miR-124-3p激动剂在制备IL4Rα蛋白表达抑制剂中的应用

mir
‑
124
‑
3p激动剂在制备il4r
α
蛋白表达抑制剂中的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体涉及mir
‑
124
‑
3p激动剂在制备il4rα蛋白表达抑制剂中的应用。


背景技术：

2.人白细胞介素4(il4，il
‑
4)，又称bcgf
‑
1、bcgf1、bsf
‑
1、bsf1等，主要由活化的t细胞产生，参与体液免疫和适应性免疫，是诱导初始辅助性t细胞向th2细胞分化的细胞因子。人il
‑
4基因定位于5q31.1，由4个外显子和3个内含子组成，约10kb。成熟人il
‑
4分子由129个氨基酸残基组成，分子量为15kda，含2个糖基化点。il
‑
4的所有生物学功能都是通过效应细胞表面的白介素4受体(il
‑
4r)介导的，il4r由a和γ亚单元组成，il
‑
4与il
‑
4r通过结合il
‑
4rα链进行信号传导。人il
‑
4rα定位于16p12.1区域，该区域基因及其多态性与哮喘、过敏性皮炎相关。
3.目前针对il
‑
4rα开发的抗体药在临床上的适应症主要为过敏、特应性皮炎、哮喘和癌症等。然而，仍然部分患者使用现有的药物不能获得良好疗效。因此，探索更多有效的治疗方法具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出mir
‑
124
‑
3p激动剂在制备il4rα蛋白表达抑制剂中的应用。
5.本发明还提出一种具有上述il4rα蛋白表达抑制剂的应用。
6.根据本发明的一个方面，提出了一种mir
‑
124
‑
3p激动剂在制备il4rα蛋白表达抑制剂中的应用。
7.根据本发明的一些实施方式，所述il4rα蛋白表达抑制剂的制备原料还包括药用载体。
8.根据本发明的一些实施方式，所述药用载体为药学领域常规的药物载体。
9.根据本发明的一些实施方式，所述药用载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、黏合剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、甜味剂和香味剂中的至少一种。
10.根据本发明的一些实施方式，所述赋形剂包括水。
11.根据本发明的一些实施方式，所述填充剂包括淀粉和蔗糖中的至少一种。
12.根据本发明的一些实施方式，所述黏合剂包括纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。
13.根据本发明的一些实施方式，所述湿润剂包括甘油。
14.根据本发明的一些实施方式，所述崩解剂包括琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠中的至少一种。
15.根据本发明的一些实施方式，所述吸收促进剂包括季铵化合物。
16.根据本发明的一些实施方式，所述表面活性剂包括十六烷醇。
17.根据本发明的一些实施方式，所述吸附载体包括高岭土和皂黏土中的至少一种。
18.根据本发明的一些实施方式，所述润滑剂包括滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇中的至少一种。
19.根据本发明的一些实施方式，所述mir
‑
124
‑
3p激动剂在il4rα蛋白表达抑制剂中的质量分数为0.1％～99％。
20.根据本发明的一些优选实施方式，所述mir
‑
124
‑
3p激动剂在il4rα蛋白表达抑制剂中的质量分数为0.5％～95％。
21.根据本发明的一些优选实施方式，所述mir
‑
124
‑
3p激动剂在il4rα蛋白表达抑制剂中的质量分数为10％～20％。
22.根据本发明的一些实施方式，所述il4rα蛋白表达抑制剂的给药量标准为：mir
‑
124
‑
3p激动剂0.01mg/天～1000mg/天。
23.根据本发明的一些实施方式，所述il4rα蛋白表达抑制剂的剂型为本领域常规的各种剂型，优选地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更优选地为片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、干混悬剂、滴丸剂、干浸膏剂、注射剂或输注剂。
24.根据本发明的一些实施方式，所述il4rα蛋白表达抑制剂的给药方式可以为本领域常规的给药方式，包括但不限于注射给药或口服给药。所述注射给药可以为静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。
25.本文所述的术语“给药剂量”为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。可以随被治疗的具体疾病以及其它因素而定，其它因素包括年龄、体重、健康状况、症状的严重程度、给药途径、治疗的频率和在治疗期间是否伴随其它的药物。
26.根据本发明的再一方面实施方式提出了上述il4rα蛋白表达抑制剂的应用，所述应用为在制备治疗应变性鼻炎药物中的应用。
27.在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备il4蛋白表达抑制剂中的应用。
28.在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备il13蛋白表达抑制剂中的应用。
29.在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备il5蛋白表达抑制剂中的应用。
30.在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备抑制嗜酸性粒细胞数目增加的药物中的应用。
31.在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备ige蛋白表达抑制剂中的应用。
32.根据本发明实施方式的所述的应用，至少具备如下有益效果：本发明方案提供的mir
‑
124
‑
3p激动剂可以显著抑制il4rα的蛋白表达，抑制嗜酸性粒细胞数目增加，同时降低il4、il13、il5和ige的蛋白表达量，在治疗过敏性鼻炎方面取得了良好的作用效果，对治疗过敏性鼻炎具有重要意义。
附图说明
33.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
34.图1为本发明实施例1中的变应性鼻炎小鼠建模流程图；
35.图2为本发明实施例2中的mir
‑
124
‑
3p激动剂对变应性鼻炎小鼠打喷嚏数目的影响结果图，其中，c为盐水对照组，t为mir
‑
124
‑
3p激动剂治疗组，ar为尘螨致敏的变应性鼻
炎组，*为p＜0.05；
36.图3为本发明实施例3中的mir
‑
124
‑
3p激动剂对变应性鼻炎小鼠血清中尘螨特异性ige表达水平影响结果图，其中，c为盐水对照组，t为mir
‑
124
‑
3p激动剂治疗组，ar为尘螨致敏的变应性鼻炎组，*为p＜0.05；
37.图4为本发明实施例4中的mir
‑
124
‑
3p激动剂对变应性鼻炎小鼠鼻粘膜中嗜酸性粒细胞浸润的影响结果图，其中，c为盐水对照组，t为mir
‑
124
‑
3p激动剂治疗组，ar为尘螨致敏的变应性鼻炎组，**为p＜0.01，***为p＜0.001；
38.图5为本发明实施例5中的mir
‑
124
‑
3p激动剂对变应性鼻炎小鼠鼻粘膜中il4rα的表达水平的影响结果图，其中，c为盐水对照组，t为mir
‑
124
‑
3p激动剂治疗组，ar为尘螨致敏的变应性鼻炎组，***为p＜0.001；
39.图6为本发明实施例5中的mir
‑
124
‑
3p激动剂对变应性鼻炎小鼠鼻粘膜中il4的表达水平的影响结果图，其中，c为盐水对照组，t为mir
‑
124
‑
3p激动剂治疗组，ar为尘螨致敏的变应性鼻炎组，**为p＜0.01，***为p＜0.001；
40.图7为本发明实施例6中的mir
‑
124
‑
3p激动剂对变应性鼻炎小鼠脾脏中il4rα的表达水平的影响结果图，其中，nc为对照组，mimic为mir
‑
124
‑
3p模拟物处理组，**为p＜0.01；
41.图8为本发明实施例6中的mir
‑
124
‑
3p激动剂对变应性鼻炎小鼠脾脏中il4的表达水平的影响结果图，其中，nc为对照组，mimic为mir
‑
124
‑
3p模拟物处理组，*为p＜0.05；
42.图9为本发明实施例6中的mir
‑
124
‑
3p激动剂对变应性鼻炎小鼠脾脏中il13的表达水平的影响结果图，其中，nc为对照组，mimic为mir
‑
124
‑
3p模拟物处理组，***为p＜0.01；
43.图10为本发明实施例6中的mir
‑
124
‑
3p激动剂对脾脏中il5蛋白表达影响结果图，其中，nc为对照组，mimic为mir
‑
124
‑
3p模拟物处理组，**为p＜0.01。
具体实施方式
44.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
45.相关研究表明mirna可以靶向调控炎症反应。而本发明方案通过变应性鼻炎小鼠和正常小鼠进行全基因组比对分析发现mir
‑
124
‑
3p在变应性鼻炎小鼠鼻粘膜中表达明显低于正常小鼠，且能够与il4rα结合，负性调控il4rα表达。另外，il4rα是il4和il13受体基因，后者是2型炎症反应的关键分子。
46.本发明所使用的mir
‑
124
‑
3p激动剂和mir
‑
124
‑
3p mimic(模拟物)均购自广州锐博生物技术有限公司。
47.实施例1变应性鼻炎小鼠建模
48.实验动物：取6
‑
8周龄c57bl/6j雌性小鼠，随机分3组，每组5只，c组为生理盐水对照组，ar为尘螨致敏的变应性鼻炎组，t为mir
‑
124
‑
3p激动剂治疗组。
49.ar建模：分腹腔致敏和鼻部激发两个阶段。腹腔致敏阶段：40μg hdm(stallergenesgreer，us)溶在200μl生理盐水中，分别于第1、5、10、15天对小鼠进行腹腔注
射。鼻部激发阶段：第16
‑
25天连续10天，每天用20μg hdm溶于20μl的生理盐水中滴鼻激发，每侧鼻腔10μl。
50.mir
‑
124
‑
3p激动剂治疗组t组小鼠与ar建模小鼠的区别在于，每次hdm鼻腔激发前3h，分别给予1.4nmol mir
‑
124
‑
3p激动剂进行滴鼻干预，每侧鼻腔10μl，连续7天。
51.生理盐水对照组c组的小鼠与ar建模小鼠的区别在于，均用生理盐水滴鼻假激发替代。变应性鼻炎小鼠建模流程图如图1所示。
52.实施例2mir
‑
124
‑
3p激动剂在减轻变应性鼻炎小鼠鼻部症状中的应用
53.实施例1制备的3组小鼠，在最后一次采用滴鼻后的15分钟内，观察3组小鼠喷嚏数目。
54.实验结果如图2所示，从图中可以看出，mir
‑
124
‑
3p激动剂可以有效的减轻变应性鼻炎小鼠鼻部症状，通过mir
‑
124
‑
3p激动剂治疗后，变应性鼻炎小鼠的鼻部症状基本可以达到正常小鼠的水平。
55.实施例3mir
‑
124
‑
3p激动剂抑制变应性鼻炎小鼠血清中尘螨特异性ige水平
56.将实施例1制备的3组小鼠摘眼球取血，离心所得血清使用elisa试剂盒(invitrogen)检测尘螨特异性ige水平。
57.实验结果如图3所示，从图中可以看出，mir
‑
124
‑
3p激动剂可以有效的降低尘螨特异性ige蛋白的表达水平，通过mir
‑
124
‑
3p激动剂治疗后，变应性鼻炎小鼠尘螨特异性ige蛋白的表达水平基本可以达到对照组正常小鼠的水平。
58.实施例4mir
‑
124
‑
3p激动剂对变应性鼻炎小鼠鼻粘膜中嗜酸性粒细胞浸润的影响
59.显微镜下解剖分离实施例1制备的3组小鼠的完整鼻粘膜，浸泡于4％多聚甲醛中，4℃处理12h后edta脱钙，石蜡包埋、切片，进行he染色，镜下观察嗜酸性粒细胞浸润数目。具体过程包括以下步骤：
60.(1)组织固定和脱钙：在4％的多聚甲醛中4℃过夜固定，加入10％的edta置于摇床上室温脱钙3天，每天换一次液体。
61.(2)梯度脱水：75％酒精30min
→
95％酒精2h
→
无水乙醇ⅰ2h
→
无水乙醇ⅱ2h。
62.(3)二甲苯透明：二甲苯ⅰ15min
→
二甲苯ⅱ15min。
63.(4)浸蜡：60℃石蜡浸入放置2h，使组织浸入融化的蜡块中。
64.(5)切片：用石蜡切片机切片后，45℃烤片2h后进行染色。
65.(6)脱蜡：二甲苯ⅰ15min
→
二甲苯ⅱ15min。
66.(7)梯度复水：无水乙醇ⅰ10min
→
无水乙醇ⅱ10min
→
95％酒精5min
→
75％酒精5min
→
双蒸水1min。
67.(8)苏木精
‑
伊红染色：苏木精水溶液染色5分钟，流水冲5分钟。1％盐酸乙醇(75％乙醇+5ml盐酸)去除细胞核之外其他成分的颜色，停留2秒。流水再冲洗2分钟，把盐酸冲干净，双蒸水再洗2分钟。然后放入酒精伊红染液中染色5分钟，双蒸水洗2秒。
68.(9)脱水：75％酒精1min
→
95％酒精5min
→
无水乙醇ⅰ5min
→
无水乙醇ⅱ5min。
69.(10)二甲苯透明：二甲苯ⅰ5min
→
二甲苯ⅱ5min。
70.(11)中性树胶封片，将切片自然晾干，置于显微镜下观察。
71.实验结果如图4所示，从图中可以看出，mir
‑
124
‑
3p激动剂可以有效的降低嗜酸性粒细胞数目。
72.实施例5mir
‑
124
‑
3p激动剂对变应性鼻炎小鼠鼻粘膜中il4rα、il4阳性细胞数目的的影响
73.显微镜下解剖分离完整鼻粘膜，浸泡于4％多聚甲醛中，4度冰箱过夜后edta脱钙，石蜡包埋、切片，免疫荧光染色il4rα，镜下观察il4rα阳性细胞数目，免疫组化染色il4，镜下观察il4阳性细胞数目。实验方法如下步骤：
74.1、免疫荧光检测小鼠鼻黏膜il
‑
4rα的表达
75.(1)脱蜡：二甲苯i15分钟
→
二甲苯ii 15分钟
→
无水酒精i 5分钟
→
无水酒精ii 5分钟
→
85％酒精5分钟
→
75％酒精5分钟
→
双蒸水洗涤。
76.(2)修复抗原：放入edta抗原修复液中，再放进微波炉进行修复。
77.(3)淬灭：在组织周围用组化笔画圈，加入淬灭剂，5分钟后用水冲洗。
78.(4)封闭:在圈内加入bsa孵育30分钟。
79.(5)加一抗：甩去封闭液，pbs洗涤后置于盛有一抗的盒中4℃孵育过夜。
80.(6)加二抗：pbs洗3次，每次5分钟。甩干切片，滴加二抗，避光孵育50min。
81.(7)复染胞核：pbs洗3次，每次5分钟。加入dapi染液，避光孵育10分钟。
82.(8)封片：pbs洗3次，每次5分钟。用抗荧光淬灭剂封片。
83.(9)拍照：在荧光显微镜下观察并拍照。
84.2、免疫组织化学检测小鼠鼻黏膜il
‑
4的表达
85.(1)脱蜡：二甲苯i15分钟
→
二甲苯ii 15分钟
→
二甲苯iii 15分钟
→
无水酒精i 5分钟
→
无水酒精ii 5分钟
→
85％酒精5分钟
→
75％酒精5分钟
→
双蒸水洗涤。
86.(2)修复抗原：把组织切片放入盛有柠檬酸抗原修复液的盒中，放入微波炉进行抗原的修复。
87.(3)阻断内源过氧化物酶：置入3％双氧水溶液，避光孵育25分钟，pbs洗3次，每次5分钟。
88.(4)封闭：在组化圈内滴入3％bsa，室温封闭30分钟。
89.(5)加一抗：轻轻甩去封闭液，pbs洗涤后放入盛有一抗的盒中4℃孵育过夜。
90.(6)加二抗：pbs洗3次，每次5分钟。在圈内滴加二抗，避光孵育50分钟。
91.(7)显色：pbs洗3次，每次5分钟。在圈内滴加dab显色液，流水冲洗切片来终止显色。
92.(8)复染胞核：加入苏木素，3分钟后用水冲洗。然后加入苏木素分化液，几秒后用水冲洗。最后加入苏木素返蓝液，用水冲洗。
93.(9)封片：75％酒精5分钟
→
85％酒精5分钟
→
无水酒精i 5分钟
→
无水酒精ii 5分钟
→
二甲苯i 5分钟，晾干后用中性树胶封片。
94.实验结果如图5
‑
6所示，从图5中可以看出，mir
‑
124
‑
3p激动剂可以显著降低变应性鼻炎小鼠鼻粘膜中il4rα的表达水平，基本可以达到对照组正常小鼠的水平；从图6中可以看出，mir
‑
124
‑
3p激动剂可以显著降低变应性鼻炎小鼠鼻粘膜中il4表达水平
95.实施例6mir
‑
124
‑
3p mimic对脾脏中il4rα、il4、il15和il13表达水平的影响
96.将实施例1制备的应变性鼻炎小鼠去脾脏，分离淋巴细胞，转染mir
‑
124
‑
3p模拟物mimic模拟激动mir
‑
124
‑
3p，rt
‑
qpcr检测il4rα、il4、il5和il13的mrna表达水平。具体方法包括以下步骤：
97.1、小鼠脾脏淋巴细胞的提取
98.(1)无菌摘取小鼠脾脏，撕去脾脏被膜。
99.(2)将滤网放在50ml离心管上，加入组织稀释液润湿。
100.(3)将脾脏放在滤网上，用注射器活塞研磨，收集冲洗下的细胞。
101.(4)向收集到的单细胞悬液中加入相等的淋巴细胞分离液。
102.(5)吸取单细胞悬液加于分离液液面上。
103.(6)离心后，由上至下细胞分为四层。第一层是稀释液；第二层是乳白色淋巴细胞；第三层是透明分离液；第四层是红细胞。
104.(7)用吸管吸取淋巴细胞层至新的15ml离心管，加10ml洗涤液，300
×
g，离心10min。
105.(8)弃上清，5ml的pbs重悬细胞，300
×
g，离心5min。
106.(9)弃上清，细胞重悬备用。
107.2、mir
‑
124
‑
3p mimic转染细胞
108.(1)细胞制备:转染前1天将细胞接种于24孔板中，根据细胞生长速度和细胞系类型确定接种的细胞数，一般为0.5
‑1×
106个细胞。转染前2小时更换新培养基。
109.(2)将1.5μl lipofectamine 3000试剂(thermofisher，us)分别加到25μl opti
‑
mem培养基中，轻轻混匀，室温静置2
‑
3分钟。
110.(3)将2.5μl mir
‑
124
‑
3p mimic、2.5μl mir
‑
124
‑
3p mimic nc分别加入到50μl opti
‑
mem减血清培养基中稀释，制备成预混液。
111.(4)将稀释完的mir
‑
124
‑
3p mimic、mir
‑
124
‑
3p mimic nc分别加入到稀释后的lipofectamine 3000试剂中，孵育10
‑
15分钟。
112.(5)将上述混合液分别滴加至24孔板中，向每孔加入0.5μl il
‑
2、0.25μl cd3抗体和0.25μl cd28抗体，最后每孔补齐opti
‑
mem减血清培养基至500μl，摇匀后放入37度co2培养箱培养。
113.(6)23小时后，向每孔细胞加入2.5μl hdm(1μg/μl)体外刺激1h，然后收集细胞，利用rt
‑
qpcr检测相关基因和蛋白的表达。
114.3、total rna kit ii提取小鼠脾脏细胞总rna
115.(1)收集24孔板中脾脏淋巴细胞：用生理盐水冲洗每孔中的细胞，离心后获取细胞沉淀。
116.(2)加入1ml rna裂解液裂解细胞，转移液体至1.5ml的离心管中，室温静置5min。
117.(3)加入200μl氯仿，高速震荡20s，室温静置2min。
118.(4)在4℃下，12000
×
g离心15min。
119.(5)转移上清到2ml的离心管，加相等的70％乙醇。
120.(6)把rna结合柱套进收集管，加入上一步的液体，10000
×
g室温离心1min，弃滤液。
121.(7)重复步骤(6)直到所有液体都结合到rna结合柱上。
122.(8)把rna结合柱套进收集管，加入500μl rna wash bufferⅰ，10000
×
g离心30s，弃滤液。
123.(9)把rna结合柱套进收集管中，加入500μl rna wash buffferⅱ，10000
×
g离心
1min，弃滤液。
124.(10)重复步骤(9)。
125.(11)把rna结合柱套进收集管中，10000
×
g空甩2min。
126.(12)把rna结合柱套进新的1.5ml的离心管，加入适量depc水，10000
×
g离心2min。
127.(13)最后测rna浓度。一般认为od260/280的值在1.8
‑
2.0视为纯度很高。
128.总rna逆转录成cdna
129.(1)rna变性：在65℃下热变性5min，立即放在冰上进行冷却。
130.(3)除去基因组dna：在冰上配置反应液。
131.(4)逆转录：在冰上配置反应液。反应液混匀后，按以下温度和时间进行反应：37℃/15min
→
50℃/5min
→
98℃/5min
→
4℃。cdna在
‑
20℃下保存。
132.4、rt
‑
qpcr检测小鼠脾脏淋巴细胞il
‑
4rα、il
‑
4、il
‑
5和il
‑
13的mrna表达水平
133.表1
[0134][0135][0136]
(1)以逆转录所得cdna为模板，按下列组分在冰上配置pcr反应液并做好记录。il
‑
4rα、il
‑
4、il
‑
5和il
‑
13基因的荧光定量pcr引物如表1所述。
[0137]
(2)加样完成后，注意勿触摸盖子顶部，盖上盖子后充分混匀，在小离心机上离心几秒钟后准备上机。
[0138]
(3)用roche lightcycler 480实时荧光定量pcr系统进行rt
‑
qpcr检测，设置rt
‑
qpcr仪：
①
反应温度95℃，时长30s，循环数为1；
②
反应温度95℃，时长5s，反应温度60℃，时长30s，循环数为40；
③
反应温度95℃，时长5s，反应温度60℃，时长1min，循环数为1；
④
反应温度50℃，时长30s，循环数为1。将孔板放置于rt
‑
qpcr仪中进行扩增。待检测完毕后导出ct值，每个样品做3个复孔，求其平均值，利用公式2
‑△△
ct计算目标mrna的相对含量。内参基因为β
‑
actin，使用primerbank设计引物，再由生工sangon biotech公司合成。
[0139]
实验结果如图7
‑
10所示，从图中可以看出，采用mir
‑
124
‑
3p激动剂可以有效的降低应变性鼻炎小鼠脾脏中il4rα、il4、il5和il13 mrna表达水平。
[0140]
变应性鼻炎是机体暴露于变应原后主要由ige介导的鼻粘膜非感染性慢性炎症性疾病。全球发病率约10
‑
40％，并呈不断上升趋势。变应性鼻炎发作期间频繁出现的鼻塞、流涕、喷嚏甚至头痛等症状，严重影响患者的睡眠、工作、学习和记忆，甚至引发抑郁等情感和认知障碍。因此，积极控制和治疗变应性鼻炎的发生发展非常重要。
[0141]
目前，变应性鼻炎的主要治疗方式包括避免接触变应原、药物治疗、免疫治疗、手术治疗、中医治疗等综合治疗。然而，仍然部分患者不能获得良好疗效。因此本技术方案对于治疗变应性鼻炎也具有重要的意义。
[0142]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。