含有KGF-2的温敏凝胶剂及其对骨关节炎的治疗作用

本发明属于蛋白质药物领域，具体而言，本发明涉及含kgf-2的温敏水凝胶，用于治疗骨关节炎。

背景技术：

骨关节炎(osteoarthritis，oa)是最常见的慢性疾病之一，可导致关节软骨及软骨下骨退行性改变。年龄、肥胖、运动损伤是导致oa的主要病因。随着人口老龄化及肥胖人数的增加，oa已成为全球范围的第四大致残诱因。oa是关节腔内炎性反应、软骨细胞凋亡、软骨细胞外基质(extracellularmatrix，ecm)丧失以及软骨下骨微结构改变等多因素共同作用的结果。患者受累关节伴随活动出现疼痛、肿胀、僵硬及活动度受限等症状，且症状随病程进展而加重，严重影响患者生活质量。迄今为止，临床实践中尚没有能有效延缓oa进展的治疗药物。常规使用的非甾体类抗炎药及皮质类固醇激素只能暂时缓解症状。此外，根据国际骨关节炎研究协会(oarsi)于2014年发布的膝部oa非手术治疗指南，关节腔内注射玻璃酸钠、口服氨基葡萄糖及针灸、电疗等物理治疗手段对于膝部oa症状的缓解效果并不明确，更难以延缓疾病发展。在膝部oa的手术治疗方案中，膝关节置换术的疗效显著，但仅适用于病情处于终末期的老年患者。其余手术方式，包括马赛克镶嵌成形术、微骨折术、自体软骨移植术等不仅无法避免供区病变，术后的再生软骨也多为性能不佳的纤维软骨。

目前富血小板血浆关节腔注射治疗骨关节炎取得了不错的疗效，但是从患者自身提取富血小板血浆不易操作，价格昂贵且可能存在生物安全问题。而富血小板血浆中含有丰富的fgf，vegf等生物大分子蛋白提示我们生长因子类蛋白药物可能在治疗骨关节炎中具有其独特的疗效。角质细胞生长因子-2(kgf-2)又叫fgf10，在软骨分化和修复中发挥重要的作用。hathaitips等利用胚胎干细胞诱导软骨分化的模型中发现外源性给予kgf-2能够增强软骨形成，建立成熟的软骨细胞群。krugerc等发现hoxc8-敲除小鼠表现为软骨缺陷，并且kgf-2基因表达显著下调。liuw等发现kgf-2对维甲酸介导的内耳软骨抑制具有治疗作用。kgf-2不仅在调控软骨分化、维持软骨稳态方面具有重要作用，而且kgf-2可下调病理状态下炎症的反应，减轻炎症损害。fgf10通过调节tlr4/nf-κb途径抑制巨噬细胞的活化和增殖，减弱sci后促炎细胞因子的释放。我们利用木瓜蛋白酶诱导的骨关节炎预实验结果显示，50μg/mlkgf-2可以改善软骨缺损状态，增加胶原蛋白表达并且下调炎症因子il-1β的表达。上述研究促进我们产生将kgf-2用于骨关节炎治疗的想法。但是，我们和其他实验室研究表明kgf-2蛋白半衰期只有2个小时，需要每天进行关节腔注射才能发挥治疗作用，大大降低患者的依从性。

本发明人早年开发了一种分泌表达重组人角质细胞生长因子-2(kgf-2)的制备方法(参见cn101538571a)并将其用于制备成滴眼液(参见cn101537172a)以及环境敏感型眼部传递系统(参见cn103656622a)。

本发明人还将kgf-2和fgf-21联用，配合泊洛沙姆407(简称为p407)，配制成温敏型水凝胶，用于治疗糖尿病并发损伤(参见pct/cn2018/092325)。

然而，在研究中，本发明人发现泊洛沙姆407需要较高的浓度，才具有温度敏感的作用，这也限制了它在添加药物及其他辅料后的渗透压，所以用于作为外伤的糖尿病并发损伤相当理想，但是难以用于需要注射入关节腔的疗法。

本发明人为此经过长期研究，包括克服了透明质酸具有亲水性不利于泊洛沙姆聚合的偏见，令人意外地获得了一种水凝胶，其安全性、稳定性、胶凝温度、渗透压以及对kgf-2的缓释性质等均符合加载kgf-2以注射入关节腔治疗的要求，结合本发明人对kgf-2单独对骨关节炎治疗效果的研究，适合于无需每天注射地治疗骨关节炎。

技术实现要素：

本发明提供了新的用于治疗骨关节炎的药物组合物，特别是适合作为关节腔注射剂治疗骨关节炎的药物组合物。

具体而言，在第一方面，本发明提供了用于治疗骨关节炎的水凝胶，其包括人角质细胞生长因子-2(kgf-2)、泊洛沙姆407和改性的泊洛沙姆407，其中，改性的泊洛沙姆407由甲基丙烯酸酯修饰的泊洛沙姆407和硫醇基团修饰的透明质酸通过硫醇-烯反应制备而得。

角质细胞生长因子-2(kgf-2)是人体皮下的组织细胞分泌的一种碱性蛋白生长因子，能特异刺激上皮细胞的新陈代谢等生理过程，包括细胞的再生、分化和迁移等。尽管有许多生长因子(如，egf、bfgf、afgf、tgf、vegf、pdgf等)能起到类似的作用，但是本发明的水凝胶使用kgf-2作为配合fgf-21的活性成分。在本发明的具体实施方式中，本发明的水凝胶使用人kgf-2(其基因序列登录号为：nm-004465.1)，该kgf-2可以是用重组dna技术生产的，及重组人kgf-2。

泊洛沙姆(poloxamer)是聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，是高分子非离子表面活性剂。本发明的水凝胶使用泊洛沙姆407或以其为原料制备改性的泊洛沙姆407。本发明的水凝胶的辅料成分少，易于控制成本。

优选本发明第一方面的水凝胶由kgf-2、泊洛沙姆407和改性的泊洛沙姆407以及水组成。

优选在本发明第一方面的水凝胶中，甲基丙烯酸酯修饰的泊洛沙姆407是通过包括如下步骤的方法制备的：

(1)将泊洛沙姆溶于二氧六环中，加入三乙胺，搅拌；

(2)向步骤(1)获得的反应液加入甲基丙烯酰氯，搅拌；和，

(3)将步骤(2)获得的反应液透析。

也优选在本发明第一方面的水凝胶中，硫醇基团修饰的透明质酸是通过包括如下步骤的方法制备的：

(1)将透明质酸溶于水中，用hcl调节ph至5.0，加入1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌；

(2)向步骤(1)获得的反应液加入n-羟基琥珀酰亚胺，搅拌；

(3)向步骤(2)获得的反应液加入l-半胱氨酸甲酯盐酸盐，搅拌；和，(4)将步骤(3)获得的反应液透析。

还优选在本发明第一方面的水凝胶中，所述硫醇-烯反应包括将甲基丙烯酸酯修饰的泊洛沙姆407与硫醇基团修饰的透明质酸混合反应的步骤。

优选在本发明第一方面的水凝胶中，kgf-2的浓度为25～100μg/ml，优选为40～60μg/ml，如50μg/ml。

优选在本发明第一方面的水凝胶中，泊洛沙姆407和改性的泊洛沙姆407的以泊洛沙姆407计的总浓度为14～16％(w/w)，优选为14.5～15.5％(w/w)，如14.5％、15％或15.5％(w/w)。在本文中，以泊洛沙姆407计表示，当对象是泊洛沙姆407时，就以泊洛沙姆407本身的量计算浓度，而当对象是泊洛沙姆407衍生物(如，改性的泊洛沙姆407)时，换算成该泊洛沙姆407衍生物中的泊洛沙姆407部分的量来计算浓度，或者换算成制备该泊洛沙姆407衍生物所需的泊洛沙姆407的理论量来计算浓度。

优选在本发明第一方面的水凝胶中，泊洛沙姆407和改性的泊洛沙姆407的摩尔比为8～12：1，优选为9～11：1，如10：1。

在第二方面，本发明提供了本发明第一方面的水凝胶的制备方法，其包括kgf-2同泊洛沙姆407和改性的泊洛沙姆407混合的过程。

优选本发明第二方面的制备方法包括kgf-2的水溶液同泊洛沙姆407的水溶液和改性的泊洛沙姆407的水溶液混合的过程。

优选在本发明第二方面的制备方法中，在混合的过程之前，还包括改性的泊洛沙姆407的制备过程，优选该过程包括硫醇-烯反应，例如，包括将甲基丙烯酸酯修饰的泊洛沙姆407与硫醇基团修饰的透明质酸混合反应的步骤。

更优选在本发明第二方面的制备方法中，在改性的泊洛沙姆407的制备过程之前，还包括甲基丙烯酸酯修饰的泊洛沙姆407的制备过程和/或硫醇基团修饰的透明质酸的制备过程。

例如，甲基丙烯酸酯修饰的泊洛沙姆407的制备过程包括如下步骤：

(1)将泊洛沙姆溶于二氧六环中，加入三乙胺，搅拌；

(2)向步骤(1)获得的反应液加入甲基丙烯酰氯，搅拌；和，

(3)将步骤(2)获得的反应液透析。

例如，硫醇基团修饰的透明质酸的制备过程包括如下步骤：

(1)将透明质酸溶于水中，用hcl调节ph至5.0，加入1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌；

(2)向步骤(1)获得的反应液加入n-羟基琥珀酰亚胺，搅拌；

(3)向步骤(2)获得的反应液加入l-半胱氨酸甲酯盐酸盐，搅拌；和，

(4)将步骤(3)获得的反应液透析。

在第三方面，本发明提供了本发明第一方面的水凝胶在制备用于治疗骨关节炎的药物中的应用。

本发明的水凝胶是骨关节炎的治疗药物，即在骨关节炎出现后用以进行治疗。在本文中，骨关节炎患者是患有骨关节炎的哺乳动物，优选是人。在本发明的具体实施方式中，使用实验动物模型来测试本发明的水凝胶。本发明的水凝胶的使用方式是注射入骨关节炎患者的关节腔中。因此优选本发明第三方面的应用中，所述药物的剂型是关节腔注射剂。

本发明第三方面的应用可以是加载kgf-2的本发明第一方面的水凝胶的单独应用，也可以是与其他制药物化合物或药物组合物的联合应用。由于加载kgf-2的本发明第一方面的水凝胶单独应用已经效果优异，因此优选本发明第三方面的应用是加载kgf-2的本发明第一方面的水凝胶的单独应用。

本发明的有益效果在于：本发明的水凝胶可以有效注射入患者的关节腔中治疗骨关节炎，在安全性、稳定性、胶凝温度、渗透压以及对kgf-2的缓释性质等方面均符合作为治疗骨关节炎的要求，尤其是安全性好，几乎与注射生理盐水组无差异；它活性成分和辅料种类少，质量稳定，易于控制成本。

本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

附图说明

图1显示了本发明所用的材料的示意图。

图2显示了合成产物的鉴定图谱，其中，(a)双键泊洛沙姆合成ft-ir鉴定，(b)巯基透明质酸合成ft-ir鉴定。

图3显示了pha水凝胶的表征，其中，(a)pha溶液的溶液-凝胶转变，(b)不同浓度pha和p407的渗透压(+,-代表凝胶稳定性)，(c)不同浓度的pha溶液及18％(w/w)p407的流变学参数，(d)不同浓度的pha溶液及18％(w/w)p407储能模量(g’)分析，(e)不同浓度的pha溶液及18％(w/w)p407水凝胶的sem图像。

图4显示了4体内外生物相容性评价，其中，(a)pha及p407溶血率对比，(b)pha及p407细胞生存率对比，(c)pha体内注射对膝关节宽度影响，(d)免疫组化检测pha体内注射炎症因子表达(400x)。

图5显示了15％(w/w)pha对kgf-2体外缓释特性，其中，(a)溶蚀法测定pha缓释作用示意图，(b)半透膜法测定pha缓释作用示意图，(c)溶蚀法测定pha对kgf-2缓释曲线，(d)半透膜法测定pha对kgf-2缓释曲线。

图6显示了kgf-2对骨关节炎的治疗作用，其中，(a)kgf-2改善骨关节炎膝关节宽度，(b)he染色(200x)，safranino染色(200x),toludineblue染色(200x)分析，(c)collagenⅱ免疫组化分析(400x)，(d)collagenⅱ表达统计分析(n＝6)，(e)il-1β免疫组化(400x)，(f)il-1β表达统计分析(n＝6)。

图7显示了加载kgf-2的pha水凝胶对骨关节炎的治疗作用，其中(a)pha-kgf-2对骨关节炎膝关节宽度的改善作用，(b)he染色(200x)，safranino染色(200x),toludineblue染色(200x)分析，(c)collagenⅱ免疫组化(400x)，(d)collagenⅱ表达统计分析(n＝6)，(e)il-1β免疫组化(400x)(f)il-1β表达统计分析(n＝6)。

图8显示了加载kgf-2的pha水凝胶改善骨关节炎的代谢平衡，(a)mmp-9免疫组化(400x)，(b)mmp-9表达统计分析(n＝6)，(c)mmp-13免疫组化(400x)，(d)mmp-13表达统计分析(n＝6)，(e)pai-1免疫组化(400x)，(f)pai-1表达统计分析(n＝6)，(g)inos免疫组化(400x)，(h)pai-1表达统计分析(n＝6)。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《细胞实验指南》、《药剂学》和cfda的相关试验指引以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。

实施例1材料与方法

1改性泊洛沙姆407的制备

1.1双键泊洛沙姆407的合成

将5g泊洛沙姆407(mw＝12210)溶于20ml的二氧六环中，按照物质的摩尔量比为1:4的量，加入333μl的三乙胺溶液(0.728g/ml)，37℃磁力搅拌下反应1小时。再照物质的摩尔量比为1:4的量，加入220μl的甲基丙烯酰氯(1.08g/ml)溶液，在氮气保护的条件下，37℃磁力搅拌下反应12小时。将反应液倒入事先用1mmol/l的edta-2na活化的透析袋(截留分子量mwco＝8000)中放入纯化水中4℃透析48小时(每6小时换一次纯化水)。将透析完成的溶液放入真空冻干机中冻干，得到双键泊洛沙姆。合成产物通过傅里叶变化红外光谱仪(ftir)(brukertensorii，germany)在500.0到4000.0cm^-1之间进行鉴定。

1.2巯基透明质酸的合成

将0.8g透明质酸(mw＝200000)溶于30ml的纯化水中，用1mol/l的hcl调节ph为5.0。按照透明质酸单元分子和1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)物质的摩尔量比为1:1的量，加入0.4gedc37℃磁力搅拌下反应1小时。再按照透明质酸单元分子和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)物质的摩尔量比为1:1的量，加入0.4gnhs37℃磁力搅拌下反应1小时。最后加入物质的摩尔量比为1:1的l-半胱氨酸甲酯盐酸盐(0.24g)。37℃磁力搅拌下反应12小时。将反应液倒入事先用1mmol/l的edta-2na活化的透析袋(截留分子量mwco＝8000)中放入纯化水(用1mol/l的hcl调节ph为5.5)中4℃避光透析48小时(每6小时换一次纯化水)。将透析完成的溶液放入真空冻干机中冻干，得到巯基透明质酸。合成产物通过傅里叶变化红外光谱仪(ftir)(brukertensorii，germany)在500.0到4000.0cm-1之间进行鉴定。

1.3改性泊洛沙姆407的制备

将双键泊洛沙姆407溶液按照物质的摩尔量之比为1:2的比例加入浓度为0.01g/ml巯基透明质酸，37℃交联反应6小时，形成ha修饰的泊洛沙姆407。将所得的反应液稀释至以双键泊洛沙姆407计的浓度分别为14.5％，15％，15.5％(w/w)的溶液，分别与同浓度的14.5％，15％，15.5％(w/w)的泊洛沙姆407(简称为p407)溶液按照1:10的体积比混合得到(以泊洛沙姆407计的)浓度为14.5％，15％，15.5％(w/w)的泊洛沙姆407改性水凝胶溶液(pha)。

2材料表征

2.1pha流变学性质分析

使用ar-g2流变仪(ta-ar-g2，usa)(平板结构：8mm板)分析样品的流变学性质。在恒定剪切应变(1％)下，温度在10～45℃的范围内(2℃/min)扫描。以100rad/s的频率测量剪切模量。相变温度从弹性模量(g')在溶液的g'和凝胶的g'之间的中点处定义。以损耗模量(g”)来评价凝胶的粘性。每次测量，使用500μl液体样品。

2.2pha凝胶的结构表征

将水凝胶样品冷冻并用真空冷冻干燥器冻干48小时。通过场发射扫描电子显微镜(sem)(hitachisu8010，japan)对凝胶的形貌进行表征，所有样品在拍电镜之前在10ma下镀金60s。来观察凝胶的空间结构。

2.3pha胶凝温度测定

用试管倒置法测定pha水凝胶的胶凝温度。将1.0ml样品置于水浴锅中，以0.5℃/分钟的速率加热。相变温度定义pha由溶液状态变成固体凝胶的温度，重复测定3次。

3pha安全性测试

3.1溶血性测试

以无菌、无热原生理盐水为稀释介质，分别取3ml14.5％，15％，15.5％(w/w)的pha水凝胶溶液和27ml生理盐水混合稀释，备用。然后取10ml稀释液，装在15ml的离心管中，放在37℃恒温水浴箱中预热30min，然后向离心管中加入200μl稀释血液，放置在37℃恒温水浴箱中培育60min。最后将离心管在3000rpm转速下离心10min，取上清液，用紫外分光光度计(varioskanlux,thermofisher)测定545nm波长的吸光度，分别以去离子水和生理盐水作为阳性对照组和阴性对照组。最后根据吸光度计算溶血率，溶血率计算公式为：

其中，[a]s,[a]n,[a]p分别为样品组，阴性对照组和阳性对照组的吸光度。

3.2细胞毒性测试

利用mtt试验，利用nih-3t3细胞测定15％的pha水凝胶的细胞性。

将nih-3t3细胞用0.25％的胰蛋白酶消化，加入96孔培养板中(每孔8×10³个细胞)，37℃，5％二氧化碳的细胞培养箱内培养，培养12h。撤去原有培养基，加入100μl饥饿培养基，饥饿。饥饿24h后，弃去旧饥饿培养基，加入100μl含药物饥饿培养基(分别为饥饿培养基，含pha的饥饿培养基，含p407的饥饿培养基，含化学交联组分的饥饿培养基，含pha+50μg/mlkgf-2的饥饿培养基，含p407+50μg/mlkgf-2的饥饿培养基，含50μg/mlkgf-2的饥饿培养基)到96孔板中培养。每组样品加6个复孔，分别在24h之后弃去培养基，然后分别在每个孔中加入20μlmtt原液(5mg/ml，pbs，ph7.4)，培养4h，吸去培养基，并在每个孔中加入150μldmso，将培养板振荡10min。最后用酶标仪测试样品在492nm的吸光度。

3.3sd大鼠体内安全性测试

将雄性sd大鼠分为两组，每组3只，左侧为正常对照组，右侧关节腔注射100μlpha溶液或者同体积生理盐水。两天注射一次，一共注射5次。在第0，7和14天，测量关节的宽度。第14天时麻醉处死大鼠，取出关节，固定于4.0％(w/v)的多聚甲醛中。然后，于37℃烘箱中脱钙2周，乙醇脱水后转移至二甲苯中，然后包埋在石蜡中。切片(5微米厚)，置于聚l-赖氨酸包被的载玻片上用于h&e染色和免疫组化染色。用尼康立式显微镜(eclpse80i，tokyo，japan)以400倍放大率拍摄切片以观察il-1β，il-6在关节软骨的表达情况。

4pha材料性能测试

4.1pha材料对kgf-2体外缓释作用

利用直接溶蚀法测定kgf-2的体外释放行为，在4.0℃条件下将kgf-2溶解于pha水凝胶溶液，形成含有kgf-2(0.3mg/ml)的pha水溶液。取上述含有kgf-2的pha水溶液1ml注入5mlep管中。将ep管置于37.0℃烘箱中孵育1.0小时以形成稳定的水凝胶。然后，在ep管中加入1.0mlpbs置于37.0℃烘箱中测定其释放行为。每隔1h取出一个ep管中的上清液，并且用bca蛋白质测定试剂盒(transgenbiotechco.，ltd.，beijing，china)检测kgf-2总蛋白的量。绘制kgf-2蛋白量随时间的累积曲线。

4.2pha材料对kgf-2的稳定性试验

2mg的kgf-2分别溶解于2ml纯化水，15％pha，18％p407和1％的透明质酸溶液中，将15％pha和18％p407放入37℃烘箱2分钟，使其胶凝。将上述各组转入50℃烘箱中放置12h，24h，48h后取出，sds-page电泳检测蛋白纯度。制备ph为3.0，7.0，9.0，11.0的上述各组样品，4℃放置12小时，24小时后，sds-page电泳检测蛋白纯度。

5加载kgf-2的pha对骨关节炎治疗作用

5.1动物及伦理批准

36只清洁级sd大鼠(200g)购自温州医科大学动物实验中心。所有动物在温州医科大学动物实验中心适应性地喂养饮用水和固体食料。室温保持在约23℃，相对湿度为60％，日夜交替时间表为12小时。所有动物实验均经温州医科大学动物伦理委员会(温州，中国)批准，并按照温州医科大学动物实验指南进行。确保对所有研究动物的人道待遇。所有合格的动物随机编号并分成6组，每组6只。

5.2sd大鼠骨关节炎模型建立及分组

sd大鼠腹腔内注射10％水合氯醛进行麻醉(剂量为3.5ml/kg，溶于磷酸盐缓冲盐水，pbs)。用脱毛剂脱去关节处毛发，在sd大鼠左腿关节腔处注射50μl的木瓜蛋白酶混合液，右腿作为正常对照。木瓜蛋白酶混合液制备方法为：8％的木瓜蛋白酶与0.03mol/l的l-半胱氨酸按照体积比2:1混合，用0.45μm微滤膜过滤。每隔1天注射一次，一共3次。注射完成后饲养3周，中间观察大鼠的状况，用游标卡尺测量大鼠关节处的宽度，确定模型是否成功。造模成功的动物，随机分为6组，每组6只动物。分别为生理盐水对照组，pha水凝胶对照组，kgf-2低剂量组(12.5μg/ml)，kgf-2中剂量组(50μg/mlkgf-2)，kgf-2高剂量组(200μg/ml)，kgf-2+pha给药组(kgf-2浓度50μg/ml)所有药物都采用关节腔注射给药，每3天给药一次，每次100μl，连续给药10次，共30天。给药过程中用游标卡尺测量大鼠关节处的宽度。

5.3h&e，safraninoandtoluidinebluestaining

在最后一次给药结束后3天，用10％(w/v)水合氯醛，按照0.4ml/100g的剂量麻醉大鼠。取出关节后，以麻醉方式处死大鼠。将大鼠关节在4.0％(w/v)的多聚甲醛中固定7天(4℃)。在37℃烘箱中用脱钙液脱钙2周，然后将关节通过分级的乙醇脱水并转移至二甲苯中，进行石蜡包埋并切片(5微米厚)。关节切片置于聚l-赖氨酸包被的载玻片上，分别进行苏木精-伊红(h&e)，番红固绿(safranino)和甲苯胺蓝(toluidineblue)染色。以200倍放大率，用尼康立式显微镜(eclpse80i，tokyo，japan)拍照，观察大鼠关节软骨。

5.4免疫组织化学染色

将石蜡切片置于65℃培养箱中5小时，然后用二甲苯脱蜡，乙醇水化。将切片置于3％(w/v)过氧化氢(用80％(w/v)甲醇稀释)中，在4℃下保持10分钟，以固定和消除内源酶活性。而后，使用胰蛋白酶37℃修复45min。将载玻片置于湿盒中，用5％(w/v)山羊血清(solarbio，中国上海，用0.01mpbs稀释)37℃培养箱中封闭1小时。而后分别与特异性一抗(il-1β(1:250)，il-6(1:250)，collagenⅱ(1:250)，inos(1:200)，mmp-9(1:250)，mmp-13(1:350)，pai-1(1:250)，timp-1(1:100))4℃孵育过夜。pbs洗涤冲洗未结合一抗后，与igg-hrp二抗(1：100，transgenbiotechco.，ltd。)在37℃培养箱中温育1小时。将切片用pbs洗涤4次，然后用3,3n-二氨基联苯胺四氢氯化物(dab)染色。使用nikoneclpse80i(nikon，tokyo，japan)显微镜，以400倍放大率从每个切片拍摄三个随机区域。

6统计分析

使用graphpadprism6.0统计软件进行统计学分析。数据表示为平均值±标准误差。使用t检验进行两组之间的比较。使用anova测试进行三组或更多组之间的比较。当p<0.05时达到统计学显着性。

实施例2结果

1改性泊洛沙姆的合成与鉴定

一般情况下，超过18％(w/w)的p407才能够形成稳定的凝胶，而本发明的pha在较低的浓度下即可形成稳定的凝胶。本实验中，我们按照图1b,c所示的路线合成了甲基丙烯酸酯修饰的泊洛沙姆407(图1b)和硫醇基团修饰的透明质酸(图1c)。通过硫醇-烯反应合成了透明质酸修饰的泊洛沙姆407(图1d)。如图2a所示，丙烯酸酯基团中c＝o伸缩振动的峰值出现在1752cm^-1处。并且，在通氮气处理下峰的面积比未通氮气处理的更大。巯基透明质酸的ft-ir曲线所示，巯基伸缩振动的峰值出现在2303cm^-1处(图2b)。

2pha具有良好的温敏特性

由于材料pha在低浓度下能够实现温敏感的溶胶-凝胶相变，所以能够用于关节腔内装载和递送kgf-2的作用，是药物能够持续的作用于关节软骨病变处。如图3a，pha在加热至37℃的体温时形成水凝胶。使用倒置试管法测定14.5％(w/w)，15％(w/w)，15.5％(w/w)pha的相转变温度分别为33.0±0.50℃，30.3±0.57℃，30.6±0.29℃。这种溶胶-凝胶转变首先允许kgf-2在4℃的pha溶液中充分混合。然后，将pha溶液应用于关节腔处，在体温作用下发生pha的凝胶化，能够使kgf-2成功地装载到pha水凝胶中，凝胶能黏附于关节腔处完成释药行为。此外，我们对单纯的pha进行了渗透压的测定，如图3b，14.5％(w/w)，15％(w/w)这2个浓度的渗透压均低于生理盐水，可以符合添加药物及其他辅料的需求。从表观上评价凝胶稳定性，15％(w/w)，15.5％(w/w)这两组具有更好的稳定性。进行流变学测试用来揭示基于pha水凝胶通过改变温度(图3c)的凝胶化过程。当水凝胶表现出粘弹性行为时，存储(g’)模量和损失(g”)模量用于测量其弹性和粘性组分。所有基于不同浓度pha水凝胶，在约29℃-32℃显示出类的溶胶-凝胶转变,此结果与倒置试管法测定的相转变温度一致。当温度高于像转变温度时，pha水凝胶的g’和g”值快速增加。29℃-32℃的转变温度在关节腔内也能够满足，使得pha水凝胶能够作为关节腔注射中的一种药物载体。另外，我们对他们表现出的存储(g’)模量进行了分析(图3d)，发现15％(w/w)和15.5％(w/w)组的存储(g’)模量明显高于14.5％(w/w)，显示出更强的弹性。图3e显示了通过sem拍摄的18％(w/w)p407，14.5％(w/w)pha，15％(w/w)pha，15.5％(w/w)pha水凝胶的微形态。扫描电镜图像显示14.5％(w/w)，15％(w/w)，15.5％(w/w)水凝胶相比18％(w/w)p407具有更加丰富的多孔结构。应该注意的是，由于凝胶多孔结构和水凝胶的高含水量(>80％)，更加有利于药物的包载和对关节损伤区域的保护。所以，从凝胶稳定性，凝胶强度，临界温度，微观结构，渗透压考虑我们选择15％(w/w)的pha进行后续的实验。

3pha具有生物安全性

这项研究中，我们用溶血率实验，细胞毒性实验和动物体内注射来研究pha的生物相容性。溶血率是测试材料血液安全性的一个简单常用的方法。图4a显示14.5％(w/w)pha，15％(w/w)pha，15.5％(w/w)pha水凝胶对于稀释兔血的溶血率分别为2.5±0.2％，2.4±0.3％，2.1±0.1％，都明显低于确保血液接触材料安全性的临界值5％，说明这几组样品都具有良好的血液相容性。在这里我们通过mtt试验来测试样品对于细胞生存率的影响。图4b显示了分别用0.5％pha、0.5％p407和0.5％点击化学反应凝胶成分(chemicalgel)处理后3t3细胞的生存率分别为96.3±3.2％，93.1±4.7％，111.0±3.0％与对照组和p407组相比并没有明显的统计学差异，值得注意的是点击化学反应凝胶成分(chemicalgel)组的生存率明显高于对照组。从于动物层面上看，15％(w/w)pha的膝关节注射没有造成显著的膝关节肿胀(图4c)，也没有看到注射部位有异常。此外，从后续的膝关节组织切片的免疫组织化学实验中，并没有看到注射pha组有明显的炎症因子的表达(图4d)。我们可以发现在对照，注射15％(w/w)pha，注射生理盐水组都没发现il-1β和il-6的表达，说明pha的注射没有造成明显的炎症反应。

4pha的体外缓释行为

图5a展示了pha水凝胶在pbs缓冲液中的溶蚀情况，随着时间的推移pha水凝胶缓慢的溶蚀。值得注意的是，剩余底部的水凝胶依然具有完整的凝胶态，并且它的凝胶结构稳定。图5c中我们用kgf-2蛋白浓度模拟了水凝胶中药物的缓释行为，我们发现药物整体缓慢均匀的释放且在34小时释放完全。图5b中我们利用渗透的原理模拟人体吸收药物的过程。图5d中我们发现pha凝胶达到平衡的时间是单纯pbs的一倍。

5kgf-2治疗骨关节炎的疗效评估及适宜浓度筛选

5.1关节腔注射梯度kgf-2能治疗oa软骨损伤

图6a中我们可以发现在造模结束时sd大鼠的关节处出现了明显的肿胀现象(正常组10.15±0.08mm，模型组12.12±0.26mm)。在给药14天后，我们发现12.5μg/ml(11.15±0.12mm),50μg/ml(10.83±0.19mm),200μg/ml(11.56±0.18mm)kgf-2的肿胀现象均得到改善，与模型组(12.05±0.23mm)相比具有统计学意义(p＜0.01),其中50μg/mlkgf-2的肿胀改善程度优于12.5μg/ml,200μg/mlkgf-2组(p＜0.05)。

从软骨结构上，通过he染色，图6b中我们可以看到正常组he染色图中软骨表面完整光滑，没有破损区域，软骨细胞排列整齐且染色均匀。而模型组软骨层表面不平整，出现了一些区域的缺损，软骨细胞的排列也变得紊乱，软骨层厚度降低且染色也不均匀。值得注意的是，当我们使用12.5μg/mlkgf-2治疗后，我们发现软骨细胞的排列变得较整齐，厚度增高且染色较均匀，但是我们依然发现在软骨层的表面还是不平整。但是我们使用50或者200μg/mlkgf-2治疗后可以明显的发现软骨层表面比12.5μg/mlkgf-2治疗后更加的完整，软骨层也没有出现破损，软骨细胞排列较为整齐，染色较为均匀。但依然没有达到正常组的软骨层染色状况。番红o/固绿染色可清楚显示胶原染色情况。图6b中正常组的番红染色区域几乎均匀的分布于软骨层，而模型组则染色程度不明显，分布也不均匀。我们发现当我们使用12.5μg/mlkgf-2治疗后，番红染色区域增加，且染色程度更加明显，但依然分布不均匀。但是我们使用50或者200μg/mlkgf-2治疗后可以明显的发现番红染色区域增加且分布较为均匀。但，依然没有达到正常组的软骨层染色状况。经甲苯胺蓝染色软骨中蛋白多糖的变化(图.6b)，镜下检查发现，正常关节软骨基质中染色明显，而模型组的染色程度不明显，提示软骨基质中蛋白多糖减少，部分软骨细胞出现坏死。在12.5μg/mlkgf-2治疗后，我们可以发现右侧染色有所恢复但不明显，左右两侧仍然不均匀。当我们使用50或者200μg/mlkgf-2治疗后软骨层的甲苯胺蓝染色程度明显高于12.5μg/ml的kgf-2治疗组。但是在中央的区域仍然不均匀且差于正常组的软骨层染色状况。

5.2关节腔注射不同浓度kgf-2能减弱oa表型的表达

通过3种染色，我们从修复损伤程度上可以简单的评价梯度kgf-2对oa的治疗效果。接着我们使用免疫组织化学对3种不同浓度的治疗效果从骨关节炎表型(colⅱ,il-1β,inos)的表达上进行评价(图6c)。骨关节炎中主要表现为分解代谢标志物为ⅱ型胶原的表达降低。fig.6d我可以发现造模后注射生理盐水组ⅱ型胶原的表达显著降低(p＜0.001)，当我们使用12.5μg/mlkgf-2治疗后，ⅱ型胶原的表达与注射生理盐水组相比有一定程度的增加(p＜0.05)。值得注意的是，使用50μg/mlkgf-2治疗组ⅱ型胶原的表达显著高于12.5μg/mlkgf-2治疗组(p＜0.01)，但与200μg/mlkgf-2治疗组相比无明显的统计学差异。骨关节炎中炎症的发展也对骨关节炎的修复产生一定的影响。软骨细胞及滑膜组织分泌产生的il-1β在骨关节炎的发生发展中起重要作用，no是由软骨细胞在前炎症因子il-1β的作用下，诱导型一氧化氮合酶(inos)催化产生的一种分解代谢因子，能够增加氧化剂损伤的敏感性。图6e我可以发现造模后注射生理盐水组il-1β的表达显著升高(p＜0.001)，当我们使用12.5μg/mlkgf-2治疗后，il-1β的表达有所的降低(p＜0.05)。而50μg/mlkgf-2治疗组则比12.5μg/mlkgf-2治疗组具有更好的降低il-1β的表达的效果(p＜0.01)。但与200μg/mlkgf-2治疗组相比明显差异。此外inos在各组中的表达也具有相同的趋势(图6e)。

综合减弱oa软骨损伤的严重程度及oa表型的表达这两个方面，我们采用50μg/mlkgf-2的剂量进行下面的工作。

6加载kgf-2的pha水凝胶治疗骨关节炎的疗效评估

6.1关节腔注射kgf-2-pha能进一步治疗oa软骨的损伤

图7a中我们发现14天时kgf-2-pha治疗组的关节肿胀程度与单纯kgf-2治疗组相比具有统计学意义(p＜0.05)。而单独给与pha治疗组则没有减轻肿胀的效果。图7b我们可以看到kgf-2-pha治疗组he染色图中软骨表面基本完整光滑，没有破损区域，软骨细胞正常排列整齐且染色均匀。明显优于单独给与kgf-2治疗组。而单独给与pha的关节软骨层表面依然发现有些不平整，出现了局部区域的缺损，但是细胞的排列比生理盐水组整齐。kgf-2-pha治疗组番红染色区域较单独给与kgf-2治疗组显著增加，且染色程度更加明显，但与正常组还有一些差距。经甲苯胺蓝染色后，我们发现kgf-2-pha治疗组关节软骨基质中染色更加明显，提示软骨基质中蛋白多糖增加。显然的，关节腔kgf-2-pha能进一步治疗oa软骨损伤，其效果明显优于单独给与kgf-2，但较正常组还有一定差距。

6.2关节腔注射kgf-2-pha能进一步改善oa表型的表达

我们同样使用免疫组织化学对3种不同浓度的治疗效果从骨关节炎表型的表达上进行评价(图7c).图7d我可以发现使用kgf-2-pha治疗组ⅱ型胶原的表达显著高于kgf-2治疗组(p＜0.01)，但单独给与pha治疗的则与生理盐水组无明显的统计学差异。此外，图7e我可以发现使用kgf-2-pha治疗组il-1β的表达显著低于kgf-2治疗组(p＜0.01)，且单独pha组与生理盐水组则无明显差异。同时，inos在各组中的表达也具有相同的趋势(图7f)。

6.3关节腔注射kgf-2-pha能改善oa中的酶代谢水平

骨关节炎中金属基质蛋白酶(mmps)能够特异性地裂解胶原分子中的三维螺旋结构，其中以mmp-13降解ii型胶原蛋白效率为最高，能导致软骨的纤维结构遭受破坏，导致软骨降解。本研究中，我们检测了oa模型经kgf-2-pha治疗后，软骨中mmp-9，mmp-13的表达情况。图8c,d正常组中mmp-13为低表达，而在模型给与生理盐水组中mmp-13的表达显著升高(p＜0.001)。在给与pha组中，mmp-13的表达与生理盐水组几无差异。明显的，再给与kgf-2治疗后mmp-13的表达显著低于生理盐水组(p＜0.01)。此外，值得注意的是在使用kgf-2-pha的治疗组mmp-13的表达又显著低于kgf-2治疗组(p＜0.01)。同时，mmp-9在各组中的表达趋势基本一致(图8a,b)，但kgf-2-pha的治疗组与kgf-2治疗组在mmp-9的表达上无差异。纤溶酶原激活物抑制物-1(pai-1)具有抑制金属基质蛋白酶功能的作用，在软骨稳态的调节上起到至关重要的作用。图8e,f我们可以发现在模型给与生理盐水组中pai-1的表达显著降低(p＜0.001)。而在pai-1方面，给与pha组的表达也高于生理盐水组(p＜0.01)。在给与kgf-2治疗后，pai-1的表达明显高于pha组和生理盐水组(p＜0.01)。此外，我们发现在使用kgf-2-pha的治疗组pai-1的表达又显著高于单纯kgf-2治疗组(p＜0.01)。同时，timp-1在各组中的表达也具有相同的趋势(图8g,h)。

综合以上的工作，我们发现加载kgf-2的pha在治疗oa软骨损伤，改善oa表型表达具有更好的作用，能够更好的维持软骨内合成代谢的稳态。