一种口服耐酸肠菌油滴剂的制作方法

一种口服耐酸肠菌油滴剂
1.申请人：北京富玛特生物科技有限公司
2.发明人：张家树 刘琼明
技术领域
3.本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种口服耐酸肠菌制剂。


背景技术：

4.传统肠菌移植手术过程复杂，患者有一定的痛苦，还可能损伤人体腔内粘膜，并由此造成不良医疗事件。将肠菌与冻干保护剂混合后制备成冻干菌粉(us 2015037461a1，cn 112472810 a，cn 109628311 a，cn 112195103 b)，再通过口服摄入人体是目前解决肠菌移植问题的主要方式。口服肠菌制剂可避免胃镜、胃管、空肠管、结肠镜等器械介入，减少损伤肠膜的手术伤害以及其他可能的手术失误，提高患者特别是幼儿患者的依从性。但直接口服冻干菌剂经过口腔、咽、食管和胃才能到达肠道；而大部分微生物不能耐受胃酸会损失部分生物活性，无法有效保持菌群微生态平衡，最终导致治疗效果差。现有的肠溶胶囊粒径较大(cn 104922158 b)，不适合婴幼儿口服。因此，需要开发一种新剂型，能够综合提高患者口服有效性和使用依从性。


技术实现要素：

5.针对现有的肠菌制剂应用中的问题，采用耐胃酸冻干菌粉和温和的油滴剂厌氧保护层，制备肠菌油滴剂型，以改善肠菌口服有效性，克服婴幼儿患者使用胶囊制剂依从性差的问题。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明提供了一种口服肠菌油滴剂，其特征在于，由按重量百分比10％
‑
20％肠菌冻干粉和80％
‑
90％食用植物油乳化系统组成；所述肠菌冻干粉由以下组分按重量百分比组成：50％
‑
65％肠菌、12％
‑
18％菊粉、10％
‑
15％海藻糖、8％
‑
12％明胶、2.5％l
‑
抗坏血酸、2.5％聚l
‑
赖氨酸；所述食用植物油乳化系统由以下组分按重量百分比组成：85％食用植物油和15％hlb为7.0
‑
8.0的聚甘油脂肪酸酯乳化剂组合物。
8.所述食用植物油为亚麻籽油、葵花籽油或藻油的任意一种。
9.所述聚甘油脂肪酸酯乳化剂组合物为四聚甘油单油酸酯和二聚甘油二油酸酯按重量比22∶3.0至27∶3.0组成。
10.本发明的有益效果：
11.1.本发明采用hlb为7.0
‑
8.0的聚甘油脂肪酸酯乳化剂组合物，在口腔、胃肠道内水份、温度适宜及温和搅拌的条件下，对所述食用植物油进行乳化，形成多重乳液递送系统；本发明所述聚甘油脂肪酸酯乳化剂相较其他食品乳化剂在酸性条件下对植物油的乳化性和稳定性更好，为菌剂在胃酸环境中提供良好的保护层；经耐胃酸检测，各实施例油滴剂与肠菌冻干粉对照1相比，肠菌耐酸存活率显著提高(表3)；所述的油滴剂相比单独的肠菌
冻干粉可以更好的隔绝空气，提高菌剂长期储存的存活率。
12.2.本发明所述肠菌冻干粉中所用明胶作为冻干保护剂的大分子蛋白组分，在本发明所述用量范围内，与不添加明胶的对照2相比冻干保护效果明显改善(表2)，与添加等量的脱脂奶粉对照3相比则具有相对较好的冻干保护效果(表2)；而添加明胶的各实施例比不添加明胶的对照2、3、6显著提高了菌剂的耐胃酸效果(表3)。
13.3.本发明所述肠菌冻干粉中所用菊粉，作为不同聚合度果糖的混合物具有大分子和小分子冻干保护剂的双重功能，可以达到与现有技术常用的麦芽糊精(对照4)相似的冻干保护效果(表2)，避免了使用麦芽糊精引起肠道炎症等副作用(参考文献1
‑
1)；并且菊粉几乎不能被胃酸水解和消化，相较单一低聚果糖可以到达结肠，较现有肠菌冻干技术更有利于肠菌中益生菌的定植(表3，参考文献3)。
14.4.本发明所述肠菌冻干粉中所用聚l
‑
赖氨酸，能够通过改变肠菌的荷电性质，在胃酸性环境下在菌体表面形成正电荷保护层；添加所述浓度的聚l
‑
赖氨酸的各实施例相较于不添加聚l
‑
赖氨酸的对照5、6，更有利于协助提高肠菌的耐酸存活率(表3)。
具体实施方式
15.对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述如下：
16.制备肠菌：将健康供体新鲜粪便样本20g，浸泡于100ml的0.9％无菌生理盐水溶液中，获得原始菌液；将原始菌液以6000g，离心10min，弃去上清；重复洗涤3次，获得肠菌菌泥。
17.制备冻干保护剂母液：称重6.0g菊粉，5.0g海藻糖，4.0g明胶，加85g ph6.0
‑
ph7.0的pbs缓冲液配制；115℃灭菌30min；使用前于37℃水浴，融化母液。l
‑
抗坏血酸、聚l
‑
赖氨酸配成10倍溶液过滤除菌，冰箱保存。
18.制备肠菌冻干粉：将肠菌菌泥和冻干保护剂母液按重量比4∶6至6∶4混匀，再将过滤除菌的l
‑
抗坏血酸、聚l
‑
赖氨酸分别按终浓度0.5％添加，获得预冻干肠菌菌液；经冷冻干燥机冻干36
‑
48h，获得肠菌冻干粉；100ml预冻干肠菌菌液可冻干为20g冻干菌粉。所用冻干机为北京博医康实验仪器有限公司pilot2
‑
4h型冻干机。
19.制备食用植物油乳化系统：食用植物油85g，加四聚甘油单油酸酯(hlb8.0)11g至13.5g，二聚甘油双油酸酯(hlb3.5)1.5g至4.0g，加热至60℃融化混匀，冷却至室温备用。
20.本发明具体实施例及对照组分如表1。
21.表1 实施例、对照组分及重量百分含量(％)
[0022][0023]
菌落计数
[0024]
采用厌氧培养活菌计数法。将各实施例和对照制备10倍系列稀释样品，稀释到10；选取三个菌落数在30
‑
300的合适稀释度，浇注改良gam培养基置于厌氧罐培养48h，进行菌落计数。所述改良gam培养基购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
[0025]
菌落计数cfu/g＝计数的加权平均值
×
10
×
稀释倍数
[0026]
冻干存活率检测
[0027]
将适量肠菌冻干粉中加入无菌生理盐水溶液，补足至冻干前体积，置于厌氧罐，37℃复苏30min后进行菌落计数。
[0028]
冻干存活率(％)＝冻干后菌落数/冻干前菌落数
×
100％
[0029]
表2 冻干存活率
[0030]
序号总菌存活率/％实施例i88.3实施例ii89.7实施例iii87.6实施例iv87.0实施例v85.9对照187.6对照237.2对照367.6对照478.1对照582.6对照617.9
[0031]
耐胃酸检测
[0032]
体外模拟消化实验参照《nature protocols》中的infogest体外静态消化方法。实施例i
‑
v和对照1
‑
6按照肠菌冻干粉重量相等取样；并按重量比1∶1加入人工胃液(ph3.0)，37℃下，厌氧罐中保温2h后，再将胃液处理后的样品12000g离心4min，无菌除氧生理盐水洗涤3次，取沉淀稀释进行菌落计数。胃液处理后，剩余沉淀加入模拟人工肠液(ph7.0)中37℃下，厌氧罐中保温1h后，12000g离心4min，无菌除氧生理盐水洗涤3次，取沉淀进行菌落计数并计算消化总损失，结果如表3。
[0033]
表3 耐胃酸损失
[0034][0035]
由表3可知，本发明的实施例i
‑
v较对照1
‑
6，经胃肠道消化损失均有明显降低，表明本发明的肠菌油滴剂较现有肠菌制剂耐胃酸效果显著增加。其中实施例iii油滴剂和无添加植物油乳化系统的肠菌冻干粉对照1相比，经胃肠道消化总损失降低了2.83lgcfu/g；而实施例iii油滴剂与不加明胶的肠菌冻干粉对照2相比，经胃肠道消化总损失降低了5.37lgcfu/g，可见植物油乳化系统和明胶为本发明的油滴剂型耐胃酸的主要影响因子。
[0036]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
[0037]
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‑
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‑
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