5-去甲基川陈皮素在制备治疗色素性皮肤病的药物中的应用

5
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去甲基川陈皮素在制备治疗色素性皮肤病的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，尤其涉及5
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去甲基川陈皮素在制备治疗色素性皮肤病的药物中的应用。


背景技术：

2.黑色素是一种由黑色素细胞产生的生物色素，是酪氨酸或3,4
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二羟苯丙氨经过一连串化学反应所形成，动物、植物与原生生物都含有这种色素，黑色素负责皮肤的颜色并防止紫外线辐射对皮肤的伤害。黑色素通常存在于皮肤，眼睛，毛囊和大脑的黑质中。黑色素生成是一个复杂的途径，涉及称为raper
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mason途径的酶促反应和自发化学催化反应的组合，并且已知色素沉着涉及数百种不同的基因。
3.而白癜风是一种比较常见的后天色素性皮肤病，是皮肤上的变色或脱色斑块，表现为局限性或泛发性皮肤黏膜色素完全脱失，发病原因为色素代谢障碍，可能是由于表皮中的黑色素减少，功能衰竭或黑色素细胞减少所致。全身各部位均可发生白癜风，但更常见于指背、腕、前臂、颜面、颈项及生殖器周围等。
4.虽然现有治疗白癜风、白化病等色素性皮肤病的药物种类较多，但其治疗效果通常较为有限，且有些激素类药物的副作用较大，不能起到较好的治疗效果。
5.因此，希望对现有天然药物活性成分展开研究，以期开发出更多现有天然药物活性成分在用于治疗和改善色素性皮肤病症状的新用途，从而为色素性皮肤病的治疗或预防提供更多的可行方案。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种5
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去甲基川陈皮素在制备治疗色素性皮肤病的药物中的应用。本发明指出，5
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去甲基川陈皮素具有刺激黑色素生成和促进黑素体转运的优良生物活性，可应用于制备治疗色素性皮肤病的药物。
7.本发明提供了5
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去甲基川陈皮素在制备黑色素生成诱导剂中的应用。
8.本发明还提供了5
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去甲基川陈皮素在制备治疗色素性皮肤病的药物中的应用。
[0009]5‑
去甲基川陈皮素(5
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demethylnobiletin)是一种天然的聚甲氧基黄酮，可从柑橘类果皮的提取物中分离制得，其结构式如下所示：
[0010][0011]
现有研究证实5
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去甲基川陈皮素表现出广泛的生物学活性，例如抗癌，抗炎，心血管保护和神经保护作用，尤其可用于有效的抗炎药产生对人结肠癌细胞的抑制作用，减轻
炎症部位水肿的形成，细胞浸润和组织损伤，以及促进神经突生长和神经元的功效，但并未给出5
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去甲基川陈皮素在调节黑色素合成和黑素体转运中有何促进和抑制作用。本发明首先指出，5
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去甲基川陈皮素对于黑色素合成以及黑素体转运能够产生促进作用，因此具有刺激黑色素生成的生物活性，可用于制备治疗色素性皮肤病的药物。
[0012]
更优选的，所述色素性皮肤病为色素减少性皮肤病。由于5
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去甲基川陈皮素所体现出的主要作用是促进黑色素的产生，因此更适用于制备治疗白癜风、白化病等色素减少性皮肤病。
[0013]
本发明还提供了一种治疗色素减少性皮肤病的药物，包括作为活性成分的5
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去甲基川陈皮素。
[0014]
优选的，所述治疗色素减少性皮肤病的药物还包括有药学上可接受的辅料。
[0015]
更优选的，所述药学上可接受的辅料包括溶剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、粘合剂或助悬剂中的至少一种。
[0016]
本发明还提供了5
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去甲基川陈皮素在制备美黑产品中的应用。美黑就是让皮肤变黑变漂亮，随着人们审美理念的变化，古铜皮肤或小麦皮肤已成为受到人们的追捧，因此如人工美黑霜或古铜仿晒产品等美黑产品也受到大众的认可和欢迎。本发明将天然活性成分5
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去甲基川陈皮素作为美黑产品中的功效组分，在外用条件下也能够增加使用者皮肤中黑色素的含量，实现天然和安全的美黑效果。
[0017]
本发明还提供了5
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去甲基川陈皮素在制备黑发产品中的应用。现代研究表明，产生白头发的原因至少包括遗传、疾病、压力大、用脑过度、休息不好和营养不良等，造成毛发髓质、皮质部分的黑色素颗粒减少、消失，最终导致白头发的产生。因此本发明在5
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去甲基川陈皮素作为黑发产品的功效组分，可以在一定程度上改善白发症状。
[0018]
优选的，所述黑发产品包括黑发洗发水或染发剂中的至少一种。
[0019]
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
[0020]
本发明通过对黑色素生成相关蛋白进行了多种生物学测定，例如黑色素含量检测，酪氨酸酶活性比色测定，蛋白质印迹分析和masson
‑
fontana氨银染色，表明5
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去甲基川陈皮素具有刺激黑色素生成和促进黑素体转运的优良生物活性，并以诱导pka依赖性途径进行camp反应元件结合蛋白(creb)的磷酸化来刺激细胞中树突结构的形成，黑色素的合成和黑素体的运输，并增加细胞内camp的水平。正是基于上述功效，5
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去甲基川陈皮素可应用于制备治疗色素性皮肤病的药物、美黑产品或黑发产品。
附图说明
[0021]
图1表示5
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去甲基川陈皮素对b16f10黑素瘤细胞的细胞毒性、黑色素含量和细胞酪氨酸酶活性的影响；
[0022]
图2表示5
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去甲基川陈皮素对树枝状尖端处伸长的树枝状晶体和黑素体形成的影响；
[0023]
图3表示5
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去甲基川陈皮素对黑素体运输相关蛋白的含量影响；
[0024]
图4表示5
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去甲基川陈皮素对黑色素生成相关基因的表达影响；
[0025]
图5表示5
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去甲基川陈皮素对creb磷酸化和camp水平的影响；
[0026]
图6表示camp/creb信号途径对5
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去甲基川陈皮素诱导黑色素合成的影响；
[0027]
图7表示pka抑制剂h89的处理对树突状结构的产生和黑素体的运输的影响；
[0028]
图8表示camp/creb信号通路对于细胞中的黑色素生成的必要性。
具体实施方式
[0029]
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
[0030]
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。下列实施例中所有control组为不作任何药物处理并加上等量相关药物溶剂的空白组。
[0031]
实施例1
[0032]
黑素体是一种含有色素的特殊细胞器，用于产生黑色素色素，并沉积在由源自pmel17蛋白的蛋白水解片段组成的原纤维上。经典的形态学研究表明，黑素体的成熟过程有四个不同的阶段，涉及多种酶和结构蛋白。
[0033]
通常称为前黑素体的i期实际上是来自内体。黑素体前体是球形的液泡，从光滑的内质网(er)出现，并包含不规则的纤维基质和管腔内囊泡。无色素的黑素体包含跨膜蛋白pmel17(gp100)，该蛋白被蛋白水解切割以形成可见的特征性内部条纹，从而产生具有卵形结构的ii期黑素体。iii期黑素体的特征是黑色素开始沉积到条纹上，从而导致其变黑和增厚iv期黑素体最终被黑色素完全充满。
[0034]
黑素体通过结合微管蛋白和驱动蛋白(正向末端的微管马达)而受到控制，并沿着微管从核周区域向树突尖端定向移动以进行长距离运输。随后，运输结束，黑素体被三联蛋白复合物的肌动蛋白丝捕获，该复合物由三个亚基组成，包括rab27a，melanophilin(mlph)和myosin va(myo5a)。
[0035]
本实施例使用mtt测定法确定5
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去甲基川陈皮素对b16f10黑素瘤细胞的细胞毒性作用，测试结果如图1中a所示，以浓度为2.5μm，5μm和7.5μm的5
‑
去甲基川陈皮素处理b16f10黑素瘤细胞48h时，细胞中的细胞毒性非常低或没有明显的细胞毒性。
[0036]
选用上述这3种剂量来检查5
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去甲基川陈皮素对黑色素含量和细胞酪氨酸酶活性的影响，测试结果如图1中b
‑
c所示，阳性对照毛喉素(fsk，黑色素生成诱导剂)可增加细胞中黑色素的水平，经5
‑
去甲基川陈皮素处理后的细胞内的黑色素含量也以剂量依赖性方式增加，表明5
‑
去甲基川陈皮素可促进细胞内黑色素的生成。
[0037]
由于酪氨酸酶在将酪氨酸氧化为多巴醌(其是黑色素合成的底物)中起着重要作用，因此本实施例还评估了5
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去甲基川陈皮素对细胞酪氨酸酶活性的影响。测试结果如图1中d所示，在5
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去甲基川陈皮素处理后，酪氨酸酶活性以剂量依赖性方式显着增加，表明5
‑
去甲基川陈皮素具备刺激细胞中黑色素生成的活性。
[0038]
实施例2
[0039]
利用能够将银结合并还原成金属银的黑色素等银亲和素物质进行可视化的功能，在用5
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去甲基川陈皮素对b16f10黑素瘤细胞进行处理后，将fontana
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masson染色技术应用于b16f10黑素瘤细胞染色。测试结果如图2所示，在使用不同浓度的5
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去甲基川陈皮素处理
后，发现随着浓度的增加，所观察到的树枝状尖端处伸长的树枝状晶体和黑素体的形成也随之增加，进一步显示5
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去甲基川陈皮素具有促进黑素体形成的作用。
[0040]
实施例3
[0041]
为了进一步阐明5
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去甲基川陈皮素对黑素体运输的调控，本实施例几种与黑素体运输控制相关的关键蛋白进行了研究，例如：pmel17是一种完整的膜蛋白，可以从内质网输出到高尔基体，在那里它被糖基化并最终参与了黑素体的形成。rab27a和myosin va是基于肌动蛋白的黑素体转运的关键调节剂。研究结果如图3所示，western印迹结果证实5
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去甲基川陈皮素增加了结构蛋白pmel17，rab27a和myosin va的表达，表明经5
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去甲基川陈皮素处理后的b16f10黑色素瘤细胞中黑色素体及其相关转运蛋白的数量得到增加。
[0042]
实施例4
[0043]
已知酪氨酸酶，trp
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1和trp
‑
2均能参与了黑色素生成的酶促级联反应，而mitf是主转录因子，它能控制以上这几种酶的表达。为了探明5
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去甲基川陈皮素的潜在作用机制，本实施例进行荧光素酶测定以验证5
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去甲基川陈皮素是否能够激活mitf
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荧光素酶相关基因的表达，并用5
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去甲基川陈皮素处理b16f10黑素瘤细胞。测试结果如图4所示，其中图4中a显示5
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去甲基川陈皮素以剂量依赖性的方式显著诱导提高mitf的转移活性；图4中b
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c显示5
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去甲基川陈皮素也同时促进黑色素生成相关基因(包括mitf，酪氨酸酶(tyrosinase)，trp
‑
1，trp
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2)的表达。综上所述，5
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去甲基川陈皮素可显著增强mitf的表达，并伴随在黑色素生成过程中关键基因表达的上调。
[0044]
实施例5
[0045]
在证明5
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去甲基川陈皮素能够诱导mitf，酪氨酸酶，trp
‑
1和trp
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2的蛋白表达后，本实施例进一步研究了5
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去甲基川陈皮素促进黑素生成的分子机制，结果如图5所示。采用浓度为2.5μm至7.5μm的5
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去甲基川陈皮素对b16f10黑素瘤细胞进行处理，在处理后15
‑
30分钟内，5
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去甲基川陈皮素引起creb的快速磷酸化(如图5中a所示)。此外，在5
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去甲基川陈皮素处理30分钟后，细胞内的camp水平也发生提高明显提高(如图5中b所示)。
[0046]
实施例6
[0047]
为了进一步研究camp/creb信号途径在b16f10黑素瘤细胞中由5
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去甲基川陈皮素诱导黑色素合成的过程，采用了pka抑制剂h89进行相关测试，测试结果如图6所示。如图6中a所示，经5μm h89处理48小时后，未在细胞中显示出明显的细胞毒性作用，因此该浓度用于所有后续实验。将b16f10黑素瘤细胞用h89(5μm)预处理30分钟，再暴露于指定浓度的5
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去甲基川陈皮素处理24小时后，b16f10黑素瘤细胞中的颜色变化和黑色素水平的定量分别如图6中b
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c所示，结果显示h89有效地减弱了5
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去甲基川陈皮素处理过的细胞中黑色素的含量；而从图6中d可以得出，h89还抑制了5
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去甲基川陈皮素介导的酪氨酸酶活性，这是黑色素生成过程中的关键步骤；而从图7可以得出，pka抑制剂h89的处理抑制了树突状结构的产生和黑素体的运输。综上所述，pka信号转导途径对于5
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去甲基川陈皮素诱导的黑色素生成过程中起到关键作用。
[0048]
实施例7
[0049]
为了确定5
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去甲基川陈皮素激活的camp/creb信号通路对于细胞中的黑色素生成是否必不可少，本实施例在添加5
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去甲基川陈皮素之前，先将b16f10细胞与5μm h89一起孵育30分钟，然后通过蛋白质印迹分析creb和总creb的磷酸化，测试结果如图8所示。如图8中
a所示，在存在h89时，5
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去甲基川陈皮素诱导的磷酸化creb表达显着下调，而总creb的表达没有变化，表明h89显著抑制了5
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去甲基川陈皮素诱导的camp/creb信号通路。如图8中b所示，在存在h89时，mitf、酪氨酸酶、trp
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1和trp
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2蛋白表达水平的增加被显著降低。
[0050]
实施例8
[0051]
本实施例一种治疗色素减少性皮肤病的药物，其制备方法为：
[0052]
取5
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去甲基川陈皮素300g，加入乳糖150g、淀粉720g混合，用淀粉浆作为粘合剂，湿法制粒，烘干，加入硬脂酸镁20g混匀，压制成片剂。口服，用于治疗色素减少性皮肤病。
[0053]
实施例9
[0054]
将5
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去甲基川陈皮素添加于现有美黑产品或黑发产品中，有助于促进黑色素的生成，改善美黑或黑发效果。
[0055]
上面结合附图对本技术实施例作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。