本发明涉及抗真菌药物领域，具体地说，是油松叶提取物协同氟康唑在制备抗真菌药物中的应用。
背景技术：
真菌是广泛存在于自然界的一类真核生物，真菌可感染人体的不同部位。我们把真菌引起的疾病统称为“真菌病”。以临床致病情况为标准可将真菌病分为浅部真菌病和深部真菌病两大类。浅部真菌病在我国极为普遍，常见的有头癣、体癣、股癣、手足癣、花斑癣和甲癣；深部真菌则主要侵犯内脏器官、骨骼及神经系统，也可侵犯皮肤、粘膜，较常见的有孢子丝菌病、着色菌丝病、防线菌病及隐球菌病。而白念珠菌属则对皮肤、粘膜、指(趾)甲和内脏均可侵犯。
目前临床上深部真菌感染的主要治疗药物是多烯类(两性霉素b)和氮唑类(氟康唑等)。其中氮唑类的氟康唑(fluconazole，flc)因其良好的生物利用度和可靠的安全性，成为治疗白念珠菌(candidaalbicans)感染中使用最多的药物。但由于其对白念珠菌的作用主要是抑菌而不是杀菌，因此在长期治疗和重复给药过程中容易引起对flc耐药，这是临床治疗深部真菌感染的一个棘手的问题。恢复耐药真菌对治疗药物的敏感度，提高耐药菌对flc的敏感性，是治疗深部耐药菌感染的一种有效的治疗途径。临床上应对真菌耐药性的措施主要是：增加药物剂量、联合用药、免疫调节等手段，同时需要科研上加快新型抗真菌药的研制和开发。鉴于抗真菌药选择范围小、毒副作用大、耐药性产生以及临床治疗失败等原因，两种或两种以上抗真菌药的联合应用已经成为临床抗真菌治疗的发展方向之一。
油松(pinustabuliformiscarr.)为松科植物(pinaceae)，别名短叶松、短叶马尾松、红皮松、东北黑松，为我国特有树种，产吉林南部、辽宁、河北、河南、山东、山西、内蒙古、陕西、甘肃、宁夏、青海及四川等省区，生于海拔100-2600米地带，多组成单纯林。其垂直分布由东到西、由北到南逐渐增高。辽宁、山东、河北、山西、陕西等省有人工林。油松叶性味：味苦，性温；祛风活血，明目，安神；杀虫，止痒。民间治流行性感冒，风湿痿痹，跌打损伤，夜盲症，失眠，湿疮，疥癣，冻疮等。油松叶的富含糖类、粗蛋白、粗脂肪、多种氨基酸、多种维生素、挥发油、生物黄酮类物质等。近年来对于油松叶的挥发油多见gc-ms分析研究，具有镇痛抗炎、杀菌、杀虫剂改善心肌缺血、解除血管平滑肌痉挛等作用；油松的其他提取物主要抗氧化、抗菌、抗肿瘤作用。但尚未见报道油松叶具有协同抗真菌的作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供油松叶提取物在制备协同抗真菌药物中的新应用。
本发明的第一方面，提供油松叶提取物协同氟康唑在制备抗真菌药物中的应用，所述的油松叶提取物为油松叶80％乙醇提取物。
进一步的，所述的真菌为白念珠菌。
进一步的，所述的油松叶提取物的制备方法为：取干燥油松叶粉碎，用80％乙醇加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用80％乙醇加热回流提取1小时，滤过；合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收乙醇，得油松叶80％乙醇提取物。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的油松叶提取物的制备方法为：取干燥油松叶粉碎，称取10.309g，用80％乙醇(300ml)加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用300ml的80％乙醇加热回流提取1小时，滤过。合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收乙醇，得80％乙醇浸膏2.177g。
进一步的，所述的抗真菌药物中油松叶80％乙醇提取物浓度大于等于1.95ug/ml即可与氟康唑(8.0ug/ml)有效协同。
本发明的第二方面，提供油松叶提取物和氟康唑联用在制备抗真菌药物中的应用，所述的油松叶提取物为油松叶80％乙醇提取物。
更进一步的，所述的油松80％乙醇提取物的石油醚、氯仿、正丁醇三种相继萃取物都具有协同氟康唑抗真菌活性，而正丁醇萃取物效果最好。
本发明的第三方面，提供一种抗真菌药物，所述的药物是以油松叶80％乙醇提取物和氟康唑为活性成分的药物组合物，或是包含油松叶80％乙醇提取物和氟康唑的药物组合物。
进一步的，所述的药物中还包括常用的药物载体或辅料。
本发明对油松叶进行了初步的协同氟康唑抗真菌活性研究，采用石油醚、丙酮、80％乙醇分别热提油松叶，获得了油松叶石油醚提取物、油松叶丙酮提取物、油松叶80％乙醇提取物，考察它们协同氟康唑抗耐药白念珠菌的作用，本发明筛选的油松叶80％乙醇提取物及其石油醚、氯仿、正丁醇相继萃取物都可协同氟康唑抗耐药白念珠菌，为拓展油松叶的临床应用，以及治疗氟康唑耐药的白念珠菌提供了新思路，为联合用药治疗真菌感染以及拓展油松的临床应用提供参考。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例：
一、实验材料与方法
(一)实验材料
1、菌株
白念珠菌103(candidaalbicans103)由海军军医大学长海医院真菌室提供。(中国专利文献cn105503788a)
菌株培养条件：所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基(sda)划板活化，白念珠菌103于30℃培养2周后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置sda斜面，用上述方法培养后于4℃保存备用。
2、受试药物
名称：油松叶提取物
(1)石油醚提取物(提取物得率为5.61％)
(2)80％乙醇提取物(提取物得率为21.12％)
(3)丙酮提取物(提取物得率为18.18％)
3、试剂
(1)rpmi1640液体培养液：
rpmi1640(gibcobrl)10g，nahco32.0g，吗啡啉丙磺酸(mops)(sigma)34.5g(0.165m)，加三蒸水900ml溶解，1.0mol/lnaoh调ph至7.0(25℃)，三蒸水定容至1000ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。
(2)沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(sda)：
蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整ph至7.0，以三蒸水定容至1000ml，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。
(3)yepd培养液：
酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，三蒸水定容至1000ml，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。
(4)pbs缓冲液：
nacl8.0g，kcl0.4g，na2hpo40.133g，kh2po40.06g，nahco30.35g，加三蒸水定容至1000ml，高压灭菌后4℃保存。
(5)抗真菌药物：
氟康唑注射液，上海信谊金朱药业有限公司。黄芩素(baicalein，be)上海历鼎生物技术有限公司。
(6)溶剂：
二甲基亚砜(dimethylsdphoxide，dmso)中国医药集团上海化学试剂公司。
(7)药物母液配制：
氟康唑为水溶液。
4、仪器设备
multiskanmk3型酶标检测仪(labsystems)
隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)
mjx型智能霉菌培养箱(宁波江南仪器厂)
thz～82a台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)
sw.ct-if型超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)
倒置显微镜(amershampharmacia)
微量加样器(finnpette)
96孔细胞培养板(nunclon)
lightcyclerrealtimepcr仪(rochediagnostics)
eppendorf5417r高速冷冻离心机(eppendorf)
biofugestratos高速冷冻离心机(heraeus)
激光共聚焦显微镜(leicatcssp2)
microconym-30滤器(millipore，bedford，ma)
(二)实验方法
1、油松叶三种提取物的提取
石油醚提取物：取干燥油松叶粉碎，称取10.126g，用300ml石油醚加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用300ml石油醚加热回流提取1小时，滤过。合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收石油醚，得石油醚浸膏0.568g。
80％乙醇提取物：取干燥油松叶粉碎，称取10.309g，用300ml的80％乙醇加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用300ml的80％乙醇加热回流提取1小时，滤过。合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收乙醇，得80％乙醇浸膏2.177g。
丙酮提取物：取干燥油松叶粉碎，称取10.270g，用300ml丙酮加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用300ml丙酮加热回流提取1小时，滤过。合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收丙酮，得丙酮浸膏1.867g。
2、真菌悬液的配制。
实验前，用接种圈从4℃保存的sda培养基上挑取白念珠菌103，接种至1mlyepd培养液，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至1mlyepd培养液中，用上述方法再次活化，16h后，用血细胞计数板计数，以rpmi1640培养液调整菌液浓度至1×103～5×103cfu/ml。将丝状菌接种至sda斜面，其中皮下组织真菌和系统性真菌(申克氏孢子丝菌)30℃培养一周；浅表真菌(羊毛状小孢子菌)30℃培养两周。各菌按以上方法活化两次后，加适量rpmi1640培养液于sda斜面，用吸管吹打菌落，使真菌孢子游离于rpmi1640培养液中，然后经四层无菌纱布过滤。培养液经血细胞计数板计数后，加rpmi1640培养液调整孢子浓度至1×103～5×103cfu/ml。
3、药敏反应板的制备
取无菌96孔板，于每排1号孔加rpmi1640液体培养基100μl作空白对照；3～12号孔各加新鲜配制的菌液100μl；2号孔分别加菌液160μl和受试化合物溶液40μl；12号孔不含药物，只加菌液100μl作阳性生长对照。2～ll号孔进行倍比稀释，使各孔的最终药物浓度分别为250.0、125.0、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98和0.49μg/ml，各孔中dmso含量均低于1％。每次配制药敏板的同时均制备一质控菌药敏板，各药敏板于30℃恒温箱培养。
4、最低抑菌浓度(mic值)的判定
在30℃恒温箱中，念珠菌培养2周后，用酶标分析仪于620nm测各孔od值。阳性对照孔的od值控制在0.2左右，与阳性对照孔比，以od值下降80％以上的最低浓度孔中的药物浓度为mic80(真菌生长80％被抑制时的药物浓度)。当药物的mic80值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：mic80值高于最高浓度64μg/ml时，计为“>64μg/ml”；mic80值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.125μg/ml”。上述实验均平行操作2至3次，当mic80值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为mic80值；当mic80值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。
参照1997年美国国家临床试验标准化委员会(nccls)提出的标准j(m27-a方案)：amb的mic的确定，与生长对照孔比较，生长100％完全抑制，培养基清亮所对应的最低药物浓度为amb的mic；与生长对照孔比较≥80％生长抑制所对应的最低药物浓度为氟康唑mic80。
5、棋盘式微量稀释法
棋盘式微量稀释法即合用的两种药物于96孔板上以二维棋盘的纵(a至h)横(2至11)两方向分别进行二倍的倍比稀释。受试药物(油松叶石油醚提取物、80％乙醇提取物、丙酮提取物)以及阳性药(黄芩素)分别与抗真菌药物氟康唑合用后，使得氟康唑和阳性药(黄芩素)的终浓度为128.0、64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5和0.25μg/ml，受试药物(油松叶石油醚提取物、80％乙醇提取物、丙酮提取物)以及的终浓度分别为250.0、125.0、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98和0.49μg/ml。实验所用试剂、药物、实验操作步骤同上。
96孔板于30℃恒温培养箱培养24h后取出，读取mic80值。棋盘式微量稀释法测试结果见表1。
表1油松叶3种提取物与氟康唑联用体外抗念珠菌活性的mic80
由表1可见，油松80％乙醇提取物具有协同氟康唑抗真菌活性。
6、油松80％乙醇提取物进一步的活性筛选
取干燥油松80％乙醇提取物1.089g，加入水10ml混溶，获得混悬液。
石油醚提取物：混悬液，用30ml石油醚萃取，三次，合并并浓缩石油醚萃取液，获得石油醚浸膏0.122g。
氯仿提取物：经上述石油醚萃取后的水层继续用30ml氯仿萃取，三次，合并并浓缩氯仿萃取液，获得氯仿浸膏0.248g。
正丁醇提取物：经上述氯仿萃取后的水层继续用30ml正丁醇萃取，三次，合并并浓缩正丁醇萃取液，获得正丁醇浸膏0.245g。
上述三种提取物协同氟康唑对白念菌株103的活性结果见表2。
表2油松80％乙醇提取物的三种萃取物与氟康唑联用体外抗念珠菌活性的mic80
由表2可见，油松80％乙醇提取物的三种萃取物都具有协同氟康唑抗真菌活性，而正丁醇萃取物效果最好。
二、讨论
真菌感染严重威胁人类健康，真菌耐药性在临床非常普遍。目前，联合用药已成为抗真菌治疗的热点。本发明筛选的油松叶80％乙醇提取物可协同氟康唑抗耐药白念珠菌，而油松叶石油醚、丙酮提取物不具有协同抗真菌作用，进一步的油松叶80％乙醇提取物的石油醚、氯仿、正丁醇相继萃取物中正丁醇萃取物效果最好。本发明为拓展油松叶的临床应用，以及治疗氟康唑耐药的白念珠菌提供了新思路。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。