一种蛋白喷雾剂及其制备方法和用途与流程

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种蛋白喷雾剂及其制备方法和用途。


背景技术：

2.2002年于中国广州首次发现一种新型病原体，其造成人的严重急性呼吸道综合征，该病原体称之为严重急性呼吸道综合征冠状病毒(sars-cov)。2012年，又一种冠状病毒在中东地区爆发，即中东呼吸道冠状病毒(mers-cov)。2019年，一种新型冠状病毒(2019-ncov)再次席卷全球，给人类的生命健康造成了严重威胁和损害。此外可感染人类的冠状病毒还有很多，例如人冠状病毒229e(hcov-229e)等。因而，这类病毒的存在，给人类的生存带来了严重隐患。
3.因此，本发明的发明人团队此前针对冠状病毒开发了一系列可以抑制病毒感染的ek1蛋白多肽，其由申请号为201610070216.4、发明名称为“广谱地抑制人类冠状病毒感染的多肽及其应用”的专利申请以及申请号为202010080751.4、发明名称为“多肽、其制备方法和用途”的专利申请记载。
4.众所周知，目前常规使用的抑制人冠状病毒的方法为注射疫苗。但是，由于肌肉注射存在一定危险性，如热源反应以及注射安全的问题，并且存在一定的疼痛感，部分患者并不愿意接受。因此，研发一种能够让患者广泛接受，并且没有疼痛感，安全性高的制剂迫在眉睫。


技术实现要素：

5.发明要解决的问题
6.针对上述本领域中存在的冠状病毒疫苗剂型单一的问题，本发明提供了一种蛋白喷雾剂，并提供了其制备方法及用途，通过筛选制剂所用的渗透剂及用量使ek1蛋白药物更容易被吸收利用。
7.用于解决问题的方案
8.第一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如下以质量百分比计的组分：蛋白0.1％-5％、渗透剂1％-15％、稳定剂0.1％-1％、ph缓冲液0.1％-2％、渗透压调节剂0.1％-1％、任选的防腐剂和余量的水。
9.进一步地，在上述药物组合物中，所述蛋白为ek1蛋白或其衍生物，其中，ek1蛋白包含以seq id no.1所示的序列；优选地，ek1蛋白衍生物包括胆固醇修饰的ek1蛋白；优选地，其中所述胆固醇修饰在ek1蛋白的c端进行；优选地，其中ek1蛋白在c端通过接头与胆固醇部分连接；优选地，其中所述接头是peg化的；优选地，其中ek1蛋白在c端通过接头与胆固醇修饰的半胱氨酸连接；优选地，其中所述接头包含(gsgsg)n，其中n为1或2；优选地，其中接头是-(gsgsg)n-dpeg4-，其中n为1或2；更优选地，所述ek1蛋白衍生物是sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-(gsgsg)n-dpeg4-c-胆固醇，其中n为1或2。
10.进一步地，在上述药物组合物中，所述渗透剂包括环糊精及其与聚乙二醇的组合；
优选地，所述渗透剂包括羟丙基-β-环糊精及其与聚乙二醇300的组合。
11.进一步地，在上述药物组合物中，所述稳定剂包括泊洛沙姆。
12.进一步地，在上述药物组合物中，所述ph缓冲液包括磷酸盐缓冲液，其ph值为6-8；优选地，所述ph缓冲液包括磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
13.进一步地，在上述药物组合物中，所述ph缓冲液将所述药物组合物的ph值调至6.0-8.0，优选6.7-7.0。
14.进一步地，在上述药物组合物中，所述渗透压调节剂包括氯化钠。
15.第二方面，本发明提供了上述药物组合物的制备方法，其包括如下步骤：将处方量的蛋白、渗透剂和稳定剂溶于一部分处方量的水中，混匀至溶清，加入处方量的ph缓冲液和渗透压调节剂，并加入剩余处方量的水，混匀，过滤，即得。
16.第三方面，本发明提供了上述药物组合物的使用方法，其包括如下步骤：将所述药物组合物加入到喷雾装置中，再通过所述喷雾装置施用于对其有需要的个体。
17.第四方面，本发明提供了一种预填装容器，其包含上述药物组合物。
18.第五方面，本发明提供了上述药物组合物在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物或预填装容器中的用途；优选地，所述冠状病毒包括sars-cov、mers-cov、2019-ncov和hcov-229e。
19.发明的效果
20.通过上述技术方案的实施，本发明所提供的ek1蛋白喷雾剂作为蛋白的鼻腔给药制剂，添加的渗透剂环糊精能够起到渗透促进作用，且加入聚乙二醇(peg)之后，能够进一步提高蛋白的渗透和吸收作用，并进一步提高生物利用度，实验发现本产品的蛋白药物利用率可以达到肌肉注射的50％以上，甚至达到70％以上。此外，聚乙二醇还能够起到保护的作用，保证了整个过程中蛋白的稳定。
附图说明
21.图1为比格犬被给予不同组别的药物后在不同时间下的血药浓度检测结果。
具体实施方式
22.以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。本发明不限于以下说明的各构成，在发明请求保护的范围内可以进行各种变更，而适当组合不同实施方式、实施例中各自公开的技术手段而得到的实施方式、实施例也包含在本发明的技术范围中。
23.除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。
24.本说明书中，使用“数值a～数值b”或“数值a-数值b”表示的数值范围是指包含端点数值a、b的范围。
25.本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方式”、“另一些具体/优选的实施方式”、“一些具体/优选的技术方案”、“另一些具体/优选的技术方案”等是指所描述的与该实施方式有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方式中，并且可存在于其它实施方式中或者可不存在于其它实施方式中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方式中。
26.本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
27.本发明所述ek1蛋白为申请号为201610070216.4、发明名称为“广谱地抑制人类冠状病毒感染的多肽及其应用”的专利申请以及申请号为202010080751.4、发明名称为“多肽、其制备方法和用途”的专利申请记载。
28.在本发明中，蛋白可以是衍生物形式。例如，ek1蛋白可以进行胆固醇修饰。胆固醇修饰的方法是公知的。蛋白与胆固醇部分连接，该连接可以是直接连接或者通过接头连接。
29.在本发明中，接头的长度可以有所变化。例如，接头可以是(gsgsg)n，其中n为大于等于1的整数，例如，n为1、2、3、4或5。
30.在本发明中，接头可以是peg化的。peg化修饰的手段对于本领域技术人员是已知的。如本文中使用，术语peg化接头是指接头附加有一个或者更多个peg。在本文中，peg化接头可以是peg化的(gsgsg)n。n为大于等于1的整数，例如，n为1、2、3、4或5。
31.在本发明中，“dpeg”是指离散聚乙二醇。dpeg4表示重复乙二醇残基的数目为4。
32.在一项实施方案中，本发明所述的ek1蛋白包含以seq id no.1所示的序列(全长36aa，从n端至c段依次为sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel)。
33.在一项实施方案中，本发明所述的ek1蛋白衍生物包括胆固醇修饰的ek1蛋白。
34.在一项实施方案中，胆固醇修饰在ek1蛋白的c端进行。
35.在一项实施方案中，ek1蛋白在c端通过接头与胆固醇部分连接。
36.在一项实施方案中，接头是peg化的。例如，接头可以用dpeg进行peg化。
37.在一项实施方案中，ek1蛋白在c端通过接头与胆固醇修饰的半胱氨酸连接。也就是说，ek1蛋白通过接头经半胱氨酸与胆固醇部分连接。
38.在一项实施方案中，接头包含(gsgsg)n，其中n为大于等于1的整数，例如，n为1、2、3、4或5。
39.在一项实施方案中，接头是-(gsgsg)n-dpeg4-，其中n为大于等于1的整数，例如，n为1、2、3、4或5。
40.在一项实施方案中，本发明所述的ek1蛋白衍生物是sldqinvtfldleyemkklee aikkleesyidlkel-(gsgsg)n-dpeg4-c-胆固醇，其中n为大于等于1的整数，例如，n为1、2、3、4或5。
41.在一项优选的实施方案中，本发明所述的ek1蛋白衍生物是sldqinvtfldleyem kkleeaikkleesyidlkel-gsgsg-dpeg4-c-胆固醇。
42.在一项实施方案中，本发明的药物组合物包含如下以质量百分比计的组分：蛋白0.1％-5％、渗透剂1％-15％、稳定剂0.1％-1％、ph缓冲液0.1％-2％、渗透压调节剂0.1％-1％、防腐剂和余量的水。
43.在一项实施方案中，本发明的药物组合物包含如下以质量百分比计的组分：蛋白0.1％-5％、渗透剂1％-15％、稳定剂0.1％-1％、ph缓冲液0.1％-2％、渗透压调节剂0.1％-1％和余量的水。
44.在一项优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含如下以质量百分比计的组分：蛋白0.1％-5％、渗透剂1％-15％、稳定剂0.1％-1％、ph缓冲液0.1％-2％、渗透压调节
剂0.1％-1％和余量的水；所述蛋白为ek1蛋白或其衍生物；所述渗透剂包括环糊精，优选羟丙基-β-环糊精；所述稳定剂包括泊洛沙姆；所述ph缓冲液包括磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，其ph为6-8；所述渗透压调节剂包括氯化钠。
45.在一项更优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含如下以质量百分比计的组分：蛋白1％-5％、渗透剂4％-15％、稳定剂0.5％-1％、ph缓冲液1％-2％、渗透压调节剂0.3％-1％和余量的水；所述蛋白为ek1蛋白或其衍生物；所述渗透剂包括环糊精，优选羟丙基-β-环糊精；所述稳定剂包括泊洛沙姆；所述ph缓冲液包括磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，其ph为6-8；所述渗透压调节剂包括氯化钠。
46.在另一项优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含如下以质量百分比计的组分：蛋白0.1％-5％、渗透剂1％-15％、稳定剂0.1％-1％、ph缓冲液0.1％-2％、渗透压调节剂0.1％-1％和余量的水；所述蛋白为ek1蛋白或其衍生物；所述渗透剂包括环糊精和聚乙二醇，优选羟丙基-β-环糊精和聚乙二醇300；所述稳定剂包括泊洛沙姆；所述ph缓冲液包括磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，其ph为6-8；所述渗透压调节剂包括氯化钠。
47.在另一项更优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含如下以质量百分比计的组分：蛋白1％-5％、渗透剂1％-15％、稳定剂0.5％-1％、ph缓冲液1％-2％、渗透压调节剂0.3％-1％和余量的水；所述蛋白为ek1蛋白或其衍生物；所述渗透剂包括环糊精和聚乙二醇，优选羟丙基-β-环糊精和聚乙二醇300；所述稳定剂包括泊洛沙姆；所述ph缓冲液包括磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，其ph为6-8；所述渗透压调节剂包括氯化钠。
48.在又一项更优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含如下以质量百分比计的组分：蛋白1％-5％、渗透剂1％-15％、稳定剂0.5％-1％、ph缓冲液1％-2％、渗透压调节剂0.3％-1％和余量的水；所述蛋白为ek1蛋白或其衍生物；所述渗透剂包括环糊精和聚乙二醇，优选羟丙基-β-环糊精1％-15％和聚乙二醇300 0.1％-0.5％；所述稳定剂包括泊洛沙姆；所述ph缓冲液包括磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，其ph为6-8；所述渗透压调节剂包括氯化钠。
49.除非另有说明，本发明中使用的仪器、试剂、材料、实验动物等均可通过常规商业手段获得。
50.实施例1：ek1蛋白鼻腔喷雾剂的处方研究
51.1.处方组成及制备方法
52.1.1处方组成
53.本品为ek1蛋白鼻腔喷雾剂，包含如下以质量百分比计的成分：
54.蛋白：0.1％-5％；
55.渗透剂：环糊精1％-15％(可选其他)，peg-300：0％-1％；；
56.泊洛沙姆：0.1％-1％；
57.ph缓冲液：0.1％-2％(ph为6-8的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液)；
58.nacl：0.1％-1％；
59.水：余量；
60.本产品处方还可加入防腐剂(本实施例所用处方没有加入)。
61.1.2制备方法
62.将上述蛋白、泊洛沙姆、渗透剂(可为环糊精，或环糊精+peg-300)溶于10％的水
中，手动震荡，至溶液澄明。之后加入ph缓冲液。然后添加nacl，并加水至100％。
63.2.渗透剂的选择
64.2.1处方设计
65.为了探讨不同渗透剂及其用量对ek1蛋白鼻腔喷雾剂在储存过程中性状及稳定性等的影响，现设计如表1所示的不同处方例，其中所用ek1蛋白氨基酸序列为以seq id no.1所示的序列。
66.表1渗透剂选择用处方的具体组成
[0067][0068]
2.2处方实验检测内容
[0069]
(1)外观性状：分别取储存第1、3、5、10、20、30天的供试品，置明亮处观察。
[0070]
(2)ph：分别取储存第1、3、5、10、20、30天的供试品，测定其ph值；要求ph值在6-8之间为合格。
[0071]
(3)渗透压：取储存第1、3、5、10、20、30天的本品1ml，依法测定(中国药典2015年版四部通则0632)毫渗透压摩尔浓度(mosmol/kg)；渗透压应该等渗或者略高渗。
[0072]
(4)有关物质及纯度(hplc测定)：
[0073]
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(zorbax300sb-c18 3.5μm，4.6
×
150mm或效能相当的色谱柱)；以30mmol/l的磷酸二氢钾溶液(取磷酸二氢钾4.08g，加水1000ml溶解，用42％的氢氧化钠溶液调节ph值至6.0)为流动相a，以乙腈为流动相b；流速为1.0ml/min；柱温为35℃；检测波长为215nm；按表2进行梯度洗脱。
[0074]
表2纯度检测试验中液相色谱法适用的梯度洗脱条件
[0075]
时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)
0955570304059414545555045555195560955
[0076]
测定方法：取储存第1、3、5、10、20、30天的本品1ml，再用流动相a稀释制成每1ml中约含0.5mg蛋白的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液20μl，分别注入色谱仪，记录色谱图；扣除溶剂及辅料峰，按面积归一化法计算主峰纯度。
[0077]
(5)稳定性
[0078]
2.3处方实验检测结果
[0079]
2.3.1处方例200901-200906检测结果
[0080]
(1)外观
[0081]
表3处方例200901-200906外观性状考察结果
[0082]
外观2009012009022009032009042009052009061d澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色3d澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色5d澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色10d澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色20d澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色30d澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色
[0083]
由上表可知，储存期间处方例200901-200906所有产品为澄清无色，检测均合格。
[0084]
(2)ph
[0085]
表4处方例200901-200906ph值测定结果
[0086]
ph2009012009022009032009042009052009061d6.86.86.76.76.86.83d6.76.96.86.86.86.85d6.86.76.86.96.96.810d6.86.86.96.86.86.920d6.96.86.76.86.76.830d6.86.86.86.86.86.8
[0087]
由上表可知，储存期间处方例200901-200906所有产品ph值均在6至8之间，检测均合格。
[0088]
(3)渗透压
[0089]
表5处方例200901-200906渗透压测定结果
[0090][0091]
由上表可知，储存期间处方例200901-200906所有产品渗透压均在280-320mosmol/kg之间，为等渗或略高渗，检测均合格。
[0092]
(4)有关物质(主峰纯度％)
[0093]
表6处方例200901-200906有关物质(主峰纯度)考察结果
[0094][0095]
从上述结果可知，hp-β-环糊精用量少，会影响ek1蛋白的稳定性。在处方范围下，泊洛沙姆的用量，对产品影响不大。
[0096]
2.3.2处方例201001-201006检测结果
[0097]
(1)外观
[0098]
表7处方例201001-201006外观性状考察结果
[0099]
外观2010012010022010032010042010052010061d澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色3d澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色5d澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色10d澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色20d澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色30d澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色
[0100]
由上表可知，储存期间处方例201001-201006所有产品为澄清无色，检测均合格。
[0101]
(2)ph
[0102]
表8处方例201001-201006ph值测定结果
[0103]
ph2010012010022010032010042010052010061d6.97.06.96.86.96.83d7.06.86.76.87.07.05d6.86.96.86.96.86.910d6.96.86.97.06.96.820d7.06.86.76.86.76.830d6.86.96.86.96.86.9
[0104]
由上表可知，储存期间处方例201001-201006所有产品ph值均在6至8之间，检测均合格。
[0105]
(3)渗透压
[0106]
表9处方例201001-201006渗透压测定结果
[0107][0108]
由上表可知，储存期间处方例201001-201006所有产品渗透压均在280-320mosmol/kg之间，为等渗或略高渗，检测均合格。
[0109]
(4)有关物质(主峰纯度％)
[0110]
表10处方例201001-201006有关物质(主峰纯度)考察结果
[0111][0112]
相比处方例200901-200906的相关检测结果，可以发现，加入peg-300之后，在含有低浓度的hp-β-环糊精的环境下，处方产品依然能够保持良好的稳定性。同时peg可以促进渗透。
[0113]
实施例2：ek1蛋白鼻腔喷雾剂纤毛刺激实验
[0114]
1.处方制备
[0115]
选择实施例1中的处方例200904和201004来进行制剂制备，其中蛋白选择ek1-1(该ek1蛋白氨基酸序列为以seq id no.1所示的序列)、ek1-2(该蛋白为胆固醇修饰的ek1蛋白，即sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-gsgsg-dpeg4-c-胆固醇)，共4个处方(200904-ek1-1、200904-ek1-2、201004-ek1-1、201004-ek1-2)。
[0116]
2.实验方法
[0117]
蟾蜍上腭的纤毛与哺乳动物的鼻腔黏膜纤毛相似，常用在体蟾蜍上腭法和离体蟾蜍上腭法评价药物。
[0118]
将蟾蜍仰卧固定于蛙板之上，用止血钳张开其口腔，用手术剪刀分离上腭黏膜，取大约3mm
×
3mm的黏膜，用生理盐水清洗，平铺于载玻片上，于黏膜表面滴加0.2ml的药物溶液，盖上盖玻片。在40倍显微镜下观察纤毛的摆动情况。随后置于加有少量蒸馏水的层析缸中，密闭，使水蒸气近饱和状态，温度在20-25℃之间。之后每隔2分钟观察纤毛摆动情况，直至纤毛停止摆动。记录从滴药至纤毛停止摆动的时间间隔。纤毛停止摆动后，用生理盐水冲洗黏膜，观察黏膜上的纤毛是否恢复摆动。同时记录恢复时间。
[0119]
3.实验结果
[0120]
表11给药后纤毛摆动时间及停摆后恢复时间
[0121]
组别给药后纤毛摆动时间(min)纤毛停摆后加入生理盐水恢复间隔(min)生理盐水649
±
2010
±
3.22200904-ek1-1599
±
1917
±
4.1200904-ek1-2601
±
2218
±
3.2201004-ek1-1619
±
3221
±
4.2201004-ek1-2633
±
1820
±
3.2
[0122]
从上述数据可以看到，给药组和生理盐水组(对照组)进行对比，给药后纤毛摆动时间基本相同，没有显著性差异。而纤毛停摆后加入生理盐水，都会恢复，只是给药组稍微慢点。因此可以证明，药物没有明显的毒性作用。
[0123]
实施例3：ek1蛋白鼻腔喷雾剂的比格犬药代动力学检测
[0124]
1.实验方案
[0125]
选取24只比格犬，均分为6组(每组4只)。根据给予的物质具体划分为如下组别：
[0126]
对照组2组：ek1-1生理盐水水溶液(ek1-1蛋白氨基酸序列为以seq id no.1所示的序列，ek1-1浓度为4mg/ml)，ek1-2生理盐水水溶液(ek1-2蛋白为胆固醇修饰的ek1蛋白，即sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-gsgsg-dpeg4-c-胆固醇，ek1-2浓度为4mg/ml)；给药浓度为ek1-1/2蛋白10mg/只，给药方式为肌肉注射；
[0127]
给药组4组：处方200904-ek1-1产品，处方201004-ek1-1产品，处方200904-ek1-2产品，处方201004-ek1-2产品；各处方药物配比同实施例2，给药剂型为喷雾，每次给药1ml，分5次喷于左右鼻孔，每只鼻孔每次喷100μl。
[0128]
给药后，分别在5min、10min、20min、30min、1h、2h、4h、8h、16h、24h取血，测量血药浓度。
[0129]
2.实验结果
[0130]
实验结果如图1所示，三种制剂的达峰时间大概都在0.5-1h之间达峰。由于ek1-1、ek1-2为多肽，在胃中会马上降解，因此无法用常规的片剂进行对比实验。
[0131]
从三种制剂对比来看，200904处方的生物利用度是肌肉注射的59％，而201004处方的生物利用度是肌肉注射的78.5％。
[0132]
作为蛋白的鼻腔给药制剂，添加环糊精能够达到渗透促进作用，而加入聚乙二醇(peg)之后，能够进一步提高蛋白ek1-1/ek1-2的渗透和吸收作用，能够进一步提高吸收和生物利用度。此外，聚乙二醇还能够起到保护ek1-1/ek1-2的作用。