针对寄生虫的保护性抗原的制作方法

专利名称：针对寄生虫的保护性抗原的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体探针及其在检测和纯化来自寄生虫和细菌的许多保护性和诊断性抗原中的应用。特别是本发明涉及鉴定和纯化普通奥斯脱(线虫)、游行毛圆线虫和肝片形吸虫等寄生虫中的抗原，制备含有上述抗原的疫苗以及将这些抗原应用于诊断分析中。
在以前的技术中人们已付出了大量努力来产生疫苗以便控制包括家畜在内的动物所遭受的寄生性的、细菌性的和其它类型的感染；然而，在最近五年内最终几乎未曾取得进展，尽管在真核生物和原核生物中大量产生外源产物的相关技术取得了飞速进展。例如，对动物的重要病原体感染中的保护性抗原的鉴定仍然是疫苗生产中的主要障碍。
在澳大利亚专利No.640364(本文引用其全部说明书以供参考中描述了一种用来制备与病原体相关的抗原的方法，这种方法包括在认为病原体最易受到攻击期间的病原体发育阶段获取病原体样品、抗体探针含有至少一种抗病原体抗体、用抗体探针探测病原体样品和分离检测的抗原。
尽管这种方法在本领域中提供了有意义的进展，但研究局限于少数寄生虫性和细菌性感染。如果这种方法能够成功地应用于其它感染并进一步用来鉴定保护性抗原，那将是本领域内意义重大的进步。
普通奥斯脱(Osfertagia Circumcincfa)是一种寄生于羊皱胃(第四胃)的肠道寄生性线虫。O.circumcincfa最近已被重新分类定为Teladorsagia circumcincfa，尽管后一名称还不太常用，皱胃中成熟寄生虫产生的卵随感染的羊的粪便排放到牧场上。
孵化后，幼虫在牧场上发育至第三阶段(L3)。L3幼虫被吃草的羊咽下并在皱胃中进一步发育。L4阶段的发育在皱胃小囊中进行，发育可能减慢或被控制，这依赖于羊的免疫状态，也依赖于季节。在春季发育成能产生成熟卵的成虫之前，幼虫可以在整个冬天在皱胃小囊中处于休眠状态。寄生虫数目的突然同步增长会导致明显的羊病态。由于粘膜上的晚期幼虫和成虫的摄食而造成的组织损伤会引起血清渗漏和皱胃内膜肥大，随后干扰皱胃的功能并导致动物的生长不良。相关的寄生虫O.ostertagii在牛中引起相似的病理症状。
尽管奥斯脱属的种类是造成澳大利亚和其它国家的牛、羊工业大量经济损失的重要原因，但背景技术还没有形成成功的疫苗来抵抗这种寄生虫。
肝片吸虫(Fasciola hepafica)肝吸虫是一种属于吸虫科的寄生虫，它能感染大量的野生和家养动物种类并且在牛羊工业中具有特别的经济重要性。在研究的种类中，大鼠是唯一能对重新感染产生强大免疫力的宿主(参见Haroun，ETM和GV.Hillyer，Vet Parasifol2063-93，1986)。因此大鼠免疫系统有力识别的抗原在疫苗生产方案中具有特别重要意义并在本申请中进行了描述。澳大利亚专利640364描述了一种针对肝片吸虫感染的保护性抗原，它具有大约120至125千道尔顿的分子量。这种抗原能在牛羊中有区别地被识别，与本申请所述的抗原完全不同。
毛圆线虫属寄生虫的感染发生于羊小肠的前3～4米部位并导致羊毛减产、生长减慢、不健壮以及腹泻。严重感染会导致死亡。它也是一种具有经济意义的疾病，但在背景技术中也没有形成成功的疫苗来抵抗这种寄生虫。
因此，本发明的目的是为了克服或至少减轻与背景技术有关的一种或多种困难和缺陷。
因此，首先，本发明提供了一种抗普通奥斯脱或相关感染的推定的保护性抗原或其片段，选自下文所述的具有近似分子量范围为26～36和95～105千道尔顿的抗原。此抗原也可能出现于寄生虫的其它种类或品系中。
26～36kD的普通奥斯脱抗原范围，可以包括在32～36位置的骈联体抗原。这种骈联体抗原可能是一种类似植物凝血素的结合β-半乳糖苷的蛋白质。该32～36kD骈联体抗原可以包含一个或多个如下肽段序列1)SAHGPPGQ2)FpHGPSYQHGYA3)IVTHPNR在26～36kD的普通奥斯脱抗原区域的低带部位含有与原肌球蛋白和谷胱甘肽S-转移酶(glutathionine S-transferase)同源的蛋白质。
普通奥斯脱的序列与下列序列同源(A)原肌球蛋白的1.N-末端序列MKAEEVRQALK2.中间序列VEADLERAEERAEAAGENKVVVL
(B)与谷胱甘肽S-转移酶同源的是N-末端序列VQYKLYYFDGRXAAEV本发明另一优选的方面是提供了一种抗游行毛圆线虫或相关感染的推定的保护性抗原或其片段，它具有如下文所述的32-35千道尔顿的近似分子量。该保护性抗原可以是骈联体。
游行毛圆线虫抗原在SDS-PAGE电泳中与上述普通奥斯脱骈联体抗原处于相同位置，因此，有可能它们是基本相似但具有种特异性抗原决定基的分子，这些抗原决定基最强地被同源的上清抗体探针所识别。
本发明更进一步的方面是提供了一种抗肝片形吸虫或相关感染的推定的保护性抗原或其片段，选自具有近似分子量范围为28kD、32kD、37kD、42～100kD、54至55kD和大于200kD的抗原，这正如上文所述。类似的抗原可以出现在其它吸虫属物种，如大片形吸虫和其它寄生吸虫如血吸虫中。
大于200kD的肝片吸虫抗原可以是一种骈联体抗原。肝片吸虫抗原只能专一地被来自免疫、攻击的大鼠肠系膜淋巴结(MLN)细胞的上清所识别。
32kD抗原可以包含如下N-末端肽链序列KPNYKRQFEPFS-DELIHYINLE。
54～55kD抗原可以包含如下N-末端肽序列LEDNGRTH-WAVLVA。
要明白的是，重组蛋白抗原可以用来替代从寄生虫中提取的天然抗原。
在疫苗和诊断检测中含有保护性抗原决定基的抗原片段和人工合成的含保护性抗原决定基的多肽可以用来替代整个天然的或重组分子。
该抗原可以出现在寄生虫的其它种类中，因此在指定的病原体引起疾病之外的其它疾病的接种和诊断中也起作用。
还要明白的是，产生的抗这些抗原的抗体也可用于诊断试验或用作单克隆或多克隆的免疫预防试剂。
根据发明的保护性抗原可以使用上述澳大利亚专利640364中所描述的方法来生产。因此本发明的另一个方面提供了一种制备与选自上文所述的片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属的种类及其相近种的病原体相联系的抗原的方法，该方法包括提供选自片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属种类和其相近种的病原体的样品；包含至少一种抗各自病原体的抗体的相应的抗体探针，其生产方法包括用选自片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属种类及其相近种的一种病原体或病原体提取物攻击免疫动物一段短时间后从免疫动物中制备一种生物样品；从该生物样品中分离细胞；在适当的培养基中体外培养细胞以及收获所说的细胞产生的抗体；用相应的抗体探针探测病原体样品以便检测出至少一种抗原；分离被检测的抗原。
因此，病原体样品优选一种寄生虫、寄生虫提取物或其寄生虫切片。奥斯脱属病原体可以是普通奥斯脱(线虫)或奥氏奥斯脱。毛圆线虫属病原体可以是游行毛圆线虫或Trichostronylus axei。片形吸虫属种类可以是肝片形吸虫或大片形吸虫。
在一个优选的方面，病原体样品可以在被认为是最易受到攻击的发育阶段提取。
据认为，病原体样品取样的时间是重要的，因为寄生虫仅在进入宿主后的短时间内是脆弱的，在此之后它可以改变结构并不再易受免疫攻击且可能不再表达保护性抗原。
例如，在病原体肝片形吸虫、普通奥斯脱和游行毛圆线虫的例子中，在幼虫阶段取样可能是合适的。
从中提取生物样品的动物可以是任何合适的类型。从中提取生物样品的动物可以是免疫动物。生物样品可以是在用病原体感染攻击免疫动物后短时间内取样。该动物可以是诸如羊或牛的动物。
动物的生物样品可以是任何合适的类型。该生物样品可以来自动物组织、器官、血液、淋巴或淋巴结、它也可以从感染动物的任何部位提取。然而，优选的样品取自感染的位点或者在某些疾病可能形成的病灶区域或者接近或通过该感染的位点或病灶区域如淋巴结。优选样品可以从肝淋巴结、皱胃淋巴结、或肠系膜淋巴结中提取。血清/血浆样品不适于作为生物样品。已发现，在血清/血浆样品中发现的大部分抗体要么与病原体的保护或特异性诊断无关，要么与病原体无关。
与此相反，本发明使用的探针高度富含病原体特异性抗体，并能选来限对保护性免疫特别重要的病原体阶段。
从生物样品中分离的细胞可包括B细胞。细胞可在包括分泌和或生产抗体期间的时间同样地进行分离。作为选择，该细胞可包括记忆细胞，它可在某些疾病的后期产生。
因此，细胞优选在体内刺激后的短时间内提取，优选在其后约2至13天内，例如导致形成抗体的细胞体内诱导的相关寄生阶段，这些形成抗体的细胞经体外培养后会将特异性的抗体分泌到培养基中。不经过预先体内刺激休眠淋巴细胞就没有或几乎没有抗体分泌到培养基中。
经过向培养基中加入辅助因子(helper facfor)可以增强培养基中刚激活的B细胞的体外抗体分泌。辅助因子可以是单独使用或结合使用的细胞因子，包括白细胞介素1、2、3、4、5、6、7和8、集群激活因子、干扰素和任何其它表明对B细胞的特异性抗体分泌具有增强效应的因子。
生产抗体探针的方法可以包括激活被分离出来进行繁殖并且分泌和/或释放抗体的细胞的进一步步骤。
细胞激活步骤可以包括在培养基内加入一种细胞激活剂。细胞激活剂可以是来源于寄生虫的或者选自是白细胞产生的分裂素和辅助因子，或是其人工合成的等价物或其组合。
分裂素可以选自来源于商陆(Phytolacca americana)的产物也称作商陆分裂素(PWM)、phorbolmyrisfic acid(PMA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、多聚腺苷酸-多聚尿苷酸(poly(A-u))、纯化的蛋白提取物、多聚肌苷酸多聚胞井酸(poly(I-c))、脂多糖(LPS)、葡萄球菌或其产物、Bacfo-sfrepfolysin O reagenf(SLO)、葡萄球菌噬菌体溶胞产物(SPL)、Epsfein-Barr病毒(EBV)、Nocardia水溶分裂素(NWEM)、植物血细胞凝体素(pHA)、伴刀豆球蛋白A(ConA)和硫酸葡聚糖及其混合物。细胞繁殖剂可以是任何间接或直接导致B细胞繁殖和或抗体分泌的试剂如固相抗免疫球蛋白。辅助因子可以是包括白细胞介素1、2、3、4、5、6、7和8、集群激活因子、干扰素的细胞因子和任何其它在单独或与其它因子或试剂结合加入时显示对B细胞繁殖和/或抗体分泌具有增强效应的辅助因子。这并不意味着已列完了所有包括辅助因子的分裂素和细胞激活试剂。
细胞的体外培养可以是在有或没有预先分离细胞亚群的情况下进行。可通过收集培养基上清来收获抗体。该上清含有体外培养的这些细胞分泌的抗体也含有人工从B细胞释放的(如经过B细胞溶胞)抗体。已惊奇地发现，含有抗体的上清可直接用来检验病原体的抗原。
在一个优选的方面中，病原体样品可以与标准缓冲液混合并放置在诸如SDS-聚丙烯酰胺凝胶的标准支持物上以分离其中所含的蛋白。然后分离的蛋白质可以转移动硝化纤维素、尼龙膜或其它膜上。
如上所述产生的相应的抗体探针可以简单地以从培养基收获的上清形式使用。作为选择抗体或被分离和纯化。
培养基中所含的抗体可被用来纯化抗原。可使用亲和纯化，优选免疫亲和纯化。
如上所述确定的抗原可利用任何合适的分析技术来检测。
因此，抗体探测步骤可进一步包括将由此产生的产物用于检测分析。
检测分析可包括Western印迹技术。检测分析也可以是免疫沉淀分析、放射免疫分析、酶联免疫分析或者免疫荧光分析。
因此，抗原可经过包含如下步骤的方法来纯化制备粗制抗原混合物和针对选自片形吸虫、奥斯脱和毛圆线虫及其相近种的病原体的固定在合适支持物上的抗体；利用被固定的抗体将粗制抗原混合物进行亲和层析；分离由此纯化的抗原。
利用传统方法可从上述培养上清探针中获取抗体。例如可使用常用来从血清或血浆中纯化免疫球蛋白的方法，如硫酸铵沉淀、辛酸分级分离、离子交换层析、或经结合并从固定的G蛋白或A蛋白中洗脱。
然后，如此获得的抗体可偶联到合适的支持物上，如CNBr-活化的Sepharose 4B(Pharmacia)、AAi-凝胶(Bio-Rad)或其它能结合蛋白质的亲和层析支持物。
固定的抗体可用来从复杂的寄生虫提取物中经亲和层析对特异性抗原进行分级分离和纯化。抗原与固定的抗体结合后，用诸如含有1.5M NaCl的缓冲液可将未结合的大分子种类从固体支持物中洗去。随后，用诸如低pH或高pH值的缓冲液或含离液序列高的离子，如0.5～3.0M硫氰酸钠的缓冲液可将该抗原从亲和柱中洗脱下来。
分离或确定的抗原用于单克隆抗体的制备。
因此，本发明进而提供了一种用来生产抗上述病原体抗原的单克隆抗体的方法，该方法包括(1)提供一种能产生抗所说保护性抗原或其片段的抗体的B细胞，并且该细胞从用针对上述病原体的保护性抗原免疫过的动物中获取；一种骨髓瘤细胞；(2)将B细胞与骨髓瘤细胞融合；(3)繁殖由此形成的杂交瘤细胞(4)收获由所说的杂交瘤细胞产生的抗体。
单克隆抗体可形成上述疾病的被动治疗的基础。
该抗原优选肝片形吸虫抗原。
由此形成的单克隆抗体可选自由下文所述的FY4-7-12、FY3-3-1、FY3-3-2、FY3-5、FY4-7-6和FY1-6组成的组中。
在鉴定抗原后，可使用分子生物学技术或化学技术(如克隆技术)来生产大量的该抗原作为选择人工合成的对应于鉴定抗原的不同片段的多肽可用作生产疫菌的工具。
因此，本发明的一个优选的方面是，它提供了一种制备针对选自片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属种类和其相近种的病原体的合成的抗原性多肽，该方法包括(1)提供一种来源于选自片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属种类及其相近种病原体的样品的cDNA文库或基因组文库；一种相应的抗体探针，该探针包括至少一种抗各自病原体的，以包括提供一种用选自片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属种类及其相近种的病原体或病原体提取物攻击感染免疫动物之后短时间内从免疫动物中提取的生物样品，或者一种由此而来的相应的单克隆抗体、或者一种在注射纯化抗原后产生的多克隆或单克隆抗体的方法生产的抗体；(2)从cDNA文库或基因组文库产生合成的多肽；(3)用抗体探针探测合成的多肽；(4)分离由此检测的合成的抗原多肽。
可使用cDNA文库或基因组文库。cDNA或基因组文库可组装成适当的表达载体，该载体能在原核宿主(如细菌)或真核宿主(如哺乳动物细胞)中转录并随后表达DNA克隆。用于筛选文库的探针优选选自(i)以上述已鉴定并纯化的抗原的氨基酸序列为基础的合成寡聚核苷酸探针；(ii)从合成的寡聚核苷酸探针产生的PCR产物；(iii)以来自已鉴定的抗原的氨基酸序列资料的合成多肽为基础的抗体；(iv)从上述生产的培养基中获得的抗体；
(v)产生的抗上述鉴定和纯化的抗原的单克隆或多克隆抗体；(vi)对该抗原具有特异性的重组或人工合成的单克隆抗体或多肽，例如在Ward ef al 1989，Nafure 241，第544至546中所描述的。
cDNA文库优选来源于普通奥斯脱的样品；相应的抗体探针是产生的抗32～36kD骈联体抗原的单克隆抗体。
还有一个方面是提供了一种上述制备的人工合成的抗原多肽。
人工合成的抗原多肽可选自克隆3～2和5-2b，它具有如下氨基酸序列M.A.FETNYP IPYRSKLTEP FEPGQTLTVK GKTGEDSVRF TINLHNSSADFSGNDVPLHV SVRFDEGKIV CNSFAKGEWGKEERKSNPYKKGDDIDIRIRAHDSKFQIFV DQKELKEYEH RLPLSSITHF SIDGDVLITH IHWGGKYYPVPYESGLAGEG LSPGKSLYLY GMPEKKGKRF HINILKKNGD IALHFNPRFDEKAWRNSLI SNEWGNEERE GKMPFEKAVG FDLEIKNEDY PFQIMVNGERFASYSHRLEP HELNGLQIGG DVEITGIQLH这正如下文所描述的。
因此，本发明的另一方面是，它提供了针对选自片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属种类及其相近种的病原体的被推定的保护性抗原，制备它的方法包括提供一种选自片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属种类及其相近种的的病原体样品；(2)一种抗体探针，该探针包括至少一种以上述方法产生的抗选自奥斯脱属和毛圆线虫属种类及其相近种的病原体的抗体；用相应的抗体探针探测病原体样品；分离检测到的保护性抗原。
保护性抗原可作为如下所讨论的疫苗和或诊断试剂。
本发明的另一方面是提供了一种抗针对选自片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属种类及其相近种病原体的保护性抗原或其片段的单克隆或多克隆抗体。
另一方面本发明提供了抗针对片形吸虫种类及其相近种的上文所述的保护性抗原或其片段的单克隆或多克隆抗体。
另一方面本发明提供了一种防止由选自片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属种类及其相近种的病原体所引起的动物感染的方法，该方法包括给动物服用有效剂量的至少一种上述保护性抗原。
保护性抗原优选来自本文所述的肝片形吸虫或游行毛圆线虫的抗原。
本发明的另一方面是提供了一种治疗由选自片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属种类及其相近种引起的动物感染的方法，该方法包括给动物服用治疗上有效量的抗上述保护性抗原的单克隆或多克隆抗体。
本发明还提供了一种疫苗或兽药组合物，它包括上述预防上有效量的至少一种针对选自片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属种类及其相近种的病原体的抗原。疫苗组合物优选包含多种针对许多病原体的保护性抗原。
本发明还提供了一种疫苗或兽药组合物，它包括治疗上有效量的至少一种抗上述保护性抗原的单克隆或多克隆抗体。该疫苗组合物优选含有多种单克隆或多克隆抗体。
在优选的形式，通过单一处理给动物提供多重保护。
根据本发明的疫苗或兽药组合物可经口服用药也可径非肠道用药(如肌肉注射、皮下注射、皮内注射和静脉内注射)。
所需剂量将随着活性成分的抗原性而变化，且所需的量仅足以诱导对存在疫苗的曲型免疫应答。
反应性实验容易形成所需的剂量。疫苗或兽药组合物的典型初始剂量可以是大约0.001～1毫克活性组分/千克体重。根据需要可提高剂量频率或者使用多重剂量以便提供满意的保护水平。
根据本发明的疫苗或兽药组合物还可包括兽药上可接受的载体，稀释剂或其赋形剂。活性成分优选悬浮或溶解于载体中。载体可以是任何对动物无毒且与活性组分相配伍的固体或溶剂。合适的载体包括液体载体，如生理盐水或其它等于或接近生理浓度的无毒盐，和固体载体，如滑石(falc)或蔗糖。如果需要的话，可加入佐剂(如Freund完全的或不完全的佐剂)或免疫调节剂(如细胞因子)以增加抗原的抗原性。当通过支气管用药时，疫苗应适于以气溶胶的形式提供。
根据本发明的疫苗或兽药组合物可掺入到活性载体中(如牛痘病毒、沙门氏菌)或以DNA或RNA形式药，正如Tang et al.，Nafure356152，1992中所述。
本发明还有一个方面是提供了一种含有针对上述鉴定和纯化的病原体的诊断性抗原及其片段的诊断分析试剂盒。
该诊断试剂盒可用于检测由选自普通奥斯脱、肝片形吸虫、游行毛圆线虫或其相近寄生虫的病原体所引起的动物感染。
诊断分析试剂盒的使用可接合诊断分析。诊断分析可包括West-ern印迹技术，也可以是诊断性免疫分析。免疫分析可以是免疫沉淀分析、放射免疫分析、酶联免疫分析、免疫荧光分析或者化学发光分析。
参考下面的实施例，本发明会得到更全面的描述。然而应明白的是下面的描述仅是解释性的，不应以任何方式理解为对上述发明普通性的限制。
在附图中

图1a普通奥斯脱用以实验免疫的Suffolk小羊中的淋巴(稀释1/1000)探测普通奥斯脱L3幼虫提取物的SDS-PAGE(12.5％凝胶)和Western)印迹分析。检测到了两簇具有表观分子量为26～36kD和95～105kD的免疫反应种类。用以攻击感染过的绵羊的皱胃淋巴结培养物上清也鉴定到了同样范围的种类。
图1b至1e通过斑点免疫分析用抗-骈联体mAb或羊血清进行的克隆反应将取自各克隆平板的IPTG滤纸切成碎片并与抗体反应。用结合抗小鼠IgM＋IgG或抗绵羊IgG的碱性磷酸酶进行检测。滤纸与如下物质进行反应抗-骈联体mAb(图1b)、阴性对照的IgM mAb(图1c)、用纯化的骈联体抗原产生的羊血清(图1d)、阴性对照羊血清(图1e)。所示的克隆是7-1、7-2、5-2b(2个分离物)、3-2、8-2(2个不同的稀释度)或阴性对照斑。图1f用从克隆中亲和纯化的抗体探测普通奥斯脱L3提取物的West-em印迹L3幼虫的液体提取物样品在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后电印迹。与如下物质进行Western印迹反应从斑点免疫分析中洗脱的亲和纯化抗体、mAb、羊血清或来自重复感染免疫的羊的皱胃淋巴，并用结合抗小鼠IgM＋IgG或抗羊IgG的碱性磷酸酶进行检测反应。泳道1阴性对照mAb；2抗骈联体mAb，从3洗脱的亲和纯化抗体克隆7-1；4克隆7-2；5和6克隆5-2b(2种分离物)；7克隆3-2；8克隆8-2；9阴性对照斑；10苯抗骈联体血清；11阴性对照血清；12免疫羊的淋巴；M预先标记的分子量标记物(Biorad)。骈联体的位置用箭头指示。图1g克隆3-2和5-2b的核苷酸序列及其预测的氨基酸序列氨基酸以三字母代码形式表示。图1h普通奥斯脱克隆3-2和5-2b预测的氨基酸序列与旋盘属丝虫和C.elegans的GBP的序列对比。
利用ANGIS从数据库中把GBP的氨基酸序列调出来(旋盘属丝虫来自GenPep数据库，登记号UO 4046-1，C.elegans来自PIR数据库，登记号S27798)。氨基酸以单字母代码表示。图1i证实骈联体抗原是类似植物凝血素的GBP用缓冲液提取普通奥斯脱L3幼虫，样品通过asialofetuin-Af-figel 15柱。洗涤后，用100mM乳糖洗脱结合的蛋白质。泳道M分子量标记；1L3提取物；2来自柱的分级分离的最后冲洗液。3-7乳糖洗脱的馏分(fraction)。骈联体抗原的位置用箭头标示。(12.5％SDS-PAGE，考马斯兰染色)。图1j和1k
重组抗原在大肠杆菌中的表达图1j和1kCTAB可溶性内含体在13％凝胶中电泳，然后电印迹。一半Western印迹与抗骈联体mAb进行反应并用结合抗鼠IgG＋IgM(图1j)的碱性磷酸酶检测，另一半与纯化骈联体的羊抗血清反应并用结合抗羊IgG(图1k)的碱性磷酸酶检测。泳道1克隆7-1；2克隆7-2；3克隆3-2，4克隆8-2；5克隆5-2b，6pMOSELOX对照。图2a-2c普通奥斯脱(线虫)三次不同试验中感染L3幼虫后接种过的羊(·-·)和对照羊(。-。)的每克粪便平均卵数(epg)。图2d在第三次奥斯脱属接种试验中用捻转血矛进行异源感染后对照羊和接种过的羊的平均粪便卵数。图3游行毛圆线虫用感染了游行毛圆线虫的羊MLN上清探测三种L3线虫幼虫抗原的Western印迹。泳道1Bio-Rad预染的分子量标记；泳道2普通奥斯脱L3抗原；泳道3捻转血矛L3抗原；泳道4游行毛圆线虫L3抗原。括号＝游行毛圆线虫的抗原。图4肝片形吸虫用200Mc口服攻击预先受过感染并已治愈的大鼠7天后分别用来自肝淋巴结(1)、肠系膜淋巴结(2)和脾(3)的上清探测NEF吸虫抗原的Western印迹。泳道4Bio-Rad预染的分子量标记。箭头表示仅被MLN上清识别的大于200kD的抗原位置。图5肝片形吸虫用经400Mc攻击感染的二次免疫并治愈的大鼠肝淋巴结(5)、肠系膜淋巴结(6)和脾(7)上清探测NEJ抗原的Western印迹。泳道4Bio-Rad预染的分子量标记箭头表示仅被MLN上清识别的抗原的位置。图6a-6d肝片形吸虫用抗羊MHC II类(阴性对照)×40的mcAb38.27(图6a)对NEJ吸虫的间接过氧化物酶免疫染色。用mcAb FY3-5和FY1-6、mcAb FY3-3-2，×40(图6b)，mcAb FY3-3-2，×100(图6c)和mcAb FY3-3-1，×100(图6d)观察到类似的阴性染色。注意将图6b和6c中的高度网状型染色与图6d中的更限定的斑点型染色进行比较。箭头指向NEJ吸虫的口吸盘。
实施例1普通奥斯脱寄生虫和实验动物普通奥斯脱的第三阶段幼虫(L3)从实验感染寄生虫的供体羊粪便培养物中收集。用普通奥斯脱幼虫重复感染羊并随后监测粪便中虫卵的排放情况来获得免疫动物。当攻击感染剂量在粪便中很少或不产生虫卵时，我们就说该动物已被免疫。羊一旦被免疫，就要灌用IVERMECTIN，之后要间隔至少四周方能用60000L3幼虫攻击感染，攻击后五至八天处死动物。培养上清的制备按上述澳大利亚专利No.640364的描述取出皱胃淋巴结(ALN)并制备细胞悬液。在DME＋10％胎牛血清中以0.5～1.0×107个细胞/毫升的浓度在培养瓶中建立10～50ml的批量培养物。初始实验表明培养上清的大多数抗体是由体内刺激的淋巴结中的抗体分泌细胞产生，并且用商陆分裂素(PWM)刺激不再增加其分泌量。因此PWM没有加到后续培养物中，在含5％CO2的空气中37℃下培养细胞五天后收获培养上清，然后在-20℃下储存直至使用。皱胃淋巴结的插管和淋巴的收集如上所述让羊(Suffolk羊)转变成免疫状态，用60000 L3幼虫攻击感染，攻击后第四天给皱胃总淋巴导管插管。插管几天后收集淋巴，将无细胞的淋巴储存于-20℃备用。供SDS-PAGE和Western印迹使用的抗原制备在含有约0.5％NaHOCl的富含CO2的空气中37℃下处理普通奥斯脱的第三阶段幼虫20分钟以除去其第二阶段的鞘。然后反复冲洗幼虫，并在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)pH7.4中3000g离心1 0分钟。第六次冲洗后，将它们转移到含有200U/ml青霉素和0.2μg/ml链霉素的500ml DME培养基(pH6.8)中，并在含20％CO2空气中39℃下培养3天。将培养液在20℃下以3000g离心15分钟，将沉淀的体外转变的L4幼虫贮于-70℃。
通过冷冻解冻三次。然后用多用匀浆器(Kinematica GmbH，瑞士)匀浆，在50mM Tris-HCl pH 8.0、150mM NaCl中过夜提取，并在50,000xg下离心30分钟从去鞘的L3幼虫、体外变成的L4幼虫、体内的L4幼虫和成虫中提取抗原。含已溶解抗原的上清在-70℃下保存。
提取的抗原在非还原条件下在12.5％(W/V)SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并Western印迹到PVDF膜(Immobilon，Millipore)或硝化纤维膜上。用于接种试验的抗原制备。
在富含CO2的空气中37℃下处理普通奥斯脱第三阶段幼虫2至3小时以除去其第二阶段鞘。去鞘的L3幼虫冷冻解冻三次，然后用基底玻璃匀浆器匀浆，接着在含有2％(W/V)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，Sigma)的150mM NaCl、50mM Tris pH8.0的溶液中过夜提取。在300g下离心30分钟以除去其它物质。再将上清在15，000xg下离心30分钟，将溶解的提取物贮存于-20℃。
已提取的抗原在非还原条件下(没有煮沸)在10％CTAB-丙烯酰胺凝胶上电泳。Western印迹凝胶两端的2条带并将这些带与阳性淋巴反应来鉴定凝胶的合适区域。将相应于免疫反应区域的凝胶区切下、捣碎并在2％CTAB溶液中培养过夜以被动洗脱抗原。用Dowex树脂在2M尿素pH10中培养15分钟以除去CTAB，然后在PBS中透析过夜以除去尿素。在Centriprep浓缩器(Amicon)中浓缩抗原，用BCA分析法(Pierce)确定蛋白质浓度并用于免疫羊。当在SDS-PAGE凝胶上电泳时该抗原制品表明含有26～36kD的免疫反应区段。抗原鉴定用从感染的羊的ALN体外培养上清和从插管皱胃淋巴结中收集的淋巴来检测Western印迹过的抗原制品。培养上清和淋巴都集中显示分子量为26～36kD和95～105kD的两区段(见图1)。
印迹的抗原与植物凝血素连接物的培养表明该抗原能结合一些植物凝血素。这表明一些抗原是糖基化的。用Western印迹鉴定26～36kD抗原的蛋白质序列用SDS-PAGE分离蛋白质并接着用CAPS缓冲液电转移到ProBlott测序膜上后，测定该区段内抗原的N-末端氨基酸序列。用考马斯亮蓝染色确定转移蛋白质在膜上的位置并将其切下。在装有印迹胶片的Applied Biosystems 476A蛋白质测序仪中测定其序列。经过用澳化氰消化CTAB纯化的抗原，用SDS-PAGE分离其片段，印迹到ProBlot上并测序(如上)获取进一步的中间序列资料。蛋白质测序结果归纳如下。位于26～36kD区段的上端部分的两条带没有给出任何序列并假定其N-末端被封闭。32～36kD区段的上端两条带进一步称为“骈联体(doublet)”，因为产生的抗该区段的单克隆抗体同时识别这两条带(见图1f)，这表明它们是相似的分子。
使用FASTA程序，在澳大利亚国家基因组信息服务中心可得到的序列数据库中筛选26-36kD区段下端带获得的序列。结果如下所示。根据它们与数据库中的序列有高度同源性的特征可鉴定其中的两个分子。同源序列是原肌球蛋白和谷胱甘肽S-转移酶。
普通奥斯脱序列与它们的同源情况是(A)与原肌球蛋白1.N-末端序列MKAEEVRQALK2.中间序列VEADLERAEERAEAAGENKVVVL(B)与谷胱甘肽S-转移酶
N-末端VQYKLYYFDGRXAAEV为了获知含有骈联体带的区段序列，制备了匀浆的普通奥斯脱第3阶段幼虫的含水提取物，并在还原条件下经SDS-PAGE分离提取物中的蛋白质。从考马斯亮蓝染色的凝胶上切下骈联体带，然后经电洗脱从切下的胶段上摆取蛋白质。分离的蛋白质用胰蛋白酶消化，因此产生的多肽经高效反向液相色谱(HPLC)分离。利用Ed-man降解法在Applied Biosystems 476A蛋白质测序仪中测序纯化的多肽。确定了如下多肽序列1)SAHGPPGQ2)FpHGPSYQHGYA3)IVTHPNR编码骈联体抗原的cDNA克隆文库制备从新鲜收获的L3幼虫中提取RNA，该幼虫已在液氮中骤然冷冻过(Chomczynski 80 Sacchi，1987，Anal.Biochem.，162，156-159)。在mAP纸(Amershan Australian)上用寡聚dT亲和层析分离信使RNA(mRNA)使用cDNA Synthesis System Plus盒(AmershamAustralian)用带有寡聚dT或者随机引物的2μg mRNA制备双链互补DNA(cDNA)。汇集寡聚dT和随机引物产生的cDNA并加入EcoR1连接物(cDNA快速连接物连接元件，Amersham Australia)，将衔接的cDNA连接到EcoR1剪切的、脱磷酸化的噬菌表达载体λMOSELOX臂(Amersham Australia)上并用λ-DNA体外包装元件(AmershamAastralia)将其包装上。获得了一个1.4×106噬菌斑形成单位(pfu)/ml的初始文库，其中9％以上是重组体。该文库在使用前在大肠杆菌ER1647细胞中扩增。文库筛选5×105pfu的扩增的cDNA文库以5×104pfu/板涂布于大肠杆菌BL21(DE3)pLys E细胞上。当针刺大小的噬菌斑出现(在37℃培养4-6小时)后，在平板上铺上硝化纤维素滤纸(该滤纸应已用10mM异丙基硫代-β-半乳糖(IPTG)浸泡过)并在37℃下再培养6小时。然后平板在4℃下保存过夜。从平板上取出滤纸，在TNT(10mM tris-HCl，pH8，150mM NaCl，0.05％Tween 20)中冲洗，在BLOTTO(5％W/V低脂肪奶粉的TNT)中封闭，并与产生的抗骈联体抗原的IgM小鼠单克隆抗体(mAb)(未释稀的培养上清于室温下培养2小时。在TNT中洗过后，将滤纸与结合有免抗-小鼠IgG＋IgM(Jackson Immunoresearch)的以15000在BLOTTO中稀释的碱性磷酸酶在室温培养1小时。再次在TNT中洗过后，用0.165mg/ml的5-澳-3-氯-4-碘磷酸盐(BCIP)和0.33mg/ml的氮蓝四唑(NBT)在碱性磷酸酶缓冲液(0.1M tris-HCl，pH9.5，0.1MNaCl，5mM MgCl2)中显色。选出了15个被推定的阳性噬菌斑(其中一些是很不明显的)，再用如上所述的单克隆抗体重新筛选之后5个噬菌斑仍呈阳性。这些噬菌斑经第三次筛选后，涂布在ER1647细胞上以制备其扩增的种子。克隆分析为了确定克隆对骈联体抗原的特异性，进行了噬菌斑免疫分析。噬菌斑纯化的克隆在BL21(DE3)pLys E大肠杆菌细胞上涂布并如上所述用IPTG滤纸诱导。然后滤纸与如下物质反应抗骈联体mAb、无关IgM小鼠mAb、在羊中产生的用于抗纯化的骈联体抗原的羊抗血清或者阴性对照羊血清(两种羊血清都在BLOTTO中以1∶50稀释，第二抗体是结合了以1∶5000稀释的来自Jackson Immunore-search的免抗羊IgG的碱性磷酸酶。如上所述检测阳性反应。所有克隆都对抗-骈联体mAb呈阳性，而对无关mAb和阴性羊血清呈阴性。两个克隆(命名为3-2和5-2b)对羊产生的抗骈联体血清呈强烈阳性(图1b～1e)。
以每80mM平板2000噬菌斑将克隆，或入MOSELOX对照噬菌斑涂布开来以达到汇合融菌。一旦针刺噬菌斑出现，就加入IPTG滤纸并继续培养过夜。用TNT充分冲洗滤纸，在BLOTTO中封闭1小时，并用抗骈联体羊抗血清(BLOTTO中1∶50稀释)室温培养4小时。(在使用前，将该血清与来自含野生型入MOSELOX噬菌斑的平板的滤纸一起培养以除尽其中的抗一大肠杆菌抗体)。然后在TNT中将滤纸洗五次，在硼酸洗涤缓冲液(0.1M硼酸、0.5M NaCl、0.05％Tween 20，pH8)中洗一次并在PBS(140mM NaCl、2.7mM KCl、8mM Na2HPO4、0.0015mM KH2PO4)中洗一次。将每张滤纸在5ml0.1M甘油、0.15M NaCl，pH2.6的溶液中洗脱一分钟以洗脱下对各克隆特异性的已结合的亲和纯化抗体，立即加到含300μl 1Mfris-HCl，pH8溶液的试管中进行中和。在4℃下将该抗体在TNT中透析1至2小时，加入低脂防奶粉以达到5％W/V并储存于-20℃。L3幼虫液体提取物在12.5％变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用电印迹法将蛋白质转移到Immobilon膜(Millipore)上。将膜在TNT中冲洗，在BLOTTO中封闭并切成条块。将条块与如下物质一起于4℃过夜培养来自克隆的亲和纯化抗体、抗骈联体的mAb或阴性对照mAb、或者羊抗骈联体抗血清或阴性对照羊血清。用结合抗一种类抗体的碱性磷酸酶进行检测，随后用BCIP和NBT显色。在对羊抗-骈联体抗血清呈阳性的2个克隆(即3-2和5-2b)中亲和纯化的抗体在Western印迹特异性地识别来自普通奥斯脱幼虫的骈联体带。
按照载体制造商的建议(Amersham Australia)在存在羧苄青霉素的条件下将克隆涂布于大肠杆菌BM25.8细胞上使其转为质粒形式(在pMOSELOX中)。按照《Molecular cloning，A Laboratory Manual，第二版》(Sambrook，J.，Fritsch，E.F. & Maniatis，T.，1989，ColdSpring Harbor Laboratory Press)中所述的碱性溶菌和CsCl密度梯度离心制备质粒DNA。用EcoRl消化质粒DNA，并在含有50μg/ml溴化乙锭的TAE缓冲液(40mM fris-乙酸，pH8，1mM EDTA)中于1％琼脂糖凝胶上分析质粒DNA。克隆3-2含有大约为1000，400和200个碱基对的三个EcoR1片段，而克隆5-2b含有1000和400碱基对的两个片段。DNA测序使用测序酶试剂盒根据制造商的说明书(United Sfafes Biochemi-cal Corporafion)以双脱氧法进行DNA测序。测序反应在α-35S-dATP存在的条件下进行并对凝胶进行放射自显影。起初使用以插入片段两边的载体为基础的引物(T7基团10和SP6引物)。随后用来测序整段插入序列的引物根据所获的序列来设计。除了克隆3-2含有一个相当长的3非翻译区(包括mRNA的poly(A)尾巴)外，克隆3-2和5-2b含有相同的DNA序列。该DNA序列及其预测的氨基酸序列在图1g中显示。预测的氨基酸序列用来通过BLAST程序(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，1W.Myers，E.W.80 Lipman，D.J.，1990，J.Mol.Biol.215，403-410)对综合蛋白质数据库进行搜寻，该搜寻以ANGIS作为界面在国家生物技术信息中心的计算机上进行。发现该序列与来自Caenorhabditis elegans和旋盘属丝虫的32kD类植物凝血素β-半乳糖苷-结合蛋白质(GBP)具有高度同源性。普通奥斯脱序列与C.elegans序列有69％相同并与旋盘属丝虫序列有78％相同。氨基酸序列的对比如图1h所示。通过与这些同源序列的类比，两个克隆都含有起始序列ATG。该骈联体是一种类植物凝血素β-半乳糖苷结合蛋白质的证据骈联体抗原与C.elegans 32k GBP所共有的特征包括在SDS-PAGE上的大小、缺乏糖基化和封闭的N-末端(见Hirabayashi，J.，Satoh，M.和Kasai，K.，1992，J.Biol.Chem.267，15485-15490)。C.elegans GBP的一个特征是它能够通过结合到asialofetuin柱上而被亲和纯化(Hirabayashi，J.，Satoh，m.，Ohyama，Y.& Kasai，K.，1992，J.Biochem.Tokyo 111，553-555)在含水缓冲液(150mM NaCl、2mM EDTA、50mM tris-HCl，pH8)中提取普通奥斯脱的L3幼虫，将提取物用于过asialofefuin-af-figel 15柱用含有100mM乳糖的上述缓冲液洗脱结合的蛋白质。SDS-PAGE分析表明该骈联体结合到asialofefuin柱上(图表1i)。这证实该骈联体确实是一种类植物凝血素β-半乳糖苷结合蛋白质。由于骈联体的两条带都结合到糖柱上，因此，它们都是类植物凝血素GBP。还不知道为什么该GBP在普通奥斯脱中显示两条带而在C.el-egans中只显示一条带。也许普通奥斯脱的蛋白质经历了某种程度的翻译后裂解。
线虫中的这些GBP的功能还不清楚，但是对C.elegans而言，据推测，它们涉及形态发生的调节，如表皮的形成。重组抗原的表达使用D.Hanahan的简单转化方法〔在《DNA克隆实用方法》第一卷，1985(D.M.Glover编辑)，IRL出版社，牛津，第115页〕将来自克隆或pMOSELIX对照的质粒DNA转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysE细胞中。有必要将该质粒从BM25.8转移到该菌株上，因为重组抗原在T7启动子控制下表达而且BL21(DE3)pLysE细胞是在Lac启动子控制下携带编码T7聚合酶的基因。挑选菌落并在37℃生长过夜。将过夜培养物以1∶100稀释，取10ml培养物接种并生长5小时。加入IPTG到0.1mM以诱导重组蛋白质的合成并继续培养过夜。将大肠杆菌细胞沉淀在含有0.1％Triton x-100的PBS中重新悬浮并用声处理将其击碎。沉淀不溶性物质(包括内含体)并在1％CTAB中用声处理重新悬浮。样品用SDS-PAGE和Western印迹进行分析(图1j和1k)。用抗骈联体mAb或用抗骈联体抗原的羊抗血清检测在Western印迹中呈阳性的克隆3-2和5-2b产生的融合蛋白质。与此相反，克隆7-1、7-2和8-2产生的融合蛋白质对骈联体mAb呈阳性但对羊抗血清不呈阳性，这证实了前面所述的斑点免疫分析的结果(图1b～1e)。pMOSELOX对照蛋白质不与两种抗体反应。所有重组融合蛋白质和pMOSELOX对照蛋白质都全部定位于CTAB-溶融的细胞沉淀中，这表明它们在内含体中表达。接种试验用含有26～36kD免疫反应性区段的天然普通奥斯脱抗原的CTAB提取物进行了三个接种试验。
接种过的羊免疫三次，每次间隔2至3周，每次免疫使用50～100μg蛋白质(在quil A中)。对照羊只接受quil A。所有免疫都以皮内给药。在最后一次免疫2至3周后用20,000L3幼虫攻击感染所有的羊并监测其粪便虫卵数。三个不同的接种试验的结果如图2a～2c所示，与对照相比，接种组的粪便虫卵数明显减少。
第一个试验由5只接种羊和3只对照羊组成。第二个试验有10只接种羊和8只对照羊。第三个试验由7只接种羊和7只对照羊组成。物种的交叉反应当用以普通奥斯脱26～36kD抗原接种的羊的血清检测时，在奥氏奥斯脱抗原制品中也鉴定到了一个26～36kD抗原区段(未显示)。这表明相似的抗原也存在于该物种中，也可能存在于其它线虫种类中。
用粗制可溶性捻转血矛的L3提取物在第三次奥斯脱接种试验的最后进行了周围血液淋巴细胞增生试验。与对照羊(平均值为6122cpm)相比，在接种羊(平均值为24003cpm)中观察到了由捻转血矛抗原引起的极显著(p＜0.02)的刺激，这表明在26～36kD抗原区段两种寄生虫间存在交叉反应。为了评估交叉保护，第三试验中的所有羊都喂用ivermecfin以去除残留的奥斯脱虫，并用10,000捻转血矛幼虫感染。如图2d中所示，与对照组相比，接种的羊的粪便虫卵数始终较低，这表明发生了交叉保护。因为对照组的粪便虫卵数存在很大差异，日虫卵数得不到统计显著性，但是两组间的方差(F-检验)存在显著差异。这两个结果表明在血矛属和奥斯脱属的物种间存在显著的异源性刺激和保护，也可能存在类似的保护性分子。95～105kD抗原的特征制备的抗澳大利亚专利640,364所述的捻转血矛的60～90kD表面抗原的特异性抗血清也与同样95～105kD区段的普通奥斯脱L3幼虫抽提物发生反应。这表明它是一种与捻转血矛中所述的类似的抗原。
实施例2游行毛圆线虫实验设计经过用游行毛圆线虫感染几次来免疫羊然后保持至少4个月不受感染。用50,000游行毛圆线虫L3幼虫攻击感染，10天后将羊杀死并取下第一肠系膜淋巴结(MLN)。按对普通奥斯脱所述的方法加工和培养淋巴结细胞，其上清用来探测寄生虫抗原的Western印迹。如前面对普通奥斯脱所述的方法制备普通奥斯脱、捻转血矛和游行毛圆线虫的L3幼虫抗原提取物。
提取的抗原在还原条件下于12.5％(W/V)SDS-PAGE上电泳并Western印迹到PVDE膜(Immobilon，Millipore)上。用MLN-上清探测Western印迹并用结合抗一羊Ig(DAKO)的过氧化物酶显色。结果和讨论观察到了与分子量为32～35kD间孤游行毛圆线虫抗原提取物的强烈反应，显然它由骈联体构成(图3)。与普通奥斯脱和捻转血矛抗原没有或只有较弱反应。然而，在SDS-PAGE上，游行毛圆线虫骈联体抗原与上述普通奥斯脱抗原具有相同的位置，因此有可能两者是基本相似的分子但具有能最强地被同源上清抗体探针识别的种特异性的抗原决定基。
实施例3肝片形吸虫我们已经使用Western印迹技术用按澳大利亚专利No.640364所述方法获取的抗体探针鉴定了推定的肝片形吸虫保护性抗原。类似的抗原也可存在于其它片形吸虫属种类(如大片形吸虫)和其它寄生线虫(如Schistosoma spp.)中。
寄生虫和抗原提取从Ciba-Geigy(N.S.W.，澳大利亚)获取肝片形吸虫后囊蚴虫(Mc)。通过如前所述的体外脱囊法(澳大利亚专利No.640364)获取刚脱囊的幼虫(NEJ)。口服感染17天后从小鼠肝中回收幼年肝吸虫。不同阶段的吸虫在含有蛋白酶抑制剂的PBS中声处理，在SDS非还原性样品缓冲液中煮沸，然后在10％SDS-PAGE凝胶上电泳并转移到PVDF膜(immobilon-P Millipore，MA)上以供进行如前所述的Western印迹(专利号640364)。培养上清的制备基本上如前所述(专利号640364)，以每毫升培养基(含有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100μ/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2.5×10-52—巯基乙醇的DME培养基)3×106个细胞体外培养脾、肝淋巴结(HLN)和肠系膜淋巴结(MLN)细胞培养4至5天后收获上清并贮存于—20℃直至使用。实施设计用100肝片形吸虫Mc感染8至9周龄的PVC大鼠，10天后用杀吸虫剂Fasinex 120(Ciba-Geigy)以75μg/克剂量处理。6周后用200Mc经口服攻击感染大鼠，攻击7-10天后杀死大鼠以收集HLN、MLN和脾细胞。结果当不存在“爆发性”感染(即用杀吸虫剂完全治愈和根除初始感染)时，第二次攻击感染后不同淋巴器官之间的局部抗体反应存在显著差异。当脾或HLN上清用来探测NEJ抗原的Western印迹时没有观察到反应，然而一个明显的抗原骈联体被来自MLN细胞的上清所识别。该抗原位于110kD分子量标记之上(图4)，并在随后的实验中(未显示)见到它迁移到200kD分子量标记之上，进而称为大于200kD的抗原。
当检测到“爆发性”感染的信号时(即肝脏肉芽瘤或胆导管中的成虫吸虫)，用HLN上清观察到了一种NEJ抗原识别的多变而复杂的类型，但是第二次攻击感染之后大于200kD抗原又仅仅而且唯一地只被MLN细胞上清识别(未显示)。
以缺乏肉眼可见的肝小管和在捣碎的全部肝脏制品中完全缺乏幼年吸虫判定所有大鼠都对口服攻击感染产生免疫。
当用17日龄肝吸虫抗原与跟上述相同的MLN上清在Western印迹上进行反应时，没有观察到这种大于200kD骈联体反应(未显示)，这表明该抗原对NEJ阶段具有特异性。结论已经发现在非还原SDS-PAGE凝胶上分子量大于200kD的骈联体抗原，该抗原存在于NEJ阶段并且能在给免疫大鼠口服攻击感染后的早期次级应答期间被MLN细胞培养上清专一性地识别。由于在大鼠中形成的抗口服攻击感染的免疫已表明发生于消化道水平(查阅Vet.Parasitol.1986，20，63～93)，因此该抗原是一种很有希望的候选疫苗。大于200kD的抗原似乎对NEJ吸虫具有阶段特异性，因为在相似条件下在从肝组织收集到的吸虫中没有检测到该抗原，因此它可能只对NEJ阶段有效。
实施例4肝片形吸虫以实施例2中报道的方式进行寄生虫和抗原提取以及培养上清的制备。实验设计用50个肝片形吸虫Mc口服感染8至9周龄的PVC大鼠，14天后用150μg Triclabendazole/克将其治愈。3天后再次用150个Mc口服感染，4天后跟上次那样将其治愈。第一次感染1-2个月后经口服攻击感染用400Me大鼠，7天后将其杀死以收集HLN、MLN和脾细胞。单克隆抗体(mcAb)的产生如上面那样对大鼠进行免疫和攻击感染，并在攻击感染5天后将其杀死。制备MLN细胞悬液，并与由英国牛津MRC Cellubr Im-munology Unit提供的Y3大鼠骨髓瘤细胞融合。针对NEJ和17日肝阶段抗原在Western印迹上筛选融合上清。以鼠胸腺细胞作为饲养细胞将阳性融合体重新克隆至少二次。利用mcAb的表面染色用含有0.05％迭氮化钠的mcAb上清液在冰上培养体外脱皮的NEJ30分钟。在冷的PBS-迭氮化合物中洗涤三次，然后象前面那样用结合了兔抗-大鼠免疫球蛋白(DAKO-Denmark)并且以1∶20在PBS中稀释的过氧化物酶进行培养。在PBS中洗三次，之后用Di-amino联苯胺底物显色数分钟，再稀释以中止显色。在PBS中再洗两次后，NEJ在含有1％甲醛和2％葡萄糖的PBS中固定并在光学显微镜下评价其染色情况。结果实施例3的结论部分所述的大于200kD的抗原也出现在免疫过两次的大鼠的MLN上清液中。另外，这种高度免疫的MLN上清液也识别约32kD的抗原和分子量的在42kD和100kD之间的弥散性抗原(图5)。这两种额外的抗原也仅能在NEJ抗原的印迹上检测到而在17日龄肝阶段抗原的印迹上检测不到。单克隆抗体(mcAb)从二次免疫和攻击感染后的MLN细胞的融合体中获得了一些单克隆抗体。其中的三个mcAb(F.h.1-3)似乎识别用MLN上清液检测到的三种抗原。从感染的大鼠肝淋巴结中产生了一个mcAb(FY 1-6)并且该mcAb识别也被NEJ和肝阶段吸虫的感染血清所强烈识别的抗原。所有产生的mcAb和它们各自的分子量抗原都归纳在表1中。
后继实验(未显示)表明mcAb FY4-7-12、FY3-3-1和FY3-3-2还与感染未处理过的小鼠2天后(而不是4天)收集的腹腔吸虫发生反应。
ND＝未做过*＝在活NEJ上进行表面染色的检测当与活NEJ反应时，2个mcAb(FY3-3-1和FY3-3-2)与NEJ吸虫的表面发生反应，且各自具有独特的染色表现(图6)。生化特征将2-巯基乙醇(终浓度为5％V/V)加到NEJ蛋白质提取物中以检测被mcAb识别的分子的还原敏感性。还原后抗原F.h.2有显著的上移现象，这表明该抗原含有许多二硫键。还原后被mcAb FY3-3-2识别的顶部带在凝胶上下移而抗原F.h.6未移动。
为了确定该mcAb是否识别碳水化合物抗原决定基，将NEJ抗原提取物的SDS-PAGE凝胶印迹到PVDF膜上并且按Woodward，MP等(J.Immunol.Methods，78143，1985)所述方法用高磺酸进行处理。高碘酸处理后mcAbFY3-3-2和FY1-6的反应性分别丧失或者剧烈降低，这表明这些mcAb与碳水化合物抗原决定基发生反应。印迹的高碘酸处理没有改变mcAbFY3-3-1和FY4-7的反应性。mcAbFY3-3-2对碳水化合物抗原决定基的识别解释了它在Western印迹上的弥散识别方式，因为碳水化合物抗原决定基存在于许多糖蛋白中。氨基酸序列资料NFJ抗原制品在SDS-PAGE上电泳，印迹到ProBlot膜(AppliedBiosystems)上并用考马斯亮蓝染色。相应于抗原号F.h.2和F.h.6的位置的带被切下来并直接在ABI型476A蛋白质测序仪中测序。获得的N-末端序列是F.h.6LEDNGRTHWAVLVAF.h.2KPNYKRQFEPFSDELIHYINLEF.h.2的序列与孟氏血吸虫的组织蛋白酶B(Sm31)mRNA〔Mol.Biochem.Parasitol.33113-122(1989)〕在14个氨基酸的重叠区有64.3％是相同的。
对于F.h.6没有发现有明显的同源性。结论本发明包括了那些被免疫攻击感染的大鼠的MLN上清所识别的抗原和所有在表1中所述的抗原及其各自的抗体。因为在大鼠中针对口服攻击感染而形成的免疫性表明出现在抗早期吸虫阶段的消化道和腹腔水平上(查阅Vet.Parasitol.1986，2063～93)，所以这些抗原是候选疫苗。其中四种抗原对NEJ和2日龄吸虫表现出具有阶段专一性，因为在类似的条件(Western印迹)下在感染的晚期收集的吸虫中检测不到它们，因此它们可能参与保护作用。阶段专一性抗原以前在肝片吸虫中没有鉴定出来，而且仅仅在本发明中通过使用分泌新抗体的细胞探针才被检测出来。
最后，要明白的是，在没有背离本文概括的本发明实质的情况下可进行各种其它的修饰和/或改变。
权利要求
1.一种抗普通奥斯脱线虫或有关感染的推定的保护性抗原或其片段，选自具有前文所述的近似分子量范围为26～36和95～105千道尔顿的抗原。
2.根据权利要求1的推定的保护性抗原，其中26～36kD抗原包括在32～36kD位置上的骈联体抗原。
3.根据权利要求2的推定的保护性抗原，其中骈联体抗原是类植物凝血素β-半乳糖苷结合蛋白质，并且可包含下列多肽序列中的一个或多个SAHGPPGQFPHGPSYQHGYAIVTHPNR
4.根据权利要求1的推定的保护性抗原，其中在26～36kD范围的抗原与普通奥斯脱含有N-末端序列MKAEEVRQALK和中间序列VEADLERAEERAEAAGEN-KVVVL的原肌球蛋白同源。
5.根据权利要求1的推定的保护性抗原，其中26～36kD范围的抗原是普通奥斯脱中的含有N-末端序列VQYKLYYFDGRX-AAEV的谷胱甘肽S-转移酶的同源物。
6.一种抗游行毛圆线虫或有关感染的推定的保护性抗原或其片段，具有前文所述的32-35千道尔顿的近似分子量。
7.根据权利要求6的推定的保护性抗原，其中该抗原是骈联体抗原。
8.一种选自前文所述的具有近似分子量为28千道尔顿、32千道尔顿、37千道尔顿、42至100千道尔顿、54至55千道尔顿和大于200千道尔顿的抗原的抗肝片形吸虫或其相关感染的推定的保护性抗原或其片段。
9.根据权利要求8的推定的保护性抗原，其中大于200kD的抗原是骈联体抗原。
10.根据权利要求8的推定的保护性抗原，其中32kD抗原包括N-末端序列KPNYKRQFEPFSDELIHYINLE。
11.根据权利要求8的推定的保护性抗原，其中54～55kD抗原含有N-末端肽序列LEDNGRTHWAVLVA。
12.根据权利要求8的推断的保护性抗原，其中肝片吸虫抗原专一性地被免疫、攻击感染的大鼠肠系膜淋巴结(MLN)细胞上清识别。
13.根据权利要求1至12任意一项的，与选自片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属的种类及其相近物种病原体相联系的抗原的制备方法，该方法包括(1)提供一种选自片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属种类及其相近物种的病原体样品；一种相应的抗体探针，包括至少一种抗各自病原体的抗体，其生产方法包括提供一种用选自片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属的种类及其相近物种的病原体或病原体提取物攻击感染免疫动物后短时间内从免疫动物中提取的生物样品，从生物样品中分离细胞，在合适的培养基中体外培养细胞并且收获所说的细胞产生的抗体；(2)用相应的抗体探针探测病原体样品以检测出至少一种抗原；(3)分离被检测的抗原。
14.根据权利要求13的方法，其中病原体样品是在其最易受攻击的发育阶段提取的。
15.根据权利要求14的方法，其中样品是在幼虫阶段提取的。
16.根据权利要求13的方法，其中相应的抗体探针以从培养基中收获的上清形式存在。
17.根据权利要求16的方法，其中上清是来自免疫攻击感染的大鼠的肠系膜淋巴结(MLN)细胞。
18.一种生产抗根据权利要求1至12中任何一个的，选自片形吸早属、奥斯脱属和毛圆线虫属物种病原体的抗原的单克隆抗体的方法，该方法包括(1)提供一种从用针对上述病原体的保护性抗原免疫的动物中获得的并且能产生抗所说的保护性抗原或其片段的抗体的B细胞；一种骨髓瘤细胞；(2)将骨髓瘤细胞与B细胞融合；(3)繁殖由此形成的杂交瘤；(4)收获所说的杂交瘤产生的抗体。
19.根据权利要求18的方法，其中抗原是肝片形吸虫抗原。
20.一种抗根据权利要求18或19的方法产生的保护性抗原的单克隆抗体。
21.一种抗前文所述的选自由FY 4-7-12、FY3-3、FY3-3-2、FY3-5、FY4-7-6和FY1-6组成的组中的肝片吸虫抗原的单克隆抗体。
22.一种针对根据权利要求1至12中任何一个的，选自片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属物种及其相近物种的病原体的人工合成的抗原性多肽的制备方法，该方法包括(1)提供一种从选自片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属物种及其相近物种病原体的样品产生的cDNA文库或基因组文库；一种相应的抗体探针，它含有至少一种由如下方法产生的抗各自病原体的抗体，该方法包括提供一种用选自片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属物种及相近物种的病原体或病原体提取物攻击感染免疫动物后短时间内从免疫动物中制备的生物样品，或者一种由此而得的相应单克隆抗体，或者一种注射纯化抗原后产生的多克隆或单克隆抗体；(2)由cDNA文库或基因组文库产生人工合成的多肽；(3)用抗体探针探测合成的多肽；，(4)分离由此检测到的合成多肽。
23.根据权利要求22的方法，其中cDNA文库是源于普通奥斯脱样品，相应的抗体探针是产生的抗32～36kD骈联体抗原的单克隆抗体。
24.一种用根据权利要求22或23的方法生产的人工合成的抗原多肽。
25.具有如下文所述的如下氨基酸序列的合成抗原多肽、克隆3-2和5-2bM.A.FETNYP IPYRSKLTEP FEPGQTLTVK GKTGEDSVRF TINLHNSSADFSGNDVPLHV SVRFDEGKIV CNSFAKGEWGKEERKSNPYK KGDDIDIRIRAHDSKFQIFV DQKELKEYEH RLPLSSITHF SIDGDVLITH IHWGGKYYPVPYESGLAGEG LSPGKSLYLY GMPEKKGKRF HINILKKNGD IALHFNPRFDEKAWRNSLI SNEWGNEERE GKMPFEKAVG FDLEIKNEDY PFQIMVNGERFASYSHRLEP HELNGLQIGG DVEITGIQLH
26.一种含有权利要求1至12中任意一个的诊断性抗原或其片段的诊断试剂盒。
27.一种预防动物疾病的方法，该方法包括给动物服用预防有效量的至少一种根据权利要求1至12中任意一个的保护性抗原。
28.一种治疗动物疾病的方法，该方法包括给动物服用治疗有效量的根据权利要求20或21的抗保护性抗原的单克隆抗体。
29.一种疫苗或兽药组合物，包括预防有效量的至少一种保护性抗原，该保护性抗原是根据权利要求1至12中任意一个的针对至少一种选自片形吸虫属、奥斯脱属和毛圆线虫属的病原体的抗原。
30.根据权利要求29的疫苗或兽药组合物，包括针对多种病原体的复合保护性抗原。
31.一种疫苗或兽药组合物包括治疗有效量的至少一种根据权利要求20或21的单克隆抗体。
32.一种根据权利要求31的疫苗或兽药组合物，包括多种单克隆抗体。
33.参考任一实施例的基本上如上文所述的一种推断的保护性抗原，或单克隆抗体。
全文摘要
针对选自由普通奥斯脱线虫、游行毛圆线虫和肝片形吸虫组成的组中的感染或相关感染的推定的保护性抗原或其片段，作为抗原，它们选自具有近似分子量范围为26～36和91～105千道尔顿的抗原、具有近似分子量为32～35千道尔顿的抗原和具有近似分子量范围分别为28千道尔顿、32千道尔顿、37千道尔顿、42至100千道尔顿、54至55千道尔顿和大于200千道尔顿的抗原。
文档编号A61P33/00GK1132514SQ94193571
公开日1996年10月2日 申请日期1994年9月27日 优先权日1993年9月28日
发明者E·N·T·米森, J·瓦尔克, K·阿思曼, S·E·纽顿 申请人:墨尔本大学, 肉类研究公司