本发明涉及生物制药
技术领域：
，尤其涉及一种用于中和抗体的免疫佐剂及其制备方法。
背景技术：
：中和抗体是一种特殊的抗体，可与细菌毒素、病原体(如病毒)及其产物特异性结合并发挥中和作用。现在也将能够与特定蛋白质，如pd1/pdl1等活性蛋白质结合并阻断其功能的抗体称为中和抗体。以病毒感染为例，病毒入侵细胞时需要依赖自身表达的特定分子(配体)与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。机体会产生相应的抗体，其中有一部分抗体，能够与病毒表面的抗原结合，并直接阻止病毒黏附靶细胞受体，防止病毒侵入细胞。这部分抗体就是中和抗体。中和抗体与普通的结合抗体相比，有很大区别。在病毒感染过程中，大多数抗体是普通的结合抗体，这些抗体通过与抗原结合，向t-淋巴细胞发出该抗原已被锁定的信号，激发细胞免疫反应，并进摧毁一步病毒。而中和抗体与病毒结合后，可以直接阻断病毒的进一步感染，这一功能不需要通过激活t-淋巴细胞系统，就可以完成。由于具备以上特性，中和抗体在疫苗和抗体药研发中，起着非常重要的作用。近年来，以pd1/pdl1抗体为代表，阻断特定蛋白质功能，并进一步发挥治疗作用的中和抗体也受到了广泛关注。中和抗体在疫苗和生物药制备中有着广泛应用，但中和抗体制备存在成功率低，工作量大，筛选复杂等难题。技术实现要素：本发明的目的在于：为了解决中和抗体制备成功率低、工作量大、筛选复杂的问题，而提出的一种用于中和抗体的免疫佐剂及其制备方法。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种用于中和抗体的免疫佐剂，所述佐剂中含有免疫刺激物皂素，具体为每ml佐剂中含有0.16mgmega-10，8mg磷脂酰胆碱，8mg胆固醇，4mg皂素。一种用于中和抗体的免疫佐剂制备方法，包括如下步骤：步骤一、将20gmega-10溶于100ml双蒸水，制成20％溶液；步骤二、称取1g磷脂酰胆碱和1g胆固醇，溶于上述溶液中，使终浓度分别达到10mg/ml；步骤三、用磷酸盐缓冲液pbs(ph6.2)溶解皂素，使有效终浓度达到100mg/ml；步骤四、将176ml不含皂素的pbs，16mlmega-10，磷脂酰胆碱和胆固醇的混合液，8ml皂素溶液混匀，200w冰浴超声10s，间隔10s，反复10次；步骤五、25℃温和混匀2hr；步骤六、将上述溶液置于3kda透析袋中，对pbs溶液进行透析，反复换液10次以上，获得制备好的佐剂。作为上述技术方案的进一步描述：所述佐剂可以冷藏或冷冻，冷藏可保存一年，冷冻可保存三年。综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：本发明中，通过独有的制备方式，用于产生高特异性高效价的中和抗体，提升了制备的成功率，有效降低工作量，并且降低了筛选的难度。具体实施方式下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例一，一种用于中和抗体的免疫佐剂，所述佐剂中含有免疫刺激物皂素，具体为每ml佐剂中含有0.16mgmega-10，8mg磷脂酰胆碱，8mg胆固醇，4mg皂素。一种用于中和抗体的免疫佐剂制备方法，包括如下步骤：步骤一、将20gmega-10溶于100ml双蒸水，制成20％溶液；步骤二、称取1g磷脂酰胆碱和1g胆固醇，溶于上述溶液中，使终浓度分别达到10mg/ml；步骤三、用磷酸盐缓冲液pbs(ph6.2)溶解皂素，使有效终浓度达到100mg/ml；步骤四、将176ml不含皂素的pbs，16mlmega-10，磷脂酰胆碱和胆固醇的混合液，8ml皂素溶液混匀，200w冰浴超声10s，间隔10s，反复10次；步骤五、25℃温和混匀2hr；步骤六、将上述溶液置于3kda透析袋中，对pbs溶液进行透析，反复换液10次以上，获得制备好的佐剂。工作原理：制备及验证单链rna病毒中和抗体：步骤一：扩增病毒将vero细胞培养至80％满，接种病毒液，待细胞病变明显，收集培养上清液，3000rpmx20min，离心去除细胞碎片；步骤二：纯化病毒蔗糖密度梯度离心纯化超速离心纯化制备病毒溶液；在离心管中依次加入30％，45％，60％的蔗糖溶液，120,000g超速离心2.5小时，发现在30％与45％以及45％与60％之间都有一条明亮的带，用长针头将两条不同部位的带都吸取出来，合并病毒液，对pbs透析以去除蔗糖；步骤三：免疫小鼠a)制备佐剂，并用edc法偶联腺病毒颗粒与纳米佐剂，将混合物冷冻保存；b)取实验组小鼠，于双后肢足垫处皮下注射免疫原，每侧30ul，初次免疫后2周追加免疫，每2周1次，共3次；c)另设弗氏佐剂对照组，将弗氏佐剂与病毒液混匀，乳化，分三次注射至小鼠皮下及腹腔，第一次为弗氏完全佐剂，第二次和第三次为弗氏不完全佐剂；步骤四：检测小鼠效价小鼠编号ck0.5k1k2k4k8k16k32k64k弗氏佐剂组-10.0460.2050.1590.1300.1190.0870.0820.0880.075弗氏佐剂组-20.0470.5860.4140.2950.2400.2020.1750.1210.109弗氏佐剂组-30.0450.4090.2770.1700.1230.0880.0780.0790.077新型纳米佐剂组-10.0481.0580.8540.7230.6060.4910.3520.2300.191新型纳米佐剂组-20.0491.1560.8930.6260.4620.3390.2550.1600.114新型纳米佐剂组-30.0501.2351.0450.8310.6300.5420.3060.2420.160步骤五：制备单链rna病毒单克隆抗体a)骨髓瘤细胞制备融合前一周，复苏sp2/0细胞，正常培养至对数期；b)脾细胞制备选定要融合的小鼠，融合当天用颈椎脱臼法处死，取脾，标准流程收集脾细胞并计数；c)细胞融合按1:3-1：10的比例混合骨髓瘤细胞和脾细胞，标准流程进行细胞融合操作，随后用hatdmem完全培养基培养，融合后3天即可以看到杂交瘤细胞，第7天换1/2hat完全培养基，第8天换1/2ht培养基。融合后10天左右开始进行筛选检测；细胞融合结果：融合后用hat选择性培养基培养，显微镜下观察，看到多个生长的杂交瘤细胞，证明融合操作成功；d)融合筛选吸取细胞上清100ul/孔进行间接elisa检测，根据elisa结果，判断阳性孔，用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次复检，进一步确认阳性孔；e)亚克隆对复筛的阳性孔细胞做两轮亚克隆，第一次亚克隆有限稀释阳性孔中细胞，至多个孔中，加htdmem培养基培养，7天左右在显微镜下观察，间接elisa检测有克隆生长的孔，取od值高的孔为阳性孔；挑取阳性孔的细胞进行第二次亚克隆，检测出稳定阳性的杂交瘤细胞株，作为最终制备单抗的细胞，并扩大培养；杂交瘤细胞株融合率为87％，间接elisa法筛选，挑选15株强阳性孔进行克隆化培养，经过三次亚克隆，最后得到8株稳定强阳性杂交瘤细胞。步骤六：鉴定中和抗体a)铺板将已长满80-90％的vero细胞消化均匀铺于24孔板中；b)病毒感染细胞长成单层达80-90％吸去培养液，将病毒稀释，共做3个梯度，并向每孔中加入病毒及抗体，实验孔加入200ul稀释好的病毒液和200ul抗体，对照孔加入200ul稀释好的病毒液和200ul培养基，每个效价做3个复孔，置于37℃温箱吸附两小时后弃残液；c)制备2％琼脂糖使用低熔点琼脂糖配方：0.2g加入10ml无菌pbs中，121℃高压灭菌15min，取出后置于55℃水浴锅中待用；将上述琼脂糖和2x维持液(fbs浓度为2％)40～50℃水浴1:1混合后，加入培养板各孔，每孔0.5ml,室温放置30min以上使其冷却凝固成覆盖层；d)培养把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养48h，把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养48h观察，观察每皿蚀斑数量；f)结果抑制率(pi)计算公式为：pi(％)＝(1一实验组噬斑/对照组噬斑)×100g)结论得到三株对该小rna病毒具有中和效能的单克隆抗体杂交瘤细胞株。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12