一种胶原蛋白分子单体皮肤涂敷液的组成和应用方法与流程

1.本发明涉及一种溶于抗坏血酸溶液的胶原蛋白分子单体皮肤涂敷液的组成和应用方法，应用于皮肤术后恢复和皮肤衰老的改善。本发明属于生物医学技术领域。


背景技术：

2.胶原蛋白是细胞外基质纤维蛋白，是哺乳动物体内大多数结缔组织的主要成分。胶原蛋白家族由20多种已知类型组成，哺乳动物真皮中主要含有i型和iii型胶原，其中i型胶原约占整个胶原蛋白的85％。i型和iii型胶原蛋白分子都是由三条α链组成的三聚体蛋白，它们的分子量约为30万(300kd)。i型胶原是含有2条α1(i)链和1条α2(i)链的异聚体，而i ii型胶原是含有3条相同α1(iii)链的同聚体，每条α链含有大约1000个氨基酸残基。它们都具有典型的重复的gly-x-y序列，脯氨酸通常占据x位置，而羟脯氨酸则占据y位置。由于含有高含量的脯氨酸和羟脯氨酸，每条α链会形成左旋螺旋结构，α链进一步折叠，相互缠绕形成复杂的三股螺旋结构。具有三股螺旋结构的胶原分子在生理条件下可以自行组装聚合形成胶原纤维，在人体内胶原纤维通过特异的金属蛋白酶可降解形成胶原片段。
3.胶原蛋白有助于保持人皮肤的紧致、色调和彭润，防止皮肤老化，是帮助保持人皮肤健康的主要因素之一。随着人们年龄的增长，新胶原蛋白的合成减少，降解增加，同时皮肤生理老化过程受到紫外线辐射、环境因素、不平衡饮食、污染和激素因素的不利影响，导致皮肤发生重大变化，表皮水合作用的正常水平丧失后，细胞外基质发生重大结构变化，胶原蛋白发生降解，其结果是真皮严重的结构和功能损伤，不可避免地产生皮肤下垂、体积减少和深度皱纹。
4.多年来医学界研究的最主要方向是真皮生物重建，通过特定的治疗旨在改善真皮质量，并从内部对抗因皮肤老化而产生的缺陷。目标是寻找和确定最佳的物质成分，使其能够刺激成纤维细胞，为其提供胶原前体并直接诱导活性，产生新生胶原蛋白。研究发现体外和真皮下给予外源胶原蛋白具有一定的上述作用，利用这一原理已开发出多种产品。目前市场上已知的含有胶原蛋白成分的产品，其中的胶原蛋白全部是i型和iii型胶原蛋白的纤维或其片段。
5.进一步的科学研究发现，和胶原纤维及胶原降解片段相比，胶原分子单体促进成纤维细胞生长的效能更好。hong xia、richard nho等人在《polymerized collagen inhibitsfibroblastproliferationvia amechanism involving the formation of a 1 integrin-protein phosphatase 2a-tuberous sclerosis complex 2 complex that suppressess6k1 activity》(the journal of biological chemistry vol.283，no.29，july 18，2008) 文献中报道了与胶原分子单体相比聚合形成纤维的胶原抑制成纤维细胞的生长。hidenorikoyama、elaine w.raines等人在《fibrillar collagen inhibitsarterial smooth muscleproliferationthrough regulation of cdk2inhibitors》(cell，vol.87，december 13， 1996)文献中介绍了胶原分子降解成胶原片段后其促进细胞生长的能力有所下降。
6.科学研究结果显示：胶原蛋白分子单体比胶原纤维或其片段具有更好的促进皮肤再生的效能，这种胶原蛋白分子单体需具有完整的三股螺旋结构。
7.国内外市场上在售的应用于皮肤领域的胶原产品，代表性的有美国collagencorporation利用牛皮开发出的牛胶原纤维注射胶和意大利euroresearch利用马皮i型胶原蛋白片段生产的产品“nithya”。还有如中国台湾双美科技有限公司的产品“双美1号”和长春博泰医药的产品“肤美达”，是利用牛皮开发的胶原纤维研制的注射胶。山西锦波生物的产品“薇旖美”、“重源”和陕西巨子生物的产品“可丽金”、“可痕”，是利用重组的人源胶原片段研制的皮肤保护产品。
8.上述的含胶原蛋白成分的产品，均是以胶原蛋白聚合形成的胶原纤维或胶原蛋白分子降解形成胶原片段的形式构建的不同剂型的产品，都不具有胶原蛋白分子单体的生物学功能，不能有效激活和诱导新的人自体胶原蛋白的产生，因此对皮肤的修复和护理作用有限。
9.抗坏血酸，也称为维生素c或l-抗坏血酸，是由植物和一些动物物种产生的六碳内酯，是一种多羟基化合物，其分子中第2及第3位上两个相邻的烯醇式羟基极易解离而释出h+，故具有酸的性质。哺乳动物许多重要的生物合成过程中需要抗坏血酸参与作用，其中包括抗体及胶原形成、组织修补、脂肪及蛋白质的合成。其主要生理功能包括：促进骨胶原的生物合成，有利于组织创伤口的更快愈合。作为水溶性强抗氧化剂，主要作用在体内水溶液中坚固结缔组织、促进胶原蛋白的合成。
10.多年的科学研究结果显示，抗坏血酸对皮肤抗衰老和修复有重要作用，曾昕在《维生素 c对皮肤健康的促进作用研究进展》(现代医药卫生2020年10月第36卷第19期)一文中对抗坏血酸的作用进行了综述。维生素c保护皮肤的功效在医疗器械、化妆品、保健品和食品领域已被广泛应用。
11.本发明旨在开发一种兼具胶原分子单体和抗坏血酸护肤功能的皮肤涂敷剂。


技术实现要素：

12.本发明中，“具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白分子单体”的定义为：组织提取或重组的异种胶原蛋白和人的同种胶原蛋白分子，前述胶原蛋白为i型和iii型胶原蛋白并且保持其天然的三股螺旋结构、分子量和多肽链序列。其含义为本专业领域人员所熟知和理解并不生产歧义。
13.本发明中，“抗坏血酸”定义为：维生素c项下的表述，其含义为本专业领域人员所熟知和理解并不生产歧义。
14.为实现本发明所使用的仪器和试剂，除单独说明外，均为本专业领域人员所熟知和理解的且可通过市售公开可以获得的。本发明实例中所使用的胶原蛋白为自制的胶原蛋白分子单体。
15.本发明创造性的应用胶原蛋白分子单体的生物学功能，旨在开发一种利用胶原分子单体促进新胶原成纤维细胞生长结合抗坏血酸促进胶原合成的皮肤涂敷液。
16.目前市场上众多的以胶原蛋白为主成分的用于皮肤保护的产品，其中的胶原蛋白的形态是胶原纤维、胶原片段或胶原多肽，均不是胶原蛋白分子单体。科学研究证明，胶原蛋白分子单体对于成纤维细胞生长的促进作用优于胶原纤维、胶原片段或胶原多肽。因此，
我们发明了具有胶原分子单体促进成纤维细胞生长结合抗坏血酸促进胶原合成功能的皮肤涂敷液，本发明的涂覆液组分中的胶原蛋白保持了分子单体的形态。完整的胶原蛋白分子单体，利用专有的制备技术从动物组织中获得或利用重组方法获得。
17.目前已知还没有应用胶原蛋白分子单体做护肤产品。由于胶原分子单体具有自我聚合组装形成纤维的能力而且不溶于水，现有的胶原纤维和胶原片段护肤产品的配制组成方法不能用于胶原蛋白分子单体，故而我们创新地发明了可以维持胶原蛋白分子处于分子单体状态而非纤维状态或片段状态的新的配制组成方法。
18.本发明的涂覆液的配制组成方法保证了涂覆液中胶原分子处于分子单体状态，保持其完整的三股螺旋结构生物结构。
19.本发明提供了一种胶原蛋白分子单体涂敷液的应用方法，该应用方法在皮肤护理领域用途广泛，可在各种改善皮肤状态途径中使用。该产品适用于整容手术治疗皮肤愈合后的皮肤恢复，如抽脂、腹部整形或人体雕塑。也适合在皮肤美容方面使用，如除皱、激光治疗、磨皮和脱皮。
20.本发明提供了一种胶原蛋白分子单体涂敷液组成，其中的抗坏血酸作为酸度调节剂，并且，胶原蛋白的合成需要抗坏血酸参加，如果抗坏血酸缺乏，胶原蛋白就不能正常合成。利用抗坏血酸促进胶原蛋白合成的作用，结合胶原蛋白分子单体，提高涂覆液在皮肤护理过程中的效果。
21.本发明提供了一种胶原蛋白分子单体涂敷液，其组成是将胶原蛋白分子单体溶于抗坏血酸溶液，这种组合是一种溶液状态，溶液ph值在2.0-4.5之间。同时可以添加包括并且不限于氨基酸、营养微量元素、小分子药物、多肽分子物质、透明质酸及其衍生物、弹性蛋白。
22.本发明是一种溶于抗坏血酸溶液的具有完整三股螺旋结构胶原蛋白分子单体的涂覆液。为实现上述目的，本发明的技术方案为一种含有完整三股螺旋结构胶原蛋白分子单体的抗坏血酸溶液的组合物。
23.本发明具体技术方案如下：
24.本发明是一种溶于抗坏血酸溶液的胶原蛋白分子单体构成的涂覆液，其中的胶原蛋白是具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白分子单体。在下面的实施例里面可以看到本发明中采用了独特的制备胶原分子单体的方法和组成配制方法，使得胶原蛋白是以胶原分子单体形态存在于涂覆液中。其中胶原分子单体是从动物相关组织中经过复杂而有效的提取分离纯化工艺制得的天然胶原蛋白分子单体，也可以是经过生物工程技术制备的重组胶原蛋白分子单体。动物组织的来源包括哺乳动物和海洋动物的相关组织，优选地，所述动物组织的来源为检疫合格的牛、猪的相关组织和合法来源的健康人的相关组织。这些组织富含i和iii型胶原，如动物和人的皮肤、筋腱、血管、心包膜、胎盘等。胶原组织提取方法常见的有碱法、酸法、酶法和上述几种方法的不同结合方法，优选的，本发明中采用酸法和酶法结合的方法，可制得高纯度的胶原分子单体溶液(见实施例1、2和图1、2的内容)。本发明中胶原分子单体的浓度的相关作用范围为0.01mg-5mg/ml，优选为0.1-3.5mg/ml。胶原分子可溶性单体在涂覆液所含胶原总量中占比≥50％，优选为≥55％。
25.在本发明中，通过对涂覆液组成和配制的研究，证明胶原蛋白分子单体发生分子聚合形成胶原纤维的程度受ph值影响，ph值低于4.0时，胶原蛋白分子不发生聚合，ph值大
于5.0 时，胶原蛋白分子有聚合发生，随着ph值的升高，胶原蛋白分子聚合形成胶原纤维的程度增大(见实例4内容)。为保持胶原蛋白分子在涂覆液中为单体状态，我们发明配制涂敷液ph 值在2.0-4.5之间，优选地，ph值在2.2-4.0之间。为保证涂覆液ph值在2.0-4.5之间，我们发明将胶原蛋白分子单体溶于抗坏血酸溶液，该溶液呈酸性，抗坏血酸在其中具有调节 ph作用。其中抗坏血酸浓度为0.1％-15％，优选为0.2％-8％；所述的抗坏血酸溶液ph值在 2.0-4.0之间，优选为2.2-4.0。
26.通过以上的技术路线实现的本发明，是一种溶于抗坏血酸溶液的胶原蛋白分子单体的组合物，构成胶原蛋白分子单体皮肤涂敷液，组分中包含且不限于胶原蛋白分子单体、氨基酸、营养微量元素、小分子药物、多肽分子物质、透明质酸及其衍生物、弹性蛋白和抗坏血酸，可以是各种不同组合比例的组合物。优选的，涂敷液组分包括胶原蛋白分子单体、抗坏血酸。其中，所述组合物可制成各种剂型，优选的，所述组合物的剂型为水剂、精华液、乳液、膏霜或面膜。优选的，所述组合物剂型为水剂。
27.本发明涂覆剂的使用方法，包括将前述任一项所述的组合物，涂覆于使用者所需要的皮肤部位。
28.本发明所述的组合物可在包括护肤和术后皮肤愈合处涂敷领域中使用。本发明由于采用以上技术路线方案，使其与已有的技术相比具有以下的创新和效果：利用具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白分子单体的生物活性，结合抗坏血酸促进胶原蛋白合成的作用，促进成纤维细胞提生长，，更好的促进皮肤的新陈代谢和皮肤护理。
附图说明
29.图1为实施例1制备的胶原蛋白分子单体溶液sds-page电泳谱图照片，照片中清晰可见电泳带，从左到右依次为：marker；制备的牛跟腱胶原；美国牛皮胶原(advanced biomatrix) 对照品，每条样品胶原谱带，从下向上，依次为胶原蛋白分子单体α2(i)链、α1(i)链、及其二聚体和三聚体带谱，无胶原片段等杂蛋白。
30.图2为实施例2制备的胶原蛋白分子单体溶液sds-page电泳谱图照片，照片中清晰可见电泳带，从左到右依次为：marker；制备的人胎盘胶原；美国牛皮胶原(advanced biomatrix) 对照品，每条样品胶原谱带，从下向上，依次为胶原蛋白分子单体α2(i)链、α1(i)链、及其二聚体和三聚体带谱，无胶原片段等杂蛋白。
31.图3为实施例3将实施例2制备的人胎盘胶原蛋白分子单体溶液样品用日本jasco j-810圆二色谱仪进行检测，10mm盐酸缓冲液，样品浓度0.1mg/ml，在190～260nm波长范围扫描所得光谱吸收曲线，结果显示，该样品具有完整的三股螺旋结构。
具体实施方式
32.下面对本发明以一些具体实施例做详细说明。公众和本领域专业技术人员应当理解，以各种形式的实现本发明的方法不应被下面展示的实施例所限制。我们提供的这些实施例是为了能够详细透彻完整地阐述本发明。
33.本发明提供了一种溶于抗坏血酸溶液的胶原蛋白分子单体涂覆液，组分包括胶原蛋白分子单体、抗坏血酸、注射用水和辅料。
34.在一个实施方案中，所述的涂覆液由胶原蛋白分子单体、抗坏血酸和辅料组成。
35.在一个实施方案中，胶原蛋白分子单体从合法来源的健康人胎盘组织中经提取分离纯化获得。另一个实施方案中胶原蛋白分子单体从牛跟腱制备获得。
36.在一个实施方案中，实验证明涂覆液中胶原蛋白分子单体形态受所在体系的ph值影响，可能形成胶原纤维。用抗坏血酸和磷酸盐缓冲液调节适合的ph值，可保证涂覆液体系中胶原蛋白分子保持单体形态。
37.在一个实施方案中，所述涂覆液组分还包括辅料，所述辅料是本专业领域人员所知晓和理解的常用普通辅料，例如，所述辅料可以为：磷酸盐缓冲液、抗氧化剂等。
38.对于本发明的使用方法，本发明不作任何限制，例如，所述涂覆液可以在皮肤抗皱、抗细纹、抗衰老方面使用，所述组合物的剂型可以水剂、膏霜、乳液、精华、面膜等。
39.对于所述涂覆液中胶原蛋白分子单体和抗坏血酸所占的浓度，本发明不作任何限制，可以根据需要进行调整，例如，在涂覆液中，胶原蛋白分子单体浓度可以是0.5mg/ml，也可以是5mg/ml，抗坏血酸浓度可以是0.02％，也可以是12％
40.本发明提供了一种涂覆液的使用方法，包括将所述涂覆液的任何剂型涂抹于使用者所需要的皮肤部位。例如，可以将所述的涂覆液涂抹于使用者的脸部、鼻部、腹部、手部等，其可以根据使用者的需要进行确定。
41.本发明提供了所述涂覆液在包括护肤和术后皮肤愈合处涂敷的应用，优选的，所述组合物在皮肤抗皱、抗细纹方面使用。
42.下面是本发明提出的一种涂覆液的组成及其应用的实施例，实施例对本发明作进一步详细阐述。
43.实施例1：牛胶原蛋白溶液制备
44.取检疫合格的新鲜牛跟腱，粉碎匀浆，在ph2.0酸性条件下，按匀浆组织和提取液(含胃蛋白酶3.5mg/ml)重量体积比1∶8的比例提取，离心分离，经过盐多级沉淀分离，将沉淀酸溶解，透析膜透析，得天然牛胶原蛋白分子单体溶液。所得胶原用sds-page方法分离， dycz-25e电泳仪，sds-page凝胶配制试剂盒为碧云天生物技术有限公司生产，配制分离胶浓度15％，浓缩胶浓度10％，考马斯亮蓝染色，结果见图1。经sds-page电泳检测分析，可见胶原蛋白分子单体α1(i)链和α2(i)链带谱，无胶原片段等杂蛋白。
45.实施例2：人胶原蛋白溶液制备
46.取新鲜健康人胎盘，粉碎匀浆，在ph2.5酸性条件下，按匀浆组织和提取液(含胃蛋白酶4.0mg/ml)重量体积比1∶10比例提取消化，离心分离，经过盐沉淀，将沉淀酸溶解，超滤纯化，得天然人胶原蛋白分子单体溶液。所得胶原用sds-page方法分离，dycz-25e电泳仪，sds-page凝胶配制试剂盒为碧云天生物技术有限公司生产，配制分离胶浓度10％、浓缩胶浓度5％，考马斯亮蓝染色，结果见图2。经sds-page电泳检测分析，可见胶原蛋白分子单体α1(i)链和α2(i)链带谱，无胶原片段等杂蛋白。
47.实施例3：人胶原蛋白圆二色谱法检测
48.取实施例2制得的胶原蛋白分子单体溶液样品，稀释到0.1mg/ml，利用jasco j-810圆二色光谱仪进行cd光谱检测：先开氮气，打开圆二色谱仪器及软件，用缓冲液调零，作为基底空白保存。再取稀释后的0.1mg/ml样本进行cd图谱检测(波长范围：250～190nm；扫描速度：50nm/min；频带宽度：1.0nm；分辨率：0.1nm)。经圆二色谱法检测胶原蛋白分子单体结构，检测结果见图3。结果显示，该样品具有完整的三股螺旋结构。
49.实施例4：溶液ph值对胶原蛋白分子聚合的影响
50.取9支各5ml胶原蛋白分子单体溶液，用磷酸盐缓冲液和抗坏血酸2％浓度溶液调节至不同ph值，用紫外分光光度计313nm波长检测不同ph值条件下胶原蛋白分子单体溶液中出现胶原纤维的程度，以吸光度值表示，实验结果如下表：
[0051][0052]
注：
±
表示极微；+表示有；-表示无
[0053]
实验结果显示，胶原蛋白分子单体溶液ph值在2.2～4.0范围之内，溶液无色透明，几乎没有吸光度值，没有出现分子单体聚集产生胶原纤维。而ph＞5.06之后，随着ph值的增加，吸光度值明显升高，溶液中可见细微丝状沉淀析出说明胶原蛋白分子单体聚集产生了胶原纤维。
[0054]
实施例5
[0055]
取实施例1提取的胶原蛋白分子单体溶液，配制50ml涂覆液，以酶标仪bca检测试剂盒方法(碧云天生物技术有限公司蛋白检测试剂盒)，美国牛胶原(advanced biomatrix)为对照品，562nm下检测蛋白浓度。取50ml容量瓶，加入注射用水实施和例1提取的胶原蛋白分子单体溶液，使胶原蛋白浓度为0.5mg/ml，抗坏血酸浓度为0.8％，室温下搅拌10分钟，调整溶液ph值为3.5，定容50ml，经0.45微米膜过滤，置于棕色瓶中，避光4℃条件下保存。
[0056]
实施例6
[0057]
取实施例2提取的胶原蛋白分子单体溶液，配制100ml涂覆液，以酶标仪bca检测试剂盒方法(碧云天生物技术有限公司蛋白检测试剂盒)，美国牛胶原(advanced biomatrix)为对照品，562nm下检测蛋白浓度。取100ml容量瓶，加入注射用水和实施例2提取的胶原蛋白分子单体溶液，使胶原蛋白浓度为1.5mg/ml，抗坏血酸浓度为2％，室温下搅拌10分钟至完全溶解，调整溶液ph值为3.0，定容100ml，经0.45微米膜过滤后置于棕色瓶中，4℃条件下避光保存。
[0058]
上面结合具体实施例对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式。属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则仍为本发明的保护范围。任
何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更，但是依据本发明的技术实质对本发明所作的任何修改、等同变化与改型，仍属于本发明的保护范围。