专利名称：发射抑制传感器的制作方法
发明的领域本发明一般来说涉及用来测量感兴趣的分析物在介质中浓度的传感器。更确切地说，本发明是一种用来测量血内气体(例如氧气、离子化氢、离子化钾和二氧化碳)浓度的，基于动态发射(例如荧光)抑制/相位调制的传感器。
动态相位调制、基于荧光的传感器一般是公知的。这类仪器被，例如，开发或提出以便用在医院中监测患者血液中诸如氧气、离子化氢和二氧化碳之类气体的浓度。感兴趣的物质(例如氧气)称为分析物。
称为萤光团的荧光物质和光致发光物质的一种已知性质是这样的，即它们响应于来自一个光源的能量的施加，吸收能量并被从其基态能级驱动到受激态能级。荧光团在其受激态是不稳定的，并在它们恢复到其基态时发出荧光(辐射衰变)或发出热能(非辐射衰变)。荧光寿命τ代表荧光团在恢复其基态之前保持于其受激态时间的平均值。荧光强度I代表荧光团在它恢复到基态时所发生的发射强度。
当一个敏感元件中的荧光团在存在着另一种称为抑制剂Q的扩散物质的情况下被光激发时，受激态与抑制剂之间的相互碰撞作用引发一种非辐射衰变的新机理，造成荧光强度和受激态寿命二者的降低。此过程称为动态荧光抑制。此外，该强度和寿命在没有抑制剂的情况下从各自的强度Io和寿命τo所降低的值直接关联着在发荧光的时候荧光团对其暴露的敏感元件中所存在的抑制剂的数量[Q]。在有和没有抑制剂时的荧光强度和寿命之间的关系由Stern-Volmer方程式来描述Io/I＝τo/τ＝1＋kqτo[Q]式中Io是没有抑制剂时的荧光强度；I是有抑制剂时的荧光强度；τo是没有抑制剂时的受激态寿命；τ是有抑制剂时的受激态寿命；kq是敏感元件中的双分子抑制率常数；以及[Q]是敏感元件中的抑制剂浓度。
强度或寿命的测量可以用来测定在敏感元件中的抑制剂浓度，例如血氧测定所用的传感器中的氧气。敏感元件中的氧气浓度[O2]可以用一个溶解度常数a来与血流中的氧气分压P02相关。因而，Stern—Volmer方程的一般形式化为Io/I＝τo/τ＝1＋akqτoPO2＝1＋KSVPO2式中KSV＝akqτo；a＝[O2]/PO2；是敏感元件中的氧气浓度；以及Po2是被测介质中氧气的分压力。
氧气对于敏感元件来说往往既是分析物又是荧光抑制剂，但情况并非并且无须总是这样。荧光抑制剂和感兴趣的分析物可能是不同的物质，但感兴趣的分析物通过一种已知的关系与抑制剂浓度关联。例如，Morero-Bondi等人的文章《用于纤维光学葡萄糖生物传感器的氧气光电管(Optrode)》，分析化学，Vol.62，No.21(1990年11月1日)介绍一种基于与葡萄糖有关的耗氧量的葡萄糖传感器，这些氧由葡萄糖氧化酶催化。该葡萄糖氧化酶固化在氧气敏感元件表面上。随着外部介质中萄葡糖浓度的提高，更多的氧气在敏感元件内被消耗掉，造成依靠氧气的荧光动态抑制的变化。因而，作为由该仪器实际测得的抑制剂浓度的函数，来计算分析物浓度。
对于本专利文件来说，“抑制剂”一词用来指称实际的荧光抑制物质，无论该抑制剂是感兴趣的分析物，还是通过已知关系与感兴趣的分析物相关联的另一种物质。应该指出，可以根据测得的抑制剂浓度和分析物与抑制剂之间的已知关系，来测定感兴趣的分析物浓度。
在光学传感应用中测定荧光寿命的一个公认的优点在于，它对染料浓度、光耦合效率及灯的差异不敏感。
相位调制荧光光谱分析是测定荧光寿命τ的一种已知方法。在相位调制方法的过程中，用光束或其他激励信号，最好是以角频ω＝2πf，其中f是以周每秒为单位的频率，的正弦振幅调制信号来激励含有分析物的介质。来自荧光团的荧光发射是一种对应激励信号的受迫响应，因而是采用与激励信号相同的角频率ω来进行振幅调制的。然而，由于处于受激态的荧光团的有限寿命，该发射相对于激励信号相位移一个角θ，此外，该发射的振幅或强度相对于激励信号低调(解调)一个值m。荧光团的该寿命可以用已知的方式根据相位移(tanθ＝ωτ)和解调因数(m＝(1＋ω2τ2)-1/2)的测量来计算。
已知的相位调制的基于荧光的检测仪器，如在Dukes等人的美国专利4,716,363中和Barnes等人的加拿大专利申请2,000,303中所述的那些仪器，利用上述相位调制技术(并像这里所述那样“单变地”工作)来测量诸如血液之类的介质中例如氧气分压之类的分析物浓度。这些仪器包括一个光纤敏感元件，该敏感元件在近端连接于光学激励系统和光学检测器。
该光纤的远端或尖端包括一个聚合母体，该聚合母体对于抑制剂是可渗透的，并且包含一种或多种染料形式的可发荧光的指示剂组分。对于体内传感器，该敏感元件配置成可插入患者血管的探针或导管的形式以便联机监测氧气浓度。
在相位调制荧光谱分析中，调制频率一般这样选择，即在感兴趣的分析物浓度范围内ωτ≈1。这相当于45°左右的相位角，在这样的相位角下寿命的计算对于测得的相位移和测得的解调比中的小误差是最不敏感的。Holst等人的文章《用于医学用途的氧气—通量—光电管(Optode)》，SPIE(摄影仪器工程师学会)—国际光学工程学会会刊，V.1885(荧光检测技术进展会议录，1993)，第216—227页，和Bacon等人的美国专利5,03O,420介绍了氧气传感器，其中以固定的调制频率测量作为氧气浓度函数的相位移。该相位信息用来测量作为氧气浓度函数的荧光寿命。Holst等人的文章介绍了一种传感器，对该传感器来说在没有抑制剂时荧光团的受激态寿命为205纳秒，由此他们确定最佳调制频率fopt＝777kHz(ωτ≈1)。出于同样理由，“单变”检测仪器一般按这样一种方式配置，即在整个感兴趣的浓度范围内，ωτ≈1或θ≈45°。例如，Dukes等人的专利4,716,363介绍一种反馈系统，该系统提供了一种给出大约45°恒定相位移所需要的调制频率。用所得到的频率去测定作为分析物浓率函数的受激态寿命。Dukes等人提出，恒定相位角方法的优点在于，对于所有感兴趣的分析物浓率均有ωτ＝1。
正如Wolfbeis在《纤维光学化学传感器和生物传感器》第II卷，CRC出版社，1991一书中所讨论的和Mauze等人在美国专利5,057,277中所传授的那样，当使用强度或寿命测量来测定分析物浓度时，过大的Stern-Volmer抑制常数K＝akqτo可能是不合意的。尤其是，当抑制常数过大时，在分析物浓度的较窄范围内出现寿命和强度的较大变化。在感兴趣的分析物的较高浓度下，与分析物有关的荧光强度和寿命的变化变得不合意地小。这些考虑与例如用来监测血液中氧气分压的传感器的正确设计相关，其中希望在Po2＝40～120mm汞柱，更可取的是在Po2＝40～200mm汞柱的范围内保持准确度。在此范围内一般要求起码约3mm(约2％)的准确度。
当为插入患者体内而配置时，可能需要敏咸元件小至直径125μm。因而，能在敏感元件尖端上供应的荧光染料的数量是有限的，造成比较小的荧光信号。通过增加染料装料和/或光子通量可以部分地抵销此问题。遗憾的是，适用于荧光抑制传感器的染料往往很容易发生染料聚集和光漂白。聚集和/或光漂白往往引起染料中的指示剂组分表现出一些不同的寿命τo，即多重寿命。对于任何给定的传感器来说，诸多重寿命往往随着老化和/或光致降解而变化。制作工艺变量也能造成不同传感器之间的不同寿命。
无论用来测定寿命的方法如何，基于受激态寿命测量的校准线必将随着τo的改变而变化。一般来说，需要两点式传感器校准和重新校准程序。初次校准一般在传感器组装之后进行或在临近使用之前进行。当传感器在使用中时，为了保持测量准确度往往需要重新校准。两点式校准程序涉及使用两种校准物，每种各具有已知的分析物浓度。一般来说，这些校准物的已知的分析物浓度接近于进行测量的范围内的最高浓度和最低浓度。在两点式校准程序的过程中，敏感元件交替地暴露于两种校准物，并测定校准线的斜率和截距，以便传感器提供准确的分析物浓度读数。实际上，两点式校准涉及对校准数据的斜率和截距的调整，正如由储存在传感器处理器的存储器中的查表数据或数学方程所代表的那样，直到以数据为特征的关系延伸通过与已知校准物的关系相对应的诸点为止。
由于两点式校准程序需要敏感元件暴露于两种标准物，为了重新校准必须即把体内传感器又把体外传感器从动脉上插着导管的患者身上的在线回路中拆下来。然而，在大多数临床情况下这是不能接受的程序，因为它能由于增加感染的危险而伤害患者。两点式校准程序还比较费时间。
显然，存在着对改善相位调制基于荧光的检测仪器的持续需求。尤其是，存在着对带有一些校准线的这种类型传感器的需求，这些校准线具有对由多重寿命和寿命的其它变异所引起的漂移和不稳定性并不敏感的斜率或斜率与截距。一种其特征在于带有对τo的变化性不敏感的斜率的校准线的传感器，将会具有能仅用一种具有已知的分析物浓度的校准物来加以校准的能力。斜率将与在传感器制作期间随不需要的染料聚集而产生的τo的变化性无关。此外，一个传感器中的较大的τo组分的任何有差别的光致降解，将引起校准线的截距而不是斜度的变化。这样一种能单点校准的传感器将增加体内血氧监测的商业上的可接受性，因为它将能进行体内重新校准。
发明要点本发明是一种用来测量分析浓度的相位调制、基于荧光的检测仪器。该仪器材能配置成允许进行准确的单点式体内或体外重新校准。
该检测仪器包括一个敏感元件，该敏感元件配置成暴露于一种抑制剂(即感兴趣的分析物或与感兴趣的分析物有关的一种物质)，并至少包括一种第一发射指示剂，其特征在于对于抑制剂的一个双分子抑制率常数kq、一个或多个超过最低寿命τoL的荧光寿命τo，并在有抑制剂的情况下暴露于一个激励信号时，能够发射出与分析物浓度有关的诸信号，该信号带有一个与浓度有关的参数，该参数作为分析物浓度的函数而变化。一个耦合于该敏感元件的激励系统以一个或多个角频率ω来提供一种振幅调制的激励信号。该激励信号例如可以取正弦波的形式或者取较复杂波形的形式，例如一个由调制基频ω和ω的较高谐波所定义的方波。一个耦合于该敏感元件的探测器探测与分析物浓度有关的诸信号并提供(诸)探测信号。一个处理器，最好包括用来储存对分析物浓度和与该浓度有关的参数之间关系的信息的存储器，耦合于该探测器。该处理器单变地处理(诸)探测信号以便得出与浓度有关的参数，并作为所得出的与浓度有关的参数和所储存信息的函数提供代表分析物浓度的(诸)输出信号。
该敏感元件和/或激励系统配置成使得对于该工作范围内的所有分析物浓度来说，以及对于大于τoL的所有寿命τo来说，该仪器均能足够地工作在条件[(Kq[Q])2＋ω2]τo2》1＋2Kqτo[Q]之内，致使与浓度有关的参数和分析物浓度之间的关系与τo的变化性和/或多重性无关。当按此方式配置时，校准斜率与τo的变化性和/或多重性无关。因而该传感器可以通过响应于敏感元件对一种具有已知浓度的校准分析物的暴露，修改使截距而不是斜率特征化的所储存的校准信息来重新校准。
可取的是，该敏感元件和/或激励系统配置成使该仪器能足够地工作在条件[(Kq[Q])2＋ω2]τo2＞4[1＋2Kqτo[Q]]之内。更可取的是，该敏感元件和激励系统配置成使该仪器能足够地工作在条件[(Kq[Q])2＋ω2]τo2＞6[1＋2Kqτo[Q]]之内。最可取的是，该敏感元件和激励系统配置成使该仪器能足够地工作在条件[(Kq[Q])2＋ω2]τo2＞10[1＋2Kqτo[Q]]之内。
在一个实施例中，该检测仪器包括一个用来以高调制频率提供激励信号的激励系统，使得对于该工作范围内的所有分析物浓度来说，以及对于大于τol的所有寿命τo来说，该仪器均能工作在条件ωτo＞10之内。在另一个实施例中，该敏感元件的特征在于一个足够高的溶解度和/或扩散率，使得对于该工作范围内的所有分析物浓度来说，以及对于大于τol的所有寿命τo来说，该仪器均能工作在条件Kqτo[Q]＞20之下。
在该检测仪器的另一个实施例中，该敏感元件和/或激励系统配置成使得对于该工作范围内的所有分析物浓度来说，以及对于大于τol所有寿命τo来说，该仪器均能定够地工作在条件[(Kq[Q])2＋ω2]τo2＞＞1＋2Kqτo[Q]和Kqτo[Q]＞9之内，致使与浓度有关的参数和分析物浓度之间的关系的斜率和截距二者都与τo的变化性无关。因而该检测仪器的重新校准是不必要的。
附图简介
图1是作为量ωτo和kqτo[Q]之函数的量值[(Kq[Q])2＋ω2]τo2/[1＋2Kqτo[Q]]的三维图解。
图2是根据本发明的传感器设备的一个实施例的示意图解。
图3是根据本发明的传感器系统的示意图解。
图4和图5是曲线图，作为氧气分压的函数表示调制频率对针对两种单体指示剂组分所侧得的相位移和解调比的影响。
图6是曲线图，表示针对图4和图5的诸指示剂的Stern-Volmer曲线。
图7和图8是曲线图，作为调制频率的函数表示针对两种单体指示剂组分和这两种组分的混合物的校准数据。
图9是针对两种单体指示剂组分和这两种组分的混合物的频率对氧气分压的曲线图(相位调制模式3)。
图10是曲线图，表示针对激发物形成系统的Stern-Volmer曲线。
图11是曲线图，作为氧气分压的函数并以用于激发物形成系统的两个调制频率表示相位移差。
图12和图13是曲线图，作为调制频率的函数表示针对两种单体指示剂组分和这些组分在硅橡胶母体中的混合物所算出的校准数据。
图14是曲线图，表示针对图12和图13中的两种单体指示剂组分所算出的Stern-Volmer曲线。
图15是曲线图，表示不同的aKq对荧光强度的氧气响应性的影响。
图16和图17是曲线图，作为针对两种单体指示剂组分和这些组分的混合物所算出的相位移和解调因数(分别)对氧气分压的校准数据。
图18是曲线图，表示针对两种单体指示剂组分和这些组分的混合物所算出的相位调制模式3的校准数据。
图19是曲线图，表示针对两种单体指示剂组分和这些组分的混合物的相位调制模式4的校准数据。
图20是针对两种具有较长寿命的单体指示剂组分和这些组分的混合物的作为氧气分压函数的在恒定相位移下的频率(相位调制模式3)的校准线。
图21是针对两种具有较长寿命的单体指示剂组分和这些组分的混合物的作为氧气分压函数的在恒定调制频率下的相位移(相位调制模式1)的校准线。
图22是作为量ωτo和Kqτo[Q]之函数的校准斜率的三维图解。
最佳实施例的详细描述用于本文时，术语“发射指示剂”或“荧光团”指的是响应于对一个诸如激励光信号之类的激励信号的暴露而产生一个诸如光学可探测信号之类的信号的任何组分，其中所述发射信号(“所发射的”信号)被一种分析物或一种与分析物有关的抑制剂所动态抑制。
用于本文时，术语“单体指示剂组分”指的是一种组分，该组分本身能或不能响应于对一个诸如激励光信号之类的激励光信号的暴露而提供一个诸如光学可探测信号之类的信号，而且该组分能参与形成一种受激态络合体。
用于本文时，术语“单体组分”指的是一种单体组分，该单体组分响应于对一个最好是激励信号的信号的暴露而提供一个最好是光学可探测信号的信号。
用于本文时，术语“激发物组分”指的是两种单体指示剂组分之间的一种受激态络合体，这些单体指示剂组分具有相同的指示剂结构并提供一种“第二发射信号”，其中所述第二发射信号被一种分析物或一种与分析物有关的抑制剂所动态抑制。包括同一单体指示剂组分的同分异构物和互变异构物。
用于本文时，术语“激发络合物组分”指的是两种不同的单体组分中之间的一种受激态络合体，这些单体组分中至少一种是单体指示物组分并提供一种“第二发射信号”，其中所述第二发射信号被一种分析物或一种与分析物有关的抑制剂所运态抑制。
为简洁起见，激发物组分和激发络合物组分有时统称为“受激态络合体”。也为简洁起见，括号内的“诸”的使用指的是它所附的词或者为单数或者为复数(例如“(诸)组分”指的是或者一种组分或者多种组分)。
本发明的相位调制、基于荧光的传感器是基于以下发现，即如果对于每个τo均满足下面式1中提出的条件，则所监测的在与浓度有关的参数(例如相位移)和分析物浓度之间关系的斜率，与在没有抑制剂的情况下荧光团的受激态寿命τo无关，而且还与在每个构成所监测的关系的受激态的本征寿命之间的多重性和其他变异无关。)2＋ω2]τo2＞＞1＋2Kqτo[Q]式1式中[Q]是抑制剂浓度(即在敏感元件或母体中的分析物浓度)；Kq是双分子抑制率常数；ω＝2πf是调制角频率。
实际上，相位调制探测可以按几种不同的模式来实现，所有模式均产生一个与浓度有关的参数，在有抑制剂的情况下当暴露于激励信号时该与浓度有关的参数作为分析物浓度的函数而变化。这些相位调制探测模式包括1.在恒定的调制频率下相位移对分析物浓度；2.在恒定的调制频率下解调因数对分析物浓度；3.在恒定的相位移下调制频率对分析物浓度；以及4.在恒定的解因素下调制频率对分析物浓度。
以上模式可描绘成“单变”方式，其中激励系统配置成在监测与浓度有关的参数时把激励信号(例如调制频率)或发射信号(例如相位移或解调因数)中的一个参数保持恒定。在这些单变系统中，可以单变地处理所监测到的参数以得出分析物浓度，而不用直接地或甚至间接地进行寿命测定或计算Stern-Volmer斜率。
与此不同，如像在BOC集团公司的欧洲专利申请公开第442276A1和442276A2中所介绍的检测仪器被描绘成“多变”方式，因为激励信号包含很宽的频率范围而若干个频率中的每一个频率下的相位移和/或解调因数都用于分析物浓度的测定。这种形式的多变方式要求用例如Fourier分析软件对发射信号反褶积(deconvo-lution)。用这种多变处理方法得到的频率域信息再经进一步处理而得到寿命值或Stern-Volmer斜率值，而这些值本身又转换成分析物浓度。这些多变检测仪器的一个缺点在于，针对每种分析物在许多频率下串行工作或同时工作的激励系统、探测器和处理器要求额外的复杂性。
对于在式1中给出的条件下单变工作的传感器来说，针对每个τo的荧光强度Ii中的与分析物有关的降低抵销了针对每个τo的调制因数mi中的与分析物有关的提高，该抵销达到这样一种程度，即针对每个τo的调制振幅接近于一个极限miIi＝Ioi/ωτoi在那里它们变得与分析物浓度无关。于是，针对每个τo的发射信号对总的测得相位移的相对贡献不随分析物浓度或调制频率而明显地变化。假定双分子抑制常数Kq对每个可抑制发射信号是相同的，则对这些传感器来说校准斜率就是不变的。与浓度有关的参数和分析物浓度之间的关系的截距对τo的变化仍然是敏感的，但此关系的斜率并非如此。如果，除了满足式1之外，传感器配置成对于在工作范围之内的所有分析物浓度来说和对于大于τoL的所有寿命τo来说均满足条件kqτo[Q]＞9，则与浓度有关的参数和分析物浓度之间关系的斜率和截距都与τo的变化性无关。
具有此工作特性的检测仪器带有明显的优点。尤其是，与浓度有关的参数和分析物浓度之间关系的斜率或者斜率和截距对τo的多重性或变化性不敏感，τo的多重性或变化性是由于变化的制作过程参数引起的和由于光致降解和染料聚集引起的，这些变化的制作过程参数造成传感器与传感器之间的染料混合物的变异，而光致降解和染料聚集则在任何给定的传感器中随着时间的推移而出现。因而，具有对寿命的变异不敏感的校准斜率的传感器，可以根据一个已知的分析物浓度(即“单点式校准”)和一个预定的斜率，通过调整与浓度有关的参数和分析物浓度之间校准关系的截距来校准。例如，一个用来监测一位患者血内气体(例如氧气)水平的体内传感器可以这样来校准，即取一个血样，用另一种方法测量感兴趣的气体浓度，并且仅这样调整该传感器所具有的测得的参数对分析物浓度关系的截距(即校准信息)，使该传感器提供一个等于由该另一种测量方法测值的输出读数。能在体内重新校准传感器提高了医学界对这种传感器的接受性。具有对寿命变异不敏感的校准斜率和截距的测试仪器一经在组装设施处设置再也不需要重新校准。
图1是作为量ωτo和kqτo[Q]之函数的量值[[(kq[Q])2＋ω2]τo2]/[1＋2kqτo[Q]]的三维图解。此图沿Z轴被截成平面以表示量[(kq[Q])2＋ω2]τo2以大于10的倍数超过量[1＋2kqτo[Q]]的区域。X＋Y轴被截成平面仅为图解目的而无意针对ωτo或Kqτo[Q]把本发明限制于一些上限。量ωτo直接关联着并受控于激励信号被抑制的频率。量kqτo[Q]与该传感器的荧光抑制效率有关并取决于传感器的染料和/或基质母体。图1中的井底一般来说描绘传统的传感器工作于其上的一个ωτo和kqτo[Q]量集。图1顶部的平坦区域描绘满足式1中提出的条件的一个ωτo和kqτo[Q]量集。从图1显然看出，根据本发明的检测仪器能配置成以下列方式中的一种或多种工作在式1中提出的条件之下1.当ωτo＞10，对于所有[Q]始终满足式1；
2.当10＞ωτo＞1，对于[(kq[Q])2＋ω2]τo2]/[1＋2kqτo[Q]]＞10处的所有[Q]始终满足式1；或者3.当kqτo[Q]＞20，始终满足式1。
根据本发明的检测仪器配置成监测具有在预定浓度工作范围之内的浓度的分析物。诸传感器还配置成按预定的误差范围之内的准确度提供测量。根据该传感器必须在其内能工作的浓度范围和必须按其进行测量的准确度，在图1中井底与平坦区域之间可能有一组工作点，在这些工作点上与浓度有关的参数和分析物浓度之间关系的斜率是与τo的变化性足够地无关，以便使该传感器能利用本发明的发现，并对所有感兴趣的浓度在预定的准确度范围内提供测量。在此文件中，术语“与τo变化性无关”和“足够地与τo的变化性无关”意指无关到这样的程度，即对于在该检测仪器中存在的并具有大于一个寿命下限τOL寿命的所有发射指示剂寿命来说，由这些寿命引起的校准斜率或者校准斜率和截距的变化，当与仪器误差的其他根源相结合时，不引起该检测仪器的工作超出其预定的误差范围。应该指出，在本发明的仪器中允许一定数量的具有小于τOL寿命的不纯荧光，只要这些不纯荧光对所探测的发射信号的贡献不会显著地影响校准斜率就可以。许多检测仪器如果它们配置成在10≥[[(kq[Q])2＋ω2]τo2]/[1＋2kqτo[Q]]＞6的条件下工作，则能对于预定工作范围内的所有浓度按预定范围之内的准确度提供测量。另一些传感器如果它们配置成在6≥[[(kq[Q])2＋ω2]τo2]/[1＋2kqτo[Q]]＞4的条件下工作，则能对于感兴趣的预定范围之内的所有浓度按的准确度范围之内预定提供测量。
根据本发明的检测仪器能配置成利用任何常规的或其他已知的相位调制探测技术来工作。尤其是，除了配置成作为外部比照的单态系统来工作外，该发明性概念可以结合到在共同受让的名称为“传感器和检测方法”的美国专利申请序列号08/137,289中所述类型的多态和/或内部比照的检测仪器中。区分本发明与常规仪器的一个特征在于，选择足够高的调制频率ω(即“高频”仪器)和/或选择具有高扩散率和/或溶解度的传感器染料和/或基质母体(即“高扩散率和/或溶解度”仪器)，以便该仪器配置成足够地工作在式1中提出的条件之内，致使校准斜率或者校准斜率和截距与τo变化性无关。
在所谓“单态”传感器中，荧光从第一受激态产生并在荧光团(即发射指示物)受激之后立即产生。然而，许多荧光团的第一受激态与敏感元件中的第二组分起反应而产生第二受激态组分(例如“受激态终合体”)，该受激态组分也能发出荧光。在这种情况下，有可能观察到两个发射信号来自未反应的第一受激态的荧光和来自已反应的第二受激态组分的荧光。这种类型的系统称为“双态”或“两态”系统。典型的受激态反应包括形成激发物和激发复合物，受激态加质子和去质子及能量转移。在许多场合，受激态过程可以用一个简单的两态反应模式来描述。每个受激态有它自己的荧光波长和它自己受激态寿命。第一发射信号在波长上比第二发射信号短些。
作为例子，上面确认的共同未决的美国专利申请序列号08/137,289介绍了形成激发物和激发络合物的两态系统荧光团在内部比照动态荧光抑制/相位调制传感器中的应用。该敏感元件可能包括一种或多种位于母体材料内或者共价地粘合于母体材料的单体组分，其中至少一种单体组分是单体指示剂组分。这些单体指示剂组分中的每一种均能响应于对第一激励信号的暴露而提供第一发射信号，第二发射信号是由一种受激态络合体(例如一种激发物组分或一种激发络合物组分)提供的，该受激态络合体是由该(诸)单体组分之一的受激态反应产生的。像诸第一发射信号一样，诸第二发射信号在该敏感元件中由在没有抑制剂的情况下的寿命τo和强度Io来描绘。在没有抑制剂的情况下，受激态综合体的寿命明显地长于未反应单体受激态的寿命。事实是这样，当存在着抑制剂Q时，受激态综合体的发射被抑制剂更广泛地抑制。来自该受激态络合体的第二发射信号的荧光还被抑制剂所动态抑制。在没有抑制剂的情况下和在有抑制剂的情况下的这些受激态络合体寿命的强度之间的关系使得可以针对受激态络合体的脉冲响应来测定Stern-Volmer特性。因而可以用相位调制探测技术来测定分析物浓度。此外，在对于每个反应受激态寿命τo均满足式1的条件的场合，校准斜率变得与第二发射信号中τo的变化性无关。
在单态系统检测仪器中，相位调制探测卷入把与浓度有关的参数与外界产生的激励信号比照。双态系统中的相位调制提供内部比照的优点；该内部比照减轻了由仪器偏置或传送信号的光纤弯曲所引起的信号失真和其他连带的问题。来自第二(例如激发物或激发络合物)发射信号的与浓度有关的参数与来自第二(例如单体)发射信号(即差动抑制)比照。要不然的话，来自第二发射信号的与浓度有关的参数可以与外加激励信号比照，或者既与外加激励信号又与第一发射信号比照。第一发射信号与第二发射信号可以靠滤色镜彼此分离并单独探测。上面作为模式1-4所描述的所有相位调制技术均可用内部比照以若干种方式来实现。作为例子，对于多态荧光传感器来说，采用以上模式1的相位调制探测可以包括一个处理器，该处理器配置成作为以下相位关系式中任何一个的函数来计算分析物浓度1.θesc－θmonomer；2.θesc－θexcitation；3.(θesc－θexcitation)－(θmonomer－θexcitation)；或4.θesc＋θmonomer－θexcitation。
式中θexcitation是激励信号的相位；θmonomer是第一发射信号的相位；以及θesc是第二发射信号的相位(其中“esc”指受激态络合体)。
一个其中能实现本发明的发现的检测仪器10简略地图示于图2中。仪器10包括一个耦合于敏感探头或敏感元件16的激励系统14。在图示的实施例中，敏感元件16靠一根或多根光纤17耦合于激励系统14，并包括一段带有一个远端或尖端的光纤18，该远端或尖端带有覆盖着聚合母体22的光学表面19。光纤17还经一个光学探测器26耦合于一个信号处理系统25。代表测得的分析物浓度的信息可以直观地显示在显示器28上。母体22对于抑制剂(由感兴趣的分析物或按已知关系与感兴趣的分析物的一种物质组成相关联)是可渗透的并包含一个由一种或多种可发荧光的发射指示剂组成的分散体。如图2中所示，聚合母体22一般来说将粘合于纤维18的靠近光学表面19的测面，及该光学表面本身。一个不透明的外涂层24，该外深层可以是分散在添加固化聚硅氧烷polysiloxane中的氧化铁颜料，涂布在母体22的总体上并越过母体向下涂布到光纤18的侧面。除了被配置成带有高扩散率和/或溶解度染料和/或基质母体之外，其中该染料和/或基质母体当与激励系统14工作的该频率或诸频率结合使用时满足式1中提出的关系，敏感元件16可以类似于其他公知的或常规的敏感元件。
除了能在一个或一些高频率下工作之外，其中这些频率当与敏感元件16的传感器染料和/或基质母体结合使用时满足式1中提出的关系，激励系统14也可以类似于其他公知的或常规的激励系统。激励系统14产生一个呈强度调制光束形式的激励信号。该光束一般来说是在一个或多个角频率下调制的正弦波，并靠光纤17耦合于敏感元件16的近端。该激励信号传播到聚合母体22，在那里它激励该母体中的该(诸)可发荧光的发射指示剂并引发一个振幅调制的光学激发信号。该激发信号被渗透过该母体的任何抑制剂所抑制，并经光纤17向回传播到探测器26。探测器26把该光学信号转换成电气形式，以便由信号处理系统25单变处理。处理系统25可以是模拟系统也可以是数字系统，该系统处理探测到的信号以得出代表分析物浓度的信息。分析物浓度的直观显示由显示器28提供。
上面描述的相位调制探测模式中的任何一种模式均能由敏感元件10来实现，以得出分析物浓度。这些相位调制模式能用单态或多态指示剂组分来实现。如果采用多态系统，则该仪器能针对内部比照技术或外部比照技术来配置。
信号处理系统25最好包括用来储存描绘所监测参数(例如相位移、频率或解调因数)与分析物浓度之间一种预期关系的校准信息的存储器(未画出)。在包括一个以微处理器为基础的或其他的数字信号处理系统25的检测仪器10中，可以作为描述一个功能上把所监测参数与分析物浓度相关联的方程式来存储该校准信息。在这样一个处理系统25中，一旦测定了所监测的参数，即求解该方程式以得到分析物浓度。要不然的话，该处理系统25可以包含一个所监测参数点与对应的分析物浓度的储存备查表。在这样一个处理系统25中，一旦测定所监测的参数，即通过根据储存在该备查表中的两个最接近的点的插值来确定对应的分析物浓度。这种类型的测量仪表处理系统一般是公知的。
在单点式重新校准期间，敏感元件16暴露于一种具有已知的分析物浓度的校准物，或者用一种其他技术来测量被监测的分析物浓度。利用一个与处理系统25耦合的诸如旋钮或键盘之类的接口(未画出)，操作者能输入代表该已知分析物浓度的信息。当根据本发明工作时，该处理器以这样一种方式修改所储存的校准信息，致使所监测参数—分析物浓度之间关系的截距而不是斜率以这样一种方式变化，即显示器28提供一个等于该已知分析物浓度的输出读数。检测仪器10借此被重新校准，并能对在其工作范围之内的所有浓度提供准确的浓度测量。能以这种方式修改校准信息的截距而不是斜率的处理系统可以用公知的技术实现。
在最佳实施例中，信号处理系统25单变地实时处理探测到的激励信号以得出所监测参数。例如，用来实现恒定调制频率模式1和2的一个这种类型的信号处理系统分别从探测到的发射信号得出相位移或解调因数。然后分别作为所得出的相位移或解调因数的函数，访问所储存的把相位移或解调因数描绘成分析物浓度函数的校准信息，以得到分析物浓度。在此单变处理技术期间，既不直接也不间接计算指示剂组分寿命。
把一种可以买到的由SLM-Aminco制造的SLM48000 MHFFourier变换光谱荧光计仪器，与一种325nm HeCd激光器结合，用作激励系统和信号处理系统，从而进行了针对本发明的研究和开发。在某些实验中还使用一种364nm氩离子激光器。此系统配置成提供一个单独的固定调制频率或一种多频率群。当配置成提供单个调制频率时，代表相位移和/或解调因数的信息(即模式1和2的数据)由该仪器直接提供。当使用配置成产生多频率群的仪器进行试验时，来自该仪器的输出数据被数字化并加在一台计算机上，然后用可以买到的快速Fourier变换软件处理此数据，以便确定多个调制频率中的每个频率下的相位和解调数据。对于两态系统，可以用滤光镜来分离不同波长的信号。此仪器还能以模拟恒定相位模式3的方式工作。得到恒定的相位移所需的频率靠插值来确定。
在实验程序期间，图2中16处所示类型的敏感元件被插入一个容纳气体样品(例如已知浓度的氧气和二氧气碳或氮气的混合物)的盒子。在敏感元件的其他实验实施例(未画出)中，能发荧光的发射指示剂分散在能有效地起母体作用的溶液里。这种发射指示剂溶液装在一个恒温杯中。用一些单独的光纤(未画出)把激励信号耦合于样品腔，并把来自样品腔的发射信号向回耦合到探测器。
还使用图3中所示的外差系统进行了针对本发明的研究和开发。图3中所示的系统包括一个用来产生在频率f下的调制信号的激励频率发生器30。该调制信号耦合于电光调制器36(如一个普克尔斯(pockels)盒)和偏振分光镜35，以调制由激光器34产生的一个光学激励信号。在一个实施例中，激光器34是一个325nm波长HeCd激光器。也可以用发光二极管或倍频激光二极管。该调制激励信号被分光镜35和分叉光纤37引到敏感元件16。从敏感元件16收到的光学发射信号经滤光盘39加到探测器38上。当该敏感元件配置成作为两态系统工作时，滤光盘39分离由敏感元件16提供的第一和第二发射信号，使探测器能通过时分多路传输对每个发射信号进行探测。探测器38可以是一个光电倍增管、雪崩光电二极管或微通道板。探测到的发射信号在加到混频器42之前被射频放大器40放大。
图3中所示系统的实施例还包括一个用来产生与该调制频率相差△f的信号的频率发生器44。由发生器44产生的信号和该调制信号在混频器46中混频，以产生一个在频率△f下的外差基准信号。由发生器44产生的该信号还在混频器42与探测到并放大了的发射信号混频，以便对该基准频率△f解调该发射信号。该解调发射信号被音频放大器48放大并被滤波器50带通滤波，以提高信噪比并去除不需要的频率分量。
在图3中所示系统的一个实施例中，激励频率发生器30产生一个2.00MHz调制信号，同时频率发生器44产生一个2.01MHz外差信号。由探测器38输出的频率为2.00MHz的探测到的发射信号在混频器42由此在频率上偏移到4.01MHz和10KHz。除了10KHz信号外，所有频率分量被带通滤波器50滤掉。同理，在混频器46的输出端提供10KHz的一个频率信号。来自带通滤波器50的该探测到的发射信号和来自混频器46的该信号被数字转换器52数字化，并加到信号处理器54上。信号处理器54在一个实施例中是一台个人计算机，并包括用来提出发射信号相对于来自混频器46的基准信号的相位移和解调因数的软件。
以下非限制性示例说明本发明的某些方面。除非另行注明，所有份数和百分数均按重量计，而所有以毫米单位表达的分压均指毫米汞柱。
实施例例1此实施例针对其中两个不同的发射寿命描绘探测到的发射信号的场合，说明本发明的改进性能。使用光谱荧光计仪器作为激励和信号处理系统，用乙烷(akq＝6.1×105mm-1sec-1)作为用于单体指示物组分的母体，苯并[g，h，i]芘(下文“BP”；τo＝93nsec)，乙烯基苯并[g，h，i]芘(下文“VBP”；τo＝35nsec)，以及这两种单体指示物组分的大约50∶50混合物的稀溶液在一个恒温杯(保持在298K)中受到用由一个氩离子激光器提供的364nm单色激光的激励。用一个400nm长通出口滤波器来监测发射。用乙醇中的1，4-双(4-甲基-5-苯基恶唑-2-基)苯(下文“Me2POPOP”；τo＝1.45nm)作为外部基准。这些溶液暴露于具有以下配方的氮中加氧的混合气体中(％氧＝0.0，5.22，10.25，15.11和空气)。针对BP、VBP及BP与VBP混合物测得的，作为O2分压和调制频率的函数的相位移和解调因数示于表1a、1b、1c、1d、1e和1f。测得的相位移修约成准确到小数点后两位。测得的解调因数修约成准确到小数点后三位。
针对BP和VBP测得的相位移和解调因数在图4和图5上针对5和30MHz调制频率表达成O2分压的函数。这两种方案的对应的Stern—Volmer曲线按τo/τ＝[[1/(mo2－1)]/[1/(m2－1)]]1/2由5MHz解调因数确定，并图示于图6中。未企图把实验数据“拟合”成一条数学上的直线(如“最小二乘法”拟合)。然而，为了清晰起见，把每种方案的相邻的实验点各用直线段相连。例如，在图6中所得连接的诸数据点形成一条略成锯齿状的大体上平直的线。在图4-图6中穿过一些实心方块形成的虚线是5MHz下的BP，而穿过一些空心方块形成的虚线是30MHz下的BP。与此类似，在这些图中穿过一些实心方块形成的实线是5MHz下的VBP，而穿过一些空心方块形成的实线是30MHz下的VBP。
注意BP与VBP之间Stern-Volmer斜率的差别，它反映了这两种染料τo的差别。相应地，5MHz相位和解调线对两种染料来说是弯曲的并且是不平行的，这符合一般表达式tanθ＝ωτ和M＝(1＋ω2τ2)-1/2，式中τ由Stern—Volmer方程式τo/τ＝1＋kqτo[O2]来定义。此5MHz频率数据表示该仪器按先有技术中公知的常规方式工作。对于VBP来说，在40至100mm汞柱的O2分压的临床范围为，ωτo＝1.1，[[(kq[Q])2＋ω2]τo2]/[1＋2kqτo[Q]]＝0.72至1.27而kqτo[Q]＝0.85至2.56。对于BP来说，ωτo＝2.9，[[(kq[Q])2＋ω2]τo2]/[1＋2kqτo[Q]]＝2.47至3.75而kqτo[Q]＝2.27～6.81。
在30MHz下该仪器工作在式1中提出的关系之下。对于VBP来说，ωτo＝6.6，[[(kq[Q])2＋ω2]τo2]/[1＋2kqτo[Q]]＝16.3至8.2而kqτo[Q]＝0.85至2.56。对于BP来说，ωτo＝17.4，[[(kq[Q])2＋ω2]τo2]/[1＋2kqτo[Q]]＝56.4至24.2而kqτo[Q]＝2.27至6.81。相应的校准线基本上是线性的和平行的，与τo的不同无关。
相位移和解调因数与τo，akq和[O2]的关系如下θ＝tan-1(2πfτ)＝tan-1(2πfτo/(1＋akqτo[O2]))；和m＝[1＋(2πfτ)2]-1/2＝[1＋(2πfτo/(1＋akqτo[O2]))2]-1/2对Po2取θ或m的一阶导数，可得到一般表达式dθ/dPO2＝-ωτo2akq/{1＋2akqτoPo2＋(akqτoPo2)2＋(ωτo)2}dm/dPo2＝ω2τo3akq/{1＋2akqτoPo2＋(akqτoPo2)2＋(ωτo)2}3/2。当满足式1的条件时，这两个表达式均变成与τo无关的dθ/dPo2≈-ωakq/{(akqPo2)2＋(ω)2}dm/dPo2≈ω2akq/{(akqPo2)2＋(ω)2}3/2此外，如果ω＞＞akqPo2，则dθ/dPo2-akq/ω而dm/dpo2≈akq/ω。在此场合，得到对Po2的线性关系。在30MHz下的平行线表明，对于两种染料来说，kq是相同的。注意对于VBP来说ωτo仅为6.6，引起VBP线在低于40—120mm贡柱的生理范围(即感兴趣的范围)的低O2分压下偏离线性平行特性的区域中，在此区域中，曲线是线性的，其中θ≈[π/2－1/ωτo－akqPo2/ω]和m≈[1/ωτo＋akqPo2/ω]并明确地确定截距与τo的关系。
已发现针对该两种染料的50∶50混合物的30MHz校准线是线性的，并将其示于图7，其斜率与纯组分的斜率类似而截距在两纯组分的截距之间。图7中所用的约定与图4至图6中的相同。此外，穿过诸实心方块形成的双点划线是5MHz下的该混合物，而穿过诸空心方块形成的双点划线是30MHz下的该混合物。
如果93nsec和35nsec寿命指示剂的一种混合物存在于同一传感器中，并且不发生特定的相互反应，则测得的相位移和解调因数可以针对各个组分用相位角定义如下tan<θ>＝N/D；m＝[N2＋D2]1/2；N＝∑fisinθicosθi；D＝∑ficos2θi；andfi＝(aiIi/Ioi)/(∑aiIoi)；式中θi是针对各个荧光团组分的相位移；fi是每种荧光团与氧气有关的对测得的总荧光的贡献；而αi是每种荧光团在没有抑制剂Q的情况下对测得的总荧光的贡献。
在5MHz的较低工作频率下，该混合物产生一些显著地偏离针对纯组分者的校准斜率，而在30MHz的较高工作频率下，斜率的偏离就不大明显了。为了保持±3mm的准确度，并假定在100mm下的单点式重新校准，大约5％的斜率精度是必要的。
针对BP、VPB及BP与VBP的50∶50混合物的稀已烷溶液，在5MHz和20MHz的工作频率下测得的相位移图示于图8中。穿过诸实心方块形成的线表示5MHz的数据。穿过诸空心方块形成的线表示20MHz的数据。在20MHz下该仪器基本上工作在式1中提出的条件之内。对于在20MHz下的VBP来说，ωτo＝4.4，[[(kq[Q])2＋ω2]τo2]/[1＋2kqτo[Q]]＝7.4至4.2而kqτo[Q]＝0.85至2.56。对于在20MHz下的BP来说，ωτo＝11.7，[[(kq[Q])2＋ω2]τo2]/[1＋2kqτo[Q]]＝25.6至12.5而kqτo[Q]＝2.27至6.81。虽然不是线性的，但是所有曲线均有相同的诸斜率。
例2采用上面例1中所述的仪表和VBP与BP指示物溶液，并暴露于如例1中所述的氮中加氧混合气体，在从5至125MHz的若干个调制频率下运用多谐Fourier(MHF)并行采集测定了作为O2分压函数的相位移。靠插值确定了将在每种氧气浓度下给出恒定的相位移的诸调制频率。图9是频率对氧气浓度的曲线图(即调制频率模式3)，而且对于纯组分和对于该混合物均表现出线性特性。
例3用于此例中的敏感元件包括覆盖着2×10-5M 1，3-双(1-芘基)丙烷(一种分子内激发物形成分子)的二甲基硅氧烷薄膜。该薄膜制备如下在0.50g的乙烯终止的硅氧烷(Petrarch Systems以商品名PS441出售)中加入0.05g的聚甲基氢硅氧烷(可从Petrarch Sys-tems以商品名PS123买到)，0.50ml的1，3-双-(1-芘基)丙烷(可从Molecular Prober买到)的9×10-5M CHzCl2溶液，以及10ml的Pt催化剂溶液。该样品在空气中，然后在真空中干燥。用于这些制备的该Pt催化剂溶液是一种Karsted催化剂在已烷中的溶液。
采用带单频率采集的SLM48000频域荧光计，用此敏感元件，按相位调制模式1进行了实验。把该敏感薄膜放置在一个恒温光学隔离腔中，该腔配备有供共线激励和发射光纤用的通口和供快速排气用的一些通口。该光纤通口布置成使纤维远端设置成与该薄膜表面成45°角地激励和发射收集，以便使散射减至最小。用由一个HeCd激光器提供的单色激光以325nm来激励该薄膜。用一个标准的单色仪串行地选择激发物发射500nm和单体发射375nm的发射波长。该传感器薄膜暴露于具有以下配方的氮中加氧混合气体(体积％氧气＝0.0，5.09，10.35，18.37)。
根据在1、3、5、10、20、30和50MHz下的单频率测量，得到针对单体发射和激发物发射的相位移，并比照作为外部基准的针对Me2POPOP的相位移。单体发射与激发物发射之间的相位差作为％O2和调制频率的函数示于表3a中。
表3aΔθ＝θexcimer－θmonomer对于O2传感器％O2调制频率(MHz)1 3 5 10 20 30 500.0 19.146.059.974.0 81.8 84.5 86.75.09 14.838.452.869.3 79.3 82.8 85.710.3511.731.946.064.3 76.4 80.9 84.515.3710.027.841.360.7 74.1 79.3 83.5用0.0％O2下的相位移差和关系式tan(Δθ)＝ωτ，算出描绘发射物脉冲响应函数的τo约为55nsec而与调制频率无关(见下面表3b)。
表3b调制频率(MHz) τoKsv*akq**1 55.18.31 1.513 54.98.27 1.515 54.98.28 1.511055.58.31 1.502055.28.41 1.523055.18.27 1.505055.28.36 1.51
*＂Ksv＂＝tan(Δθ)o/tan(Δθ)对氧气分压mm的斜率。
所报告斜率的单位是mm-1×103。
**＂akq＂由Ksv/τo确定，报告的单位是mm-1sec-1×10-5发射物形成系统的这些属性导致基于相位移差的平滑的Stern－Volmer抑制特性。这针对在1MHz调制频率下收集的数据示于图10中。该Stern－Volmer关系式为τo/τ＝1＋akqτoPo2＝tan(Δθ)o/tan(Δθ)，式中kq是双分子抑制率常数，a是氧气在硅氧烷中的溶解度，而Po2是被检测介质中的氧气分压力。针对每个调制频率确定了Stern－Volmer斜率Ksv＝akqτo(表3b)。根据Ksv和τo值，确定量akq约为1.51×105mm-1sec-1。下面用此量在高调制频率下估算Δθ对O2校准线的特性。
在图11中，针对3MHz和20MHz的调制频率，作为O2分压力的函数示出相位移差Δθ。穿过诸实心方块形成的3MHz相位线是弯曲的，符合一般表达式tanΔθ＝ωτ＝ωτo/(1＋kqτoapo2)。τo的变异将导致一族不平行的曲线。此3MHz频率说明超出式1条件的传感器工作。对于在3MHz和Po2＝40至120mm的此指示剂组分来说，ωτo＝1.04；[[(kq[Q])2＋ω2]τo2]/[1＋2kqτo[Q]]＝0.71至0.69；而kqτo[Q]＝0.33至1.00。
在20MHz下，穿过诸空心方块形成的对应曲线是线性的。在此频率下，ωτo＝6.91；[[(kq[Q])2＋ω2]τo2]/[1＋2kqτo[Q]]＝28.8至16.3；而kqτo[Q]＝0.33至1.00。像例1中那样，Δθ≈[(π/2)－(1/ωτo)－(akqPo2/ω)。于是该斜率与τo的变异无关，不像Stern-Volmer斜率那样。用得自上面的akq＝1.51×105mm-1sec-1，算出一个理论斜率akq/ω＝-0.0688 deg/mm，此理论斜率与-0.0686deg/mm的实验斜率相当好地吻合，于是在频率上限证实了该方程式的形式。在20、30和50MHz下的校准斜率的对比，证实了斜率对调制频率的反逆关系数。
例4图12是针对在硅橡胶母体中的苯并[g，h，i]芘(BP；τo＝93nsec)和乙烯基苯并[g，h，i]芘(VBP；τo＝35nsec)单体指示剂组分，及这些单体指示剂组分的50∶50混合物的若干组校准数据的图解。这些仿真基于用实验方法得出的τo值(得自例1)和akq值(得自例3＝1.5×105mm-1sec-1)。用在3MHz下调制的激励信号时，对于35nsec指示剂组分ωτo≈0.66而对于93 nsec指示剂组分ωτo≈1.76。每组数据描绘测得的相位移θ与氧气浓度(分压)之间的一种校准关系。图13是针对相同的传感器按相位调制模式2(解调因数m作为氧气浓度函数)的各组仿真校准数据的图形表达。当使用常规的调制频率(即ωτ≈1)时，针对这三种传感器的作为氧气分压函数的相位移和解调因数的校准数据线，表现出分别如图12和图13中所示的很差的特性(例如，可变的斜率和截距)。在这些场合，对于τo＝93nsec的传感器，调制频率选为3MHz，以便在生理相关的氧气分压的中点(90mm W2)处提供最高的校准精度。然而，在较高的调制频率下(图12和图13中所示的20MHz数据)，这些校准线的斜率变成与τo变化性和τo多重性无关。
例5Wolfbeis的书较详细地讨论了一种常见的氧气传感器配置，其中一种多环芳香烃(PAH)分散于或共价粘合于硅橡胶。在此材料中，氧气溶解项a与控制扩散的双分子抑制率常数kq之积约为1.5×105mm-1sec-1。对于在这样一种敏感元件中的典型PAH荧光团来说，受激状态寿命一般从τo＝20变化到100nsec，导致K＝akqτo＝0.003至0.015mm-1的Stern-Volmer校准斜率。图14表示针对上面刚刚描述的氧气传感元件的荧光寿命对氧气分压的Stern-Volmer曲线，其中τo＝35或93 nsec。在此场合，氧气在聚合母体中的溶解度和扩散率是这样的，以致该传感器在感兴趣的整个分析物浓度范围内给出良好的响应灵敏度。对于更长寿命的染料或者对于其中氧气溶解度和扩散率大得多的聚合母体基质来说，Stern-Volmer抑制常数可能变得过高。例如，图15表示把akq从1.5×105mm-1sec-1到9.5×105mm-1sec-1提高6.3倍(例如，通过把PAH指示物组分分散在一种不同的母体中)的影响。具体地说，图15针对τo＝93nsec表示此影响。如果Stern-Volmer抑制常数变得过高，则在40至120mm汞柱的临床范围内振幅灵敏度降低。为了根据常规做法克服这种降低了的灵敏度，即如Mauze所传授的，可以改变荧光团或母体聚合物的性质，以降低τo、a或kq。通过改变该敏感元件的化学配方，可以降低Stern-Volmer抑制常数，以便在感兴趣的分析物浓度范围之内实现更想要的灵敏度。
在常规做法不同，在此例中表示了高Stern-Volmer抑制常数与高调制频率的结合，以提供一些保持分析物灵敏度并且与τo多重性无关的校准斜率。图16和图17是针对上面例1中所述的VBP(τo＝35nsec)和BP(τo＝93nsec)单体指示剂组分，并针对这两种单体指示剂组分的50∶50混合物，算出的相位移和解调因数(分别)对氧气分压的校准数据的图形表达。与常规做法不同，通过提高氧气溶解度和扩散率，已经提高了Stern-Volmer抑制常数，致使akq＝9.5×105mm-1sec-1。虽然图16和图17是用根据例1中所述的测得数据计算的数据点的仿真，但是例如通过把VBP和BP单体指示剂组分分散于三甲基硅烷乙烯母体，能够实现近似地具有此akq值的敏感元件。还与常规做法不同，通过把调制频率从3MHz改为45MHz，乘积ωτo也可观地提高。因而在图16和图17中所示的整个生理学相关的氧气分压力范围力，满足式1中提出的条件。对于此传感器中的VBP和在40至120mm的生理学范围内ωτo＝9.9；[[(kq[Q])2＋ω2]τo2]/[1＋2kqτo[Q]]＝27.2至12.7；而kqτo[Q]＝1.33至4.00。对于BPωτo＝26.3；[[(kq[Q])2＋ω2]τo2]/[1＋2kqτo[Q]]＝87.3至36.2；而kqτo[Q]＝3.53至10.60。
例6此例子也是基于针对上面例4中所述的VBP、BP和50∶50混合物指示组分的计算的仿真，再次在具仍诸如akq＝1.5×105mm-1sec-1的氧气溶解度和扩散率的硅氧烷母体中。这些指示剂组分在硅氧烷中的分散将具有这些特性。如果令调制频率这样变化，即相位移在Δθ＝20°、45°和60°处保持恒定(相位调制模式3)，则得到图18所示类型的校准线。根据下面针对由单个τo描绘的一个个别荧光团得出的校准关系，f＝(tanθ/2π)[1/τo＋akqPo2]。
对于有一个τo的个别荧光团来说，校准线是线性的，而且校准斜率变成与τo无关，仅与母体关联常数akq有关。在图18中，分别用线A和E表示针对具有τo＝35nsec和τo＝93nsec的单个荧光团的敏感元件的校准线，表现出相同的斜率。如果可以做出保证，即一个敏2感元件不表现出τo的双峰分布，则可以假定线性和恒定校准斜率，并可确定单点式校准法。然而，在许多场合，为了充分描述这些敏感元件的荧光寿命特性，需要一个以上的τo。在这些场合，斜率和截距二者均变化。然而，我们已经发现，通过达到足够的相位移，诸斜率变成与多重性无关，并且可以实现单点式校准。例如，图18针对两种互不反应的荧光团，一种τo1＝35nsec而另一种τo2＝93nsec，的50∶50混合物表示出结果。线B针对80°相位移，线C针对45°相位移；而线D针对20°的相位移。随着相位移从20°变到45°变到80°，针对混合物的校准斜率变得越来越线性，而且诸斜率接近于纯组分。在θ＝45°时，校准斜率与针对纯组分得到者差10％。在θ＝80°时，针对混合物的校准斜率是线性的并具有与纯组分相同的斜率。此相位移充分保证高调制频率，致使对于感兴趣的所有氧气浓度来说均满足式1中提出的工作条件。对于此传感器中的VBP和在40至120mm的生物学范围内ωτo≥5.9；[[(kq[Q])2＋ω2]τo2]/[1＋2kqτo[Q]]＝24.8至343；而Kqτo[Q]＝0.211至0.634；对于BPωτo≥15.8；[[(kq[Q])2＋ω2]τo2]/[1＋2kqτo[Q]]＝117至126；而kqτo[Q]＝0.56至1.69。
注意，在图18中，纵坐标题为“归一化频率(MHz)”。对于具有一个τo的个别荧光团来说，tanθ＝2πfτ＝(2πfτo)/(1＋akqτo[O2])针对f求解，得到f＝((1＋akqτo[O2])/(2πτo))tanθ用量2π/tanθ遍乘以上等式两端，得到2πf/tanθ＝1/τo＋akq[O2]此后一方程式即为Stern-Volmer形式，其中归一化频率2πf/tanθ等于1/τ。于是，对于纯组分来说，归一化频率2πf/tanθ等于1/τ。
例7按与上面例6中所述类似的方式，如果令调制频率这样变化，即解调因数保持恒定(相位调制模式4)，则得到图19中所示类型的校准线。对于由一个τo描绘的个别发色团来说，校准关系为f＝((1/m)2－1)1/2[1/τo＋akqPo2]。如图19中所示，随着解调因数从0.9(线H)变到0.1(线G)，针对混合物的校准斜率变得越来越线性而且斜率接近于针对纯组分者(线F和I)。在m＝0.1时，混合物的校准斜率近似为线性并且近似有与纯组分相同的斜率。此解调因数保证足够高的调制频率，致使对于感兴趣的所有氧气浓度来说均满足式1中提出的工作条件。
注意，在图19中“归一化频率(MHz)”可以类似地得出(像对图18做的那样)并且对于纯组分来说等于(2πf)/((1/m2)－1)1/2。
例8图20和图21分别是45°的恒定相位移下的频率(模式3)和10MHz的恒定调制频率下的相位移(模式4)的校准线，作为氧气分压的函数，针对具有350nsec和930nsec寿命的染料，和这些染料的50∶50混合物。图20和图21中所示的数据线是靠根据染料在akq＝7.1×105mm-1sec-1的母体中的假设的计算进行的仿真。在Mauze等人的美国专利5,057,277中基本上公开的类型的钌染料可以被弄成具有这种比较长的寿命。这种染料能分散于三甲基硅烷乙烯母体，以实现大约7.1×105mm-1sec-1的akq。对于350nsec染料ωτo＝22.0；[[(kq[Q])2＋ω2]τo2]/[1＋2kqτo[Q]]＝27.91至22.65；而kqτo[Q]＝9.94至29.82。对930 nsec染料ωτo＝58.4；[[(kq[Q])2＋ω2]τo2]/[1＋2kqτo[Q]]＝76.3至60.8；而kqτo[Q]＝26.4至79.2。此例子说明敏感元件在式1的条件之内工作。用这种较长寿命的染料时，校准关系的截距像斜率那样与τo变化性无关。通过采用在更高扩散率母体中的更长寿命的染料，可以得到甚至更高的截距与τo变化性的无关性。
图22是作为量ωτo和koτo[Q]的函数的校准斜率(40mm汞柱下每mm氧气分压的相位移°)的三维图解。此图形沿Z轴截成平面以表示一个最佳工作区，在那里对于大于τoL的所有τo来说校准曲线的截距均与τo无关；在那里对于大于τoL的所有τo来说校准曲线的斜率均与τo无关(即满足式1)；而且在那里校准斜率是大的。当1/τ＞＞1/τo时，或者更定量地说，当1/τ＞10(1/τo)时，校准曲线的截距变成与τo变化性无关。当kqτo[Q]＞9时满足此条件。
结论式1中提出的工作条件保证了非常规地高的，不适合于受激态寿命的准确测量的调制频率的采用。然而，避免直接测定该寿命，如相位调制模式1-4所示，这种调制频率使得可以用敏感元件，其中Stern-Volmer抑制常数对常规做法来说被认为是过高的，进行准确的分析物浓度测量。此外，通过工作在式1中提出的条件之下，可以使校准斜率及斜率和截距与τo多重性无关。
虽然已经对照最佳实施例描述了本发明，但是本专业的技术人员将会理解，可以在形式上和细节上进行改进而不脱离本发明的精神和范围。
权利要求
1.一种用来检测在介质中的一种分析物浓度的方法，该方法包括以下步骤把一个敏感元件暴露于所述介质，所述敏感元件包括一种配置成暴露于一种抑制剂的发射指示剂，所述抑制剂包含所述分析物或一种按已知关系与所述分析物相关联的物质，而且其中所述发射指示剂具有一个针对所述抑制剂的双分子抑制率常数kq和一个或多个大于最低寿命τOL的荧光寿命τO；把所述敏感元件暴露于一个角频率ω下的激励信号，借此使所述敏感元件发射一个与分析物浓度有关的信号或一些具有一个与分析物浓度有关的参数的信号，该参数作为分析浓度的函数而变化；探测所述(诸)发射信号并提供(诸)探测信号；单变地处理至少一个所述诸探测信号以得出该与浓度有关的参数，借此测定在所述介质中所述分析物的浓度，其中所述敏感元件和/或所述激励信号这样配置，以便提供一种工作条件，其中对于感兴趣的工作范围之内的所有分析物浓度来说以及对于大于τOL的所有寿命τo来说，量{[(kq[Q])2＋ω2]τo2}均大于4倍的量{1＋2kqτo[Q]}，这里[Q]是所述敏感元件中所述抑制剂的浓度。
2.一种用来检测在介质中的一种分析物浓度的方法，该方法包括以下步骤把一个敏感元件暴露于所述介质，所述敏感元件包括一种母体材料和一种发射指示剂，其中所述母体材料对于包含所述分析物或一种按已知的关系与所述分析物相关联的物质的一种抑制剂来说是可渗透的，而且其中所述发射指示剂具有一个针对所述抑制剂的双分子抑制率常数kq和一个或多个大于最低寿命τOL的荧光寿命τo；把所述敏感元件暴露于一个角频率ω下的第一激励信号，借此使所述敏感元件发射一个与分析物浓度有关的信号或一些具有一个与分析物浓度有关的参数的信号，该参数作为分析物浓度的函数而变化；探测所述(诸)发射信号并提供(诸)探测信号；单变地处理至少一个所述诸探测信号以得出该与浓度有关的参数，借此测定在所述介质中所述分析物的浓度，其中所述敏感元件和/或所述激励信号这样配置，以便提供一种工作条件，其中对于感兴趣的工作范围之内的所有分析物浓度来说以及对于大于τOL的所有寿命τo来说，量{[(kq[Q])2＋ω2]τo2}均足够地大于量{1＋2kqτo[Q]}，以致该与浓度有关的参数和抑制剂浓度之间的关系的斜率与τo变化性无关，这里[Q]是所述母体中所述抑制剂的浓度。
3.一种用来测量在感兴趣的工作范围之内的一种分析物的浓度的仪器，该仪器包括一个敏感元件，它包括一种母体材料和一种发射指示剂，其中所述母体材料对于包含所述分析物或一种按已知的关系与所述分析物相关联的物质的一种抑制剂来说是可渗透的，百且其中所述发射指示剂具有一个针对所述抑制剂的双分子抑制率常数kq，一个或多个大于最低寿命τOL的荧光寿命τo，并且当在有抑制剂的情况下暴露于一个激励信号时，能发射一些具有一个与分析物浓度有关的参数的信号，该参数作为分析物浓度的函数而变化；一个耦合于该敏感元件，用来在一个或多个角频率ω下提供该激励信号的激励系统；一个耦合于该敏感元件，用来探测该(诸)与分析物浓度有关的信号并提供(诸)探测信号的探测器；一个处理器，该处理器包括一个用来储存描绘分析物浓度和该第一与浓度有关的参数之间的关系的校准信息的存储器，该处理器用来单变地处理该(诸)第一探测信号以得出该第一与浓度有关的参数，并作为该得出的与浓度有关的参数和该储存的校准信息的函数，提供代表分析物浓度的(诸)输出信号；而且其中该敏感元件和/或激励系统配置成使该仪器能足够地工作在该工作条件之中，其中对于感兴趣的工作范围之内的所有分析物浓度来说以及对于大于τOL的所有寿命τo来说，量{[(kq[Q])2＋ω2]τo2}均大于4倍的量{1＋2kqτo[Q]}，这里[Q]是所述母体中所述抑制剂的浓度。
4.一种用来测量在感兴趣的工作范围之内的一种分析物的浓度的仪器，该仪器包括一个敏感元件，它包括一种配置成暴露于一种抑制剂的发射指示剂，所述抑制剂包含所述分析物或一种按已知的关系与所述分析物相关联的物质，而且其中所述发射指示剂的特征在于一个针对所述抑制剂的双分子抑制率常数kq，一个或多个大于最低寿命τOL的荧光寿命τo，并且当在有抑制剂的情况下暴露于一个激励信号时，能发射一些具有一个与分析物浓度有关的参数的信号，该参数作为分析物浓度的函数而变化；一个耦合于该敏感元件，用来在一个或多个角频率ω下提供该激励信号的激励系统；一个耦合于该敏感元件，用来探测该(诸)与分析物浓度有关的信号并提供(诸)探测信号的探测器；一个处理器，该处理器包括一个用来储存描绘分析物浓度和该与浓度有关的参数之间的关系的校准信息的存储器，该处理器用来单变地处理该(诸)探测信号以得出该与浓度有关的参数，并作为该得出的与浓度有关的参数和该储存的校准信息的函数，提供代表分析物浓度的(诸)输出信号；而且其中该敏感元件和/或激励系统配置成使该仪器能足够地工作在该工作条件之中，其中对于感兴趣的工作范围之内的所有分析物浓度来说以及对于大于τOL的所有寿命τo来说，量{[(kq[Q])2＋ω2]τo2}均足够地大于量{1＋2kqτo[Q]}，以致该与浓度有关的参数和抑制剂浓度之间的关系的斜率与τo变化性无关，这里[Q]是所述敏感元件中所述抑制剂的浓度。
5.任何上述权利要求的该方法或仪器，其中该敏感元件和/或激励信号这样配置，以便提供一种工作条件，其中对于感兴趣的工作范围之内的所有分析物浓度来说以及对于大于τOL的所有寿命τo来说，量{[(kq[Q])2＋ω2]τo2}均大于6倍的量{1＋2kqτo[Q]}，而且其中所述敏感元件还包括一种对所述抑制剂是可渗透的母体。
6.任何上述权利要求的该方法或仪器，其中该敏感元件和/或激励信号这样配置，以便提供一种工作条件，其中对于感兴趣的工作范围之内的所有分析物浓度来说以及对于大于τOL的寿命τo来说，量{[(kq[Q])2＋ω2]τo2}均大于10倍的量{1＋2kqτo[Q]}。
7.任何上述权利要求的该方法或仪器，其中所述激励信号的该频率提供一种工作条件，其中对于感兴趣的工作范围之内的所有分析物浓度来说以及对于大于τOL的所有寿命τo来说，量ωτo均大于4，而且其中所述分析物和所述抑制剂是氧气。
8.任何上述权利要求的该方法或仪器，其中所述激励信号的该频率提供一种工作条件，其中对于感兴趣的工作范围之内的所有分析物浓度来说以及对于大于τOL的所有寿命τo来说，量ωτo均大于6，而且其中所述敏感元件还包括一种对所述抑制剂是可渗透的母体。
9.任何上述权利要求的该方法或仪器，其中所述激励信号的该频率提供一种工作条件，其中对于感兴趣的工作范围之内的所有分析物浓度来说以及对于大于τOL的所有寿命τo来说，量ωτo均大于10。
10.任何上述权利要求的该方法或仪器，其中该敏感元件配置成提供一种工作条件，其中对于感兴趣的工作范围之内的所有分析物浓度来说以及对于大于τOL的所有寿命τo来说，量kqτo[Q]均大于10。
11.任何上述权利要求的该方法或仪器，其中该敏感元件配置成提供一种工作条件，其中对于感兴趣的工作范围之内的所有分析物浓度来说以及对于大于τOL的所有寿命τo来说，量kqτo[Q]均大于15，其中所述敏感元件还包括一种对所述抑制剂是可渗透的母体，而且其中所述分析物从氧气、离子化氢和二氧化碳中选取。
12.任何上述权利要求的该方法或仪器，其中该敏感元件配置成提供一种工作条件，其中对于感兴趣的工作范围之内的所有分析物浓度来说以及对于大于τOL的所有寿命τo来说，量kqτo[Q]均大于20，而且其中所述分析物和所述抑制剂是氧气。
13.任何上述权利要求的该方法或仪器，其中所述激励信号具有恒定的角频率ω1而所述敏感元件发射诸与分析物浓度有关的信号，这些信号相对于所述激励信号相位移了△θ1并解调了一个解调因数m1，而且其中所述处理器单变地处理所述诸探测信号，以得出所述发射信号与所述激励信号之间的相位移。
14.任何上述权利要求的该方法或仪器，其中所述可渗透母体包含一种聚合物，而且其中所述分析物和所述抑制剂是氧气。
15.任何上述权利要求的该方法或仪器，其中所述激励信号由一个光源产生，该光源从发光二极管、激光二极管、倍频激光二极管及固态光源中选取。
16.任何上述权利要求的该方法或仪器，其中所述发射指示物包括至少两种单体组分，其中所述单体组分中至少一种是单体指示剂组分，而且其中所述敏感元件，当暴露于所述激励信号时，提供一个来自未反应第一受激态的第一发射信号和一个来自在所述敏感元件中由所述单体组分产生的第二受激态综合体的第二发射信号，而且其中所述第一和/或第二发射信号被单变地处理，以测定所述分析物的浓度。
17.任何上述权利要求的该方法或仪器，其中所述敏感元件配置成工作在一个动脉导管的在线回路之中。
18.任何上述权利要求的该方法，该方法还包括步骤把所述(诸)探测信号与一个描述该监测参数和分析物浓度之间关系的校准曲线相比较。
19.任何上述权利要求的该方法或仪器，其中所述与浓度有关的参数是提供一个恒定的相位移或解调因数所需要的该调制频率。
20.任何上述权利要求的该方法或仪器，其中所述分析物从氧气、离子化氢和二氧化碳中选取。
21.任何上述权利要求的该仪器，其中所述处理器包括描绘分析物浓度和所述与分析物浓度有关的诸信号之一与所述激励信号间的相位移之间的关系的储存信息，单变地处理该(诸)探测信号以得出所述相位移，并作为所述储存信息和所述得出相位移的函数，提供代表分析物浓度的(诸)输出信号。
22.任何上述权利要求的该仪器，其中所述处理器包括描绘分析物浓度和该第一与分析物浓度有关的信号与该第二与分析物有关的信号间的相位移差之间的关系的储存信息，单变地处理该(诸)探测信号以得出所述相位移差，并作为所述储存信息和所述得出相位移差的函数，提供代表分析物浓度的(诸)输出信号。
全文摘要
本发明涉及一种用来测量一种分析物的浓度的检测仪器和方法。该检测仪器包括一个敏感元件，此敏感元件包括至少一种第一发射指示物，该发射指示物的特征在于一个双分子抑制率常数k
文档编号A61B5/145GK1133088SQ9419373
公开日1996年10月9日 申请日期1994年8月18日 优先权日1993年10月14日
发明者詹姆斯·G·本特森 申请人:明尼苏达州采矿制造公司