限于口服和呼吸道吸入；本发明的表达基因包括但不限于人ace2基因；本发明包括优选ace2基因、益生菌载体、克隆载体或表达载体、分泌型表达载体、胞外区基因、胞壁基因，进行最佳匹配，构建各种高效表达分泌型ace2蛋白、益生菌表面ace2蛋白及益生菌内ace2蛋白的以益生菌为载体的ace2疫苗，如将ace2基因与分泌型基因或分泌型载体连接，构建能表达游离于菌体外或定位于菌体表面的ace2蛋白的疫苗。

例如将ace2基因与乳酸菌内源基因pepn或细胞壁锚定基因prtb及载体进行酶切、连接，构建重组载体，使ace2基因和pepn基因融合表达定位于乳酸菌细胞壁表面的ace2-pepn融合蛋白(pepn蛋白是乳酸菌胞壁主要结构蛋白)，进而制成各种微胶囊、乳制品或生物制剂。或以s1-rbd基因、il-10基因替换ace2基因，然后与胞外锚定质粒或分泌型质粒构建重组质粒，进而转化益生菌，使重组益生菌持续表达s1-rbd、il-10而起抗病毒感染作用。或以ace2基因、s1-rbd基因、il-1o基因、益生菌、分泌型载体或质粒、胞外区基因和胞壁基因进行优选组合，构建表达相应分泌型蛋白、益生菌表面蛋白和/或益生菌内部蛋白的载体，然后转化益生菌，制成口服或喷雾接种的疫苗。

7.ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌的抗病毒功能检测

7.1.ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌的准备

从-80℃冰箱中取出lacf^-突变株嗜酸乳杆菌(下称lacf^-株)及ace2-lacf双表达嗜酸乳杆菌(下称ace2-lacf株)，分别接种于mrs琼脂平板，在37℃培养箱中培养18h，传代3次，分别取单菌落接种于mrs和m17液体培养基(m17培养基中添加0.5％的乳糖作为唯一的碳源)，37℃培养48～72h，观察平板上细菌的生长情况，至od值约为0.4-o.6(嗜酸乳杆菌生长平台早期)时，将培养物以7000×g，4℃离心15min，分离培养液及菌体备用。

7.2.病毒液的准备

将vero细胞接种于含dmem培养液(10％胎牛血清)的25cm²培养瓶中，置36℃5％co2培养箱中培养成30％汇合度的单层细胞，吸去培养液，用dmem清洗细胞2遍，然后加入0.5ml经双抗处理的covid-19患者咽拭样本，置36℃5％co2培养箱中吸附90min后，吸去样本，加入3-5mldmem培养液(10％胎牛血清)，每天观察细胞病变效应(cpe)，培养5～7d后，取病变细胞上清液进行蔗糖梯度超速离心，分离病毒，分别用ace2-lacf株培养液和lacf^-株培养液配成1o³～1o⁵tcid50/ml病毒液，分别称ace2-lacf株病毒液和lacf^-株病毒液。

7.3.ace2-lacf株培养液(ace2)和lacf^-株培养液的体外抗病毒对比检测

7.3.1.vero细胞的准备

将vero接种于含dmem培养液(10％胎牛血清)的24孔板中，置36℃5％co2培养箱中培养成30％汇合度的单层细胞，吸去培养液，用dmem清洗细胞2遍，分为ace2-lacf株组和lacf^-株组，每组12孔，然后分别加入0.5ml的ace2-lacf株病毒液和lacf^-株病毒液，每天观察cpe，并以rt-pcr分别检测培养至第1、3、5、7天的培养液的病毒rna(每天各3孔混合)。

7.3.2.rt-pcr检测病毒rna的方法

核酸提取试剂盒、新型冠状病毒(orf1ab/n)核酸检测试剂盒(批号：20200123)和da3200核酸提取仪，购自中山大学达安基因股份有限公司，abi7500型pcr仪购自美国thermofisherscientific。按试剂盒说明书操作，扩增反应条件为：50℃15min；95℃15min；94℃15s；55℃45s；共45个循环，在55℃采集荧光信号。

根据试剂盒说明，结果判断标准如下：①如果检测样本在orf1ab和n基因通道无扩增曲线或ct值＞38，判为sars-cov-2阴性；②如果检测样品在orf1ab和n基因通道ct值≤38，且有明显的扩增曲线，判为sars-cov-2阳性；③如果检测样品在orf1ab或者n基因通道ct值≤38，另一通道无扩增曲线，复检结果与原来结果一致，判为sars-cov-2阳性。

7.3.3.病毒rna检测结果

在表1中，当vero细胞分别与ace2-lacf株病毒液和lacf^-株病毒液混合培养1天时，各自培养液病毒rna检测结果的阳性滴度分别为1∶36、1∶324；在表2中，当vero细胞分别与ace2-lacf株病毒液和lacf^-株病毒液混合培养3天时，各自培养液病毒rna检测结果的阳性滴度分别为1∶324、1∶2916，此时lacf^-株病毒液组中有1孔的vero细胞出现细胞病变效应(cpe)；在表3中，当vero细胞分别与ace2-lacf株病毒液和lacf^-株病毒液混合培养5天时，其培养液病毒rna检测结果的阳性滴度分别为1∶2916、1∶8748，此时ace2-lacf株病毒液组中有2孔的vero细胞出现cpe，lacf^-株病毒液组中新增3孔的vero细胞出现cpe；在表4中，当vero细胞分别与ace2-lacf株病毒液和lacf^-株病毒液混合培养7天时，各自培养液病毒rna检测结果的阳性滴度分别为1∶17496、1∶17496以上，此时ace2-lacf株病毒液组中新增3孔的vero细胞出现cpe，lacf^-株病毒液组中新增4孔的vero细胞出现cpe。上述说明ace2-lacf株病毒液比lacf^-株病毒液具有较强的抑制病毒感染vero细胞的作用，特别是在感染早期病毒量较少时这种抑制作用更明显，但随着病毒的大量繁殖，这种抑制作用相对变小。间接说明ace2-lacf株病毒液中的ace2蛋白能在一定程度上抑制病毒感染。

表1vero分别与ace2-lacf株及lacf^-株病毒液混合培养1天的培养液病毒rna检测结果

表2vero分别与ace2-lacf株及lacf^-株病毒液混合培养3天的培养液病毒rna检测结果

表3vero分别与ace2-lacf株及lacf^-株病毒液混合培养5天的培养液病毒rna检测结果

表4vero分别与ace2-lacf株及lacf^-株病毒液混合培养7天的培养液病毒rna检测结果

7.4.ace2-lacf株和lacf^-株吸附病毒功能的对比检测

7.4.1.制备ace2-lacf株和lacf^-株的病毒培养液

同上以mrs液体培养基分别培养ace2-lacf株和lacf^-株，分别收集菌株，制成10⁵/ml的菌液，以每瓶3ml菌液各接种3瓶(25cm²培养瓶)，在相同条件下培养24-48h，待菌株生长汇合度达50-60％时去除培养液，每瓶分别加5ml相同量的10³～10⁵tcid50/ml病毒液，继续培养24-48h，分别分离培养液和菌株，然后将各自3瓶混合，rt-pcr检测病毒rna。

7.4.2.rt-pcr检测病毒rna的方法

同7.3.2，参照rt-pcr检测说明书操作。

7.4.3.病毒rna检测结果

表5说明，ace2-lacf株因菌体表面的ace2蛋白吸附了病毒，所以其菌体的病毒rna检测结果明显高于其培养液；而lacf^-株因菌体表面没有ace2蛋白吸附病毒，所以其菌体的病毒rna检测结果明显低于其培养液。说明表达在ace2-lacf株表面的ace2能与宿主细胞竞争吸附病毒，所以能竞争抑制宿主细胞吸附、感染病毒。

表5ace2-lacf株和lacf^-株吸附病毒后的培养上清液及菌体病毒rna对比检测结果

7.5.ace2-lacf株诱导的抗-ace2抗体及其抗病毒检测

7.5.1.动物接种

选择6-8周龄、40克左右的spf级雌性balb/c小鼠，随机分为ace2-lacf株组和lacf^-株组，每个试验组10只，又分为低、中、高剂量组，分别给小鼠隔天喂服含2×10⁹、2×10¹⁰和2×10¹¹cfu/ml的ace2-lacf株或lacf^-株的食物，另设阴性对照组，喂服不含菌株的相同食物，于第21天分别取小鼠的血液及粪便检测抗-ace2抗体(ace2-ab)。

7.5.2.检测原理和方法

应用双抗原夹心法测定人ace2-ab。以ace2包被微孔板，然后加入ace2-ab，再加hrp标记的hace2，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过洗涤、底物tmb显色，转化成蓝色，颜色的深浅和样品中的ace2-ab呈正相关，用酶标仪测定450nm吸光度(od)，通过标准曲线计算ace2-ab的浓度。

具体操作按说明书：制备100u/l、50u/l、25u/l、12.5u/l、6.25u/l的标准品，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔和对照孔，在标准孔中准确加各标准品50μl，在待测样品孔中加样品稀释液40μl、再加待测样品(小鼠血清或粪便上清液)10μl，在对照孔中加对照样品(对照组小鼠的血清或粪便上清液)轻轻晃动混匀，用封板膜封板后置37℃温育30分钟，小心揭掉封板膜，弃液体，甩干，加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干，每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外，再用封板膜封板后重复上述操作，然后每孔先加显色剂a50μl，再加显色剂b50μl，轻轻混匀，37℃避光显色15分钟，终止反应，以空白调零，450nm波长测量各孔的od值，以标准品的浓度为横坐标，od值为纵坐标，绘制标准曲线，按样品od值查出浓度，取均值。

7.5.3.ace2-ab的检测结果

由表6～8可知，接种中、高剂量的ace2-lacf株的小鼠血清和粪便中ace2-ab均显著增高，说明ace2基因表达的ace2蛋白刺激小鼠产生了ace2-ab。

表6低剂量组小鼠第21天血清和粪便ace2-ab检测结果

表7中剂量组小鼠第21天血清和粪便ace2-ab检测结果

表8高剂量组小鼠第21天血清和粪便ace2-ab检测结果

7.5.4.ace2-ab的抗病毒检测

①将ace2对照组的ace2-ab(兔抗ace2抗体)和ace1对照组的ace1-ab(兔抗ace1抗体)分别配成0.05、0.5、5、50和100ug/ml，然后分别与1×10⁴个vero细胞混合；同时将喂服低、中、高剂量的ace2-lacf株的小鼠血清(ace2-ab)和喂服低、中、高剂量的ace2-lacf株的小鼠粪便上清液(ace2-ab)分别与1×10⁴个vero细胞混合。

②将上述混合物置37℃水浴1h，分别用dmem基础液洗涤细胞3次，然后分别用2mldmem培养液(10％fbs)混悬细胞，移入12孔板，每孔加入20ul10³tcid50/ml病毒液，置37℃、5％co2培养箱3～5天，每天观察细胞病变效应(cpe)。

③用台盼蓝染色法计数1000个细胞中的活细胞和死细胞数目，计算细胞成活率(成活率＝未染色的细胞数/观察的细胞总数)。

④结果发现，当ace2对照组的ace2-ab浓度分别为0.05、0.5、5、50和100ug/ml时，相应的细胞成活率分别为55％、60％、75％、85％和85％；当ace1对照组的ace1-ab浓度分别为0.05、0.5、5、50和100ug/ml时，相应的细胞成活率均为10～15％；而喂服ace2-lacf株低、中、高剂量的小鼠血清的细胞成活率分别为35％、60％、65％，喂服ace2-lacf株低、中、高剂量的小鼠粪便上清液的细胞成活率分别为35％、65％、65％。

⑤说明ace1-ab没有抗病毒作用，而ace2-ab和本发明所述ace2-ab具有抗病毒作用。