专利名称：用于成象的锝-99m标记的肽的制作方法
发明的背景1.发明的领域本发明涉及放射性诊断试剂和肽，以及标记的放射性诊断剂的制备方法。更具体地说，本发明涉及肽、肽的制备方法和用于制备这类肽的试剂盒、以及使用这类肽使哺乳动物体内的各部位成象的方法，所说的哺乳动物体使用锝-99m(Tc-99m)通过放射性结合基团标记，所说的放射性键合基团与Tc-99m形成中性配合物。
2.现有技术的描述在核药物领域中，有时需要通过检测少量体内给药的放射性标记示踪化合物(称之为放射性指示剂或放射性药物)的分布来定位某些疾病症状或评估疾病症状的严重程度。用于检测这些放射性药物的方法通常被称之为成象方法或放射性成象方法。
在放射性成象中，放射性标记是发射γ射线的放射性核素，其中使用检测γ射线的照相机定位放射性指示剂(这种方法经常被称之为闪烁照相法)。成象部位之所以可检测是因为选择使用了可在病变部位定位的放射性指示剂(称为正反差法)或特定地选择使用了不能在病变部位定位(称为负反差法)的放射性指示剂。
必须考虑各种不同的因素以使人体放射性成象达到最佳化。为了使检测的效率达到最高，优选使用发射γ射线的能量为100至200keV的放射性核素。为了使病人获得最少量的放射性辐射，放射性核素的物理半衰期应短至仅能满足成象过程之所需。为了能够在每天及在每天的任何一个时间进行病理检查，优选在诊所地点始终有一个可获得的放射性核素源。
各种已知的放射性核素包括67Ga、99mTc(Tc-99m)、111In、123I、125I和169Yb都可用于放射性成象。其中Tc-99m是优选的放射性核素，因为其发出能量为140keV的γ射线，且具有6小时的物理半衰期以及使用钼-99/锝-99m发生器易于当地获得。
使用放射性标记肽的成象方法，其感光性要高于现有技术中使用其它已知放射性药物进行放射性成象的感光性。因为，放射性肽的特异性结合使放射性信号集中在检查所感兴趣的区域。与靶向物特异性结合的小分子合成肽可以优选地用作放射性指示剂的基质。这是因为1.可用化学方法合成这类肽(不再要求其在生物系统中如细菌或哺乳动物细胞中制备，或者要求其从生物衍生的物质如蛋白质片段中分离)；2.它们是小分子，因而，可迅速地从体内除去那些与非靶向物结合的放射性指示剂，由此减少了背景(非靶向物)放射性和更好地确定靶向物；3.小分子的肽可以容易地经化学处理使其在特异性结合部位的亲合力达到最大。
小分子易于合成的标记肽优选用作日常使用的放射性药物。显然，目前仍需要有能直接注入病人体内并通过在疾病部位的定位使疾病部位成象的小分子合成的标记肽。由于Tc-99m可用作成象用放射性核素的特性和特异性结合的小分子合成肽作为放射性指示剂分子的效用，Tc-99m标记的小分子合成肽作为γ射线闪烁照相法的放射性指示剂明显具有许多优点。
现有技术中已经报道了放射性标记的肽。
Ege等人在美国专利4,832,940中教导了用于定位T-淋巴细胞成象的放射性标记的肽。
Olexa等人，于1982年，在欧洲专利申请823017009中公开了选自从交联的血纤维蛋白分离得到的片段E1和从交联的血纤维蛋白分离得到的片段E2的药学上可接受的放射性标记的肽，和具有片段E1和片段E2之间的氨基酸序列中间体的肽。
Ranby等人，于1988年，在PCT/US88/02276中公开了检测动物体内血纤维蛋白的方法，该方法包括将放射性标记的化合物共价结合到血纤维蛋白上。
Hadley等人，于1988年，在PCT/US88/03318中公开了包括如下步骤的检测体内血纤维蛋白-血小板凝块的方法(a)给病人施用标记的稀释溶解血栓蛋白，其中标记选择性地连接在血纤维蛋白结合区域之外的那部分溶解血栓蛋白上；(b)检测病人体内标记的溶解血栓蛋白的分布状况。
Lees等人，于1989年，在PCT/US89/01854中教导了用于动脉成象的标记肽。
Sobel，于1989年，在PCT/US89/02656中公开了使用标记的酶失活组织纤维蛋白溶酶原激活剂定位动物体内一个或多个血栓位置的方法。
Stuttle，于1990年，在PCT/GB90/00933中公开了含有3至10个包含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)序列的氨基酸并能结合到体内RGD结合部位上的放射性标记的肽。
Maraganore等人，于1991年，在PCT/US90/04642中公开了放射性标记的血栓抑制剂，其包含(a)抑制剂部分；(b)连接部分；和(c)阴离子结合位置部分。
Rodwell等人，于1991年，在PCT/US91/03116公开了“分子识别单元”与“效应物域”的共轭物。
Tubis等人，于1968年，在Int.J.Appl.Rad.Isot.19835-840中描述了用锝-99m标记肽的方法。
Sundrehagen，于1983年.在Int.J.Appl.Rad.Isot.341003中描述了用锝-99m标记多肽的方法。
在现有技术中，螯合剂在放射性标记多肽方法中的应用以及使用Tc-99m标记肽和多肽的方法都是已知的，并且公开在共同待审的美国专利申请07/653,012和07/807,062中，这两篇专利申请在此引用作为参考文献。
尽管Tc-99m最适宜用于放射性成象，但是，目前对于Tc-99m化学特性的研究还不象对其它元素化学特性的研究那样全面。为此，至今尚未大量使用由Tc-99m标记的方法。Tc-99m通常是以Tc-99m的高锝酸盐(TcO-4，锝为+7价氧化态)的形式获得，一般从钼-99/锝-99m发生器中得到。但是，高锝酸盐不能良好地与其它化合物结合。因此，为了放射性标记肽，必需将Tc-99m的高锝酸盐转化成其它的形式。由于锝在水溶液中不能形成稳定的离子，所以必需将其以配位化合物的形式置于一种溶液中，所说的溶液具有足够的稳定性以阻止其分解并最终使Tc-99m转化成不溶的二氧化锝或再转化成高锝酸盐。
上述这类Tc-99m的配位化合物(以+1至+6价氧化态)是已知的。但是，许多这类配位化合物由于其分子形状的原因而不适合用于放射性标记。为了进行放射性标记，特别有利的是将配位化合物制成螯合物，在该螯合物中通过单一的螯合配位体提供所有围绕锝离子的供电子团。由此，通过螯合剂和肽之间的单一连接体使螯合的Tc-99m共价结合到肽上。
这些配位体有时被称为具有螯合部分和连接部分的双功能螯合剂。这类化合物在现有技术中也是已知的。
Byme等人在美国专利4,434,151中描述了高半胱氨酸硫羟内酯(thiolactone)衍生的双功能螯合剂，该螯合剂能够使放射性核素偶合到含有氨基末端的化合物上，所说的含有氨基末端的化合物能够在待成象的器官或组织中定位。
Fritzberg，在美国专利4,434,151中描述了一系列以2，3-二(巯基乙酰氨基)丙酸盐为基质的锝螯合剂。
Byme等人在美国专利4,571,430中描述了用于螯合放射性核素的新的高半胱氨酸硫羟内酯双功能螯合剂，，该螯合剂能够使放射性核素偶合到含有氨基末端的化合物上，所说的含有氨基末端的化合物能够在待成象的器官或组织中定位。
Byme等人在美国专利4,575,556中描述了用于螯合放射性核素的新的高半胱氨酸t硫羟内酯双功能螯合剂，该螯合剂能够使放射性核素偶合到含有氨基末端的化合物上，所说的含有氨基末端的化合物能够在待成象的器官或组织中定位。
Davison等人在美国专利4,673,562中描述了主要用作肾功能监视剂的二酰氨基-二硫代-配位体的锝螯合物和其盐。
Nicolotti等人在美国专利4,861,869中描述了用于与生物分子如抗体形成共轭物的双功能偶合剂。
Fritzberg等人在美国专利4,965,392中描述了用于标记蛋白质的各种S-保护的以巯基乙酰基甘氨酰基甘氨酸为基质的螯合剂。
Fritzberg等人在欧洲专利申请86100360.6中描述了用于制备锝标记的成象试剂的二巯基、二氨基、或二酰氨基羧酸或胺配合物。
Dean等人，于1989年，在PCT/US89/02634中描述了用于放射性标记蛋白质和肽的双功能偶合剂。
Flanagan等人在欧洲专利申请90306428.5中公开了通过一组有机螯合分子用Tc-99m对合成肽片段进行标记的方法。
Albert等人在欧洲专利申请WO91/01144中公开了使用放射性标记的肽进行放射性成象的方法，所说的放射性标记的肽与生长因子、激素、干扰素和细胞分裂素有关并含有共价连接在放射性核素螯合基团上的特异性识别肽。
Dean在共同待审的美国专利申请07/653,012中教导了用于制备肽的试剂和方法，所说的肽含有共价连接在用于体内放射性成象的特异性结合肽上的Tc-99m螯合基团，该美国专利申请在此作为参考文献使用。
Baidoo & Lever于1990年，在Bioconjugate Chem，1132-237中描述了使用提供阳离子锝配合物的双氨双巯基基团标记生命分子的方法。
可以简单地通过加入含巯基部分如半胱氨酸或巯基乙酸来标记肽。这类方法在现有技术中已有描述。
Schochat等人在美国专利5,061,641中公开了对含有至少一个“悬挂的”巯基的蛋白质进行直接放射性标记的方法。
Dean等人在共同待审的美国专利申请07/807,062中教导了通过含有游离巯基的连接基团来放射性标记肽的方法，该美国专利申请在此作为参考文献使用。
Goedemans等人在PCT申请WO89/07456中描述了使用环硫醇化合物，特别是2-亚氨基硫醇和其衍生物放射性标记蛋白质的方法。
Thornback等人在欧洲专利申请90402206.8中描述了使用含有巯基的化合物，特别是2-亚氨基硫醇进行放射性标记的蛋白质的制备方法和应用。
Stuttle在PCT申请WO90/15818中描述了Tc-99m标记含有RGD的低聚肽的方法。
Burns等人，于1985年，在欧洲专利申请85104959.3中描述了用于制备少量中性Tc-99m脑成象剂的双胺双硫醇化合物。
Kung等人于1986年，在欧洲专利申请86105920.2中描述了用于制备少量中性Tc-99m成象剂的双胺双硫醇化合物。
Bergstein等人于1988年，在欧洲专利申请88102252.9中描述了用于制备少量中性Tc-99m脑成象剂的双胺双硫醇化合物。
Bryson等人于1988年，在Inorg.Chem.272154-2161中描述了对于过量配位体呈不稳定状态的锝-99的中性配合物。
Misra等人于1989年，在Tet.Let.301885-1888中描述了用于标记的双胺双硫醇化合物。
Bryson等人于1990年，在Inorg.Chem.292948-2951中描述了可以生成中性Tc-99m配合物的含有二个酰氨基、一个巯基和一个取代的吡啶基的螯合剂。
Taylor等人于1990年，在J.Nucl.Med.31885(摘要)中描述了用于脑成象的中性Tc-99m配合物。
使用螯合剂对肽进行放射性标记，和用Tc-99m标记肽的方法在现有技术中是已属已知技术，并已公开在下面共同待审的美国专利申请中07/653,012、07/807,062、07/871,282、07/886,752、07/893,981、07/955,466、08/019,864、08/073,577、08/210,822、08/236,402和08/241,625。为使血栓成象而用作闪烁照相成象剂的标记肽在现有技术中也是已知的，并已公开在下面共同待审的美国专利申请中07/886,752、07/893,981和08/044,825；以及公开在国际专利申请PCT/US92/00757、PCT/US92/10716、PCT/US93/02320、PCT/US93/03687、PCT/US93/04794、PCT/US93/05372、PCT/US93/06029、PCT/US93/09387、PCT/US94/01894、PCT/US94/03878和PCT/US94/05895。上述每篇文献以其整体在此被引用作为参考文献。
发明的简要说明本发明提供了放射性标记肽的闪烁照相成象剂。本发明的放射性标记肽含有与体内的靶向物特异性结合的肽并共价连接到放射性标记结合部分，其中放射性标记结合部分与放射性同位素相结合。本发明一个特有的优点就是放射性标记结合部分共价连接在含有肽的氨基酸残基的侧链上。
由于下述的多种原因，上述这种共价连接模式十分有利。第一、与肽的氨基酸组分的侧链形成共价连接避免了共价连接的放射性标记结合部分对于特异性结合肽的特异性结合特性的干扰。第二、这种连接方式可以使环肽(其定义是指端部不含有游离的氨基或羧基)与本申请公开的用作闪烁照相成象剂的放射性标记结合部分一起使用。第三、与氨基酸组分的侧链形成的共价连接可以使照相检查更为灵活地选取使用各种本发明的闪烁照相成象剂以最大限度地提高效率和降低抗原性等。与氨基酸侧链的共轭作用使得放射性标记结合部分可以在肽的合成过程中以氨基酸共轭物的形式加入肽中，或在肽的合成结束之后加入肽中。最后，环肽公知是抗外蛋白酶消化的，由此而将体内的这种提高了稳定性的肽结合至本发明的闪烁照相成象剂中。
本发明的第一个方面是提供可用于哺乳动物体内各部位成象的放射性标记的肽。所说的肽包含具有氨基酸序列和与该肽共价连接的放射性标记结合部分的特异性结合的肽。另外，放射性标记结合部分共价连接在包含该肽的氨基酸的侧链上。在优选的实施方案中，放射性标记结合部分共价连接在具有包含胺或硫醇的侧链的氨基酸侧链上，氨基酸最优选的是赖氨酸或高半胱氨酸。在另一个优选的实施方案中，放射性标记是锝-99m。
本发明的第二个方面是提供一种用于制备哺乳动物体内各部位成象用的闪烁照相成象剂的试剂，所说的试剂包含特异性结合的肽，该特异性结合的肽中放射性标记结合部分通过肽的氨基酸的氨基酸侧链共价连接在该肽上，所说的放射性结合部分具有下面的通式IC(pgp)s-(aa)-C(pgp)s其中(pgp)s是保护的半胱氨酸，(aa)是任何不含硫羟基的初级α-或β-氨基酸。在优选的实施方案中，氨基酸是甘氨酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于制备哺乳动物体内各部位成象用的闪烁照相成象剂的试剂，所说的试剂包含特异性结合的肽，其中放射性标记结合部分通过肽的氨基酸的氨基酸侧链共价连接在该肽上，所说的放射性结合部分具有下面的通式IIA-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X其中A是H、HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC或R4；B是H、SH或-NHR3，-N(R2)-(氨基酸或肽)或R4；Z是H或R4；X是SH或-NHR3、-N(R3)-(氨基酸或肽)或R4；R1、R2、R3和R4分别为H或直链或支链低级烷基或低级环烷基；n是0、1或2；其中(肽)是2至约10个氨基酸的肽；和；(1)当B为-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)时，X是SH和n是1或2；(2)其中当X为-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)时，B是SH和n是1或2；(3)当B为H或R4时，A是HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC，X是SH和n是0或1；(4)当A为H或R4，而其中的B为SH时，X是-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)和当X是SH时，B是-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)；(5)当X为H或R4时，A是HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC和B是SH；(6)当Z为甲基时，X是甲基，A是HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC和B是SH和n是0；和(7)当B为SH和X为SH时，n不为0；以及其中硫羟基部分为还原形式和其中(氨基酸)是任何不含硫羟基的初级α-或β-氨基酸。
在本发明这一方面的具体实施方案中，放射性标记结合的部分具有下面的通式IIa.-(氨基酸)1-(氨基酸)2-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}IIb.-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}-(氨基酸)1-(氨基酸)2IIc.-(伯α，ω-或β，ω-二氨基酸)-(氨基酸)1-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}或IId.-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}-(氨基酸)1-(初级α，β-或β，γ-二氨基酸)其中(氨基酸)1和(氨基酸)2分别为任何天然生成的、修饰的、取代的或改变的不含硫醇基的α-或β-氨基酸；A是H、HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC或R4；B是H、SH或-NHR3、-N(R2)-(氨基酸或肽)或R4；Z是H或R4；X是SH或-NHR3、-N(R3)-(氨基酸或肽)或R4；R1、R2、R3和R4分别为H或直链或支链低级烷基或低级环烷基；n是0、1或2；(肽)是2至约10个氨基酸的肽；和(1)当B为-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)时，X是SH和n是1或2；(2)当X为-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)时，B是SH和n是1或2；(3)当B为H或R4时，A是HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC，X是SH和n是0或1；(4)当A为H或R4，而B为SH时，X是-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)和当X是SH时，B是-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)；(5)当X为H或R4时，A是HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC和B是SH；(6)当Z为甲基时，X是甲基，A是HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC和B是SH和n是0；和(7)当B为SH和X为SH时，n不为0；以及其中硫羟基部分为还原形式。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于哺乳动物体内各部位成象的放射性标记的肽，所说的肽包含特异性结合的肽，该特异性结合的肽中放射性标记结合部分通过肽的氨基酸的氨基酸侧链共价连接在肽上，所说的放射性结合部分具有下面的通式
{为了本发明的目的，具有这种结构的放射性标记结合部分将被称之为吡啶甲酸(Pic)为基础的部分}或
{为了本发明的目的，具有这种结构的放射性标记结合部分将被称之为吡啶甲基胺(Pica)为基础的部分}其中X为H或保护基团；(氨基酸)是任何氨基酸；放射性标记结合部分共价连接至肽上，放射性标记结合部分和放射性标记的配合物呈电中性。在优选的实施方案中，氨基酸是甘氨酸及X为乙酰氨基甲基保护基。在另一优选的实施方案中，肽通过氨基酸共价连接到放射性标记结合部分上，最优选的是氨基酸为甘氨酸和放射性标记为锝-99m。
在本发明的另一实施方案中，提供了一种用于哺乳动物体内各部位成象的放射性标记的肽，所说的肽包含特异性结合的肽和通过肽的氨基酸侧链共价连接到肽上的双氨基双巯基放射性标记结合部分。在本发明的这一实施方案中的双氨基双巯基放射性标记结合部分具有选自下面通式组的通式
其中每个R分别为H、CH3、或C2H5；每个(pgp)s分别为硫羟基保护基或H；m、n和p分别为2或3；A为直链或环状的低级烷基、芳基、杂环基、它们的组合或取代的衍生物；和X为肽；以及
其中每个R分别为H、CH3、或C2H5；m、n和p分别为2或3；A是直链或环状的低级烷基、芳基、杂环基、它们的组合或取代的衍生物；V为H或CO-肽；R’为H或肽；其前提条件是当V为H时，R’是肽，而当R’为H时，则V为肽。{为了本发明的目的，具有这些结构的放射性标记结合部分将被称之为“BAT”部分}。在优选的实施方案中，肽通过氨基酸共价连接到放射性标记结合部分，最优选的是氨基酸为甘氨酸，放射性标记为锝-99m。
在本发明上述这些方面的优选实施方案中，特异性结合化合物是包含3至100个氨基酸的肽。最优选的放射性标记是锝-99m。
本发明提供的特异性结合肽包括(但并不仅限于这些)具有下述序列的肽甲酰-MLF(VGVAPG)3酰胺(VPGVG)4酰胺RALVDTLKFVTQAEGAK酰胺RALVDTEFKVKQEAGAK酰胺PLARITLPDFRLPELAIP酰胺GQQHHLGGAKAGDVPLYKKIIKKLLESLRALVDTLK酰胺GGGLRALVDTLK酰胺GGGLRALVDTLKFVTQAEGAK酰胺GGGRALVDTLKALVDTL酰胺GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYRPSPSPIHPAHHKRDRRQ酰胺GGGFD.Cpa.YWDKTFT酰胺
{SYNRGDSTC}3-TSEAGGGLRALVDTLK酰胺GCGGGLRALVDTLK酰胺GCYRALVDTLKFVTQAEGAK酰胺GC(VGVAPG)3酰胺本发明的试剂可以形成为其中特异性结合化合物或放射性标记结合部分均共价连接在多价连接部分上。本发明的多价连接部分包含至少2个相同的能够共价结合到特异性结合化合物或放射标记结合部分上的连接体官能基团。优选的连接体官能基团是伯胺或仲胺、羟基、羧酸基团或巯基反应基团。在优选的实施方案中，多价连接部分包含双琥珀酰亚氨基甲基醚(BSME)、4-(2，2-二甲基乙酰基)苯甲酸(DMAB)、三(琥珀酰亚氨基乙基)胺(TSEA)、N{2-N’，N’-二(2-琥珀酰亚氨基乙基)氨基乙基〕}-N6，N9-二(2-甲基-2-巯基丙基)-6，9-二氮壬酰胺(BAT-BS)、二-(乙酰亚氨基乙基)醚、三(乙酰亚氨基乙基)胺、二-(乙酰亚氨基乙基)醚、二-(乙酰亚氨基甲基)醚、α，ε-二乙酰基赖氨酸、赖氨酸和1，8-二乙酰亚氨基-3，6-二氧杂辛烷。
本发明还包括本发明的肽和Tc-99m形成的配合物以及用Tc-99m放射性标记本发明肽的方法。本发明提供的放射性标记配合物是在还原剂存在下，由本发明的肽与Tc-99m反应而制得。优选的还原剂包括(但不仅限于这些)连二亚硫酸盐离子、亚锡离子和亚铁离子。本发明的配合物还可以通过本发明提供的预还原的Tc-99m配合物的配位体交换用Tc-99m标记本发明的肽而制得。
本发明还提供了用于制备由Tc-99m标记的本发明肽的试剂盒。用于由Tc-99m标记本发明肽的试剂盒包括一个含有预定量本发明的肽和足够量用于由Tc-99m标记肽的还原剂的封闭的小瓶。
本发明提供了通过体内的化学合成制备本发明肽的方法。在优选的实施方案中，肽通过固相肽合成方法来合成。
本发明提供了Tc-99m标记的肽通过在体内获得γ射线闪烁照相法成象而使哺乳动物体内各部位成象的使用方法。这些方法包括施用诊断有效量的本发明的Tc-99m放射性标记肽和检测在哺乳动物体内的检查部位定位的Tc-99m发射的γ射线。
本发明特别优选的实施方案会通过下面一些优选实施方案和权利要求的更为详细的说明变得十分明显。
附图的简要说明
图1表示患有肿瘤大鼠体内的99mTc-P587的成象。
发明的详细说明本发明提供了用于在哺乳动物体内各靶向部位成象的Tc-99m标记的肽，所说的肽包含通过氨基酸侧链共价连接在放射性标记结合部分上的氨基酸序列，其中放射性标记结合部分与放射性同位素相结合。
使用Tc-99m进行标记是本发明的一个优点，因为这种同位素的核特性和放射特性使其成为一种理想的闪烁照相成象剂。这种同位素具有140keV的单一光子能和约6小时的放射性半衰期，并且易于从99Mo，99mTc发生器中获得。在现有技术中已知的其它放射性核素则具有太长的有效半衰期(例如111In的半衰期为67.4小时)或者具有毒性(例如125I)。
在放射性标记结合部分和与该部分共价连接的肽中(所说的放射性标记结合部分含有共价连接在本发明提供的硫羟基保护基[(pgp)5]上的硫羟基)，硫羟基保护基可以相同或不同并可以是(但并不仅限于这些)-CH2-芳基(芳基是苯基或烷基或烷氧基取代的苯基)；-CH-(芳基)2，(芳基是苯基或烷基或烷氧基取代的苯基)；-C-(芳基)3，(芳基是苯基或烷基或烷氧基取代的苯基)；-CH2-(4-甲氧基苯基)；-CH-(4-吡啶基〕(苯基)2；-C(CH3)3-9-苯基芴基；-CH2NHCOR(R是未取代的或取代的烷基或芳基)；-CH2-NHCOOR(R是未取代的或取代的烷基或芳基)；-CONHR(R是未取代的或取代的烷基或芳基)；-CH2-S-CH2-苯基优选的保护基具有通式-CH2-NHCOR，其中R是具有1至8个碳原子的低级烷基、苯基或有低级烷基、羟基、低级烷氧基、羧基或低级烷氧基羰基取代的苯基。最优选的保护基是乙酰氨基甲基。
本发明的每个含有特异性结合肽的实施方案都包含氨基酸序列。本发明中所用的术语氨基酸是指天然生成或非天然生成的所有L-或D-氨基酸。
本发明的肽可以在体内化学合成。通常，本发明的肽优选在氨基酸合成器中制备。本发明的肽也可以这样来合成，即其中使用本领域内的普通技术人员熟知的技术，使放射性标记结合部分在体外化学合成过程中共价连接到肽上。由于可以确定共价连接的具体部位，因此，这种在合成中共价连接到放射性标记结合部分上的肽是优选的。
本发明中特别优选将放射性标记结合部分通过靶向特异性结合肽的氨基酸侧链共价连接到肽上。上述的共价连接可以通过与特定的氨基酸侧链形成共价键而将放射性标记结合部分偶合到肽上来完成，或者也可以通过结合在肽合成中与放射性标记结合部分共轭的氨基酸来完成。
在前一种情况下，例如，在pH8-10的条件下，将放射性标记结合部分CLCH2CO.Gly-Gly-Cys-Lys酰胺(特别是，在合成过程中，通过半胱氨酸残基中巯基的三苯甲基化来保护)偶合到生长激素释放的抑制因子受体结合的肽cyclo.(N-CH2).Phc-Tyc-(p-Trp)-Lys-Val-Hcy上生成肽cyclo.(N-CH2).phc-Tyc-(p-Trp)-Lys-Val-Hcy.(CH2CO).Gly-Gly-Cys-Lys酰胺(接着脱去保护)。在上述该通式中，应该认识到放射性标记结合部分是共价连接在高半胱氨酸的侧链硫原子上。
在另一种情况下，通过使用在肽合成过程中制得的赖氨酸衍生物，Na(Fmoc)-Nε(N9-(叔丁氧基羰基)-N6，N9-二(2-甲基-2-三苯基甲基硫代丙基)-6，9-二氮壬酰基)赖氨酸将放射性标记结合部分BAT(N6，N9-二(2-巯基-2-甲基丙基)-6，9-二氮壬酸)结合到白细胞结合肽，甲酰基.Met-Leu-Phe-Lys.酰胺上。
本发明其它的放射性标记结合部分可以在肽合成中引入靶向特异肽上。可以将含有吡啶甲酸的放射性标记结合部分共价连接到赖氨酸的ε-氨基上得到，例如，αN(Fmoc)-Lys-εN[Pic-Gly-Cys(保护基)]，其可以结合到肽链的任何位置上。该序列特别优选，因为其提供了易于结合到靶向物结合肽的模式。
在放射性锝和本发明肽的配合物的制备方法中，在还原剂存在下，锝配合物，优选为Tc-99m的高锝酸盐，与本发明的肽进行反应。优选的还原剂是二亚硫酸盐离子、亚锡离子和亚铁离子。最优选的还原剂是二氯化锡。在其它的优选实施方案中，还原剂是固相还原剂。配合物和制备这类配合物的方法通常是以一个试剂盒的形式提供，所说的试剂盒包含一个含有预定量待标记的本发明的肽和足够量用于由Tc-99m标记肽的还原剂的封闭小瓶。另外，所说的配合物也可以通过本发明的肽与预选制得的锝和另一种作为转移配位体的已知化合物形成的易变配位化合物的反应而生成。该方法是被称之为配位体交换的已知方法并已为本领域内的普通技术人员所熟知。易变配位化合物可以使用象酒石酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐或甘露糖醇这样的转移配位体来制备。本发明使用的Tc-99m的高锝酸盐包括碱金属盐如钠盐、或铵盐或低级烷基铵盐。
在本发明优选的实施方案中，提供了用于制备锝标记的肽的试剂盒。本发明的肽可以使用本领域内的普通技术人员所熟知的和下述的方法和手段化学合成。由此制得的肽包含3-100个氨基酸残基，并且这种肽共价连接在放射性标记结合部分上，所说的放射性标记结合部分与放射性同位素相结合。肽是以足以能满足用Tc-99m标记肽的量被引入到含有还原剂如二氯化锡或固相还原剂的小瓶中。该小瓶中还包含了如上所述的转移配位体(如酒石酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐或甘露糖醇)。本发明的锝标记的肽可以通过将适量的Tc-99m或Tc-99m配合物加入到小瓶中并在下述实施例3中所述的条件下进行反应来制备。
本发明提供的放射性标记的肽具有适量的放射性。在Tc-99m放射性配合物的制备中，通常，优选制得在含放射性浓度为每毫升约0.01毫居里(mCi)至100mCi的溶液中的放射性配合物。
本发明提供的放射性标记的肽可以用于使哺乳动物体内各部位显象。根据本发明，将锝标记的肽以一个单位的可注射剂量给药。任何本领域内的普通技术人员所熟知的常用载体，如无菌盐水溶液或血浆都可以在放射性标记之后，用于制备可注射的溶液。所说的可注射溶液根据本发明的方法使各器官、肿瘤等诊断成象。通常，给药的单位剂量具有的放射性为约0.01mCi至100mCi，优选1至20mCi。以单位剂量注射的溶液为约0.01毫升至约10毫升。在静脉注射给药之后，可以在几分钟后使体内的器官或肿瘤成象。但是，如果需要，也可在放射性标记肽注射入病人体内数小时或更长的时间之后成象。在大多数情况下，在0.1小时内，给药剂量中有足够量的放射性标记肽在待成象的区域积累以进行闪烁照相。任何诊断用的常用闪烁照相成象方法都可用于本发明。
可以将本发明提供的锝标记的肽和配合物置于任何静脉注射常用的介质如盐酸水溶液介质或血浆介质中并通过静脉注射给药。上述这种介质还可含有常用的药物添加剂物质如用于调节渗透压的药学上可接受的盐、缓冲剂、防腐剂及类似物质。优选的介质是常用的盐水和血浆。
下面将用实施例更为全面地说明制备和标记这些化合物的方法。这些实施例说明了上述方法的一些方面和有利的效果。它们只是用于说明本发明，而并不是用来限定本发明。
实施例1固相肽合成使用Applied Biosystems Model 431A肽合成反应器和使用二环己基碳化二亚胺/羟基苯并三唑或2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯/羟基苯并三唑(HBTU/HOBT)与9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)偶合的氨基末端保护和使用用于羧基末端酸的对羟基甲基苯氧基甲基聚苯乙烯(HMP)树脂或用于羧基末端酰胺的Rink酰胺树脂，以0.25毫摩尔(mmole)的规模，进行固相肽合成(SPPS)。在室温下，使用含有三乙酸、水、苯硫基甲烷、乙二硫醇和三乙基硅烷(含量比为100∶5∶5∶2.5)的溶液将树脂结合产物裂解1.5-3小时。
在适当的情况下，通过下述步骤以引入αN-甲酰基，即用在98％甲酸中的过量乙酸酐处理裂解和去保护后的肽，并搅拌约18小时，然后使用HPLC提纯。在适当情况下，通过用20％(体积/体积)在NMP(N-甲基吡咯烷酮)中的乙酸酐对结合在树脂上的游离N-氨基末端肽处理30分钟以引入N-乙酰基末端。通过使用作为SPPS中待偶合的最后残基的2-卤代乙酸或者通过用2-卤代乙酸/二异丙基碳化二亚胺/在2-卤代乙酸酐的NMP中的N-羟基琥珀酰亚胺/在NMP中的二异丙基乙胺处理与树脂结合的游离N-末端氨基肽以引入2-氯乙酰基和2-溴乙酰基。在适当的情况下，通过下述方法使用HPLC提纯的2-卤代乙酰化的肽环化，所述的方法包括将在含或不含0.5-1.0毫摩尔EDTA的碳酸氢钠或氨水缓冲液(pH8)中的0.1-1.0毫克/毫升溶液搅拌1-48小时，然后用乙酸酸化，冷冻干燥和使用HPLC提纯。在适当的情况下，通过用0.006摩尔K3Fe(CN)6的等分试样处理以0.1毫克/毫升的浓度处于pH7缓冲溶液中的前体半胱氨酸-游离巯基肽直至其保持稳定的黄色以使Cys-Cys二硫醚键发生环化。用过量的半胱氨酸还原过量的氧化剂，冷冻干燥混合物，然后用HPLC提纯。
在适当的情况下，通过使用二异丙基碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺使吡啶甲胺共轭到前体肽上以引入“Pica”基团。通过使用作为SPPS中待偶合的最后残基的BAT酸或用BAT酸/二异丙基碳化二亚胺/在NMP中的N-羟基琥珀酰亚胺处理结合在树脂上的N-末端游离氨基肽以引入BAT配位体。通过下述方法使[BAM]共轭到肽上，所述方法包括，首先使用在DMF、NMP或CH2CL2中的二异丙基碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺或HBTU/HOBt的混合物活化肽羧酸酯，然后，在二异丙基乙胺存在下，使其偶合；偶合后，按照上述的方法使所得的共轭物去保护。
在适当情况下，在室温下，通过含单一巯基的肽(浓度为5-50毫克/毫升，在50毫摩尔磷酸钠缓冲液中的溶液，PH8)与预先溶解在乙腈中的0.5摩尔当量BMME(二马来酰亚氨基甲基醚)反应约1-18小时制备BSME加成物。将反应所得溶液浓缩并用HPLC提纯浓缩得到的产物。
在适当情况下，在室温下，通过含单一巯基的肽(浓度为10-100毫克/毫升，在DMF中的肽溶液或浓度为5-50毫克/升，在毫克磷酸钠(PH8)/乙腈或THF中的肽溶液)与预先溶解在乙腈中或DMF中的含或不含1摩尔当量三乙醇胺的0.33摩尔当量的TMEA(三(2-马来酰亚氨基乙基)胺(其公开在美国专利申请08/044,825中，该申请在此引用作为参考文献))反应约1-18小时制备TSEA加成物。将含有加成物的反应混合物浓缩，然后再用HPLC提纯该加成物。
在适当情况下，在室温下，通过通过含有单一巯基的肽(浓度为2-50毫克/毫升，在50磷酸钠(PH8)/乙腈或THF中的肽溶液)与预先溶解在乙腈或THF中的0.5摩尔当量的BAT-BM(N-[2-(N’，N’-二(马来酰氨基甲基硫代丙基)氨基乙基)]-N9-(叔丁氧基羰基)-N6，N9-二(2-甲基-2-三苯基甲基硫代丙基)-6，9-二氮壬酰胺)(其公开在美国专利申请08/044,825，该申请在此引用引用作为参考文献)反应约1-18小时制备BAT-BS加成物。将反应所得溶液蒸发至干并通过用10毫升TFA和0.2毫三乙基硅烷处理1小时使[BAT-BS]-肽共轭物去保护。将溶液浓缩，用乙醚使产物加成物沉淀，然后再用HPLC浓缩。
通过制备性高压液相色谱(HPLC)分离提纯粗产物肽，其中使用WatersDdlta Pak C18柱和使用0.1％三氟乙酸在由乙腈改性的水中的溶液进行梯度洗脱。在乙腈从洗脱馏份中蒸除之后，将该洗脱馏份冷冻干燥。由快速原子爆炸质谱(FABMS)确认每种产物都相同。
实施例2用Tc-99m进行放射性标记的一般方法将0.1毫克实施例2中制得的肽溶解在0.1毫升水或50毫升磷酸钾缓冲液中(PH=5.6或7.4)。通过下述方法制备Tc-99m的葡庚糖酸盐，该方法包括用含有至多200mCi的1.0毫升Tc-99m高锝酸钠再配制一个Glucoscan小瓶(E.I.DuPont de Nemours，Inc.)并将其在室温下放置15分钟。然后，将25微升Tc-99m的葡庚糖酸盐加入到肽中，并使其在室温下或100℃下反应15-30分钟，通过0.2微米过滤器过滤。
通过使用下述条件的HPLC测定Tc-99m标记肽的纯度用放射性标记肽装载Waters DeltaPure RP-18，5μ，150毫米×3.9毫米分析柱；以1毫升/分钟的溶剂流速洗脱肽。经20分钟从10％溶剂A(0.1％CF3COOH/H2O)至40％溶剂B90(0.1％CF3COOH/90％CH3CN/H2O)进行梯度洗脱。
使用与积分记录器相连的联机放射性检测器检测放射性组分。在上述条件下，在1至4分钟之间洗脱Tc-99m的葡庚糖酸盐和Tc-99m高锝酸钠，而Tc-99m标记肽则在很长一段时间之后才洗脱。
下面的表格说明了用上述方法对实施例2制得的肽成功地进行了Tc-99m标记。
表I
表I(续)
*上标是指下面的标记条件1=室温下，在10％HPCD中，2=在室温下，在50/50乙醇/水中3=在100℃，在0.9％NaCl中HPLC方法(用RT后的上标表示)Waters-1柱，在10分钟内100％溶液A→100％溶液B
表II
*下述是相应的肽使用的标记条件1.将肽溶解在50毫摩尔磷酸钾缓冲液(PH7.4)中并在室温下标记。
2.将肽溶解在50毫摩尔磷酸钾缓冲液(PH7.4)中并在100℃下标记。
3.将肽溶解在水中并在室温下标记。
4.将肽溶解在水中并在100℃下标记。
5.将肽溶解在50毫摩尔磷酸钾缓冲液(PH6.0)中并在100℃下标记。
6.将肽溶解在50毫摩尔磷酸钾缓冲液(PH5.0)中并在室温下标记。
**HPLC方法一般方法 溶剂A ＝0.1％CF3COOH/H2O溶剂B70＝0.1％CF3COOH/70％CH3CN/H2O溶剂B90＝0.1％CF3COOH/90％CH3CN/H2O溶剂流速＝1毫升/分钟Vydak柱＝带有防护柱的Vydak218TP54RP-18，5μ×220毫米×4.6毫米分析柱Brownlee柱＝Brownlee Spheri-5 RP-18，5μ×220毫米×4.6毫米分析柱Waters柱＝Waters Delta-Pak C18，5μm，39毫米×150毫米方法1Brownlee柱10分钟内从100％A至100％B70方法2Vydak柱 10分钟内从100％A至100％B90方法3Vydak柱 10分钟内从100％A至100％B70方法4Brownlee柱10分钟内从100％A至100％B90方法5Waters柱 10分钟内从100％A至100％B90用单一字母缩写表示氨基酸可以在G.Zubay，Biochemistry(2d.ed.)，1988(MacMillenPublishingNew york)第33页上找到；Ac＝乙酰基；Pic＝吡啶甲酰基(吡啶-2-羰基)＝6氨基己酸；Hly＝高赖氨酸(homolysine)；Acm＝乙酰亚氨基甲基；pGlu＝焦谷氨酸；Mob＝4-甲氧基苄基；Pica＝吡啶甲基胺(2-(氨基甲基)吡啶)；Apc＝L-[S-(3-氨基丙基)半胱酸；FD＝D-苯基丙氨酸；WD＝D色氨酸；YD＝D酪氨酸；Cpa＝L(4-氯苯基)丙氨酸；Thp＝4-氨基-四氢噻喃-4-羧酸；ma＝巯基乙酸；DNal＝D-2-萘基丙氨酸；Dpg＝-二丙基甘氨酸；Nle＝正亮氨酸；BAT＝N6，N9-二(2-巯基-2-甲基丙基)-6，9-二氮壬酸；BAT酸(保护的)＝N9-(叔丁氧基羰基)-N6，N9-二(2-甲基-2-三苯基甲基硫代丙基)-6，9-二氮壬酸；BAM＝N1，N4-二(2-巯基-2-甲基丙基)-1，4，10-三氮癸烷；BAM(保护的)＝N1-(叔丁氧基羰基)-N1，N4-二(2-甲基-2-三苯基甲基硫代丙基)-1，4，10-三氮癸烷；[BAT-BM]＝N-[2-(N’，N’-二(2-马来酰亚氨基乙基)氨基乙基]-N9-(叔丁氧基羰基)-N6，N9-二(2-甲基-2-三苯基甲基硫代丙基)-6，9-二氮壬酰胺；[BAT-BS]＝N-[2-(N’，N’-二(2-琥珀酰亚氨基乙基)氨基乙基]-N6，N9-二(2-巯基-2-甲基丙基)-6，9-二氮壬酰胺；[BMME]＝二马来酰亚氨基甲基醚；[BSME]＝二琥珀酰亚氨基甲基醚；[DTPA]＝二亚乙基三胺五乙酸；Amp＝4-脒基苯基丙氨酸。
实施例3在高胆固醇血症兔子模型中使用Tc-99m标记化合物P215使动脉粥样硬化斑定位和体内成象将22个两种性别体重为2-3公斤的新西兰白兔(NZW)分成两组。将对照组的兔笼养并喂食商购的兔食(Purina)。从7周龄开始给HC组的兔喂食标准化的高胆固醇食物(混合了1％重量/重量浓度的胆固醇的兔食)直至兔长到28周龄。给所有的兔随意喝水。
按照上述实施例1的方法制备Tc-99m标记的P215({BAT}.RA1VDTLKFVTQAEGAK酰胺)。用140-160mCi的Tc-99m标记约250-400微克的肽并将其制成在0.2毫升体积剂量中含7-8mCi(12.5-20.0微克/兔；6-7微克/公斤)的单位剂量。以慢速浓输液的方式(约0.1毫升/分钟)从兔耳外侧的静脉给成年兔静脉给药Tc-99m标记的肽。使用装有针孔准直器(5毫米孔)和Tc-99m的能量视窗组并且程序设置为累计计数500,000次或扫描所需时间的γ射线照相机来获得成象。在成象前的瞬间，使用克他命和甲苯噻嗪的混合物麻醉动物(5∶1，1毫升/公斤肌肉内给药)。
在心脏正上方的40°-50°处(左斜前方取景区)收集γ射线照相成象以勾画出主动脉弓并检查下行的主动脉。在注射后的1小时和2小时得到成象，在注射后的3小时和5小时间或性地得到成象。在每次收集成象之前根据需要对动物进行补充麻醉。
在2.5小时(在2小时扫描之后)时，给动物施用静脉剂量的戊巴比妥钠以使其致死。根据验尸，从中腹区的主动瓣膜中移出主动脉和切除分枝血管。使用平行孔准直器，再从躯体外使主动脉成象。然后，纵向打开主动脉并用苏丹第四染色，由此使动脉粥样硬化斑变成深砖红色。脱脂的和未损伤的主动脉内皮仍保持其原样，并且在这些条件下所说主动脉内皮的外观呈现白桃红色。在体内和体外的Tc-99m P215成象中的正反差和在HC-处理的兔主动脉中苏丹IV的沉积图案表明，本发明的闪烁照相成象剂能够使动脉粥样硬化斑成象。
实施例4在体内使用Tc-99m标记的化合物P357使犬模型的深静脉栓塞成象肌肉注射给药克他命和乙酰丙嗪的结合物使Mongrel狗镇静，然后，静脉注射给药戊巴比妥钠使其麻醉。将18号口径的血管导管(angiocath)从右侧股骨静脉的靠远端的一半处插入静脉并将由8毫米Dacron缠绕的不锈钢绕制线圈(Cook Co.，Bloomington 1N)置于每个动物接近股骨中部的股骨静脉中。取出血管导管，缝合伤口并通过X光记录线圈的移动。然后，使各动物过夜后苏醒。
在线圈移动一天后，将每个动物再次麻醉，在动物的每个前肢上经静脉输液生理盐水并插膀胱导管收集尿样。将动物仰卧置于低耗能状态，且在装有各种用途准直器的γ射线照相机下，使Tc-99m达到光峰。在NuclearMac计算机系统中获得成象。
将Tc-99m标记的P357{(CH2CO-YD.Apc.GDCGGCAcmGCAcmGGC.酰胺)2-[BAT-BS]}{185-370mBq(5-10mCi)Tc-99m和0.2-0.4毫克P357}注射进入插入点处的一条前肢静脉血管中。保持第二条前肢血管用于收集血样。在注射后约10-20分钟和在注射后约1，2，3，和4小时，获取500,000次或20分钟的(无论哪种方式，只选取更短时间的那种)腿部的腹面成象。通过心内注射或药团静脉注射给药安乐死剂量的饱和氯化钾溶液，然后用肝磷脂注射器通过心脏穿刺收集两种血样。将含有血栓的股骨静脉和大腿肌肉试样细心地剖开分离。然后，从血管中切割下血栓并置于预先称重的试管中。称重血栓试样并用Tc-99m通道中的γ井式计数器计数。另外，还计数已知馏份的注射剂量。
测定新鲜的血栓重量、安乐死之前获得的血栓和血液中的百分注射剂量(％ID)/克以及血栓/血液比和血栓/肌肉比。通过对在靶向区(ROI)中测得的计数/象素的分析来确定血栓/背景比率，所说的靶向区是根据储存在计算机中的成象，在血栓和其相邻肌肉区域上画出的。
上述所得结果用来说明可以在体内迅速而有效地定位深静脉血栓。
实施例5闪烁照相成象和Tc-99m标记的肽的生物分布为了说明上面给出的Tc-99m标记肽的作用，在新西兰白兔的左腓肠部上肌肉内注射大肠杆菌有效染剂。在肌肉内注射克他命和甲苯噻嗪使动物镇静24小时之后，给动物静脉注射Tc-99m标记的肽(≤150微克，2-10mCi)。将动物以仰卧姿式置于γ射线照相机(LEAP准直器/Tc-99m达到光峰)的取景区中，并在注射1小时后开始成象，然后，在此后的3小时内每间隔约1小时进行成象。在获取成象和根据需要再次使动物麻醉之间使动物苏醒。
在完成最后一次成象后，通过静脉注射过量的苯巴比妥使每个动物致死，并解剖获取血样和感染组和对照组肌肉组织的试样。称重组织试样，使用γ计数器计数组织试样和注射剂量的标准量，并测定留在组织中的百分注射剂量(每克组织)。对于每种肽计算出每克感染组织的百分注射剂量，感染肌肉组织与非感染肌肉组织的比率，以及感染肌肉组织与血液的比率。下面的表中给出了使用具有下述通式的本发明Tc-99m标记试剂所获得的这些结果甲酰基MLFK(BAT).酰胺表III
A＝％ID/克感染的肌肉B＝％ID/克对照组的肌肉C＝感染的肌肉与对照组的肌肉之比D＝％ID/克血液E＝感染的肌肉与血液之比实施例6用大鼠肿瘤表达的生长激素释放抑制因子受体(SSTR)的定位和体内成象用基本上如Bakker等人(1991，Life Sciences491593-1601)所述的方法进行由大鼠肿瘤细胞表达的生长激素释放抑制因子受体的体内成象。
将采样并冷冻的肿瘤接髓质解冻后获得的CA20948鼠的胰肿瘤细胞，以每个动物0.05-0.1.05-0.1毫升细胞悬浮液的剂量，通过肌肉注射植入6周龄Lewis鼠的右后腿。使肿瘤长至约0.5-2克，采样，并将肿瘤接髓质植入第二个鼠，自然组Lewis鼠。重复这种转种方式以生产患肿瘤动物的下一代。用于体内研究的患肿瘤动物通常是第三至第五代转种的且长有0.2-2克肿瘤的鼠。
为了研究放射性试剂对于肿瘤的特异性，在注射放射性试剂之前30分钟，给选择的动物施用皮下SSTR阻断剂量(4毫克/公斤)的奥曲肽(Bakker等人已对此发表了实验报告，其结果是111In-[DTPA]奥曲肽肿瘤吸收下降了40％)。
将第三至第五代转种的CA20948患有肿瘤的Lewis鼠禁锢并通过背侧的尾静脉注射，对应于0.2-0.4毫升中3-8微克肽，剂量为0.15-0.20mCi的99mTc-标记的肽。
在选定的时间，将动物颈部脱位而致死并对其进行选择性验尸。称重采样的组织试样并在γ井式计数器中逐个计数注射剂量的可分量。
表1中给出了选择的放射性标记肽的90分钟生物分布。其中99mTc-P587、99mTc-P617、99mTc-P726、和99mTc-P736显著地表明非常高的肿瘤吸收，肿瘤/血液比率表明了它们在靶向(肿瘤)组织中高的特异性吸收。
图1表明了患肿瘤鼠中99mTc-P587的成象。在腿下部(箭头所指部分)肿瘤中的高吸收清晰可见。
对于经预先注射奥曲肽处理或没有经预先注射奥曲肽处理两种情况，比较99mTc-P587在鼠肿瘤中的吸收，其中已经知晓生长激素释放抑制因子结构类似物结合在体内的生长激素释放抑制因子受体之上。在这些实验中，通过在施用99mTc-P587之前施用奥曲肽而阻断受体可使放射性标记肽的特异性肿瘤吸收下降76％。这些结果证实体内99mTc-P587的结合是SSTR特异性。
表IV
应该认识到上述公开的本发明的一些具体实施方案以及所有在此基础上所做的改进或变化的等同物都在本申请权利要求中所述的本发明的精神和保护范围之内。
权利要求
1.一种用于制备哺乳动物体内各部位成象所用的闪烁照相成象剂的试剂，其包括具有含3-100个氨基酸的氨基酸序列的特异性结合肽和与所说的肽共价连接的放射性标记结合部分，其中放射性结合部分共价连接在特异性结合肽的氨基酸残基的侧链上。
2.权利要求1的试剂，其中特异性结合肽和放射性标记结合部分通过赖氨酸残基或高半胱氨酸残基共价连接。
3.包含权利要求1试剂的闪烁照相成象剂，其中放射性标记配合部分与放射性标记相结合。
4.权利要求3的试剂，其中放射性标记是锝-99m、铟-111、或镓-68。
5.权利要求1的试剂，其中放射性标记结合部分具有选自下列的通式ICp(aa)Cp其中Cp是保护的半胱氨酸，(aa)是不含硫羟基的任何初级α-或β-氨基酸；和
其中X＝H或保护基；(氨基酸)＝不含硫羟基的任何初级α-或β-氨基酸；V
其中，每个R5分别为H、CH3或C2H5；每个(pgp)s分别为硫羟基保护基或H；m、n和p分别为2或3；A＝直链或环状的低级烷基、芳基、杂环基、它们的组合或取代的衍生物；V＝H或-CO-特异性结合化合物；X＝特异性结合的化合物；
其中，每个R5分别为H、具有1至6个碳原子的低级烷基、苯基或有低级烷基或低级烷氧基取代的苯基；m、n和p分别为1或2；A＝直链或环状的低级烷基、芳基、杂环基、它们的组合或取代的衍生物；V＝H或-CO-特异性结合化合物；X＝特异性结合的化合物；和其中当V＝H时，R6＝特异性结合化合物，当R6＝H时，V＝-CO-特异性结合化合物。
6.权利要求5的试剂，其中通式I的放射性标记配合部分中保护的半胱氨酸具有下面通式的保护基-CH2-NH-CO-R其中R是具有1至6个碳原子的低级烷基，2-、3-、4-吡啶基、苯基、或有低级烷基、羟基、低级烷氧基、羧基或低级烷氧基羰基取代的苯基。
7.权利要求5的试剂，其中通式为Cp(aa)Cp的放射性标记配合部分具有下面的通式
8.包含权利要求5试剂的闪烁照相成象试剂，其中放射性标记配合部分与放射性标记相结合。
9.权利要求8的试剂，其中放射性标记是锝-99m、铟-111、或镓-68。
10.权利要求1的试剂，其中放射性标记配合部分包含下面通式的含单一硫羟基的部分IIA-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X其中，A是H、HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC或R4；B是H、SH、-NHR3、-N(R2)-(氨基酸或肽)、或R4；X是H、SH、-NHR3、-N(R3)-(氨基酸或肽)或R4；Z是H或R4；R1、R2、R3和R4分别为H或直链或支链低级烷基或低级环烷基；n是0、1或2；(肽)是2至约10个氨基酸的肽；和当B为-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)时，X是SH，和n是1或2；当X为-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)时，B是SH，和n是1或2；当B为H或R4时，A是HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或氨)-OOC，X是SH，和n是0或1；当A为H或R4，而其中的B为SH时，X是-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)和当X是SH时，B是-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)；当X为H或R4时，A是HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或氨)-OOC和B是SH；当Z为甲基时，X是甲基，A是HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC，B是SH和n是0；当B为SH和X为SH时，n不为0；和其中硫羟基部分为还原形式和其中(氨基酸)是任何不含硫羟基的初级α-或β-氨基酸。
11.权利要求10的试剂，其中放射性标记配合部分是选自具有下面通式的放射性标记部分IIa.-(氨基酸)1-(氨基酸)2-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}IIb.-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}-(氨基酸)1-(氨基酸)2IIc.-(伯α，ω-或β，ω-二氨基酸)-(氨基酸)1-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}或IId.-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}-(氨基酸)1-(初级α，β-或β，γ-二氨基酸)其中(氨基酸)1和(氨基酸)2分别为任何天然生成的、修饰的、取代的或改变的不含硫羟基的α-或β-氨基酸；A是H、HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC或R4；B是H、SH或-NHR3、-N(R3)-(氨基酸或肽)或R4；X是SH或-NHR3、-N(R3)-(氨基酸或肽)或R4；Z是H或R4；R1、R2、R3和R4分别为H或直链或支链低级烷基或低级环烷基；(肽)是2至约10个氨基酸的肽；n是0、1或2的整数；和当B为-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)时，X是SH和n是1或2；当X为-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)时，B是SH和n是1或2；当B为H或R4时，A是HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC，X是SH和n是0或1；当A为H或R4，而其中的B为SH时，X是-NHR3、-N(R3)-(氨基酸或肽)和当X是SH时，B是-NHR3或-N(R3)-(氨基酸或肽)；当X为H或R4时，A是HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC和B是SH；当Z为甲基时，X是甲基，A是HOOC、H2NOC、(氨基酸或肽)-NHOC、(氨基酸或肽)-OOC和B是SH和n是0；当B为SH和X为SH时，n不为0；和其中硫羟基部分为还原形式。
12.包含权利要求10试剂的闪烁照相成象剂，其中放射性标记配合部分与放射性标记相结合。
13.权利要求12的试剂，其中放射性标记是是锝-99m、铟-111、或镓-68。
14.权利要求1的试剂，其中特异性结合的肽是选自具有下述氨基酸序列的肽甲酰基-MLF(VGVAPG)3酰胺(VPGVG)4酰胺RALVDTLKFVTQAEGAK酰胺RALVDTEFKVKQEAGAK酰胺PLARITLPDFRLPELAIP酰胺GQQHHLGGAKAGDVPLYKKIIKKLLESLRALVDTLK酰胺GGGLRALVDTLK酰胺GGGLRALVDTLKFVTQAEGAK酰胺GGGRALVDTLKALVDTL酰胺GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYRPSPSPHPAHHKRDRRQ酰胺GGGFD.Cpa.YWDKTFT酰胺
{SYNRGDSTC}3-TSEAGGGLRALVDTLK酰胺GCGGGLRALVDTLK酰胺GCYRALVDTLKFVTQAEGAK酰胺GC(VGVAPG)3酰胺
15.权利要求1的试剂，其中该试剂还进一步包括与许多特异性结合化合物共价连接并且也与许多放射性标记结合部分共价连接的多价连接部分，以制备多体的多价闪烁照相成象剂，其中多体的多价闪烁照相成象剂的分子量小于约20,000道尔顿。
16.权利要求15的试剂，其中多价连接部分是双琥珀酰亚氨基甲基醚、4-(2，2-二甲基乙酰基)苯甲酸、三(琥珀酰亚氨基乙基)胺、N{2-N’，N’-二(2-琥珀酰亚氨基乙基)氨基乙基〕}-N6，N9-二(2-甲基-2-巯基丙基)-6，9-二氮壬酰胺(BAT-BS)、二-(乙酰亚氨基乙基)醚、三(乙酰亚氨基乙基)胺、二-(乙酰亚氨基乙基)醚、二-(乙酰亚氨基甲基)醚、αε-二乙酰基赖氨酸、赖氨酸和1，8-二乙酰亚氨基-3，6-二氧杂辛烷，或其衍生物。
17.由权利要求1的试剂与锝-99m在还原剂存在下进行反应而制得的配合物。
18.权利要求17的配合物，其中还原剂选自连二亚硫酸盐离子、亚锡离子和亚铁离子。
19.通过用锝-99m标记权利要求1的试剂生成的配合物，所说的标记是通过预先制备的锝-99m配合物的配位体交换来进行。
20.用于制备放射性药物制剂的试剂盒，所说的试剂盒包括含有预定量权利要求1的试剂和足够量用于由Tc-99m标记肽的还原剂的封闭的小瓶。
21.权利要求1的试剂用于使哺乳动物体内各部位成象的用途，其中试剂用锝-99m进行标记。
22.制备权利要求1试剂的方法，其中肽是在体外化学合成。
23.权利要求22制备肽的方法，其中肽是通过固相肽合成法来合成。
24.权利要求1的试剂，其中特异性结合肽是环肽。
全文摘要
本发明涉及放射性标记的肽和这类肽的制备方法。更具体地说，本发明涉及肽、肽的制备方法和用于制备这类肽的试剂盒、以及使用这类肽使哺乳动物体内的各部位成象的方法，所说的哺乳动物体使用锝-99m(Tc-99m)通过放射性键合基团标记，所说的放射性键合基团通过肽的氨基酸侧链共价连接在特异性结合的肽上。
文档编号A61K51/08GK1154072SQ95194335
公开日1997年7月9日 申请日期1995年6月1日 优先权日1994年6月3日
发明者理查德·T·迪安, 斯科特·巴特拉姆, 威廉·麦克布莱德, 约翰·利斯特-詹姆斯, 埃德加·R·西维特罗 申请人:迪亚太德公司