专利名称：防止内脏粘连或出血的羊膜移植物或覆盖物的制作方法
技术领域：
本发明归属于防止或减少损伤特别是外科损伤后粘连和防止内脏损伤后出血方面的领域。
粘连形成起因于很多医学情况或外科手术，包括盆腔炎、子宫内膜异位和其他盆腔或腹部炎症。这种外科手术及囊肿、肿瘤等都可导致粘连形成。粘连引起输卵管闭塞，干扰输卵管、卵巢功能，抑制排卵，继发不育症。粘连形成从损伤发展到浆膜面，渗出纤维蛋白原，形成纤维蛋白，导致盆腔组织器官的稠厚或薄膜的粘连带，互相固定。盆腔、腹腔粘连是女性不育的主要原因。
历年来，大量天然和合成移植物被用于减少损伤表面上的粘连形成，然而，仅仅有勉强成效。天然物质包括腹膜、网膜、脂肪和羊膜，以及羊膜加绒毛膜。过去使用合成材料，包括聚乙烯醇薄膜和钽箔，晚近，使用由明胶薄膜和明胶泡沫糊(Upjohn Co.，Kalamazoo，Michigan)组成的屏障，Surgicel(Johnson & Johnson，NewBrunswick，New Jersey)，和硅橡胶(Dow—corning，Midland，Michigan)以及Gore结构筛网((Gore—Tex，Gore，Texas)和多孔网眼(Johnson & Johnson，New Brunswick，New Jersey)等。较新的材料已导致更有希望的结果。
由于防止出血的手段和方法无效，引起肝、胰、脾、肾等内脏出血损伤导致死亡。
人羊膜用作外科辅助物已有较长历史。Trelford和Trelford—Sauder发表了一篇极好的综述。在很多实验动物模型以及病人身上，羊膜曾被试用于防止盆腔和腹腔粘连而未成功，用于输卵管手术及阴道重建术上有其广泛的经验。其他应用包括结膜缺损的修复、胆道重建，以及穿颅术后脑膜脑粘连的预防。然而，它对于人类的主要作用停留在烧伤、溃疡和其他皮肤损伤的领域及伤口愈合上。
在本发明之前，并无描述人羊膜在预防人腹腔内粘连上有潜能重大意义的文献存在，尽管通过大量合成剂的使用在这一领域已取得某些进步。Badaway等最近报告了羊膜腹内应用在大鼠模型上防止粘连。他们很少注意到在浆膜表面抑制粘连形成的作用，但在腹膜壁层上观察到稍好的结果。他们对不成功所作的解释涉及手术后器管静止和郁血的问题，这两方面均可在人手术后粘连形成上起作用。
没有实质性的文献描述用羊膜包裹内脏，对受损伤的内脏如肝、胰、脾、肾等在受伤后防止出血。
文献研究揭示，制备和贮存膜的不同方法几乎与病例或实验报告一样多。用戊二醛处理的膜得到很差的结果(未发表资料)，用乙醇预处理和烘箱干燥或仅在生理盐水中冷冻也得到同样不满意的经验。
提供从人胎盘而来的羊膜材料薄片，如膜片，将是很有益的，它成功地防止或减少损伤后(如外科创伤后)的内部粘连，促进愈合，并且不引起免疫反应。
用这种羊膜薄片(膜片)，提供对受伤出血内脏的包裹或覆盖将是很有益的，它成功地阻止出血。
本发明针对特殊制备的羊膜薄片或膜，它们的制备和使用方法，其使用成功地防止或减少因损伤(如对内脏的外科损伤)而引起的粘连，成功地防止出血，促进愈合，并且不引起免疫反应。
本发明的一个方面，提供适于防止或减少患者内脏粘连的移植物，它包含灭菌羊膜材料的薄片或膜，它们不含抗原部位，避免引起免疫反应，并且暴露基底膜，I、II、III型胶原，昆布氨酸，纤维结合素类和其他暴露的糖蛋白成分，它们促进所接触的受伤器官的愈合。
前述事项可通过以下步骤来完成去除从人胎盘所获得羊膜材料的细胞层，最好是胎儿侧的细胞层，暴露基底膜和I、II、III型胶原、昆布氨酸、纤维结合素类及羊膜材料的其他糖蛋白成分；与这些成分接触据信可促进伤口愈合。细胞层的去除还除去了可引起免疫反应的抗原部位。例如，按照本发明，除去细胞单层(以胰蛋白酶钠洗涤为佳)，然后灭菌(如r—辐射)，在预防和减少粘连上是成功的。这样制备的膜产生充分的新血管形成，不引起明显的炎症浸润。这也支持这些膜不引起明显免疫反应的结论，如同Badaway的研究中观察所见，在本发明中，可以用任何合适的方法除去细胞单层，但该法应完全地除去细胞单层。例如，应用胃蛋白酶等其他蛋白酶，而无花果蛋白酶是不能令人满意的，因为它只对蛋白质中不经常存在的半胱氨酸残基有特异性，因此不完全除去该细胞单层。除去了细胞层的羊膜还可用其他方法灭菌，如用也与其胶原交联的戊二醛进行化学灭菌。
膜薄且有异常的顺应性，使其极利于使用。膜在盆腔和腹腔中必须单层应用，以防止在膜本身内部纤维化形成。这种合成移植物虽不经缝合而被应用，但这些薄膜还可用细微缝合定位，或用液体抗粘连药如葡聚糖固定。与合成筛网相反，这些羊膜的使用还有一个技术优点是，它们能在不完全干的表面上应用和缝合。
因而，本发明的一个目的是提供不含抗原部位从而避免引起免疫反应，和具有暴露的基底膜、I、II、III型胶原、昆布氨酸、纤维结合素类和其他糖蛋白成分的灭菌羊膜材料移植物或覆盖物，在接触时促进伤口愈合。
本发明的另一个目的是提供细胞层被除去，暴露胶原，其他糖蛋白和基底膜的灭菌羊膜移植物或覆盖物，以促进伤口愈合，并除去可引起免疫反应的细胞层中的抗原部位。
本发明的再一个目的是为防止患者受伤后内脏粘连或出血而提供从人胎盘而来的，其细胞层被蛋白分解处理而除去的羊膜移植物或覆盖物。
本发明的再一个目的是提供羊膜胎儿侧上细胞单层被胰蛋白酶除去的这种移植物或覆盖物。
本发明的还有一个目的是提供这样一种移植物或覆盖物，其中细胞单层材料被除去的羊膜膜被r—辐射消毒与胶原交联。
本发明的进一步目的是提供防止患者因损伤而致内脏粘连或出血的移植物或覆盖物的制备方法，即除去羊膜胎儿侧的细胞物质，然后将膜灭菌。
本发明的更进一步目的是提供防止患者损伤后内脏粘连或出血的方法，包括将按本发明的羊膜材料的移植物施用于可能形成粘连或出血的患处表面。
其他和进一步的目的，特征和优点贯穿于说明书和权利要求书。
本发明的移植物包含人羊膜材料单层例如膜，它无抗原部位，避免免疫反应，并有暴露的基底膜、I、II、III型胶原，昆布氨酸、纤维结合素类及其他糖蛋白成分，它们促进接触到的损伤器官的愈合。较佳地是这样完成的将细胞层从膜上除去，暴露其促进伤口愈合的胶原和基底膜成分，并除去可引起免疫反应的抗原部位。较佳地，用有效除去细胞物质的蛋白酶来除去它，较佳地用胰蛋白酶，它作用于蛋白质的多部位(赖氨酸和精氨酸)，几乎所有蛋白质对胰蛋白酶的蛋白水解作用敏感。另一方面，无花果蛋白酶对较少出现在蛋白质中的半胱氨酸残基有特异性。其他蛋白酶对除去细胞层有效，如糜蛋白酶和胃蛋白酶。这样一种人体单层羊膜成功地防止或减少损伤(如外科损伤)后的粘连和出血。应用这些经处理的单层移植物已获得极好的结果。
制备这些按本发明所述的羊膜移植物的方法建议如下收取新鲜接生的人体胎盘，最好在剖腹产术时取下胎盘，用手工从绒毛膜上分离羊膜，从羊膜的胎儿侧除去细胞物质，例如将它们浸泡在胰蛋白酶溶液中，然后将羊膜的胶原灭菌，例如用r—辐射或化学品戊二醛来灭菌。
按本发明的防止内脏粘连和出血的方法包括将移植物单层薄片经缝合或不经缝合或通过使用液体抗粘连辅助物如葡聚糖而施用于创伤表面。有利的是，这些羊膜移植物和覆盖物可在不完全干燥的表面上施用和缝合。
实施例1材料和方法羊膜取自剖腹产术时取出的新鲜的人胎盘。将羊膜用手工从绒毛膜上分离，用蒸馏水洗涤。将干净的膜先在10％胰蛋白酶溶液中浸泡处理3小时。接着，按下面的方法用r—辐射将它们照射灭菌。首先，将整个膜以60,000拉德/小时辐射8小时20分钟，总剂量500,000拉德。然后将膜切成约2×2cm的小方块，以60,000拉德/小时辐射共33小时20分钟，相当于2,000,000拉德剂量。将这样制得的小方块在-70℃蒸馏水中冷冻，保存到使用(四周内)。在使用前，将膜于22℃融化。在此方法中不使用抗生素。
手术过程研究动物为经产雌性新西兰家兔，每只至少重3.5kg，以保证盆腔器官的大小合适。A组至C组每组分配6只家兔，D组为18只。手术时，用氯胺酮、丙嗪和二甲苯嗪组成的混合物按1cc/kg体重的剂量麻醉家兔。将腹部剃毛，作消毒准备并盖上手术巾。如前Badaway等所述，在手术显微镜下施用无菌显微外科技术。实验性损伤由从子宫角的浆膜层和肌层延伸到子宫内膜腔的一系列切割和粘膜的多处撕裂所组成。用微型剪刀造成1cm长、间隔5mm的切口。用每距7—Omaxon多针间断缝合，将大小约1×2cm的膜移植物以单层缝合到损伤部位上。将膜的母体侧对着伤口放置，胎儿侧面向腹腔。手术后，将腹腔作三层闭合，灭菌敷料保留在位72小时。全部动物手术后接受普鲁卡因青霉素，剂量50ml/kg，IM QOD×5，并喂养在27℃，湿度40—70％的与自然条件相似的环境下，给以Purina RabbitChow块料，任意饮水。
实验组的描述将动物随机分成3组，每组6只，第4组18只动物。每只家兔经受两次外科手术，首次剖腹术包括指定的手术过程，第二次探视剖腹术用于评估实验介入的效果。各组情况如下A组(n＝6)是背景对照组，该组腹部打开受到非特异性的损伤或处理，再关闭。B组(n＝6)是模型对照组，其中，如上所述的对照性损伤在每只动物的一个子宫角上进行，对照侧子宫角不受损伤，两侧子宫角上均不作治疗介入。C组(n＝6)是第一治疗组，其中，如B组一样在一侧子宫角上进行损伤，然后损伤和未损伤的子宫角上均用细缝线固定覆盖膜移植物。D组(n＝18)形成第二治疗组，其中两侧子宫角均以类似方式进行实验性损伤。然后一侧子宫角缝上膜，对照侧子宫角用间断的、能止血的7—0maxon间隔的细缝线处理。
首次剖腹术及外科干预后30天，每只动物再施行剖腹检查，将粘连照相，对它们的存在与否、包括的面积百分比及粘连性质的分级(薄、厚、薄膜状、稠密)进行评估。用Fisher’s Exact Test进行统计学分析，p＜0.05时认为有意义。
结果全部结果概括于表1。
表1实验性损伤后膜处理与未处理子宫角的结果对比组子宫角外科手术有粘连的粘连类型 受累表面动物数(％) 的百分比AR无 0n＝6 L无 0BR切割6(100)a 稠密·厚 75n＝6 L无 0CR切割＋膜0n＝6 L只用膜 1(17) 薄膜状·薄 10DR切割＋膜3(17)a薄膜状、薄 10n＝18L切割＋缝合 18(100) 稠密、厚 80a左右子宫角均为P＜0.05背景对照组A＋模型对照组B证实了模型的可靠性，即证明单单剖腹术无背景粘连，而实验性损伤若不处理则在100％的情况下引起稠密粘连。这些粘连包括表面粘连及导致受累子宫角严重弯曲的环—环(loop—to—loop)粘连。进一步观察到，这些粘连不跨越到受损的对侧子宫角(P＝0.002)。
实验组C显示损伤的子宫角与未损伤子宫角上均放置膜移植物部位的粘连形成无显著性差异(p＝0.5)。仅在未损伤子宫角上发现一例薄的膜状粘连，在损伤侧未见粘连。最后，在实验组D，与止血微细缝合部位所发现的相比，膜移植物显著地减少粘连的形成。在100％情况下，用缝合处理的子宫角上，观察到在损伤部位平均80％的表面积上有稠密的厚的粘连。相反，覆盖着膜移植物的受损子宫角仅17％(p＝0.0000003)显示有些粘连，这些粘连是薄的膜状的，并且仅覆盖损伤/移植区域的约10％。组织学研究表明，膜已与浆膜层整合，在移植物部位显示新生血管形成。浆膜表面存在最低限度的多形核白细胞浸润，提示无明显的免疫反应。
单层膜之薄及其异常的顺应性使其特别有利于使用。在盆腔和腹腔中单层应用是必须做到的，以防止在膜内部纤维化形成。而且，合成移植物不经缝合而使用，在上述实施例中，用细缝线将膜固定在位。在人体，这增加了伴随使用液体抗粘连辅助物如葡聚糖的可能性。使用这些羊膜还有一个显然与合成筛网相反的附加的技术优点，即它们可在不完全干的表面施用和缝合。
实施例2在本实施例中，用按实施例1所制备的和使用的这些膜预防腹膜粘连和改善广泛子宫内膜异位或附件盆腔粘连。
实施例3在本实施例中，除了分别用糜蛋白酶和胃蛋白酶代替胰蛋白酶外，羊膜膜的处理与实施例1中相同，取得满意的结果。
实施例4在本实施例中，除了在除去细胞层后用戊二醛处理来进行羊膜膜的灭菌外，羊膜膜的处理与实施例1和3相同，取得满意的结果。
实施例5在本实施例中，将羊膜膜薄片包裹或复盖在内脏(肝、胰、脾、肾)受伤和出血部位，最好是羊膜的暴露成分对着受伤部位，成功地防止了出血。如前面的实施例那样，将羊膜膜施用到位。如前所述，这些羊膜膜移植物和覆盖物可被施用和覆盖在湿的表面及干的表面上。
上述动物研究是防止或减少人类内脏粘连和出血的极好模型。此处所用的术语“患者”包括人和动物患者。
因此，本发明很适合于达到其目的，并且有上述特征和优点以及其他固有的特征和优点。
前面的较佳实施方案是为公开的目的而给出的，其中可进行改变，这些改变落在所附权利要求范围所定义的本发明的精神内。
权利要求
1.适于减少患者的受伤内脏粘连的移植物，其特征在于包含无抗原部位，具有暴露的基底膜和I、II、III型胶原、昆布氨酸、纤维结合素类和羊膜材料的其他糖蛋白成分，在接触时促进受伤器官愈合的从人胎盘而来的羊膜材料的灭菌薄片。
2.按权利要求1所述的移植物，其中羊膜材料薄片除去了细胞层，除去了抗原部位，暴露了羊膜材料的成分。
3.按权利要求2所述的移植物，其中已通过用胰蛋白酶处理除去细胞层。
4.按权利要求1所述的移植物，其中胶原是交联的。
5.按权利要求2所述的移植物，其中胶原是交联的。
6.按权利要求3所述的移植物，其中胶原是交联的。
7.按权利要求1所述的移植物，其中胶原是用0.25M—2.5M拉德的r—辐射交联的。
8.按权利要求2所述的移植物，其中胶原是用0.25M—2.5M拉德的r—辐射交联的。
9.按权利要求1所述的移植物，其中羊膜材料薄片是单层薄片。
10.按权利要求2所述的移植物，其中羊膜材料薄片是单层薄片。
11.按权利要求3所述的移植物，其中羊膜材料薄片是单层薄片。
12.按权利要求4所述的移植物，其中羊膜材料薄片是单层薄片。
13.按权利要求5所述的移植物，其中羊膜材料薄片是单层薄片。
14.按权利要求6所述的移植物，其中羊膜材料薄片是单层薄片。
15.适于减少受伤内脏粘连的移植物的制备方法，其特征在于从人胎盘羊膜除去细胞物质，从而暴露基底膜、I、II、III型胶原、昆布氨酸、纤维结合素类和羊膜材料的其他糖蛋白成份，它们在施用于受伤器官时促进愈合，还从而除去细胞物质上的抗原部位，以及将羊膜灭菌。
16.按权利要求15所述的方法，其中通过用胰蛋白酶处理除去细胞物质。
17.按权利要求15所述的方法，还包括将羊膜材料交联。
18.按权利要求16所述的方法，还包括将羊膜材料交联。
19.按权利要求16所述的方法，还包括用0.25M—2.5M拉德的r—辐射将羊膜材料灭菌和交联。
20.减少患者内脏损伤后粘连的方法，其特征在于将权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14的移植物施用于易受粘连形成的内脏表面。
21.减少患者内脏出血的方法，其特征在于用权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14的移植物至少复盖内脏的出血部位。
全文摘要
揭示一种特殊处理的羊膜薄片，如羊膜膜，它防止损伤(如外科损伤)后粘连及防止损伤引起的内脏出血。羊膜薄片已除去细胞单层，暴露基底膜、I、Ⅱ、Ⅲ型胶原、昆布氨酸、纤维结合素类和其他糖蛋白成分，它们促进伤口愈合，羊膜薄片也除去了细胞单层上的可引起免疫反应的抗原部位。该羊膜材料是灭菌的，并可交联。它以单层施用于粘连的创伤表面或包裹在出血内脏上，可缝合或辅以液体抗粘连辅助物。该移植物可施用于湿的及干的表面。
文档编号A61L33/00GK1115673SQ9510081
公开日1996年1月31日 申请日期1995年2月24日 优先权日1994年2月24日
发明者R·L·扬 申请人:研究发展基金会