专利名称：中国毛虾蛋白降压肽及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及从中国毛虾(Accedes chinensis)的酶解产物中分离纯化具有新的氨基酸序列的降压肽及其制备方法与应用，属于海洋生物技术领域。
背景技术：
由食物蛋白经过部分酶解所得的短肽越来越引起食物学家的重视。这些短肽具有各种活性，比如提高免疫力，提高营养吸收率，抗高血压活性。具有这些活性的蛋白已经从食物蛋白酶解物中纯化出来，这些肽在蛋白质序列内是没有活性的，只有通过酶解或食物加工从蛋白中释放出来才具有活性。
血管紧张素转化酶(ACE)是一种能够催化血管紧张素1转化成血管紧张素2的羧肽酶，能够导致血压升高，因此抑制ACE活性，可以导致血液中的血管紧张素2的浓度降低，从而导致血压降低。虽然人工合成的ACE抑制剂具有明显的降血压效果，但是副作用太大，因此现在必须找到更安全、新颖、高效的治疗高血压的药物。现在从不同的蛋白中通过不同的酶进行酶解，在其酶解物中发现了许多ACE抑制短肽，这些蛋白资源包括牛奶蛋白、大豆蛋白、鸡蛋蛋白、鸡肉蛋白、海洋鱼类蛋白、藻类等，到现在为止已有两百多中具有ACE抑制活性的酶解活性肽被报道，但是现在报道的ACE抑制短肽主要来源于陆地蛋白的酶解物，来源于海洋蛋白酶解物的报道较少，因此，今后，海洋生物蛋白酶解物将成为今后筛选新的ACE抑制肽的重要来源。
毛虾是我国渤海湾水域的一种低附加值的海洋蛋白资源，每年的捕捞量达到30万吨，到目前为止，没有有效的开发利用，只是晒干制作虾皮或制作虾酱，产品的附加值较低。由于毛虾较高的蛋白含量和较低的脂肪含量，因此，毛虾是用于酶解的很好的蛋白资源，而且就毛虾的氨基酸组成来说，富含具有与降血压肽结构有关的支链氨基酸和芳香族氨基酸，是酶解分离降高血压肽的好原料。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种中国毛虾蛋白降压肽及其制备方法与应用。
本发明从中国毛虾的蛋白酶解产物中分离纯化出新的具有六个氨基酸的降压肽，其序列分别为Phe-Cys-Val-Leu-Arg-Pro，Ile-Phe-Val-Pro-Ala-Phe或Lys-Pro-Pro-Glu-Thr-Val。具有较高的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性。
考虑到上述三种六肽有可能在消化道内被进一步酶解，所以根据体内酶的作用位点，对上述三种六肽可能的酶解产物短肽进行了化学合成，经ACE抑制试验，筛选得到Cys-Val-Leu-Arg-Pro，Val-Leu-Arg-Pro，Phe-Cys-Val-Leu，Cys-Val-Leu，Arg-Pro，Val-Leu，Phe-Cys，Ile-Phe-Val-Pro-Ala，Phe-Val-Pro-Ala-Phe，Val-Pro-Ala-Phe，Val-Pro-Ala和Ile-Phe等12种序列的短肽具有很好的ACE抑制活性。
纵上，本发明的中国毛虾蛋白降压肽是具有如下序列的短肽之一或组合
Phe-Cys-Val-Leu-Arg-Pro肽1，Ile-Phe-Val-Pro-Ala-Phe肽2，Lys-Pro-Pro-Glu-Thr-Val肽3，Cys-Val-Leu-Arg-Pro肽4，Val-Leu-Arg-Pro肽5，Phe-Cys-Val-Leu肽6，Cys-Val-Leu肽7，Arg-Pro肽8，Val-Leu肽9，Phe-Cys肽10，Ile-Phe-Val-Pro-Ala肽11，Phe-Val-Pro-Ala-Phe肽12，Val-Pro-Ala-Phe肽13，Val-Pro-Ala肽14或Ile-Phe肽15。
本发明中国毛虾蛋白降压肽的制备方法，包括从中国毛虾的蛋白酶解产物中分离纯化具有新的氨基酸序列的降压肽(ACE抑制肽)和进一步利用酶解液分离纯化ACE抑制肽。具体包括酶解毛虾制备酶解液、从酶解液中分离纯化降压肽、序列测定和降压肽的固相合成。
上述酶解毛虾制备酶解液可用现有技术，本发明提供的方法是如下具体步骤中的(1)和(2)。
下面详细说明本发明的各操作步骤，但不限于此(1)蛋白酶制剂的制备培养基饼粉2～3份、玉米粉2～3份、麸皮1～1.5份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份、水100份，均为重量份，下同。灭菌，冷却，接种枯草芽孢杆菌SM98011(Bacillus.Subtilis SM98011)的茄子瓶菌种的菌悬液5～10份，通风搅拌，培养15～18小时，作为液体种子待用。
液体深层发酵制备蛋白酶制剂培养基豆饼粉3～3.5份、玉米粉3.5～5.0份、麸皮2.0～2.5份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份、水100份，均为重量份，下同。灭菌，接种上述步骤的液体种子，接种量为培养基重量的5～7％，通风搅拌，控温，发酵37～40小时，得蛋白酶制剂。酶活为4000U/ml。
(2)酶解毛虾制备酶解液基本原料中国毛虾，按鲜重称取毛虾45～50份原料，打浆，然后加入液体重量45～50份的上述蛋白酶制剂，调pH值到6.8～7.3，温度45～50℃，搅拌酶解5小时。酶解完毕，离心取上清。
(3)从酶解液中分离纯化降压肽(ACE抑制肽)用5000Da的超滤膜将酶解液超滤，将超滤小于5000Da的超滤液过PharmadexLH20柱(2.5×100cm，medium Pharmadex)，用蛋白核酸检测仪，在214nm处进行检测，根据从色谱柱分离得到的色谱峰分别收集，收集的洗脱液冻干称重后，测定ACE抑制活性，将抑制活性高的组分多次收集，然后进一步用高压液相色谱反相C18分离。PDA检测器检测波长为220nm，然后根据所得的肽的谱图将肽峰分别收集浓缩，测定ACE抑制活性，得到具有高的ACE抑制活力的肽。
(4)序列测定将第三步分离得到的具有高的ACE抑制活力的纯肽，用氨基酸自动测序仪测定氨基酸组成，再通过液质连用仪分析3条肽的分子量和肽段的分布，分析出3条肽的氨基酸序列。序列分别为Phe-Cys-Val-Leu-Arg-Pro，Ile-Phe-Val-Pro-Ala-Phe或Lys-Pro-Pro-Glu-Thr-Val。
(5)降压肽的固相合成根据人体内蛋白酶(胰蛋白酶，糜蛋白酶和胃蛋白酶)的酶切位点和上述3个分离纯化的肽，设计12条肽(原肽序列的一部分)Cys-Val-Leu-Arg-Pro，Val-Leu-Arg-Pro，Phe-Cys-Val-Leu，Cys-Val-Leu，Arg-Pro，Val-Leu，Phe-Cys，Ile-Phe-Val-Pro-Ala，Phe-Val-Pro-Ala-Phe，Val-Pro-Ala-Phe，Val-Pro-Ala和Ile-Phe。按现有技术固相合成，然后测定每一条肽的ACE抑制活性。结果证明固相合成的12条肽具有较高的ACE抑制活性。
上述步骤(1)的培养基中加豆油0.3～0.35重量份作消泡剂。
上述步骤(3)中测定肽的ACE抑制活性方法可用现有公知技术，如分光光度法或高压液相色谱法，本发明提供如下ACE抑制活性测定方法—毛细管电泳法10μl底物Hip-His-Leu(1mM)，0.8mU的血管紧张素转化酶(ACE)分别和若干10μl的0.03～40mg/ml中国毛虾酶解液混合为若干组样品。所述试剂都用100mM的硼酸缓冲液(包含0.3M NaCl，pH 8.3)配制。反应液在37℃反应30min，然后用0.1％三氟乙酸TFA(10μl)中止反应。血管紧张素转化酶抑制反应产物直接在毛细管电泳仪上进行检测。毛细管电泳仪为Beckman Coulter P/ACE MDQ(Fullerton，CA)装置，配备有PDA(photodiode array)检测器，数据采集、分析、系统控制用P/ACE MDQ软件，该软件来自Beckman Coulter(Fullerton，CA)。中止反应后的混合物样品直接用毛细管电泳进行检测，上样压力为1psi，时间为5秒，电泳电压20kV，紫外吸收为228nm，电泳时间5分钟，电泳缓冲液为20mM的硼酸缓冲液(pH9.18)。每测定一个样品之后用缓冲液冲洗毛细管1分钟。底物和产物马尿酸分别在2.5分钟和3.5分钟出峰，根据上述软件计算马尿酸的峰面积。
ACE抑制活性的计算(IC50值的计算)马尿酸配制成不同浓度0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，2，4，6mM，通过毛细管电泳测定其峰面积与马尿酸浓度的线性关系。
峰面积＝K×Chip+NACE活力(umol/min)＝V×Chip÷tV反应体积，t反应时间，K根据峰面积和马尿酸浓度求出的曲线常数，Chip马尿酸浓度，N马尿酸浓度曲线与Y轴的交点。
通过血管紧张素转化酶作用，不含任何抑制肽，从底物Hip-His-Leu释放出来的马尿酸HA的量被定义为100％ACE活力。抑制50％的ACE活力的海洋蛋白酶解产物的量被定义为酶解产物的抑制活力。IC50值的计算采用线性对数法，以Log(ACE活力/(1-ACE活力))对Log(水解产物浓度mg/ml)作图，所得直线与X轴的交点对应的值为M，10M为酶解产物抑制ACE活力的IC50值。
上述步骤(3)所用高压液相色谱柱为反相C18柱。
上述步骤(4)氨基酸分析是将肽用6N的HCl在115℃全水解22小时，通过氨基酸自动测序仪进行测定。
本发明的中国毛虾蛋白降压肽产品为白色粉末，易溶于水，可以是肽1-肽15中的一种或其组合。
本发明的中国毛虾蛋白降压肽用于制备降压药物。
本发明的优良效果在于将陆地微生物酶工程技术应用于毛虾的深层次开发利用。具体体现在1、用海洋毛虾作为酶解原料2、从酶解液通过色谱方法分离纯化具有降血压功能的肽3、用ACE反应来检测各步产物的降压活性4、并对得到的具有新序列的肽的部分，进行序列合成，得到的小肽具有更高的ACE抑制活力。
图1是实施例1步骤(3)经过3000Da的膜超滤的毛虾酶解液经过PharmadexLH20柱分离的色谱图。
图2、图3和图4分别是II、III、IV号样品在高压液相的反相C18柱上分离得到的色谱峰。
图5、图6和图7分别是II、III、IV号样品的IC50值的线性对数图，证明II、III、IV号样品是具有高的ACE抑制活力的纯肽，它们分别是分离纯化的3条肽(肽1、肽2和肽3)。
具体实施方式
实施例1.
(1)蛋白酶制剂的制备种子培养基以重量份牛肉膏0.3份、蛋白胨1份、琼脂2份、NaCl 0.5份为培养基，水98份，pH为7.1，灭菌，划线接枯草芽孢杆菌SM98011(Bacillus.SubtilisSM98011)菌种，30℃培养，培养20小时。
发酵培养基豆饼粉3份、玉米粉2份、麸皮1份、Na2HPO4 0.4份、KH2PO40.04份、水100份，加豆油0.3份作消泡剂。120℃灭菌30分钟，冷却后，接上种子的菌悬液10份，150升发酵罐中，装样量70升，于30℃下，通风量(V风/V液·时间)10.6，搅拌330转/分钟，培养36小时。此时pH7.0。
(2)酶解短肽的制备首先称取50份(鲜重)的中国毛虾，打浆。然后加入50份(液体重量)的蛋白酶制剂，调pH值到7.2，50℃，搅拌酶解5小时，酶解完毕，5000rpm离心，上清为酶解短肽液。
(3)降压肽的分离纯化将上清液用5000Da的膜超滤，然后将超滤液上Pharmadex LH20柱，分离得到9个峰，分别收集，测定ACE抑制活力，得到第II，III，IV号峰具有较高的ACE抑制活力(见图1)，反复收集，上高压液相色谱，将II，III，IV号样品进一步分离，得到19个色谱峰(见图2)，其中有3个峰具有较高的ACE抑制活力，这3个峰对应的肽为肽1，肽2和肽3。
(4)降压肽的序列测定将步骤(3)得到的具有较高ACE抑制活力3个纯肽用6N的HCl全水解，用氨基酸自动测序仪测定氨基酸组成，然后用液质连用仪分析3条肽的分子量和肽段的分布，分析出3条肽的氨基酸序列。Phe-Cys-Val-Leu-Arg-Pro，Ile-Phe-Val-Pro-Ala-Phe，Lys-Pro-Pro-Glu-Thr-Val。毛细管电泳法测定IC50值分别为12.3μM，19.8μM和24.1μM。如图5，图6和图7所示。根据现有技术具有酶解ACE抑制肽的IC50值为0.2μM-600μM，IC50值越小，说明对ACE的抑制作用越强，降血压效果越好。由此证明，从中国毛虾酶解物中分离纯化的肽1，肽2和肽3具有较高的ACE抑制活性。
(5)肽的固相合成根据体内蛋白酶(胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶)的酶切位点，设计了12条肽，分别是分离纯化的3个原肽序列的一部分Cys-Val-Leu-Arg-Pro(肽4)，Val-Leu-Arg-Pro(肽5)，Phe-Cys-Val-Leu(肽6)，Cys-Val-Leu(肽7)，Arg-Pro(肽8)，Val-Leu(肽9)，Phe-Cys(肽10)，Ile-Phe-Val-Pro-Ala(肽11)，Phe-Val-Pro-Ala-Phe(肽12)，Val-Pro-Ala-Phe(肽13)，Val-Pro-Ala(肽14)和Ile-Phe(肽15)。按现有技术固相合成，对合成的肽用毛细管电泳法测定了它们的ACE抑制活性，IC50值依次为141.3，22.3，19.8，17.6，28.1，34.5，478.6，23.9，24.5，575.4，34.4，26.7μM。说明合成的肽对ACE的抑制作用强。
本实施例所得的短肽产品干燥处理后为白色粉末，易溶于水。
实施例2如实施例1所述，所不同的是原料毛虾的用量不一样，45份(鲜重)的毛虾，打浆。然后加入50份(液体重量)的蛋白酶制剂。
本发明的短肽具有较高的ACE抑制活性，即使进入消化道经酶解后，其酶解产物仍有较高的降压活性。本发明的特点在于集酶工程技术和肽纯化鉴定技术于一体，对毛虾这一量大而至今未被有效利用的海洋蛋白资源进行了深入的开发利用，发现了有新的氨基酸序列组成的ACE抑制肽并保证了在体内的功能性，为以后降压药物的开发奠定了基础。
序列表<110>山东大学<120>中国毛虾蛋白降压肽及其制备方法与应用<160>11<170>Patent In3.1<210>1<211>6<212>PRT<213>中国毛虾(Accedes chinensis)<400>1Phe Cys Val Leu Arg Pro<210>2<211>6<212>PRT<400>2Ile Phe Val Pro Ala Phe<210>3<211>6<212>PRT<400>3Lys Pro Pro Glu Thr Val<210>4<211>5<212>PRT<400>4Cys Val Leu Arg Pro<210>5<211>4<212>PRT<400>5Val Leu Arg Pro
<210>6<211>4<212>PRT<400>6Phe Cys Val Leu<210>7<211>3<212>PRT<400>7Cys Val Leu<210>8<211>2<212>PRT<400>8Arg Pro<210>9<211>2<212>PRT<400>9Val Leu<210>10<211>2<212>PRT<400>10Phe Cys<210>11<211>5<212>PRT<400>11Ile Phe Val Pro Ala
<210>12<211>5<212>PRT<400>12Phe Val Pro Ala Phe<210>13<211>4<212>PRT<400>13Val Pro Ala Phe<210>14<211>3<212>PRT<400>14Val Pro Ala<210>15<211>2<212>PRT<400>15Ile Phe
权利要求
1.中国毛虾蛋白降压肽，其特征在于，是具有如下序列的肽2Ile-Phe-Val-Pro-Ala-Phe肽2，或在肽2中氨基酸序列经缺失一个或几个氨基酸衍生的肽11-肽15，序列如下Ile-Phe-Val-Pro-Ala肽11，Phe-Val-Pro-Ala-Phe肽12，Val-Pro-Ala-Phe肽13，Val-Pro-Ala肽14，Ile-Phe肽15。
2.权利要求1所述的中国毛虾蛋白降压肽的制备方法，包括酶解毛虾制备酶解液、从酶解液中分离纯化降压肽、氨基酸序列测定和肽的固相合成，其特征在于从中国毛虾的蛋白酶解产物中分离纯化出新的具有六个氨基酸的降压肽，其序列为Ile-Phe-Val-Pro-Ala-Phe；根据体内酶的作用位点，对上述六肽可能的酶解产物短肽进行了化学固相合成，经血管紧张素转化酶抑制试验，筛选得到Ile-Phe-Val-Pro-Ala，Phe-Val-Pro-Ala-Phe，Val-Pro-Ala-Phe，Val-Pro-Ala和Ile-Phe共4种序列的短肽具有很好的血管紧张素转化酶抑制活性。
3.如权利要求2所述的中国毛虾蛋白降压肽的制备方法，其特征在于所述酶解毛虾制备酶解液，具体步骤如下(1)蛋白酶制剂的制备培养基饼粉2～3份、玉米粉2～3份、麸皮1～1.5份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份和水100份，灭菌，冷却，接种枯草芽孢杆菌SM98011的茄子瓶菌种的菌悬液5～10份，通风搅拌，培养15～18小时，作为液体种子待用，均为重量份；然后液体深层发酵制备蛋白酶制剂，具体如下培养基豆饼粉3～3.5份、玉米粉3.5～5.0份、麸皮2.0～2.5份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份和水100份，均为重量份，灭菌，接种上述的液体种子，接种量为培养基重量的5～7％，通风搅拌，控温，发酵37～40小时，得蛋白酶制剂；(2)酶解毛虾制备酶解液基本原料中国毛虾，按鲜重称取毛虾45～50份原料，打浆，然后加入液体重量45～50份的上述蛋白酶制剂，调pH值到6.8～7.3，温度45～50℃，搅拌酶解5小时，酶解完毕，离心取上清。
4.如权利要求2所述的中国毛虾蛋白降压肽的制备方法，其特征在于所述从酶解液中分离纯化降压肽具体如下用5000Da的超滤膜将酶解液超滤，将超滤小于5000Da的超滤液过Pharmadex LH20柱，2.5×100cm，用蛋白核酸检测仪，在214nm处进行检测，根据从色谱柱分离得到的色谱峰分别收集，收集的洗脱液冻干称重后，测定血管紧张素转化酶抑制活性，将抑制活性高的组分多次收集，然后进一步用高压液相色谱柱分离，PDA检测器检测波长为220nm，然后根据所得的肽的谱图将肽峰分别收集浓缩，测定血管紧张素转化酶抑制活性。
5.如权利要求4所述的中国毛虾蛋白降压肽的制备方法，其特征在于所述上高压液相色谱柱为反相C18柱。
6.如权利要求2所述的中国毛虾蛋白降压肽的制备方法，其特征在于所述氨基酸序列测定是将肽用6N的HCl在115℃全水解22小时，通过氨基酸自动测序仪进行测定。
7.权利要求1所述的中国毛虾蛋白降压肽用于制备降压药物。
全文摘要
中国毛虾蛋白降压肽及其制备方法与应用，属于海洋生物技术领域。本发明从中国毛虾的蛋白酶解产物中分离纯化出新的具有六个氨基酸的降压肽，具有较高的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性。此外，根据体内酶的作用位点，对上述三种六肽可能的酶解产物短肽进行了化学合成，经ACE抑制试验，筛选得到12种序列的短肽具有很好的ACE抑制活性。本发明降压肽用于制备降压药物。本发明将微生物酶工程技术应用于毛虾的深层次开发利用，得到的具有新序列短肽，具有高的ACE抑制活力。
文档编号C07K5/08GK1908008SQ20061010829
公开日2007年2月7日 申请日期2004年12月29日 优先权日2004年12月29日
发明者张玉忠, 何海伦, 陈秀兰, 吴昊, 周百成 申请人:山东大学