专利名称：一种蛇毒溶栓素的配方和制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于一种医疗药物的配方和制备工艺。
现有的抗血栓的蛇毒制剂有两类，一是取材于蝮蛇毒的蛇毒抗栓酶，另一类是取材于蕲蛇毒的去纤酶(类凝血酶)。它们虽然对治疗血栓有一定的效果，但其生产工艺简单，只经过一次离子交换柱二乙氨基葡聚糖凝胶A-50层析，分离工艺粗糙，故药用组分不纯，药效不高。加之含有神经毒、出血毒和磷酯酶A等有毒物质，其毒付作用反应较大。
本发明针对现有抗栓酶的缺点，建立了一套制备蛇毒抗血栓最为有效的新工艺及其配方。将两种蛇毒的优势有效组分，经分离、纯化后定量检测，制备时去除有毒物质，按防治目的合理配方组合，使研制出来的新制剂具有高纯、高效和低毒的特点。
本发明的制备工艺先分两步工艺，即蝮蛇毒及蕲蛇毒的制备工艺(见附图
)。
一、蝮蛇毒制备工艺蝮蛇毒经二乙氨基乙基琼脂糖凝胶CL-6B(DEAE-SepharoseCL-6B)柱层析分离(A)-经葡聚糖凝胶(Sephadex)G-100柱纯化(B-)纯精氨酸酯酶(C)。
二、蕲蛇毒制备工艺蕲蛇毒经Sephadex G-100柱分离(D)-经DEAE-Sepharose CL-6B柱分离(E)-经Sephadex G-75柱纯化(F)-高纯度类凝血酶(G)。
三、组合工艺将纯精氨酸酯酶组分(C)与高纯度类凝血酶(G)组合(H)-微孔滤膜过滤(I)-加赋形剂(J)-包装、冷冻干燥、熔封(K)。
其中蝮蛇毒层析的分离中所用的缓冲液PH为6.5-7.6，浓度为0.005-0.03mol/L;蕲蛇毒层析的分离中所用的缓冲液PH为7.6-9.0，浓度为0.01-0.05mol/L。它们在分离阶段梯度洗脱中氯化钠浓度为0.4-0.8mol/L。
本发明的配方为纤溶组分10-30u，抑聚组分300-600u，舒缓组分0.3-0.6u，类凝血酶6-10u。
现结合附图简述实施例一、蝮蛇毒制备工艺经DEAE-Sepharose CL-6B柱层析分离(A)，用PH7.0，浓度为0.01mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-Hcl)缓冲液浸泡、装柱并平衡，柱高50cm，直径2.6cm。蝮蛇毒4g，溶于上述缓冲液中上柱。而后第一步平衡洗脱，第二步加浓度为0.6mol/L的氯化钠直线梯度洗脱。洗脱液流经蛋白检测仪描绘出蛋白峰图谱，用收集器收集。继而将各蛋白峰进行精氨酸酯酶、纤溶组分、抑聚组分、舒缓组分的活力测定，分别按各活力峰收集。
而后，经Sephadex G-100柱纯化(B)，用PH7.0，浓度为0.01mol/L的Tris-Hcl缓冲液浸泡，装柱并平衡，柱高100cm，直径2.6cm。将(A)柱分离得到纤溶组分、抑聚组分、舒缓组分的收集液，分别上Sephadex G-100柱，用PH7.0，浓度为0.01mol/L Tris-Hcl缓冲液洗脱，洗脱液经酶活力和蛋白量测定后分别收集，总蛋白回收率为23%，获得纯精氨酸酯酶，其中纤溶组分68000u，抑聚组分2040000u，舒缓组分1700u。
二、蕲蛇毒制备工艺
蕲蛇毒经Sephadex G-100柱分离(D)，用PH8.0，浓度为0.02mol/L Tris-Hcl平衡缓冲液浸泡、装柱并平衡，柱高100cm，直径2.6cm。蕲蛇毒3g，溶于上述平衡缓冲液中上柱、洗脱，洗脱液流经蛋白检测仪描绘出蛋白峰图谱，用部分收集器收集。继而将分离得到的各蛋白峰进行类凝血酶活力及蛋白量的测定，收集合并活力峰。
而后进入DEAE-Sepharose CL-6B柱分离(E)。用PH8.0，浓度为0.02mol/L Tris-Hcl平衡缓冲液浸泡、装柱并平衡，柱高40cm，直径2.6cm。将上述分离得到的较粗的类凝血酶收集液上柱、洗脱，先是平衡洗脱，后是加0.6mol/L Tris-Hcl直线梯度洗脱，并测定洗脱液中类凝血酶活力及蛋白量，合并收集酶活力峰洗脱液。
第三是经Sephadex G-75柱纯化(F)。用PH8.0，浓度为0.02mol/L Tris-Hcl平衡缓冲液浸泡、装柱并平衡，柱高100cm，直径2.6cm。将上述离子交换层析再分离得到的类凝血酶收集液上柱，用平衡缓冲液洗脱，收集酶活力峰，测定其类凝血酶活力及蛋白量。总蛋白回收率为13.6%，获得类凝血酶48000u。
三、组合工艺将纯精氨酸酯酶(C)与高纯度类凝血酶(G)组合(H)。按内定配方的量，取纤溶组分10u，抑聚组分300u，舒缓组分0.3u，类凝血酶6u混合，测定精氨酸酯酶每安瓿为0.25u。再经0.2μ微孔滤膜过滤(I)，附加适量的赋形剂(J)，分装灌入2ml安瓿进行冷冻干燥、熔封(K)。
本发明工艺精细，制剂高纯、高效、低毒，临床试用对防治各种血栓疾病均有显著疗效。
权利要求
1.一种蛇毒溶栓素的配方和制备工艺，其特征在于其配方为纤溶组分 10-30u； 抑聚组分 300-600u；舒缓组分 0.3-0.6u； 类凝血酶 6-10u。其制备工艺为
2.根据权利要求1所述的一种蛇毒溶栓素的配方和制备工艺，其特征在于蝮蛇毒层析的分离中所用的缓冲液PH为6.5-7.6，浓度为0.005-0.03mol/L;蕲蛇毒层析的分离中所用的缓冲液PH为7.6-9.0，浓度为0.01-0.05mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种蛇毒溶栓素的配方和制备工艺，其特征在于蝮蛇毒与蕲蛇毒在分离阶段梯度洗脱中，氯化钠浓度为0.4-0.8mol/L。
全文摘要
一种蛇毒溶栓素的配方和制备工艺。将蝮蛇毒及蕲蛇毒的优势有效组分，经分离、纯化，制备时去除有毒物质，按防治目的的合理配方组合，新制剂具有工艺精细、高纯、高效、低毒等优点，对抗血栓有显著疗效。
文档编号A61P3/00GK1063041SQ9210055
公开日1992年7月29日 申请日期1992年1月21日 优先权日1992年1月21日
发明者舒雨雁, 韦世秀, 黄湘萍, 雷丹青, 刘绵林 申请人:广西医学院