专利名称：从红三叶中提取异黄酮的方法
技术领域：
本发明涉及一种从红三叶中提取异黄酮的方法。
背景技术：
红三叶(7h/o/〖wwpra^7^L.)为豆科三叶草属的多年生草本植物，又名红 车轴草、红花苜蓿、红菽草、金雀菜、三叶草。该植物除了可作优良饲料和牧草 之外，国外民间还将其花序之煎剂用于祛痰、利尿和消炎，治疗感冒和肺结核， 外敷治疗脓肿、烧伤和眼疾等，并将其花、种子、根或全株制成浸膏剂、糊剂、 煎剂或泡茶饮用，治疗胃溃疡、胃癌、乳腺癌及肠癌等。我国民间则以红三叶的 花序及带花枝叶入药，用于镇痉、止咳、止喘，另外，还可将其全草制成软膏， 治疗局部溃疡。
近年来国际上采用植物雌激素样物质替代激素疗法，特别是采用天然来源的 异黄酮化合物治疗妇女更年期综合征、骨质疏松症、老年性痴呆等疾病取得了较 大成效。国内外已经对大豆Gfyc/"ewax ，野葛Pweran》/oZwto ，空心苋 兹er"a"/zera / /n./oxero/t/es,黄芪 A/ragfl/wj附e^m"acera， 红三叶 7hyb/Z謂 pra/eme中异黄酮含量及其生理作用进行了较深入的研究，研究发现，红三叶 是少数几种含有4种雌激素样异黄酮(染料木素、大豆苷元、鹰嘴豆芽素A、 B) 的植物之一。而大豆只包含两种主要的异黄酮染料木素和大豆苷元，不含鹰嘴豆 芽素A、 B。红三叶具有比大多数异黄酮6倍以上的雌激素样的活性且具有双向 调节的作用。目前，红三叶异黄酮的提取物是国际上公认的治疗妇女更年期综合 征疗效确切的植物药，其销量在美国多年来一直名列植物药的前10位，我国每 年均有大量出口。因此，充分利用红三叶资源，进行红三叶异黄酮的开发，具有 重要的社会效益和经济效益。
关于红三叶中异黄酮的提取制备工艺研究，国内近几年已有一些专利申请， 主要采用的是先选择适当的有机溶剂进行提取，再采用有机溶剂萃取法或大孔吸 附树脂柱层析法或者是二者相结合的方法进行精制纯化。但工艺中普遍存在的不 足之处是提取的大多是异黄酮苷，而据国外有关研究报道，发挥药效作用的为
异黄酮苷元，即使有些申请专利中提取的是异黄酮苷元，也是采取先用有机溶剂 提取苷，再水解转化成苷元的方法，工序复杂。有机溶剂萃取中使用了大量有机 溶剂，易燃、易爆、成本高，制得的红三叶提取物中残留有机溶剂对人体健康无 益。大孔吸附树脂柱层析前，样品溶液未经过任何处理，造成树脂污染严重，使 用周期短。
发明内容
本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种较简便、高效率的从红三叶中 提取获得高纯度异黄酮的方法，从而使之用作保健食品和医药品的原料。
本发明通过一歩水解法、水沉碱溶法、膜分离、柱层析等歩骤，可获得高纯 度的异黄酮产品。
一种从红三叶中提取异黄酮的方法，其特征在于该方法包括以下歩骤
A、 取红三叶全草，粉碎，用含盐酸的乙醇溶液加热回流提取，合并提取液， 过滤，滤液备用；
B、 将上述滤液回收乙醇，浓縮，用氢氧化钠溶液调pH至中性，离心，沉 淀用氢氧化钠溶液溶解并调pH至9-11，离心，上清液备用；
C、 将上述上清液在巻式膜分离设备中依次进行微滤、超滤及纳滤；
D、 将上述经过纳滤的原液过大孔吸附树脂，先用水洗至接近无色，弃去水
洗液，继以含水乙醇洗脱，收集该洗脱液。
E、 将上述洗脱液回收乙醇后，浓縮，干燥，得红三叶异黄酮产品。 在本发明的A歩骤中，含盐酸的乙醇溶液为含0.1 1.0mol/L盐酸的
65wt。/。 85wt。/。食用乙醇。
在本发明的C歩骤中，沉淀物用氢氧化钠溶液溶解并调pH 9 11，离心后 上清液保温至25 40°C ，在操作压力0.10 0.15 MPa下进行膜分离。
在本发明的C步骤中，膜分离过程，依次采用了微滤、超滤、纳滤技术。 所用的膜材为聚偏氟乙烯膜、聚醚砜膜或聚砜膜；微滤膜孔径为0.2 0.45 pm， 超滤膜截留分子量为50000 1000 KD，纳滤膜截留分子量为300 100 KD。
在本发明的D步骤中，经过纳滤后的样品原液，无需浓缩，直接过大孔吸 附树脂，先用水洗至接近无色，弃去水洗液，再用20 40wt。/。乙醇洗脱，弃去 该洗脱液，继以60 80wt。/。乙醇洗脱，收集该洗脱液。通过A歩骤，可获得异黄酮含量为5%的粗品；通过C步骤，经膜分离后可 获得含量为10%的异黄酮，最终可获得含量高于60%的异黄酮。
本发明以含盐酸的乙醇溶液为提取溶剂，采用一步水解法，使红三叶中异黄 酮苷全部转化为异黄酮苷元，简化了工艺，提高了产品的药用价值'另外，由于 红三叶原植物中既含有异黄酮苷又含有异黄酮苷元，而二者的极性、溶解性等方 面有差异，如果二者同时存在，给后续的精制纯化工艺带来困难，必然造成苷或 苷元的损失，因此，本发明首先采用一步水解法，经一次提取，将红三叶中异黄 酮苷全部转化为异黄酮苷元，这样在后续的精制纯化过程中只考虑苷元，并利用 苷元不溶于水、易溶于稀碱液的性质，使苷元得以初步纯化。
本发明采用了国际上公认的20世纪末至21世纪中期最有发展前途的前沿技 术之一膜分离技术进行分离纯化， 一方面提高产品中异黄酮苷元的纯度， 一方面 使大孔吸附树脂柱层析前的样品溶液得以净化，减轻了树脂的损害，延长了树脂 的使用周期，另外，纳滤技术的应用使树脂柱层析前的样品溶液无需浓缩，可直 接上样，简化了工序。
本发明具有以下优点 (1)用含盐酸的食用乙醇为提取溶剂，将红三叶中的异黄酮苷全部转化成 异黄酮苷元，该法既提高了产品的药用价值，又简化了工艺。(2)利用异黄酮苷 元不溶于水、易溶于稀碱液的特性，使其得到初步纯化。(3)依次采用微滤、超 滤、纳滤等技术，对稀碱水溶解的异黄酮苷元进行膜分离，提高其纯度，并使大 孔吸附树脂柱层析前的样品溶液得以净化，减轻对树脂的损害，延长树脂的使用 周期，另外，纳滤技术的应用使树脂柱层析前的样品溶液无需浓縮，可直接上样， 简化了工序。(4)经过纳滤后的样品原液，过大孔吸附树脂。该工艺简单、可适 合工业化大生产，且制备过程中，仅采用食用级乙醇为溶剂，污染少，成本低。 本发明在红三叶异黄酮的整个制备过程，仅采用水和食用级乙醇为溶剂，减 少污染，所得终产品中无有机溶剂残留。
图1为采用本发明的制备方法所得到的红三叶异黄酮提取物的高效液相色 谱图。
图2为采用本发明的制备方法所得到的红三叶异黄酮提取物的紫外光谱 图。
具体实施方式
实施例1
取红三叶全草，粉碎，用含lmol/L盐酸的85%乙醇溶液加热回流提取2次， 每次1.5小时，合并提取液，过滤，滤液备用。
将上述滤液回收乙醇，浓縮，用氢氧化钠溶液调pH至中性，离心，沉淀用 氢氧化钠溶液溶解并调pH至10，离心，上清液备用。
将上述上清液保温至4(TC，在巻式膜分离设备中依次进行微滤、超滤及纳 滤，操作压力0.15MPa。其中微滤膜材为聚偏氟乙烯膜，孔径为0.45)am，超滤 膜为聚砜膜，截留分子量为5000 KD，纳滤膜为聚醚砜膜，截留分子量为200 KD。
将上述经过纳滤的原液过D1C)1型大孔吸附树脂，先用水洗至接近无色，弃 去水洗液，再用30%乙醇洗脱，弃去该洗脱液，继以70%乙醇洗脱，收集该洗 脱液。
将上述洗脱液回收乙醇后，浓縮，干燥，得红三叶异黄酮产品。 实施例2
取红三叶全草，粉碎，用含0.5mol/L盐酸的65%乙醇溶液加热回流提取2 次，每次2小时，合并提取液，过滤，滤液备用。
将上述滤液回收乙醇，浓缩，用氢氧化钠溶液调pH至中性，离心，沉淀用 氢氧化钠溶液溶解并调pH至9，离心，上清液备用。
将上述上清液保温至3(TC，在巻式膜分离设备中依次进行微滤、超滤及纳 滤，操作压力0.10 MPa。其中微滤膜材为聚偏氟乙烯膜，孔径为0.2 pm，超滤 膜为聚醚砜膜，截留分子量为IOOOKD，纳滤膜为聚砜膜，截留分子量为100 KD。
将上述经过纳滤的原液过AB-8型大孔吸附树脂，先用水洗至接近无色，弃 去水洗液，再用20%乙醇洗脱，弃去该洗脱液，继以60%乙醇洗脱，收集该洗 脱液。
将上述洗脱液回收乙醇后，浓缩，干燥，得红三叶异黄酮产品。 实施例3
取红三叶全草，粉碎，用含0.1mol/L盐酸的95%乙醇溶液加热回流提取2 次，每次1小时，合并提取液，过滤，滤液备用。
将上述滤液回收乙醇，浓缩，用氢氧化钠溶液调pH至中性，离心，沉淀用 氢氧化钠溶液溶解并调pH至11，离心，上清液备用。
将上述上清液保温至25°C，在巻式膜分离设备中依次进行微滤、超滤及纳 滤，操作压力0.12 MPa。其中微滤膜材为聚偏氟乙烯膜，孔径为0.2 pm，超滤 膜为聚醚砜，截留分子量为50000 KD，纳滤膜为聚砜膜，截留分子量为300 KD。
将上述经过纳滤的原液过AB-8型大孔吸附树脂，先用水洗至接近无色，弃 去水洗液，再用40%乙醇洗脱，弃去该洗脱液，继以80%乙醇洗脱，收集该洗 脱液。
权利要求
1. 一种从红三叶中提取异黄酮的方法，其特征在于该方法包括以下步骤A、取红三叶全草，粉碎，用含盐酸的乙醇溶液加热回流提取，合并提取液，过滤，滤液备用；B、将滤液回收乙醇，浓缩，用氢氧化钠溶液调pH至中性，离心，沉淀用氢氧化钠溶液溶解并调pH至9-11，离心，上清液备用；C、将上述上清液在卷式膜分离设备中依次进行微滤、超滤及纳滤；D、将上述经过纳滤的原液过大孔吸附树脂，先用水洗至接近无色，弃去水洗液，继以含水乙醇洗脱，收集该洗脱液。E、将上述洗脱液回收乙醇后，浓缩，干燥，得红三叶异黄酮产品。
2、 如权利要求l所述的方法，其特征在于在A歩骤中，含盐酸的乙醇溶液为含0.1 1.0mol/L盐酸的65wt％ 85wt％食用乙醇。
3、 如权利要求l所述的方法，其特征在于在C歩骤中，沉淀物用氢氧化钠溶液溶解并调pH 9 11，离心后上清液保温至25 40℃，在操作压力0.10 0.15MPa下进行膜分离。
4、 如权利要求l所述的方法，其特征在于在C步骤中，膜材料为聚偏氟乙烯膜、聚醚砜膜或聚砜膜；微滤膜孔径为0.2 0.45 μm，超滤膜截留分子量为 50000 1000KD,纳滤膜截留分子量为300 100KD。
5、 如权利要求l所述的方法，其特征在于在D歩骤中，经过纳滤后的样品原液，无需浓縮，直接过大孔吸附树脂，先用水洗至接近无色，弃去水洗液，再用20 40wt％乙醇洗脱，弃去该洗脱液，继以60 80wt％乙醇洗脱，收集该洗脱液。
全文摘要
本发明涉及一种从红三叶中提取异黄酮的方法。本发明通过一步水解法、水沉碱溶法、膜分离、柱层析等步骤，可获得高纯度的异黄酮产品。本发明采用了膜分离技术进行分离纯化，一方面提高产品中异黄酮苷元的纯度，一方面使大孔吸附树脂柱层析前的样品溶液得以净化，减轻了树脂的损害，延长了树脂的使用周期，另外，纳滤技术的应用使树脂柱层析前的样品溶液无需浓缩，可直接上样，简化了工序。该工艺简单、可适合工业化大生产，且制备过程中，仅采用食用级乙醇为溶剂，污染少，成本低。
文档编号C07D311/36GK101205224SQ20061010532
公开日2008年6月25日 申请日期2006年12月22日 优先权日2006年12月22日
发明者勇 刘, 师彦平, 娟 陈 申请人:中国科学院兰州化学物理研究所