乳头状瘤病毒疫苗的制作方法

专利名称：乳头状瘤病毒疫苗的制作方法
技术领域：
本文提供编码乳头状瘤病毒L1和L2蛋白的重组表达载体，制造重组蛋白的方法和使用重组蛋白的方法。
背景技术：
乳头状瘤病毒感染在许多动物中发生，包括人类，绵羊，狗，猫，兔，猴，蛇和母牛。乳头状瘤病毒感染上皮细胞，通常在感染位点诱导良性上皮和纤维上皮肿瘤。乳头状瘤病毒是种特异性感染因子，人类乳头状瘤病毒不能感染非人类动物。
基于乳头状瘤病毒感染的宿主可将它们分为不同的组。基于DNA序列同源性可将人类乳头状瘤病毒(HPV)进一步分为60型以上(参见综述乳头状瘤病毒和人类癌症，H.Pfister(编)，CRC Press，Inc.，1990)。乳头状瘤病毒型表现为型特异性免疫原，因为对某一型乳头状瘤病毒感染的中和免疫性不授予针对另一型乳头状瘤病毒的免疫性。
在人类中，不同HPV型引起不同疾病。HPV型1，2，3，4，7，10和26-29在正常和免疫妥协个体两者中引起良性疣。HPV型5，8，9，12，14，15，17，19-25，36和46-50在免疫逃逸个体引起扁平损害。HPV型6，11，34，39，41-44和51-55引起生殖器或呼吸粘膜的非恶性湿疣。HPV型16和18引起生殖器粘膜的上皮发育不良并与多数宫颈，阴道，外阴和肛管的原位和侵袭性癌有关。HPV6和HPV11是90％以上的湿疣(生殖器疣)和喉乳头状瘤的致病因子。HPV6型的最大量的亚型为HPV6a。
在动物中的免疫学研究显示针对乳头状瘤病毒抗原的中和抗体的产生防止同源病毒的感染。由于乳头状瘤病毒体外培养困难，有效的乳头状瘤病毒疫苗进展很慢。由于缺乏适当的动物模型，有效HPV疫苗的发展特别缓慢。
抗体对乳头状瘤病毒的中和表现为型特异性并依赖于病毒表面的构象表位。
乳头状瘤病毒是编码达8个早基因和两个晚基因的小(50-60nm)，无包膜，二十面体DNA病毒。病毒基因组的开放阅读框(ORFs)称为E1至E7和L1和L2，其中“E”指早而“L”指晚。L1和L2编码病毒衣壳蛋白。早(E)基因与病毒功能如病毒复制和细胞转化相关。
L1蛋白是主要衣壳蛋白并具有55-60kDa的分子量。L2蛋白是次要衣壳蛋白，它具有55-60kDa的预期分子量和经聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的75-100kDa的表观分子量。免疫学资料提示L2蛋白的大部位于L1蛋白之内。L2蛋白在不同的乳头状瘤病毒中是高度保守的，特别是C末端的10个碱性氨基酸。L1ORF在不同乳头状瘤病毒中是高度保守的。
L1和L2基因已被用于产生用于防止和治疗动物中乳头状瘤病毒感染的疫苗。Zhou等(1991；1992)将HPV型16L1和L2基因克隆入牛痘病毒载体并用重组载体感染CV-1哺乳类细胞以产生病毒样颗粒(VLP)。
细菌衍生的重组牛乳头状瘤病毒L1和L2已被产生。对重组细菌蛋白的中和血清与天然病毒在低水平交叉反应，可能是由于天然的和细菌衍生的蛋白构象的不同。表达HPV6L1，HPV11L1，HPV16L1，HPV18L1，HPV31L1或HPV16L2 ORF的重组棒病毒(baculovirus)已被用于感染昆虫SF9细胞并产生L1和L2蛋白。Western印迹测定显示棒病毒衍生的L1和L2蛋白与针对HPV16的抗体反应。棒病毒衍生的L1形成VLPs。
Carter等(1991)证实HPV16L1和HPV16L2蛋白由酿酒酵母的重组株产生。Carter等还证实了HPV6bL1和L2蛋白的产生。该HPV6bL1蛋白不是全长L1蛋白。重组蛋白作为细胞内的或分泌的产物产生。重组L1和L2蛋白分子量近似于天然蛋白。当蛋白在细胞内表达时，发现当在不存在变性剂情况下细胞被溶胞时大多数蛋白不可溶。虽然这种不溶性可易化蛋白的提纯，它可妨碍蛋白天然表位的分析。
从酵母分泌的重组蛋白显示含有酵母衍生的碳水化合物。这些N-连接的寡糖的存在可掩藏天然表位。另外，分泌的重组蛋白可含有其它修饰，如持有分泌前导序列。
建立通过重组酵母的培养大量生产任何种型的乳头状瘤病毒蛋白的方法将是有用的。产生大量的具有天然蛋白的免疫授予特性，如天然蛋白的构象的乳头状瘤病毒蛋白也将是有用的。
本发明涉及具有天然乳头状瘤病毒蛋白免疫授予特性的重组乳头状瘤病毒蛋白的产生，及其生产和应用的方法。本发明涉及用于预防和可能治疗乳头状瘤感染的疫苗的生产。本发明的重组蛋白能够形成病毒样颗粒，这些VLP是免疫原性的，在动物模型中防止疣的形成。本发明采用美洲产白尾棕色兔和HPV6型(亚型6a)作为模型系统。发明概述本发明提供编码乳头状瘤病毒L1和L2蛋白的重组表达载体，制造重组蛋白的方法和应用重组蛋白的方法。
附图简述

图1显示用于表达乳头状瘤病毒L1和/或L2衣壳蛋白的双向酵母表达载体。
图2显示HPV6aL1在酵母中的表达(免疫印迹)。
图3显示HPV6aL2在酵母中的表达。在酵母中表达的HPV6aL2的免疫印迹；泳道1，分子量标记；泳道2，在E.coli中表达的trpE-L2融合蛋白作为阳性对照；泳道4，在酵母中表达的HPV6aL1作为阴性对照；泳道5，在酵母中表达的HPV6aL2(实验细节见正文)。
图4是在酵母中表达的HPV6aL1 VLPs的电子显微照片。
图5是在酵母中表达的HPV6aL1/L2 VLPs的电子显微照片。
图6是在酵母中表达的CRPVL1，L2和L1+L2蛋白的免疫印迹表(A)通过用与抗CRPVL1抗血清的反应性测定的CRPVL1的表达。表(B)通过用与抗CRPVL2抗血清的反应性测定的CRPVL2的表达。道1，以kDa为单位的分子量标记(Amershem RainbowTM标记，14300-200000道尔顿)；泳道2，含有CRPVL2表达载体的BJ5462；泳道3，含CRPVL2表达载体的1569株；泳道4和5，为表达CRPVL1和CRPVL2用两种质体共转化的1569株的两种分离体；道6-8含有共表达CRPVL1和L2蛋白的单个载体的1569株的3种分离体；道9和10，含有共表达CRPVL1和L2蛋白的单个载体的BJ5462的两种分离体。L1和L2移动的位置标记在适当的版面的右轴上。图6是图7是酿酒酵母株系1558构建的示意图。
图8是酿酒酵母株系1569构建的示意图。
图9列出提纯过程的主要步骤。
图10是株的名单。
图11显示从酵母提纯的HPV16L1+L2的一套SDS-PAGE测定。除最终提纯的VLP外，从提纯过程中的中间步骤得到的保留物(retains)也包括在内。该表提供每一道中样本的鉴定。用胶状Coomassie印迹的凝胶以及用针对L1和L2蛋白的抗血清探测的Western印迹包括在内。
图12是另一种美洲产白尾棕色兔乳头状瘤L1纯化过程的示意图。
图13和14是纯化的VLP的SDS/PAGE测定。
发明详述本发明提供防止，特征描绘，检测和治疗乳头状瘤病毒(PV)感染的方法，组合物和工艺。该方法基于在酵母中重组体L1或重组体L2或重组体L1和L2蛋白的生产。该重组体蛋白能模仿天然PV的构象性中和性表位。重组体L1或L1和L2蛋白也可能能够形成病毒样颗粒(VLP)。本发明的组合物包括但不限于编码L1或L2或L1和L2蛋白的重组DNA分子，该重组体蛋白可单独存在或与其它重组体蛋白结合，包含至少一种的重组体蛋白，重组体蛋白片段的VLP，包含重组体蛋白的药物学组合物，包含重组体蛋白的疫苗组合物，针对重组体蛋白或VLP的抗体，包含至少一种重组蛋白的免疫原性组合物，包含重组DNA分子或重组体蛋白的诊断试剂盒。本发明的工艺包括但不限于生产重组体蛋白的工艺，此种生产重组体蛋白的工艺包含用重组体DNA分子转化适当的酵母宿主细胞，在允许编码重组体蛋白的DNA表达的条件下培养转化的酵母，并提纯重组体蛋白。本发明的工艺还包括施用重组体蛋白，重组体蛋白组合物或VLP于动物，包括但不限于人类。适当的宿主细胞包括，但不限于酵母属，毕赤酵母属，Kluybermyces，裂殖酵母属和汉逊酵母属的酵母株系。
乳头状瘤病毒感染发生在许多动物中，包括人类，绵羊，狗，猫，兔，猴，蛇和母牛。乳头状瘤病毒感染上皮细胞，通常在感染位点诱导良性的上皮或纤维上皮肿瘤。
基于乳头状瘤病毒感染的宿主可将它们归入不同的组。基于DNA序列同源性将人类乳头状瘤病毒进一步归入60多种型(综述见乳头状瘤病毒和人类癌症，H.Pfister(编)，CRC Press，Inc.，1990)。乳头状瘤病毒型表现为型特异性免疫原，因为对一种型的乳头状瘤病毒感染的中和免疫性不授予针对另一型乳头状瘤病毒的免疫性。
在人类中，不同HPV型引起不同的疾病。HPV类型1，2，3，4，7，10和26-29在正常和免疫妥协个体引起良性疣。HPV型5，8，9，12，14，15，17，19-25，36和46-50在免疫妥协个体中引起扁平损害。HPV型6，11，34，39，41-44和51-55引起生殖器和呼吸道粘膜的非恶性湿疣。HPV型16和18引起生殖道的上皮发育不良并与宫颈，阴道，外阴和肛管的多数原位和侵袭性癌有关。HPV6和HPV11引起大多数生殖器疣和喉乳头状瘤。
在动物中的免疫学研究已显示针对乳头状瘤病毒衣壳蛋白的中和抗体的产生防止同源病毒的感染。由于在体外培养乳头状瘤病毒有关的困难延续了有效的乳头状瘤病毒疫苗的建立。由于缺乏适当的动物模型，有效的HPV疫苗的建立特别缓慢。
抗体对乳头状瘤病毒的中和表现型特异性并依赖于病毒表面的构象表位。
乳头状瘤病毒为编码达8种早基因和2种晚基因的小的，无被膜，20面体DNA病毒。病毒基因组的开放阅读框(ORFs)称为E1至E7和L1和L2，其中“E”指早而“L”指晚。L1和L2编码病毒衣壳蛋白。早(E)基因与病毒复制和转化等功能相关。
L1蛋白是主要衣壳蛋白并具有55-60kDa的分子量。L2蛋白是次要衣壳蛋白，它具有55-60kDa的预期分子量和以聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定为75-100kDa的表观分子量。
通过酿酒杆菌的重组株生产HPV16L1，HPV16L2，和HPV6L1型蛋白已有报导。建立通过培养重组酵母生产大量各种类和型的乳头状瘤病毒蛋白的方法是有用的。生产大量具有天然蛋白的免疫授予特性，如天然蛋白的构象，乳头状瘤病毒蛋白也是有用的。
本发明针对具有天然乳头状瘤病毒的免疫授予特性的重组乳头状瘤病毒蛋白的生产以及它们的生产方法和应用。本发明特别针对对乳头状瘤病毒感染的预防性疫苗的生产。本发明通过以美洲产白尾棕色兔乳头状瘤病毒(CRPV)和人类乳头状瘤病毒型6(HPV型6或HPV6)作为模型系统举例说明。这种举例说明不限制本发明的范围，它包括乳头状瘤病毒(PV)的其它型和亚型，包括但不限于HPV型11，HPV型16和HPV型18以及HPV亚型6a和HPV亚型6b。
包含该蛋白或VLP的药物学上有用的组合物可按照已知方法如混合一种药物学可接受的载体而配制。这种配剂的载体和方法的实例见于Remington’s Pharmaceutical Sciences。为形成适合有效用药的药物学上可接受的组合物，这种组合物应包含有效量的该蛋白或VLP。这种组合物可包含从一种以上HPV衍生的蛋白或VLP。
本发明的治疗性或诊断性组合物以足够治疗或诊断PV感染的量施用于个体。根据一系列因素如个体的状况，体重，性别和年龄，有效量可不同。其它因素包括用药的方式。通常，该组合物以约1μg～250μg的剂量施用。
本药物组合物可以多种途径如皮下，局部，口服，经粘膜和肌肉内，而用于个体。
本发明的疫苗包含包括在宿主中诱导中和抗体形成所需的抗原决定簇的重组蛋白或VLP。这种疫苗还足够安全而施用时无临床感染的危险；不具有毒性副作用；可通过一种有效途径用药；稳定；并与疫苗载体相容。
该疫苗可通过各种途径，如经口，非肠道地，皮下地，经粘膜或肌肉内用药。用药的剂量可根据个体的条件，性别，体重和年龄；用药的途径；以及疫苗的PV型。该疫苗可以胶囊，悬液，酏剂，或液体溶液等形式应用。该疫苗可与一种免疫学上可接受的载体配制。
该疫苗以治疗有效量，即足以产生免疫保护反应的量用药。治疗有效量可根据PV型不同而不同。该疫苗可以单剂量或多剂量用药。
本发明的方法使防止PV感染的亚病毒疫苗配方成为可能。使用该方法，可制备单价或多价PV疫苗。例如，单价HPV型16疫苗可通过配方重组体HPV16L1蛋白或L2蛋白或L1和L2蛋白而制备。另外，可通过混合来自不同HPV型的L1或L2或L1和L2蛋白配制多价HPV疫苗。
本发明的重组体蛋白和LPV可用于免疫原性组合物的配方。这种组合物，当导入适当的宿主时，能在宿主中引起免疫应答。
该重组体蛋白和VLP可用于产生抗体。本文中使用的术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体，以及其片段，例如Fv，Fab和F(ab)2片段，它们都能结合抗原或半抗原。
本发明的重组体蛋白，VLP和抗体可用于对HPV感染进行血清分型和HPV筛查。可将重组体蛋白，VLP和抗体置于适合于HPV检测和血清分型的试剂盒的配方中。这种试剂盒包含间隔化的装载体，适合紧密放置于至少一种容器。该装载物进一步包含试剂，如适合检测多种HPV型的重组体HPV蛋白或VLP或抗HPV抗体。该装载体也可包含检测如标记抗原或酶底物等的工具。
本发明的重组体蛋白和VLP也用作分子量和分子大小标记。
提供下列实施例以进一步明确本发明，而不限制本发明于这些实施例的个别事例。
实施例1酵母株系U9的制备酿酒酵母株系2150-2-3(MATa，leu2-04，adel，cir°)得自Leland Hartwell博士(华盛顿大学，西雅图，华盛顿)。株系2150-2-3的细胞在30℃ 5ml YEHD培养液中培养过夜(Carty等.，J.Ind.Micro.2(1987)117-121)。将细胞在灭菌蒸馏水中洗涤3次，再悬于2ml灭菌蒸馏水中，并将0.1mL细胞悬液种植于6个5-氟-乳清酸(FOA)板的每一个以选择ura3突变株(冷泉港实验室酵母遗传学手册)。将板在30℃温育。该培养液含每250ml蒸馏水3.5g Difco YeastNitrogen Base，不含氨基酸和硫酸氨；0.5g 5-氟-乳清酸；25mg尿嘧啶；和10.0g葡萄糖。
将培养液通过0.2μm滤膜滤过灭菌，然后250ml维持于50℃的5％Bacto-琼脂(Difco)，10ml 1.2mg/ml腺嘌呤，和5ml L-亮氨酸溶液(180mg/50ml)混合。将产生的溶液以每petri盘20ml分配。
温育5天后，出现大量菌落。通过从原始FOA培养板再划线菌落至新鲜FOA培养板上并在30℃温育分离单个菌落。通过影印培养至YEHD板和尿嘧啶减少板对来自第2套FOA板的一些菌落检验ura3突变的存在。所希望的结果是在YEHD上良好生长而在尿嘧啶减少培养液上不生长。得到了表现这些特性的一株分离体(U9)。在-70℃将它贮存为冰冻甘油贮存种(株系#325)以供以后使用。
实施例2制备破裂酵母MNN9基因的载体为制备分离MNN9基因的载体，首先需要从酿酒酵母基因组DNA克隆MNN9基因。这一点通过标准的多聚酶链反应(PCR)技术完成。供全长MNN9编码序列的PCR使用的5’正义(Sense)引物和3’反义引物基于已发表的酵母MNN9基因序列设计(ZymogeneticsEPO专利申请第88117834.7号，出版物第0-314-096-A2)下列含侧翼Hind III位点的(下划线的)寡脱氧核苷酸引物被使用正义引物 5’ - CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3’ (序列 ID NO1)反义引物 5’ - TGA TAA GCTTGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3’ (序列 ID NO2)MNN9基因的起始蛋白酶密码子以粗体强调。PCR的进行使用得自酿酒酵母株系FRY 188的基因组DNA作为模板，Taq DNA多聚酶(Perkin Elmer)和25个扩增循环(94℃，1分钟；37℃，2分钟；72℃，3分钟)。产生的1.2kbp PCR片段用Hind III消化，凝胶纯化，并与Hind III消化的碱性磷酸酶处理的pUC13(Pharmacia)连接。产生的质体称为p1183。
为用酵母URA3基因破裂MNN9基因，将质体pBR322-URA3(它含编码亚克隆λpBR322的Hind III位点的酿酒酵母URA3基因的1.1kbpHind III片段)用Hind III消化并将带有有功能的URA3基因的1.1kbpDNA用凝胶提纯，用T4DNA多聚酶作钝末端，然后与Pml I-消化的质体p1183连接(PmlI在MNN9编码序列内剪切)。产生的质体p1199含有MNN9基因被有功能的URA3基因形成的碎片。
实施例3含有MNN9基因碎片的U9衍生株系1372的构建为破裂株系U9(#325)中的MNN9基因，将30μg质体p1199用Hind III消化以产生线性mnn9∷URA3破裂盒。株系325细胞用Hind III消化的p1199 DNA通过原生质球方法转化(Himmen等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA &51929-1933)并将转化体在缺乏尿嘧啶和含1.0M山梨醇的合成琼脂上选择。该合成培养基含，每升蒸馏水琼脂，20g；酵母氮碱w/o氨基酸，6.7g；腺嘌呤，0.04gK；L-酪氨酸，0.05g；山梨醇，182g；葡萄糖，20g；和亮氨酸缺少溶液#2，10ml。亮氨酸缺少溶液#2含升蒸馏水L-精氨酸，2g；L-组氨酸，1g；L-亮氨酸，6g；L-异亮氨酸，6g；L-赖氨酸，4g；L-蛋氨酸，1g；L-苯丙氨酸，6g；L-苏氨酸，6g；L-色氨酸，4g。
将板在30℃温育5天，在5天时已出现大量菌落，从10个菌落制成染色体DNA制品，随后用EcoRI加Hind III消化。该DNA消化物随后通过Southern印迹评价(J.Sambrook等，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，1989)，使用带有MNN9基因(从质体p1199分离)的1.2kbp Hind III片段作为探针。鉴定了一株分离体(株系#1372)它在Southern印迹上显示期待的DNA带改变，以及MNN9突变体特征性地显示的极度丛生性(clumpiness)。
实施例4破裂酵母HIS3基因的载体的构建为构建在盒中由URA3基因破裂酿酒酵母HIS3基因的破裂盒，将质体YEp6(K..Struhl等，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 761035)用BamHI消化。将带有HIS3基因的1.7kbp BamHI片段用凝胶提纯，用T4DNA聚合酶制作钝末端，并与事先已用BamHI消化和用T4 DNA聚合酶处理过的pUC18连接。产生的质体(称为p1501或pUC18-HIS3)用NheI(它在HIS3编码序列中剪切)消化，并将载体片段用凝胶提纯，用T4DNA聚合酶制造钝末端，随后用小牛小肠碱性磷酸酶处理。通过用Hind III消化将URA3基因从质体pBR322-URA3分离并将带有URA3基因的1.1kbp片段用凝胶提纯，用T4DNA聚合酶制造钝末端，并与上述pUC18-HIS3 NheI片段连接。产生的质体(称为pCU18-his3∷URA3或p1505)含有一个破坏盒，在该盒中酵母HIS3基因被有功能的URA3基因破裂。
实施例5通过HIS3基因分离酵母PRBI基因的载体的构建带有酿酒酵母PRBI基因的质体FP8ΔH由Carnegie-Mellon大学的E.Jones博士提供(C.M.Molhle等，1987，Genetics 115255-263)。将它用Hind III加XhoI消化并将带有PRBI基因的3.2kbp片段用凝胶提纯并通过用T4DNA聚合酶处理制造钝末端。该质体pUC18用BamHI消化，凝胶提纯并通过用T4DNA聚合酶处理制造钝末端。产生的载体片段连接至上述PRBI基因片段以产生质体pUC18-PRBI。质体YEp6，它含有HIS3基因，它用BamHI消化。所产生的带有功能HIS3基因的1.7kbp BamHI片段用凝胶提纯并随后用T4DNA聚合酶处理制造钝末端。pUC18-PRBI用EcoRV加NcoI消化，该酶切PRBI编码序列中剪切并去除蛋白酶B活性位点和侧面序列。在pCU18中带有PRBI编码序列的残基5’和3’部分的5.7kbp EcoRV-NcoI片段用凝胶提纯，；通过用T4DNA聚合酶处理制造钝末端，用小牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化，并与上述钝末端HIS3片段连接。所产生的质体(称为pUC18-prbl∷HIS3，stock#1245)含有有功能HIS3基因替代已如上去除的PRBI基因的这一部分。
实施例6包含MNN9和PRBI基因两者的破裂物的U9相关酵母株系的构建含有MNN9基因.破裂物的U9-相关株系1372在实施例3中描述。株系1372的克隆分离体在FOA板上传代以选择ura3突变体。得到了一些株系1372的ura3分离体，选择一株分离体(株系12930-190-S1-1)用于随后的HIS3基因分离。该pUC18-his3∷URA3基因.破裂物载体(p1505)用XbaI加EcoRI消化以产生线性his3∷URA3破裂物盒并用于通过乙酸锂方法转化株系12930-190-S1-1(Methods inEnzymology，194290(1991))。Ura+转化体在缺乏尿嘧啶的合成琼脂培养基上选择，在同一培养基上为克隆分离体再划线，然后在缺乏尿嘧啶或组氨酸的培养基上影印培养，以筛选同时为Ura+和His-的那些分离体。为随后破坏PRBI基因选择了一株分离体(株系12930-230-1)。该PRBI基因分离物载体(pUC18-prbl∷HIS3，stock#1245)用SacI加XbaI消化以产生线性prbl∷HIS3破坏物盒并用于通过乙酸锂方法转化株系12930-230-1。His+转化体在缺乏组氨酸的琼脂培养基上选择，并在克隆分离体的相同培养基上再切割。从许多所产有的His+分离体制备基因组DNA，用EcoRI消化，然后在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。然后使用针对PRBI基因的放射标记的617bp探针进行Southern印迹分析，该探针使用下列寡脱氧核苷酸引物通过PCR制备5’ TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3’ (SEQ ID NO3)5’ CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3’ (SEQ ID NO4)得到十一株分离体它们显示与带有2.44kbp prbl∷HIS3 DNA片段的探针期待的杂交。它与带有1.59kbp片段的探针对野生型PRBI基因的杂交相反。含有希望的prbl∷HIS3分离物的一株分离体被选择用于进一步的用途并被称为株系#1558。
实施例7为酵母PEP4基因的破裂构建载体酿酒酵母基因以下列方式从酵母基因组文库克隆。含酵母基因组文库pLS101(Schultz和Friesen，1983，J.Bacteriol，1558-14)的大肠埃希杆菌细胞在5ml含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中繁殖过夜。从该培养物，将10-4和10-5稀释液种植于LB加氨苄青霉素板上。使用硝酸纤维素滤器制备菌落板量。用于酵母PEP4基因的600bp探针通过PCR使用Taq DNA聚合酶制备，总质体DNA来自pLS101酵母文库，而下述寡脱氧核苷酸引物的设计是基于已发表的用于PEP4的DNA序列(C.A.Woolford等.，Mol.Cell.Biol.62500(1986))。正义引物 5’ - GAG GCT ACC AGC GAG CCG GGC-3’ (SEQ IDNO5)反义引物 5’ - GGC CAG TGG GCC AAC AGG TTC-3’ (SEQ IDNO6)PCR通过25个扩增循环进行(94℃1分钟，37℃2分钟，72℃3分钟)。PCR探针用凝胶提纯，放射标记，并与上述菌落滤过液杂交。有几个克隆与PEP4探针杂交阳性并在LB加氨苄青霉素板上再划线以培养单个菌落。质体DNA通过碱性-SDS溶解(Sambrook等，上文)从数种分离体制备并用BamHI消化。观察了期待的14kbp载体带和6.9kbpPEP4插入带。经EcoRI加XhoI双消化，观察到PEP4的期待的1.5kbp带。显示这些期待结果的一株分离体(株系#860)被选择供进一步使用。得自株系#860的质体DNA用BamHI消化，并且携带染色体PEP4基因的6.9kbp BamHI DNA片段被亚克隆入pUC13的BamHI位点以产生质体p890。该质体p890随后用NcoI消化(它在PEP4编码序列内剪切)，凝胶提纯，通过用T4DNA聚合酶处理制造钝末端，并与带有有功能URA3基因(按照实施例2中制备)的1.1kbp钝末端片段连接。含有被URA3基因破坏的PEP4基因的质体称为pUC13-pep4∷URA3(株系#906)。
实施例8作为含有prbl和pep4两种突变的株系U9的衍生产物的酵母株系#1569的构建为破裂株系U9中的HIS3基因，将破裂物载体pUC18-his3∷URA3用EcoRI加XbaI消化，随后用于通过乙酸锂方法转化株系U9。Ura+转化体在缺乏尿嘧啶的琼脂培养基上选择并在同一培养基上划线以供克隆分离体。产生的Ura+分离体的一些复制种植于缺乏尿嘧啶或组氨酸的琼脂上并筛选Ura+并且His-者。一株分离体(株系#1524)被选择用于随后破裂PRBI基因。该PRBI基因破坏物载体pUC18-prbl∷HIS3用SacI加XbaI消化并随后用于通过乙酸锂方法转化株系#1524。His+转化体在缺乏组氨酸的琼脂培养基上选择并在相同培养基上为克隆分离体再划线。基因组DNA从一些His+分离体制备，并通过用放射标记的PRBI探针进行Southern印迹杂交来评价。显示所希望的PRBI基因被HIS3(即prbl∷HIS3)破裂的一株分离体(株系#1537)被选择用于PEP4基因的随后破裂。株系#1537在FOA板上传代以获得ura3分离体并且一株分离体(株系#1541)被选择供进一步使用。
为破裂株系#1541中的PEP4基因，将PEP4基因破裂载体pUC13-pep4∷URA3用XhoI消化以产生线性pep4∷URA4破裂盒并用于通过乙醋锂方法转化株系#1541。Ura+转化体在尿嘧啶减少的琼脂培养基上被选择并再划线以便在相同培养基上的克隆分离。基因组DNA从一些Ura+转化体制备，并使用针对PEP4基因的放射标记探针通过Southern印迹评价。显示PEP4基因被URA3基因所希望的破坏的一株分离体(株系#1569)被选择供进一步使用。
实施例9CRPV L1表达载体的构建CRPV L1基因从含有完整CRPV病毒基因组的质体pLAII(PeterHowley博士，NCI)通过PCR被扩增，PCR使用Vent聚合酶(NewEngland Biolabs，Inc.)，35个扩增循环(94℃，1分钟；50℃，1分钟；72℃，2分钟)并使用下列含侧翼BglII(下划线)位点的寡核苷酸引物正义引物 5’ - GAA GAT CTT CAA AAC AAA ATG GCA GTG TGGCTG TCT AC - 3’ (SEQ ID NO7)反义引物 5’ - GAA GAT CTT TAT TAA GTA CGT CTC TTG GGTTTA G-3’ (SEQ ID NO8)
正义序列在紧邻CRPV L1起始蛋白酶密码子(以粗体强调)的上游导入一个酵母非翻译前导序列。1.6kb的L1 PCR产物用BglII消化，凝胶提纯并亚克隆入载体pSP72(promega)的Bgl II位点以产生质体pSP72-CRPV-L1(p12930-314-4-1)。
一个亚克隆被完全测序并发现与已发表的CRPV L1序列有4个核苷酸不同。该变化不导致氨基酸变化。L1基因作为BglII片段从pSP72-CRPV-L1剪切并亚克隆入位于酵母GAL 10启动子和酵母表达载体pC1/1GAL 10pADHlt中的ADH1转录终止子之间的独特BamHI位点，该pC1/1GAL 10pADHlt含得自YEp52的GAL 10启动子(Broach等，Exp.Manipulation of Gene Expression，1983，8381-116)和pC1/1载体骨架中的ADHl转录终止子。所产生的质体称为p12930-323-6-1。
实施例10CRPV L2表达载体的构建在用Sal I消化质体后使用Vent聚合酶(New England Biolabs，Inc.)从质体PLA II通过PCR扩增，CRPV12基因，凝胶提纯该7.9kb片段并连接至其自身。进行35个扩增循环(90℃，1分钟；50℃，1分钟；72℃，2分钟)并使用含侧翼EcoRI位点(下划线)的寡核苷酸引物正义引物 5’ - GGA ATT CAC AAA ACA AAA TGG TTG CAC GGTCAC GAA AAC-3’ (SEQ ID NO9)反义引物 5’ - GGA ATT CTT ATT CTG CGT AGA CAG CCA CACTG-3’ (SEQ ID NO10)该正义引物在紧临CRPV L1起始蛋白酶密码子(以粗体强调)上游引入一个酵母非翻译前导序列。该1.5kb PCR产物用EcoRI消化，凝胶提纯并亚克隆入包含背离酵母GAL1/GAL10启动子的双向启动子载体pUC18-GAL1p-GAL10p的EcoRI位点。该载体在GAL1启动子和ADH1转录终止子的第一拷贝之间含有一个单一BamHI位点，单一EcoRI和SmaI位点位于GAL10启动子和ADH1转录终止子的第二拷贝间。产生的表达载体在一个1.4kb SphI片段上携带。含有希望的紧邻GAL10启动子插入的L2的1个克隆(p12930-295-2-2)被完全测序并显示含有与发表的序列相比6个核苷酸的变化，其中4个导致氨基酸变化。起始模板DNA的序列测定证实该变化也存在于pLAII中而不是由PCR引起的。含L2基因的该pUC18-GALlp-GAL10p载体用SphI剪切，并将带有ADHlt-GAL1p-GAL10p-L2-ADHlt表达盒的2.9kb片段连接于酵母穿梭载体pC1/1的大SphI片段。所产生的质体称为p12930-323-2-3(pC1/1-GAL1p-GAL10p-CRPV-L2)。
实施例11CRPV L1和CRPV L2衣壳蛋白在酵母中的表达质体p12930-323-6-1和p12930-323-2-3(pC1/1-GAL10p-CRPV/L1和pC1/1-GAL1p-GAL10p-CRPV/L2)被用于转化酿酒酵母株系#1569，BJ5462[E.W.Jones，Methods inEnzymology 194(1991)428-453]和BJ1995[Jones，ibid]。克隆分离体在30℃在含2％半乳糖的YEHD培养基培养48-72小时。收获细胞后，用玻璃珠使细胞团破碎，Triton X-100加至终浓度为0.5％并通过免疫印迹测定对产生的细胞溶解物进行CRPV L1和L2表达的评价。含40μg总细胞蛋白的样品在还原和变性条件下在12％ Tris-甘氨酸凝胶(Novex)上电泳并电印迹至PVDF膜(Novex)。CRPV L1和L2蛋白使用多克隆抗L1和抗L2抗血清(Hershey Medical Center的Dr.John Kreider惠赠)作为第一抗体并使用结合于辣根过氧化物酶的蛋白A(Amersham，Inc.)作为第2抗体进行检测。该膜使用化学荧光ECCTM检测药盒(Amersham，Inc.)加工。在所有带有L1表达质体的样品中均检测到55-61 kDa的L1蛋白带，而在来自酵母的带有L2表达质体的所有样本中均检测到约90kDa的L2蛋白带。
用抗L2抗血清检测衍生自载有L1表达质粒的酵母克隆的样品没有信号检测到，反之亦然。
实施例12A.重组CRPV L1衣壳蛋白的提纯除非特别指出，所有步骤均在4℃进行。贮存于-70℃的细胞被解冻并悬溶于相等体积的“L1缓冲液”(20mM磷酸钠，pH 7.2，100mMNaCl，1.7mM EDTA)。蛋白酶抑制因子PMSF和胃酶抑素A被加入至悬液中至终浓度分别为2mM和1.7μM。细胞在微流化床(microfluilizer)中流过10次而被溶胞。溶胞产物通过在5000xg离心10分钟澄清。上清液在L1缓冲液中5cm 45％蔗糖(w/v)垫的上面分层，L1通过在100,000xg离心4小时沉淀。沉淀物再悬于1/10体积L1缓冲液中并通过在5000xg离心10分钟澄清。吐温-80被加至上清液至终浓度为0.01(v/v)并将上清液在室温通过在Sephacryl S-1000树脂(Pharmacia)的1700ml柱(5cm ID)，上通过分子排阻层析法分级。此柱的走柱缓冲液为10mM磷酸钠，pH 7.2，150mM NaCl，0.01％(v/v)吐温80。含有通过免疫斑点印迹方法测定具有免疫活性的物质级分被收集并通过超滤浓缩至1/6体积，超滤使用带有76mm直径YM-100平片膜(100000 MWCO)的Amicon搅拌室。该产物通过Millex-GV 0.22μm膜(Millipore)灭菌滤过。经提纯的CRPV L1衣壳蛋白被吸附至氢氧化铝，浓度为100μg/ml。B.重组CRPV L1衣壳蛋白的特征描述终产物的鉴定通过Western印迹和通过N-末端序列测定证实。通过SDS/PAGE加Coomessie和银染确定纯度，并通过带有215nm处光学检测的溶液筛选毛细管电泳(SSCE)。通过SSCE显示该制品纯度为75％。
实施例13重组CRPV 12衣壳蛋白的提纯除非特别指出，所有步骤均在4℃进行。贮存在-70℃的细胞被解冻并悬溶于等体积的“L1缓冲液”(20mM磷酸钠，pH 7.2，100mMNaCl，1.7mM EDTA)。将蛋白酶抑制剂PMSF和胃酶抑素A加至悬溶液至终浓度分别为2mM和1.7μM。细胞在微流化床中通过10次而被溶解。溶解物通过在5000xg离心10分钟被澄清。上清液在5ml Ll缓冲液中的45％蔗糖(w/v)垫上部分层，L2在100000xg离心4小时被沉淀。将沉淀物再悬溶于1/10体积的L1缓冲液中。该再悬溶的沉淀物通过在5000xg离心10分钟澄清。将吐温80加入上清液中至达到终浓度为0.01％(v/v)并将上清液在室温通过在Sephacryl S-1000树脂(Phamacia)的1700ml柱(5cm ID)上进行分子排阻层析而分级。该柱的走柱缓冲液是10mM磷酸钠，pH 7.2，150mM NaCl，0.01％(v/v)吐温80。通过免疫斑印迹显示含有免疫活性物质的级分被收集。收集的级分进行SDS/PAGE(银染)和Western印迹测定。
实施例14A.重组CRPV L1衣壳蛋白的提纯-方案1
贮存在70℃的细胞被解冻并悬溶于等体积的破坏缓冲液中(20mM磷酸钠，pH7.2，100mM NaCl，1.7mM EDTA)。将蛋白酶抑制剂PMSF和胃酶抑素A加入悬液至终浓度分别为2mM和1.7μM。细胞经10分通过微流化床而被溶解。溶解产物通过在5000xg离心10分钟被澄清。上清液在L1缓冲液的5ml 45％蔗糖(w/v)垫上部分层，而L1则通过在100000xg离心4小时被沉淀。将沉淀物再悬溶于1/10体积的L1缓冲液中。再悬溶的沉淀物通过在5000xg离心10分钟澄清。将吐温80加入上清液中至终浓度为0.01％并将上清液在室温通过分子排阻层析法在Sephacryl S-1000树脂(Phamacia)的1700ml柱(5cm ID)上分级。该柱的走柱缓冲液为10mM磷酸钠，pH7.2，150mM NaCl，0.01％吐温80。经免疫斑点印迹测定含免疫活性物质的级分被收集并通过使用带有76mm直径YM-100平片膜(100000 MWCO)的Amicon搅拌室超滤而浓缩至1/6体积。该产物通过Millex-GV 0.22μm膜(Millipore)灭菌滤过。B.重组CRPV L1衣壳蛋白的特征描述终产物的鉴定通过Western印迹和N-末端序列测定证实。纯度通过SDS/PAGE加Coomessie和银染确定，并通过带有215nm处光学检测的溶液筛选毛细管电泳(SSCE)。经SSCE测定L1为75％纯品。电镜显示存在50～55nm直径大小范围的VLP。C.分析性分子排阻HPLC为测定VLP，样本按照依次分子排阻色谱法分级。色谱使用Perkin-Elmer系列410生物泵HPLC进行，带有一个接有200微升注射环的ISS 100自动注射器。该柱是TSK-凝胶G5000 PW，7.5×600mm(TOSOHAAS，Montgomeryville，宾夕法尼亚)。为监测蛋白从柱上的洗脱，在280mm处的光学检测通过Perkin-Elmer LC-235二极管列阵检测器完成。流动相为0.5M NaCl于10mM磷酸钠缓冲液中，pH7.2。流速为0.5mL/分，收集1ml的级分。柱校准使用来自Sigma公司的蛋白标准以及重组乙肝表面抗原(Recombivax Merck & Co西点，宾夕法尼亚)。在洗脱中收集的级分中的抗原的检测通过免疫斑点印迹测定完成。D.免疫斑点印迹测定每个级分的10微升级分被加至PVDF膜试纸条上(Immobilon-P，Millipore Corp.，Bedford，MA)，该试纸被预先沾湿并置于湿的印迹纸上。样品浸及膜中，膜被置于阻断溶液中(5％(w/v)脱脂干燥奶溶于0.15M NaCl，0.02％(w/v)叠氮化钠，0.01M磷酸钠，pH7.2)并在室温在轻柔搅拌下温育至少3小时。阻断溶剂被倾去并用第1抗体溶液取代。
使用的第一抗体取决于要被检测的抗原CRPV L1用兔抗CRPV血清“晚反应”(Biodesign International，Kennebunk，ME)探查。CRPV L2用免抗CRPV L2血清探查。
HPV6a L1用单克隆抗体MAB837(Chemicon International，Inc.，Temecula，加利福尼亚)探查。HPV6a L2用小鼠抗HPV6a L2-trpE融合血清探查。
使免疫复合物可观察的方法是常规方法，使用连接于碱性磷酸酶的第二抗体和产物质NBT/BCIP。E.液相筛(solution sieving)毛细管电泳(SSCE)CRPV VLP样本(～0.2毫克/毫升)在100℃在1％2-巯基乙醇和1％(w/v)SDS中加热10分钟。该样本与参考标记物，苯六羧酸一起被电动地加至硅融合的毛细管，42cm(距检测器22cm)×0.05mm l.D.，用10倍腔体积的0.1N NaOH水和ProSort筛剂(sieving reagent)(Applied Biosystems，Foster City，加利福尼亚)预平衡。使用AppliedBiosystems Model 270A-HTCE仪器给予300伏特/cm的分压。洗脱样本通过在215nm处的吸收率监测，使用Nelson Turbochrom 3软件收集数据。F.从重组CRPV L1衣壳蛋白制造疫苗经提纯的CRPV L1衣壳蛋白以100μg/ml的浓度被吸收至Al(OH)3。
实施例15通过用酵母衍生的CRPV L1 VLPs进行疫苗接种避免CRPV引起的乳头状瘤发展对5只新西兰白兔进行免疫接种，肌肉内注射吸收于铝的135mg L1VLPs(75％纯度，见实施例17)或作为阴性对照的吸收于氢氧化铝的100mg重组乙型肝炎表面抗原(99％纯度)。这些动物经过8周给予两次加强注射，随后在最后一次加强注射后10天用CRPV攻击。在免疫接种前，每次加强注射时，和攻击前采集的血清通过L1-VLP特异性ELISA测定。间接ELISA测定方法被用于确定对酵母表达的CRPV L1 VLPs的血清抗体反应。在ELISA中使用的抗原是使用Christensen等描述的重组棒病毒(baculovirus)在昆虫细胞中表达的CRPV L1 VLPs(J.Virol，643151-3156，1990；J.Gen.Virol.752271-2276(1994)。山抗兔IgG-碱性磷酸酶被用作第2抗体而P-硝基苯磷酸酶作为底物(Kirkegaard and Perry Labs.，Inc)。在405nm处测定吸收率。通过终点稀释度(以1∶100开始的血清的3倍稀释)测定滴度，如果L1-特异性吸光度超过兔免疫接种前血清的平均吸收率读数加2个标准差则认为是阳性。确切的滴度使用SOFTmax程序版本2.3(MolecularDevices Inc.，Menlo Park，加利福尼亚)从这些数据计算。
抗L1 VLP抗体滴度在第1次免疫接种后4周出现，并且随每次加强注射而增加。对照动物则阴性。在CRPV攻击后6周，接种的动物在15个攻击位点15个均无湿疣(1∶2稀释或1∶12稀释的病毒贮存种)而对照动物在15个位点显示12个湿疣形成(1∶2稀释病毒)或15个中9个显示湿疣形成(1∶12稀释病毒)。15周后，被免疫接种的动物仍无湿疣。
通过将兔血清与CRPV混合并随后用经处理的CRPV攻击兔进行病毒中和测定(基本按照Christensen等1991，Virology 181572-579中的方法)。确定中和抗体的标准是完全病毒中和(3/3位点湿疣形成阴性)。测定来自5个免疫接种的动物和5个对照动物的血清。在1剂CRPV L1 VLPs后收集的血清在80％(4/5)的兔中含有能完全中和未稀释的病毒。在2或3剂CRPV L1 VLPs后，100％的兔(5/5)具有病毒中和抗体。对照血清不显示任何病毒中和活性。取决于最终滴度，选择的免疫接种的动物的血清可在10-1000倍间进行稀释并仍具有100％中和性。
为检测是否中和抗体反应对天然CRPV L1 VLPs是特异性的，选择一种免疫血清并与已被包被天然或变性酵母衍生CRPV L1 VLPs的硝酸纤维素方块温育。硝酸纤维素方块(1cm2)包被有天然的或变性的(在8M尿素中用碘乙酸还原和烷基化)酵母表达的CRPV L1 VLPs。天然的或变性的酵母提取物被用作对照。兔免疫血清用硝酸纤维素方块系列温育4次，4℃8-14小时，随后按上述在病毒中和测定中被检测。只有天然CRPV L1 VLPs能吸收负责中和CRPV的抗体，而变性或对照酵母蛋白不吸收这些抗体。另外，天然CRPV L1 VLPs也去除对在昆虫细胞中表达的CRPV L1 VLPs ELISA反应性(数据未显示)。
实施例16在单个质体中共表达CRPV L1/L2的载体的构建质体pSP72-CRPV-L1(p12930-314-4-1)用Bgl II消化并且携带带有酵母5’-非翻译区前导序列的CRPV L1 ORF的1.5kbpBgl II片段被凝胶提纯。质体p12930-323-2-3(pC1/1-GAL1p-GAL10p-CRPV-L2)用BamHI消化，该BamHI在GAL1启动子和ADH1转录终止子间剪切。线性载体片段被凝胶提纯并随后与前述CRPV-L1 BglII片段连接以产生质体p12930-366-1-2(pC1/1-GAL1/10p-CRPV/L1+L2)。这导致形成含有在GAL1启动子控制下的CRPV-L1 ORF和在GAL10启动子控制下的CRPV-L2 ORF的质体。
实施例17从两种质体共表达CRPV L1/L2的载体的构建含L2基因的pUC18-GAL1p-GAL10p载体用SphI剪切并将带有ADHlt-GAL1p-GAL10p-L2-ADHlt表达盒的2.9kb片段用凝胶提纯和通过用T4RNA聚合酶处理制造钝末端。酵母穿梭载体YEP24[Botstein等，Gene 817(1979)]用BamHI消化，通过用T4DNA聚合酶处理制造钝末端，用牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化，然后与上述钝末端L2表达盒连接以产生质体p1594。
实施例18在酵母中CRPV L1和L2的共表达质体p12930-366-1-2(pC 1/1-GAL1/10p-CRPV/L1+L2)被用于转化酿酒酵母株系#1569和BJ5462(一种质体系统)并将产生的转化体在亮氨酸减少的合成琼脂培养基上选择。在平行实验中，株系1569被pC 1/1-GAL10p-CRPV-L1表达载体p12930-323-6-1加YEP 24-GAL10p-L2表达载体p1594(两种质体系统)共转化，并将产生的含两种载体的转化体在缺乏亮氨酸和尿嘧啶两种物质的合成琼脂培养基上选择。单质体系统和双质体系统两者的克隆分离体在30℃在含2％半乳糖的YEHD复合培养基中培养48-72小时。收获细胞后，将细胞沉淀物用玻璃珠打碎。加入Triton X-100至终浓度为0.5％并通过免疫印迹测定法测定CRPV L1和L2的表达。含50μg总细胞蛋白的样本在还原和变性条件下在8-16％Tris-甘氨酸梯度凝胶(Novex)上电泳并电印迹至PVDF膜(Novex)上。CRPV L1和L2蛋白使用多克隆兔抗L1或抗L2抗血清(Hershey Medical Center的JohnKreider博士惠赠)作为第一抗体并使用连接于辣根过氧化物酶的蛋白A(Amersham，Inc.)作为第二抗体进行检测。膜使用化学荧光ECLTM检测盒(Amersham，Inc.)加工。55～61kDa的L1蛋白带和约90kDa的L2蛋白带在来自带有L1+L2表达质体的酵母克隆的所有样本中检测到。在来自带有L1表达质体的酵母克隆的所有样本中未检测到L2的信号。在来自只含L2表达载体的细胞的样本中未检测到L1的信号。
实施例19提纯CRPV L1和CRPV L1+L2 VLPs供电镜研究将酵母表达的CRPV L1和CRPV L1和L2蛋白部分提纯和浓缩以供电子显微镜(电镜)研究。在1.5升含2％半乳糖的YEHD培养液中接种用L1+L2共表达载体p12930-366-1-2(pC1/1-GAL1/10p-CRPV/L1+L2)转化的酿酒酵母株系#1569或BJ5462，并在30℃培养48-72小时。在平行实验中，以GAL10p-CRPV-L1表达载体p12930-323-6-1加YEp24-GAL10p-L2质体p1594共转化的株系#1569细胞按相似方式培养。收获细胞并将细胞沉淀物冷冻于-70℃。所有下列步骤均在4℃进行。细胞沉淀物被解冻并悬溶于等体积的“L1缓冲液”(20mM磷酸钠，pH7.2，100mM NaCl，1.7mMEDTA)。蛋白抑制因子PMSF和胃酶抑素A被加至悬液至终浓度分别为2mM和1.7μM。细胞经3-5次通过微流化床被溶解。溶解产物通过在5000xg离心10分钟被澄清。上清液在L1缓冲液中45％(v/v)蔗糖的5ml垫上部分层，并且L1，L2或L1和L1蛋白通过在100000xg离心4小时被沉淀。沉淀物再悬溶于1/10体积的L1缓冲液。再悬溶的沉淀通过在5000xg离心10分钟澄清。
为进行电镜分析(Structure Probe，West Chester，宾夕法尼亚)，将一份等分试样置于200目网状碳包被的铜格栅上。将1滴2％磷钨酸(PTA)，pH 7.2置于格栅上20秒。该格栅在TEM检查前进行空气干燥。所有显微观察均使用JEOL 100CX发射电子显微镜(JEOL USA，Inc.)以100KV的加速电压进行。所产生的显微照片最终放大率为100000倍。
在所有带有CRPV L1表达质体或带有共表达CRPV L1和L2的质体的酵母样本中，在50-55nm直径大小范围观察到VLP。在酵母对照样本或只携带L2表达质体的酵母样本中未观察到VLP(图7，8，9)。
实施例20重组CRPV L1衣壳蛋白的提纯-方案2除非特别指出，所有步骤在4℃进行。
贮存在-70℃的细胞被解冻并悬溶于等体积的破坏缓冲液(20mM磷酸钠，pH7.2，100mM NaCl，1.7mM EDTA)中。蛋白酶抑制因子PMSF和胃酶抑素A被加入至终浓度分别为2mM和1.7μM。细胞使用BioNeb Cell Disruptor系统(Glas-Col Apparatus Co.，TerraHaute，IN)进行溶解。溶解产物通过在5000xg离心10分钟进行澄清。
上清液在L1缓冲液中5cm的45％蔗糖(w/v)垫上部分层，L1通过在100000xg离心4小时被沉淀。沉淀物再悬溶于1/10体积的L1缓冲液中。再悬溶的沉淀物通过在5000xg离心10分钟被澄清。
上清液用PBS 1∶5稀释，通过在Sorvall SA-600离心器中在4℃以6500rpm离心10分钟被再澄清。上清液经0.22微米注射器滤器滤过并通过阴离子交换层析法分级。
阴离子交换层析的进行使用带有5毫升注射环的Perkin-Elmer系列410生物泵HPLC进行。层析介质为在150mm×10mm ID玻璃柱中的Fractogel EMF TMAE-650(S)25-40微米树脂(EMSeparations，Gibbstown，NJ)。为监测蛋白从柱上的洗脱，使用Perkin-Elmer LC-235二极管列阵检测器进行280nm处的光学检测。该柱用0.01M磷酸钠缓冲液中0.15M NaCl，pH7.2(缓冲液A)平衡。该柱以0.75ml/分的流速走柱。将样本加在柱上，并用缓冲液A洗柱以去除未结合物质。结合物质用氯化钠线性浓度梯度0.15M至0.65M洗脱5分钟，随后用0.65M至1.15M线性梯度洗脱30分钟。在洗脱中收集的级分中抗原的检测通过免疫斑点印迹测定进行。含免疫活性物质的级分(即，在0.81M和1.05M NaCl间被洗脱的级分)被收集。
收集的级分在Macrosep离心浓缩装置(Filtron Technology Corp.，Northborough，MA)中被浓缩至1/5体积。
该浓缩物通过使用在87cm×27mm ID柱中的Sephacryl S-1000SF树脂(Pharmacia，Piscataway，NJ)通过分子排阻层析法进行分级。该柱以2.5ml/分流速走柱。蛋白的洗脱通过280nm处的吸收率监测。抗原通过免疫印迹检测。
含有免疫活性物质的级分收集在一起并通过起滤浓缩，使用带有43mm直径YM-100平片膜(Amicon，Inc.，Beverly，MA)的搅拌室(Amicon，Inc.，Berverly，MA)在10psi氮气分压下进行。
终产物通过SDS/PAGE加Coomassie染色，和通过溶液筛选毛细管电泳(SSCE)进行特征描述。得自方案2的该终产物用SSCE检测度为88％。
实施例21A.重组CRPV L1衣壳蛋白的提纯-方案3除非特别指出，所有步骤在4℃进行。
贮存于-70℃的细胞被解冻并悬溶于等体积的破坏缓冲液(20mM磷酸钠，pH7.2，100mM NaCl，1.7mM EDTA)。蛋白酶抑制因子PMSF和胃酶抑素A被加入悬液至终浓度分别为2mM和1.7μM。使用BioNeb Cell Disruptor系统(Glas-Col Apparatus Co.，TerraHaute，IN)溶解细胞。溶解产物通过在5000xg离心10分钟澄清。
上清液在L1缓冲液中5cm 45％蔗糖(w/v)垫上部分层，L1通过在100000xg离心4小时被沉淀。沉淀物被再悬溶于1/10体积的L1缓冲液中。再悬溶的沉淀物通过在5000xg离心10分钟澄清。
上清液用1/2体积氯仿提取。移去水层并在室温在Beckmanmicrofuge中以12000rpm离心5分钟澄清。
上清液用PBS 1∶5稀释，通过在4℃在Sorvall SA-600离心器中以6500rpm离心10分钟再澄清。该上清液经0.22微米注射器滤器过滤并通过阴离子交换层析分级。
阴离子交换层析使用带有5毫升注射环的Perkin-Elmer系列410生物泵HPLC进行。层析介质为150mm×10mm ID玻璃柱中的Fractogel EMF TMAE-650(S)25-40微米树脂(EMSeparations，Gibbstown，NJ)。为监测蛋白从柱上的洗脱，使用Perkin-Elmer LC-235二极管列阵检测器进行280nm处的光学检测。该柱用0.01M磷酸钠缓冲液中的0.15M NaCl，pH7.2(缓冲液A)预平衡。该柱以0.75ml/分的流速走柱。将样本加在柱上，用缓冲液A洗柱以去除未结合物质。结合的物质用氯化钠线性浓度梯度洗脱，先0.15M至0.65M5分钟，随后用0.65M至1.15M线性梯度洗脱30分钟。洗脱中收集的级分中抗原的检测通过免疫斑点印迹测定完成。含免疫活性物质的级分(即，在0.81M和1.05M NaCl间洗脱的级分)被收集在一起。
经收集在一起的级分在Macrosep离心浓缩装置(FiltronTechnology Corp.，Northborough，MA)中浓缩至1/5体积。
该浓缩物使用87cm×27cm ID柱中的Sephacryl S-1000SF树脂(Pharmacia，Piscataway，NJ)通过分子排阻层析法分级。该柱以2.5ml/分的流速走柱。蛋白的洗脱在A280nm处监测。抗原通过免疫印迹检测。
含免疫活性物质的级分被合并，并通过使用带有43mm直径YM-100平片膜(Amicon，Inc.，Berverly，MA)的搅拌室(Amicon，Inc.，Beverly，MA)在10psi氮气压力下通过超滤浓缩。
终产物经用Coomassie染色的SDS/PAGE，并通过溶液筛选毛细管电泳(SSCE)进行特征描述。方案3终产物的纯度经SSCE测定为95％。
实施例22在富含复合物和化学限定培养基中CRPV L1和HPV型6aL1(株系1644)的表达这些株系的接种物在如上所述的无亮氨酸合成培养基中培养以供转移至摇动瓶培养。所使用的这些摇动瓶用障板隔断以得到高通气能力(每300mL烧瓶70ml液体，Tunair Labware)并且向培养基中补充Ca0.5mL/L的抗泡剂(UCON LB-625，Union Carbide)。丰富的复合培养基含(每升)40g Difco酵母提取物；20g Sheffietel Hysoy胨；30g葡萄糖；50g半乳糖；在灭菌前将培养基调节为pH5.3。所使用的化学限定培养基类似于Oura所述者(Biotechnol.Bioengineer.161197-1212，1974)但补充以(每升)0.1g氯化胆碱；0.4g腺嘌呤；30g谷氨酸钠作为氮源；0.2g尿嘧啶；20g葡萄糖；40g半乳糖。在烧瓶中接种3mL接种物并在28℃温育66小时，在旋转摇动器上每分钟转动250转。在一定时间间隔从烧瓶中取样，通过使用抗CRPV L1和抗HPV 6a L1抗血清的免疫印迹证实表达。
实施例23HPV-6a基因组的克隆从一例诊断为严重尖锐湿疣的病人得到的组织(由IndianaUniversity School of Medicine的Dr.Darron Brown提供)通过限制性酶消化和聚合酶链反应(PCR)分型并显示含有HPV型6a。从组织样本中提取DNA并用Hind III酶消化。在通过0.8％低融温度琼脂糖prep凝胶按大小分级后，将8-kb区从凝胶上切除并用GelaseTM酶(Epicentre Technologies，Inc.)消化琼脂糖。将样本与已被Hind III消化并去磷酸化的pUC18(Pharmacia，Inc.)连接。在相应E.coli DH5细胞(BRL)转化后，该质体文库使用与HPV-6a L1基因互补的32P标记的寡脱氧核苷酸筛选HPV-6a阳性克隆。含8-kb HPV-6a基因组的pUC18质体被分离，并通过限制性酶和Southern印迹测定确定性质。这种质体称为pUC18-HPV-6a。完整8-kb HPV-6a基因组使用ABI自动配对序列仪(#373A)按照制造商的说明进行测序。
从1名25岁，产后女性病人得到一个大的外阴尖锐湿疣病损。该病损的碎片在液氮中冷冻，然后用Braun mikrodismembrator II (B.Braun Instruments，Melsungen，德国)加工。产生的物质用0.6％(w/v)十二磺酸钠(SDS)溶解，用蛋白酶K(50 mcg/ml)处理，并用酚/氯仿/异戊醇提取。DNA用乙醇沉淀并通过紫外线分光光度测量定量。高分子量DNA的存在通过琼脂糖凝胶电泳后进行溴化乙锭染色而确定。
HPV DNA 型使用杂种捕获测定确定，商品名为Vira TypePlus(Digene Diagnostics，Beltsville，MD)。使用的HPV探针分为两组，它们的组成是基于每型与生殖道恶性的关系。探针组A包含“低危险”型HPV6，11，42，43和44而探针B包含“高危险”型16，18，31，33，35，45，51，52和56。总DNA用Pst I，BamHI和Hind III消化并在高度严格性条件下进行Southern印迹(Tm-15℃)以确定HPV亚型。
为确定完整HPV6a序列，基于已发表的HPV6b序列合成测序引物。完整8.1kbp HPV6a基因组的两条链通过双脱氧链终止方法进行测序，使用PRISMTM试剂盒和Applied Biosystems(ABI)自动配对测序仪(#373A)按照制造商的说明(ABI，Inc.，Foster City，CA)。在正义和反义序列不配对的情况下，合成额外的HPV6a特异性引物以在有问题区域双向再测序而取得一致。
HPV6a和HPV6a的DNA序列表现大于97％的一致性，在8010bp中鉴定出共229bp改变。与HPV6b序列相比最显著的不同发现是在长控制区中(LCR；nt7205-nt106)。在HPV6a LCR中除数个单核苷酸(nt)改变外，还发现在nt7350处一段94bp的插入和在nt7804处另一段19-bp的插入。在nt7615，HPV6a基因组删除6个碱基对。
实施例24HPV6a L1酵母表达载体的构建HPV6a DNA被用作PCR的模板。HPV6a L1基因的PCR扩增使用Vent聚合酶(New England Biolabs，Inc.)，35个扩增循环(94℃1分钟，48℃1分钟，72℃1分45秒)，并使用含侧翼BglII位点(下划线)位点的下列寡脱氧核苷酸引物正义引物 5’ - CTCAGA TCTCAC AAA ACA AAA TGT GGC GGCCTA GCG ACA GCA CAG-3’ (SEQ ID NO11)反义引物 5’ - GAGAGA TCTTAC CTT TTA GTT TTG GCG CGCTTA C-3’ (SEQ ID NO12)正义引物在紧邻HPV6a L1起始蛋氨酸密码子(以粗体强调)上游导入酵母非翻译前导序列。1.5kbp的L1PCR产物用Bgl II消化并凝胶提纯。pC1/1-GAL表达载体通过从双向启动子载体pUC18-GAL1p-GAL10p分离1.4kbp SphI片段而构建，该pUC18-GAL1p-GAL10p含有来自两侧各带有1个拷贝酵母ADH1转录终止子的质体pBM272的发散GAL1/GAL10启动子[Bennetzen，J.L和Hall，B.D.(1982)J.Biol.Chem.2573018-3025]。在产生的表达盒中，BamHI位点位于GAL1启动子和ADH1转录终止子的第一拷贝间，并且SmaI克隆位点位于发散GAL10启动子和ADH1转录终止子第二拷贝间。酵母穿梭载体pC1/1(Rosenberg等，Naturc 312(1984)77-82)用SphI消化并与1.4kbpSphI GAL启动子片段连接。产生的载体，pC1/1-GAL，用BamHI线性化，BamHI在GAL1启动子和ADH1转录终止子之间剪切。BamHI消化的pC1/1-GAL载体和BglII消化的HPV6a L1 PCR片段被连接并用于转化E.coli DH5细胞(BRL)。分离出一种pC1/1-GAL质体，它含HPV-6a L1基因并被称为p13173-357-6。在p13173-357-6中的L1基因被测序(ABL测序仪#373A)并显示与pCU18-HPV6a克隆中的L1基因相同。
实施例25HPV6a L1和L2酵母表达载体的构建质体p13173-357-6(pC1/1-GAL+HPV6a L1)用SmaI消化，该酶在GAL10启动子和ADH1转录终止子之间剪切。1.4kbpHPV6a L2基因通过PCR扩增，使用pCU18-HPV6a DNA作为模板，Vent聚合酶(New England Biolabs，Inc.)，10个PCR扩增循环(94℃，1分钟；48℃，1分钟；72℃，1分45秒)以及下列含有侧翼SmaI位点(下面划线的)的寡脱氧核苷酸引物。正义引物 5’ - TCCCCC GGGCAC AAA ACA AAA TGG CAC ATAGTA GGG CCC GAC GAC-3’ (SEQ ID NO13)反义引物 5’ - TCCCCC GGGCTA GGC CGC CAC ATC TGA AAAAAA TAA GG-3’ (SEQ ID NO14)正义引物在紧邻HPV6a L2起始蛋氨酸密码子(以粗体强调)上游导入酵母非翻译前导序列。该PCR片段用SmaI消化，凝胶提纯并与SmaI消化的p13173-357-6质体连接。含HPV6a L1和L2基因两者的pC1/1-GAL质体被分离并命名为p14049-7-2。L2基因被测序(ABI测序仪#373A)并发现与pUC18-HPV6a克隆中的L2基因一致。
实施例26在酵母中HPV6a L1的表达和HPV6a L1和L2的共表达质体p13173-357-6(pC1/1-GAL+HPV6a L1)和p14049-7-2(pC1/1-GAL+HPV6a L1和L2)被用于转化酿酒酵母株系#1569(MATa，leu2-04，prb1，adc1，pep4，cir°)和#1558(MATa，leu2-04，prb1，mnn9，adc1，cir°)用宿主株#1558产生的重组株系是株系#1644(HPV6a L1)和#1670(HPV6a L1+L2)如表中所示。克隆分离体在30℃在含2％半乳糖的YEHD培养基中培养68-78小时。收获细胞后，将细胞团块用玻璃珠打碎并将细胞产物通过免疫印迹测定法测定HPV6a L1或HPV6a L2蛋白的表达。含40μg总细胞蛋白的样本在10％Tirs甘氨酸凝胶上还原和变性条件下电泳并电印迹至硝酸纤维素滤膜。L1蛋白使用针对trpE、HPV11融合蛋白产生的免抗血清(Brown，D.R.等，Virology 20146-54)作为第一抗体和驴抗免IgG辣根过氧化物酶连接的(HRP)全抗体(Amersham，Inc.)作为第二抗体进行免疫测定。滤网使用化学荧光ECLTM测定盒(Amersham，Inc.)进行加工，在除阴性对照(pC1/1，不加L1或L2基因)外的所有样本中检测到50-55kDa的L1蛋白。
L2蛋白作为70kDa蛋白带通过使用小鼠1∶250稀释血清作为第一抗体以及HRP-连接的，羊抗鼠IgG(Amersham，Inc.)作为第二抗体(1∶1000稀释液)进行Western测定而被检测，该小鼠已用基本按照Carter等的方法制备的trpE-HPV6a L2融合蛋白免疫接种3次。
为进行电镜分析，将每种样本的等分试样置于200筛孔被包被铜格栅上。一滴2％磷钨酸(PTA)，pH7.0被置于格栅上20秒。在TEM检查前该格栅在空气中干燥。所有显微观察均使用JEOL 100CX发射电子显微镜(JEOL USA，Inc.)，使用加速电压100KV。所产生的显微图片最终放大率为100000倍。
在所有带有HPV6a L1或HPV6a L1和L2共表达质体的酵母样品中均在50-55nm直径大小范围内观察到VLP。
实施例27HPV6a L1+L2(株系#1670)株系1670平板培养物的表面生长物被无菌地转至无亮氨酸液体培养基，该培养基含(每升)8.5g Difco酵母氮碱，不加氨基酸和硫酸铵；0.2g腺嘌呤；0.2g尿嘧啶；10g琥珀酸；5g硫酸铵；0.25g L-酪氨酸；该培养基在灭菌前用NaOH调至pH5.0-5.3。在28℃，250rpm旋转摇动器上培养25小时后，在贮存于70℃(1mL/每冰冻小瓶)前通过加入灭菌甘油至终浓度为17％(w/v)制备冰冻培养小瓶。株系1670发酵用的接种物在相同培养基(500mL/每2升烧瓶)中培养并开始于转移2个冰冻培养物小瓶的解冻内容物至2升烧瓶，和在28℃，旋转摇动器上以250rpm旋转温育25hr。株系1670的发酵使用New BrunswickSF-116发酵器，在接种后工作容量为10升。所使用的产物含(每周)20g Difco酵母提取物；10g Sheffield Hysoy胨；20g葡萄糖；20g半乳糖；该培养基在灭菌前调pH至53。2升接种物烧瓶的整个内容物(500m1)被转移至已在28℃，每分钟5升空气，400rpm，3.5psi压力温育的发酵器中。按需要增加搅拌以维持溶解氧气水平大于40％饱合度。发酵的进展通过离线葡萄糖测定(Beckman葡萄糖2测定仪)和在线质量分光光度测定(Perkin-Elmer 1200)监测。温育69小时后，达到每升9.9g干细胞重量的细胞密度。该培养物经中空纤维滤过(Amicon H5 MP01-43 Cartridbge在Amicon DC-10滤过系统中)至ca.2L，用2升磷酸盐缓冲盐水通过滤过(diafilter)，并在分配至500ml离心瓶前进一步浓缩(至ca 1升)。通过在4℃以8000rpm(Sorval GS3离心器)离心4分钟收集细胞团。倾析上清液后，细胞团(总共225g湿细胞)被贮存于-70℃直至使用。
实施例28重组HPV6a L1+L2衣壳蛋白的提纯除非指出，所生步骤均在4℃进行。
株系#1670的细胞冰冻贮存于-70℃。冰冻细胞(湿重＝38.0g)在20-23℃解冻并再悬溶于50mL“L1缓冲液”(20mM磷酸钠，pH7.2，100mM NaCl，1.7mM EDTA)。加入蛋白酶抑制PMSF和胃酶抑素A至终浓度分别为2mM和1.7μM。细胞泥浆(cell slurry)经在约8000psi压力下在M1 10微流化床(Microfluidics Corp.，Newton，MA)中通过3次而破碎。破碎的细胞泥浆在5000xg离心10分钟以去除细胞碎片。回收含L1+L2抗原的上清液。
通过加入缓冲液A(20mM MOPS，pH7.0)将上清液1∶5稀释，并加在缓冲液A平衡基的Fractogel EMD TMAE-650(S)树脂(EM Separations，Gibbstown，NJ)的阴离子交换捕获柱上(5.0cm ID×4.0cm)。在用缓冲液A洗1次后，该抗原用缓冲液A中的0-1.0MNaCl梯度洗脱。进行免疫斑点印迹以确定从该柱得到的哪种级分含L1蛋白。
经免疫斑点印迹测定含L1蛋白的级分通过Bradford方法测定总蛋白，随后进行使用银染和Western印迹的SDS-PAGE。
显示相对纯和丰富的L1蛋白的TMAE级分被合并。抗原通过硫酸铵分级法被浓缩。通过加入固体试剂同时轻柔搅拌30分钟将溶液调至63％饱合的硫酸铵。样本被置于冰上并允许沉淀进行30分钟。该样本在12000xg离心。沉淀物再悬溶于20.0mL PBS(6.25mM磷酸钠，pH7.2，150mM NaCl)中。
再悬溶的沉淀物在Sephacryl 500HR树脂(Phamacia Piscataway，NJ)的分子排阻 柱上进行层析。走柱缓冲液是PBS。层析在20-23℃进行。级分通过使用银染和Western印迹检测的SDS-PAGE分析。合并最纯的级分。将所产生的合并物浓缩。
终产物通过使用胶体Coomassie染色的SDS-PAGE测定。L1和L2蛋白被估测具有85％同源性。L1和L2蛋白通过使用合适抗血清的Western印迹证实。终产物被分装并贮存于-70℃。此工艺生成3.0mg总蛋白。
通过Structure Probe(West-Chtster，PA)进行电子显微镜检查。将等分试样置于200目碳包铜格栅上。一滴pH 7.0的2％磷钨酸被加至格栅上20秒。格栅在TEM检查前进行空气干燥。所有电镜检查使用JEOL100CX发射电子显微镜(JEOL USA，Inc.)，加速电压为100KV。所产生的显微照片最终放大率为100,000倍。证实存在50-55nm大小范围的病毒样颗粒。
实施例29提纯HPV-6a L1和L1/L2 VLPs供电镜研究酵母表达的HPV-6a L1和HPV-6a L1+L2蛋白被部分提纯并浓缩以供电镜(EM)研究。在1至1.5升YEHD培养基(含2％半乳糖和0.1M山梨醇)中接种带有质体p13173-357-6(L1表达载体)或质体p14049-7-2(L1或L2共表达载体)的酿酒酵母株系#1558，并在30℃培养68-78小时。通过在4000g离心10分钟收获细胞，细胞团在-70℃冷冻。所有下述步骤均在4℃进行。细胞团被解冻并悬溶于等体积的“L1缓冲液”(20mM磷酸钠，pH7.2，100mM NaCl，1.7mM EDTA)。加入蛋白酶抑制剂PMSF和胃酶抑素A于泥浆中至终浓度分别为2mM和1.7μM。细胞经3-5次通过微流化床被溶解。溶解产物通过在5000xg离心10分钟被澄清。上清液在L1缓冲液和5cm45％(w/v)蔗糖垫顶部被分层，并且L1或L1+L2蛋白通过在100000xg离心4小时沉淀。沉淀物再悬溶于1/10体积L1缓冲液中并通过在5000xg离心10分钟澄清。样本通过电镜研究并显示含病毒样颗粒。
实施例30HPV L1和L2基因的克隆总基因组DNA通过常规方法(Sambrook等，见上文)从Caski细胞(ATCC#CRL1550)提取。该DNA用Bstl 107I和SphI内切核酸酶消化并通过0.8％低融点琼脂糖制备性凝胶电泳。对应于约～3.5kbpDNA的区从凝胶上被剪切下来并用GelaseTM酶(EpicentreTechnologies，Inc.)消化该琼脂糖。凝胶提纯的DNA用T4DNA聚合酶制造钝末端并与含埋藏的Hind III位点的钝末端，磷酸化寡脱氧核苷酸连接子相连结。该连结混合物用Hind III消化至完全并且～3.5kbp的DNA按上述通过琼脂凝胶按大小分级。凝胶提纯的DNA与已被Hind III消化并去磷酸化的pUC18质体DNA连接。在转化足够的E.coli DH5细胞(BRL)后，通过菌落杂交对该质体文库筛选HPV 16-阳性克隆，菌落筛选使用与HPV-16 L1基因3’末端互补的反义32P-标记寡脱氧核苷酸(5’-GAG AGA TCT TCA AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTAGC-3’)。含3.3kbp HPV16基因组片段的pUC18质体通过限制性酶和Sourthern印迹分析被分离和确定性质。这种质体被命名为pUC18-HPV16 L1/L2，并含所有L1和L2编码DNA序列。质体DNA使用QiagenTM质体Maxi试剂盒(Giagen，Inc.)制备。
实施例31HPV 16 L1酵母表达载体的构建该克隆，pUC18-HPV16 L1/L2被用作PCR模板。HPV 16 L1基因通过PCR扩增，使用Vent聚合酶(New England Biolabs，Inc.)，10个扩增循环(94℃，1分钟；48℃，1分钟；72℃，1分45秒)，以及下列含侧翼Bgl II位点(下面划线)的寡脱氧核苷酸引物正义引物 5’ - CTCAGA TCTCAC AAA ACA AAA TGT CTC TTTGGC TGC CTA TGA AGG CC-3’(SEQ ID NO15)反义引物 5’ - GAGAGA TCTTAC AGC TTA CGT TTT TTG CGTTTA GC-3’ (SEQ ID NO16)正义引物在紧邻HPV 16 L1起始蛋氨酸密码子(以粗体强调)上游导入酵母非翻译前导序列。该1.5kbp L1 PCR产物用Bg1 II消化，凝胶提纯，并与BamHI消化的pC 1/1-GAL载体连接。分离出一种pC1/1-GAL质体含有HPV 16 L1基因并命名为p14049-37-1。p14049-37-1中的L1基因被测序，使用PRISMTM盒(ABI，Inc.)和ABI测序仪Model #373A，按照制造商的指示。该分离体中的L1基因与已校正的，发表的原型序列(Kimbauer，R.等，(1993)J.Virol.676929-6936)相比，显示含3个核苷酸改变，导致2个氨基酸改变His-202变为Asp，Thr-266变为Ala。原始模板DNA的序列分析证实这些变化也存在于基因组克隆pUC18-HPV16 L1/L中，因而不是由PCR导入的。
实施例32HPV16 L1和L2酵母表达载体的构建质体p14049-37-1(pC1/1-GAL+HPV 16 L1)用SmaI消化，该酶在GAL10启动子和ADH1转录终止子间剪切。1.4kbp的HPV 16L2基因通过PCR被扩增，使用pUC18-HPV 16 L1/L2 DNA作为模板，Vent聚合酶(New England Biolabs，Inc.)，10个PCR扩增循环(94℃，1分钟；48℃，1分钟；72℃，1分45秒)，以及含有侧翼BamI位点(下面划线的)的下列寡脱氧核苷酸引物正义引物 5’- TCCCCC GGGCAC AAA ACA AAA TGC GAC ACAAAC GTT CTG CAA AAC-3’ (SEQ ID NO17)反义引物 5’- TCCCCC GGGCTA GGC AGC CAA AGA GAC ATCTGA-3’ (SEQ ID NO18)正义引物在紧邻HPV 16 L2起始蛋氨酸密码子(用粗体强调)上游导入酵母非翻译前导序列。该1.4kbp L2 PCR产物用BamI消化，凝胶提纯，并与BamI消化的p14049-37-1载体连接。含有HPV 16 L1和L2基因两者的pC1/1-GAL质体被分离并命名为p14049-42-2。p14049-42-2被测序，使用PRISMTM盒(ABI，Inc.)和ABI测序仪Model #373A，按照制造商的指示。此分离体中的L2基因与已校正的，发表的原型序列(Kimbauer，R.等，(1993)见上文)相比，显示含5个核苷酸改变，导致1个氨基酸改变Ser-269变为Pro。基因组克隆pUC18-HPV 16 L1/L2的序列分析证实此变化也存在于原始模板DNA中而非由PCR导入。
实施例33A.在酵母中HPV 16 L1的表达和HPV 16 L1和L2的共表达质体p14049-37-1(pC1/1-GAL+HPV 16 L1)和p14049-42-2(pC1/1-GAL+HPV 16 L1和L2)被用于转化酿酒酵母株系#1558。产生的重组株系为#1678(HPV 16-L1)和#1679(HPV 16L1+L2)，如表中所示。克隆分离体在30℃在含20％半乳糖的YEHD培养基中培养68-78小时。收获细胞后，细胞团用玻璃珠破坏，并通过免疫印迹测定法测定溶解产物HPV 16 L1或HPV 16 L2蛋白的表达。含40mg总细胞蛋白的样本在10％Tris-甘氨酸凝胶上在还原和变性条件下电泳并电印迹至硝酸纤维素滤膜。HPV 16 L1蛋白的免疫检测使用针对trpE-HPV 11 L1融合蛋白产生的兔多克隆抗血清(D.Brown等，Virology 20146-54)作为第一抗体和HRP连接的驴抗兔IgG抗体(Amersham，Inc.)作为第二抗体。滤膜使用化学荧光ECL检测盒(Amersham，Inc.)进行处理。50-55kDa L1蛋白带在除阴性对照(pC1/1，不带L1或L2基因)外的所有样本中检测到。L2蛋白作为一条70kDa蛋白带通过免疫印迹被检测到，免疫印迹使用针对在E.coli中表达的trpE-L2融合蛋白产生的小鼠抗HPV 16 L2血清作为第一抗体。羊抗鼠IgG HRP-连接的(Amersham，Inc.)被用作第二抗体，并且滤膜按上述处理。B.重组HPV类型16 L1+L2衣壳蛋白的提纯除非特别指出，所有步骤均在4℃进行。
细胞冰冻贮存于-70℃。冰冻细胞(湿重＝27.6g)在20-23℃解冻并再悬溶于40mL“L1缓冲液”(20mM磷酸钠，pH7.2，100mMNaCl，1.7mM EDTA)。加入蛋白酶抑制剂PMSF和胃酶抑素A至终浓度分别为2mM和1.7μM。细胞泥浆经3次通过M110微流化床(Microfluidics Corp.，Newton，MA)在约8000psi压力在打碎。打碎的细胞泥浆以5000xg离心10分钟以去除细胞碎片。含L1+L2抗原的上清液被回收。
上清液通过加入缓冲液A(20mM MOPS，pH 7.0)被1∶5稀释并加在在缓冲液A平衡的FractogelEMD TMAE-650(S)树脂(EMSeparations，Gibbstown，NJ)的阴离子交换捕获柱(5.0cm ID×4.8cm)上。在用缓冲液A洗一次后，该抗原用缓冲液A中0-1.0M NaCl梯度洗脱。进行免疫斑点印迹检测以确定从柱上洗脱的哪些级分含L1蛋白。
经免疫斑点印迹确定含L1蛋白的级分被测定总蛋白，通过Bradford方法，继以使用银染色和Western印迹的SDS-PAGE。
显示可比的纯度和浓度的L1蛋白的TMAE级分被合并。抗原通过硫酸铵分级浓缩。通过在轻柔搅拌中加入固体试剂30分钟将样品调至48％饱合的硫酸铵。样本被置于冰上并过夜沉淀。该样本在12000xg离心。沉淀物再悬溶于20.0ml PBS中(6.25mM磷酸钠，pH 7.2，150mMNaCl)。
再悬溶的沉淀物在20-23℃在Sephacryl 500HR树脂(Pharmacia，Piscataway，NJ)的分子排阻柱(2.6cm ID×89cm)上分别层析。走柱缓冲液是PBS。级分经使用银染色和Western斑点印迹检测的SDS-PAGE分析。合并最纯的级分。所产生的合并物在50ml搅拌室中使用43mm YM-100平片膜(Amicon，Beverly，MA)在4-6psi N2压力下浓缩。
终产物通过使用胶体Coomassie染色的SDS-PAGE测定。L1和L2蛋白估测为76％同源。L1和L2蛋白的一致性经使用适当抗血清的Western印迹证实。终产物被分装并贮存于-70℃。该步骤产生总共0.53mg蛋白。
使用Structure Probe(West Chester，PA)进行电镜分析。等分试样被置于200目碳包铜格栅上。一滴2％磷钨酸，pH7.0被置于格栅上20秒。格栅在TEM检查前进行空气干燥。所有显微镜检使用JEOL100CX发射电子显微镜(JEOL USA，Inc.)进行，加速电压为100KV。产生的显微照片最终放大率为100000倍。证实基存在50-55nm大小范围的病毒样颗粒。C.重组HPV型16 L1+L2衣壳蛋白的提纯除非特别指出，所有步骤在4℃进行。
细胞冷冻保存于-70℃。冷冻细胞(湿重＝92.8g)在20-23℃解冻并再悬溶于105mL“L1缓冲液”(20mM磷酸钠，pH7.2，100mMNaCl，1.7mM EDTA)。蛋白酶抑制剂PMSF和胃酶抑素A被加入至终浓度分别为2mM和1.7μM。细胞泥浆通过3次通过M110 Y微流化床(Microfluidics Corp.，Newton，MA)在约16000psi压力下破碎。破坏的细胞泥浆在6100xg离心15分钟以去除细胞碎片。回收含L1+L2抗原的上清液。
通过加入缓冲液A(20mM MOPS，.pH7.0)将上清液1∶5稀释并加在在缓冲液A中平衡的FractogelEMD TMAE-650(S)树脂(EM Separations，Gibbstown，NJ)的阴离子交换捕获柱(5.0cm ID×4.2cm)上。用缓冲液A洗涤1次后，用在缓冲液A的0-1.0M NaCl梯度洗脱该抗原。实施免疫斑点印迹以确定来自该柱的哪些级分含L1蛋白。
经免疫斑点印迹确定含L1蛋白的级分，使用Bradford方法，随后进行使用银染色和Western印迹的SDS-PAGE测定总蛋白。
显示相当纯度和浓度L1蛋白的TMAE级分被合并。抗原通过硫酸铵分级浓缩。通过在轻柔搅拌下加入固体试剂10分钟将样品调至35％饱合的硫酸铵。样品被置于冰上并让沉淀进行4小时。将样本要12000xg离心。沉淀物再悬溶于20.0mL PBS中(6.25mM磷酸钠，pH 7.2，150mM NaCl)，其中含1mM EDTA。
再悬溶的沉淀物在Sephacryl 500HR树脂(Pharmacia，Piscataway，NJ)的分子排阻柱(2.6cm ID×89cm)上分别层析。走柱缓冲液是PBS+1mM EDTA。级分通过使用银染色和Western斑点检测的SDS-PAGE进行测定。合并最纯的级分。产生的合并物在50mL搅拌室中浓缩，使用43mm YM-100平片膜(Amicon，Beverly，MA)，在4-6psi氮气压力下。
终产物通过使用胶体Coomassie染色的SDS-PAGE分析。L1和L2蛋白被估测为70％同源。L1和L2蛋白的一致性经使用适当抗血清的Western印迹证实。终产物被分装并贮存于-70℃。这种工艺产生总共3.8mg蛋白。
实施例34A.株系1679(HPV型16 L1+L2)的发酵株系1679制备冰冻贮存培养物，接种物培养，发酵，和细胞回收的步骤基本如上所述。在67小时温育后，达到每升4.4g干细胞重量的细胞密度并在回收后产生总量为93g湿重的细胞团。B.株系1678(HPV型16 L1)的发酵株系1678制备冰冻贮存种，接种物培养，发酵，和细胞回收的步骤基本如上所述。在70.5小时温育后，两个10升发酵罐的内容物被合并(细胞密度为8.7g干细胞/升)，回收后它产生总共258g湿细胞团。C.重组HPV型16 L1衣壳蛋白的提纯除非指出，所有步骤在4℃进行。
株系#1678的细胞冰冻贮存于-70℃。冰冻细胞(湿重120g)在20-23℃解冻并再悬于140mL“改良L1缓冲液”(20mM磷酸钠，pH7.2，100mM NaCl)加入蛋白酶抑制剂PMSF和胃酶抑素A至终浓度分别为2mM和1.7μM。将细胞泥浆在约16000psi压力下3次通过M110-Y微流化床(Microfluidics Corp，Newton，MA)而破坏。破碎的细胞泥浆在11000xg离心40分钟以去除细胞碎片。回收含L1抗原的上清液。
上清液通过加入缓冲液A(20mM MOPS，.pH 7.0)1∶5稀释，并加在在缓冲液A中平衡的FractogelEMD TMAE-650(S)树脂(EM Separations，Gibbstown，NJ)的阴离子交换捕获柱(5.0cm ID×6.4cm)上。用缓冲液A洗涤1次后，该抗原被缓冲液A中的0-1.0MNaCl梯度洗脱。施行免疫斑点印迹以确定来自该柱的哪些级分含L1蛋白。
经免疫斑点印迹确定含L1蛋白的级分，通过Bradford方法，继以使用银染色和Western印迹的SDS-PAGE被测定总蛋白。
显示相当纯度和浓度的L1蛋白的TMAE级分被合并。该抗原通过硫酸铵分级被浓缩。通过在轻柔搅拌下加入固体试剂10分钟将样本调至35％饱合的硫酸铵。样本被置于冰上并允许沉淀进行5小时。该样本在12000xg离心。沉淀物再悬溶于20.0mL PBS(6.25mM磷酸钠，pH7.2，150mM NaCl)中。
再悬溶的沉淀物在Sephacryl 500HR树脂(Pharmacia，Piscataway，NJ)的分子排阻柱(2.6cm ID×89cm)上分别层析。走柱缓冲液为PBS。级分通过使用银染色和Western印迹检测法的SDS-PAGE测定。最纯的级分被合并。产生的合并物在50mL搅拌室中浓缩，使用43mm YM-100平片膜(Amicon，Beverly，MA)，在4-6psi的氮气压力。
终产物通过使用胶体Coomassie染色的SDS-PAGE测定。L1蛋白被估测具有70％同源性。L1的一致性通过使用适当抗血清的Western印迹证实。最终产物被分装并在-70℃贮存。此工艺产生总共7.4mg蛋白。D.分析程序免疫斑点印迹程序样本在Milli-Q-H2O中1∶10稀释(当需要时)并将10mcL样本点至PolyscreenTMPVDF膜(NEN Reserch Prodcts，Boston，MA)上。所点样本干燥后，在水中洗膜并干燥膜。通过在印迹缓冲液(5％无脂牛奶于6.25mM磷酸钠，pH7.2，150mM NaCl，0.02％NaN3)中稀释适当的抗血清制备第一抗体溶液。在20-23℃温育至少1小时。将斑点在3次更换PBS(6.25mM磷酸钠，pH7.2，150mM NaCl)中每次各洗1分钟。通过稀释印迹缓冲液中适合的碱性磷酸酶连接的配合抗血清制备第二抗体溶液。温育在相同条件下进行至少1小时。斑点如前被洗涤并使用一步NBT/BCIP底物(Pierce，Rockford，IL)进行检测。
用作检测的抗体如下HPV6a L1通过MAB837(Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)被检测。HPV6a L2被小鼠抗HPV6a L2-trpE融合血清合并物#641和647检测。HPV 16 L1被MAB885(Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)检测。HPV 16 L2通过小鼠抗HPV 16 L2-trpE融合血清合并物#611检测。用于总蛋白的Bradford测定总蛋白使用商购Coomassie Plus盒(Pierce，Rockhford，IL)。样本在Milli-Q-H2O中稀释至适当水平。标准的和微测定程序所需要的量分别为0.1mL和1.0mL。对两种程序，BSA(Pierce，Rockford，IL)被用于产生标准曲线。该测定按照制造商的建议实施。标准曲线使用CricketGraph软件在Macintosh IIci计算机上作图。
实施例35重组HPV 11型L1衣壳蛋白的提纯除非特别指出，所有步骤均在4℃进行。
细胞冰冻贮存于-70℃，冰冻细胞(湿重＝180g)在20-23℃解冻并再悬溶于900ml“破坏缓冲液”中(50mM MOPS，pH7.2，500mM NaCl，1mM CaCl2)。蛋白酶抑制剂AEBSF和胃酶抑素A被加入至终浓度分别为1mM和1.7μM。细胞泥浆在约16000psi压力下4次通过M110 Y微流化床(Microfluidics Corp，Newton，MA)而被破坏。足够量的10％Triton X100表面活性剂(Pierce，Rockford，IL)被加至已破坏的细胞泥浆中以使TX 100的浓度为0.5％。此泥浆搅拌20小时。经Triton X100-100处理的溶解产物在12000xg离心40分钟以去除细胞碎片。回收含L1蛋白的上清液。
上清液对5体积20mM磷酸钠，pH7.2，0.5M NaCl进行透过滤过，使用300K切向流膜盒(Filtron，Northborough，MA)。保留在膜上的物质经放射免疫测定和Western印迹显示含L1蛋白。
滞留物被上样于在20mM磷酸钠，pH7.2，0.5M NaCl中平衡的SP Spherodex(M)树脂(IBF，Valleneuve-la-Garenne，Frouce)的高分辨率亲合柱(11.0cm ID×5.3cm)。在用平衡缓冲液洗1次和用20mM磷酸钠，pH7.2，1.0M NaCl的分步洗涤(Step wash)后，L1蛋白通过20mM磷酸钠，pH7.2，2.5M NaCl的分步洗涤而洗涤。在洗涤和洗脱期间收集级分。通过Bradford方法测定柱级分的总蛋白。然后通过Western印迹和用胶体Coomassie检测的SDS-PAGE测定级分。级分还通过放射免疫测定法进行测定。
显示相当纯度和丰度的L1蛋白的SP Spherodex级分被合并。
终产物通过Western印迹和使用胶体Coomassie检测的SDS-PAGE测定。L1蛋白通过Coomassie染色凝胶的密度计量学显示为＞95％同源。L1蛋白的同一性通过Western印迹证实。终产物通过0.22μm膜无菌滤过并贮存于4℃。此工艺导致产生总共202mg蛋白。
使用Structure Prode(West，Chester，PA)进行电镜测定。等分试样被置于200目碳包铜格栅上。一滴2％磷钨酸，pH 7.0被置于格栅上20秒。在TEM检查前让格栅在空气中干燥。所有电镜检查均使用JEOL100CX发射电子显微镜(JEOL USA，Inc.)加速电压为100KV。产生的显微照片最终放大率为100000倍。SDS-PAGE和Western印迹测定所有凝胶，缓冲液，和电泳装置均得自Novex(Sau Diego，CA)并按照制造商的建议运行。简言之，将样本在Milli-Q-水中稀释至等蛋白浓度并与含200mM DTT的样本温育缓冲液1∶1混合。样本在100℃温育10分钟并置于预制的12％Tris-甘氨酸凝胶上。该样本在125V电泳1小时45分。凝胶通过胶体Coomassie染色处理，使用商购的试剂盒(Integrated Soparation Systems，Natick，MA)。
为进行Western印迹，在25V以40分钟将蛋白转至PVDF膜上。用Milli-Q-水洗膜并空气干燥。第一抗体是针对TrpE-HPV 11 L1融合蛋白产生的多克隆兔抗血清(Dr.D.Brown赠品)。通过在印迹缓冲液(5％无脂牛乳于6.25mM磷酸钠中，pH7.2，150mM NaCl，0.02％NaN3)中稀释抗血清而制备抗体溶液。在20-23℃至少温育1小时。在3次更换PBS(6.25mM磷酸钠，pH7.2，150mM NaCl)中，每次洗涤印迹1分钟。第二抗体溶液通过在印迹缓冲液中稀释羊抗-兔IgG碱性磷酸酶连接的抗血清(Pierce，Rockford，IL)而制备。温育在相同条件下进行至少1小时。如前所述洗涤印迹并使用1步NBT/BCIP底物(Pierce，Rockford，IL)进行检测。
实施例36HPV 18 L1和L2在酵母中的表达质体p191-6(pGAL1-10+HPV 18 L1)和p195-11(pGAL1-10+HPV 18 L1+L2)被用于转化酿酒酵母株系#1558(MATa，leu204，prbl∷HIS3，mnn9∷URA3，adel，cir°)。克隆分离体在30℃在含2％半乳糖的YEHD培养基中培养48小时。收获细胞后，细胞团用玻璃珠打碎，并通过免疫印迹测定法测定细胞溶解产物的HPV18 L1和/或HPV 18 L2蛋白的表达。含25μg总细胞蛋白的样本在变性条件下经10％Tris-甘氨酸凝胶(Novex，Inc.)电泳，并电印迹至硝酸纤维素滤膜。L1蛋白被免疫检测，使用针对trpE-HPV 11 L1融合蛋白产生的兔抗血清作为第一抗体(Brown等，1994，Virology 20146-54)和辣根过氧化物酶(HRP)连接的猴抗-兔IgG(Amersham，Inc.)作为第二抗体。滤膜用化学荧光ECLTM检测盒(Amersham，Inc.)处理。可在L1和L1+L2共表达酵母克隆两者中(分别为株系1725和1727)检测到50-55 kDa的L1蛋白带，而在阴性对照(pGAL1-10，无L1和L2基因)中检测不到。
HPV 18 L2蛋白通过Western测定法检测，使用针对trpE-HPV 18L2融合蛋白产生的羊多克隆抗血清作为第一抗体，继以HRP连接的，兔抗羊IgG(Krikegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)。滤膜按上述加工。L2蛋白作为75kDa蛋白在L1+L2共表达酵母克隆中(株系1727)被检测到，但在阴性对照或L1表达克隆中未被测到。
实施例37HPV 18 L1(株系1725)和18 L1+ΔL2(株系1727)的发酵株系1725和1727的平板培养的表面生长物被无菌地转至无亮氨酸液体培养基，该培养基含有(每升)8.5g不加氨基酸和硫酸铵的Difco酵母氮碱，0.2g腺嘌呤；0.2g尿嘧啶；10g琥珀酸；5g硫酸铵；40g葡萄糖；0.25g L-酪氨酸；0.1g L-精氨酸；0.3g L-异亮氨酸；0.05g L-蛋氨酸；0.2g L-色氨酸；0.05g L-组氨酸；0.2g L-赖氨酸；0.3gL-苯丙氨酸；此培养基在灭菌前用NaOH调pH至5.0-5.3。在28℃，250rpm在旋转摇动器上培养后，冰冻培养瓶通过加入灭菌甘油至终浓度为17％(w/v)而制备，然后贮存于-70℃(1ml/冰冻小瓶)。接种物在相同培养基中培养(500mL/2升培养瓶)，并通过运送冰冻培养物小瓶的解冻内容物并在28℃，250rpm于旋转摇动器上培养29小时而开始。每种株系的发酵使用在接种后工作容积为10L的新Brunswick SF-116发酵器。生产培养基含(每升)20g Difco酵母提取物；10gSheffield Hysoy胨；20g葡萄糖；20g半乳糖；0.3mL UnionCarbide UCON LB-625抗泡剂；培养基在灭菌前调pH至5.3。该2升接种物烧瓶的全部内容物(500ml)被转至在28℃，5升空气/每分钟，400rpm，3.5psi压力下温育的发酵器。增加搅拌以维持溶解的氧气水平大于40％饱合度。发酵的进展通过脱机葡萄糖测定(Beckman葡萄糖2测定仪)和联机的质量分光光度测定(Perkin-Elmer 1200)监测。温育66小时后，达到每升9.5g至9.7g干细胞重量的密度。培养物经空心纤维滤过(Amicon DC-10滤过系统中的Amicon H5 MP01-43柱体)浓缩至ca.2升，对2升磷酸盐缓冲盐水通过滤过，并在分配至500mL离心瓶前进一步浓缩(至ca 1升)。通过在8000rpm(Sorval GS3离心器)在4℃离心20分钟收集细胞团。倾析上清液后，细胞团(总共191至208g湿细胞)被贮存于-70℃直至使用。
实施例38重组HPV 18 L1型衣壳蛋白的提纯除非特别指出，所有步骤均在4℃进行。
细胞贮存于-70℃。冰冻细胞(湿重＝126g)在20-23℃解冻并再悬于70mL“破坏缓冲液”(20mM磷酸钠，pH7.2，100mMNaCl)加入蛋白酶抑制剂PMSF和胃酶抑素A至终浓度分别为2mM和1.7μM。细胞泥浆在约16000psi压力下4次通过M110-Y微流化床(Microfluidics Corp，Newton，MA)而被破坏。破坏的细胞泥浆在11000xg离心40分钟以去除细胞碎片。含L1抗原的上清液被回收。
上清液通过加入缓冲液A(20mM MOPS，.pH 7.0)被1∶5稀释并上样于在缓冲液A中平衡的FractogelEMD TMAE-650(S)树脂(EM Separations，Gibbstown，NJ)的阴离子交换捕获柱(9.0cm ID×3.9cm)。用缓冲液A洗涤1次后，该抗原用缓冲液A中的0-1.0M NaCl梯度洗脱。通过Bradford方法分析柱级分的总蛋白，然后将各级分以相等的总蛋白装载量通过Western印迹和使用银染色测定的SDS-PAGE进行测定。
显示相当纯度和丰度L1蛋白的TMAE级分被合并。抗原通过硫酸氨分级被浓缩。通过在轻柔搅拌下加入固体试剂10分钟将溶液调整至35％饱合的硫酸铵。样本被置于冰上并让沉淀进行4小时。将样本在16000xg离心45分钟。沉淀物再悬溶于20.0mL PBS(6.25mM磷酸钠，pH7.2，150mM NaCl)中。
再悬溶的沉淀物在Sephacryl 500HR树脂(Pharmacia，Piscataway，NJ)的分子排阻柱(2.6cm ID×89cm)上层析。走柱缓冲液是PBS。级分通过Western印迹和使用银染色检测的SDS-PAGE测定。最纯的级分被合并。产生的合并物在50ml搅拌室中，在4-6psi的氮气压力下使用43mm YM-100平片膜(Amicon，Beverly，MA)进行浓缩。
终产物通过Western印迹和使用胶体Coomassie检测的SDS-PAGE进行测定。L1蛋白被估测为50-60％同源。L1蛋白的特性经Western印迹证实。终产物被分装并贮存于-70℃。此工艺产生总共12.5mg蛋白。
实施例39免疫原性组合物的制备经提纯的VLP按已知的方法配方，如通过混入药物学上可接受的载体，稳定性，或疫苗佐剂。本发明的免疫原性VLP可通过合并生理学上可接受的组合物如PBG，盐水或蒸馏水制备供疫苗应用。该免疫原性VLP以约0.1至100μg的剂量范围施用，优选约1至20μg的范围，以获得所希望的免疫原性效应。每剂配方的VLP量可根据许多因子不同而不同，包括但不限于个体条件，体重，年龄和性别。可通过许多途径施用VLP配方，包括但不限于口服，皮下，局部，经粘膜和肌肉内。这种VLP配方可包含单一类型的VLP(如来自HPV6a的VLP)或VLP混合物(如来自HPV6a，HPV 11，HPV 16和HPV 18的VLP)。
抗微生物保护剂，如乙基汞硫代水杨酸钠，任选地可存在。本发明的免疫原性抗原，如果希望的话，可与疫苗稳定剂和疫苗佐剂合用。典型的稳定剂是特异的化合物，如多阴离子如肝素，肌醇六硫酸酯，硫酸化β-环糊精，较不特异的赋形剂，如氨基酸，山梨醇，甘露糖醇、木糖醇，甘油，蔗糖，葡萄糖，海藻糖，以及溶液条件的变化如，中性pH，高离子强度(Ca.0.5-2.0M盐)，二价阳离子(Ca2+，Mg2+)。佐剂的实例是Al(OH)3和Al(PO)4。本发明的疫苗可在冷藏或冰冻形式下贮存。
实施例40针对VLP的抗体的提纯纯化的VLP被用于产生抗体。本文使用的术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体以及其片段，如Fv，Fab和F(ab)2片段，这些片段也能结合抗原或半抗原。抗体可以多种方式应用，包括但不限于重组VLP的提纯，天然L1或L2蛋白的提纯，以及试剂盒。试剂盒包含单元化的装载体，该装载体适合紧紧放置至少一个容器。该装载体还应包括试剂如抗VLP抗体或适合检测HPV或HPV片段的VLP或针对HPV的抗体。该装载体还包括检测工具使标记的抗体或酶底物等。抗体或VLP或试剂盒可用于多种用途，包括但不限于法医学分析和流行病学研究。
权利要求
1.分离和纯化的乳头状瘤病毒蛋白，选自L1蛋白、L2蛋白、L1+L2蛋白，及其功能衍生物，该蛋白纯度至少为60％。
2.权利要求1的蛋白，其中乳头状瘤病毒选自人类乳头状瘤病毒和美洲产白尾棕色兔(cottontail rabbit)乳头状瘤病毒。
3.权利要求2的蛋白，其中人类乳头状瘤病毒选自HPV6a、HPV6b、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、PHV33、HPV35、HPV41、HPV45和HPV58。
4.权利要求1的蛋白，其中该蛋白由一种合成系统生产，此系统包括一种重组体宿主。
5.由权利要求1的蛋白构成的衣壳。
6.由权利要求1的蛋白构成的病毒样颗粒。
7.生产权利要求1的纯化蛋白的方法，它包括(a)用重组体DNA分子转化宿主，该重组体DNA分子编码选自乳头状瘤病毒L1蛋白，乳头状瘤病毒L2蛋白，乳头状瘤病毒L1+L2蛋白，及其功能衍生物；(b)在允许重组体DNA分子表达以产生粗重组体乳头状瘤病毒蛋白的条件下培养转化的宿主；和(c)提纯粗重组体乳头状瘤蛋白以产生纯化蛋白。
8.通过权利要求7的方法生产的重组体乳头状瘤病毒蛋白。
9.由权利要求7的蛋白构成的衣壳。
10.由权利要求7的蛋白构成的病毒样颗粒。
11.包含权利要求1的蛋白的疫苗。
12.包含权利要求1的蛋白的药物组合物。
13.治疗或预防乳头状瘤病毒感染的方法，包含向宿主施用权利要求11的疫苗。
14.供检测乳头状瘤病毒或乳头状瘤病毒抗体的试剂盒，它包含一种试剂，该试剂选自编码权利要求1的乳头状瘤病毒蛋白的DNA分子，权利要求1的蛋白，由权利要求1的蛋白构成的病毒样颗粒，针对权利要求1的蛋白的抗体，和针对由权利要求1的蛋白构成的病毒样颗粒的抗体。
15.一种方法，用于生产装配入衣壳或病毒样颗粒的重组体乳头状瘤病毒衣壳蛋白，它包含a)将编码至少一种乳头状瘤病毒衣壳蛋白的乳头状瘤病毒基因克隆入一种载体；b)将该载体运送入宿主细胞以产生重组体宿主细胞；c)在允许产生乳头状瘤病毒衣壳蛋白的条件下培养该重组体宿主细胞；和d)纯化该乳头状瘤病毒衣壳蛋白。
16.通过权利要求15的方法生产的衣壳。
17.通过权利要求15的方法生产的病毒样颗粒。
18.一种用于在脊椎动物中诱导免疫反应的方法，它包含向动物施用权利要求15的纯化蛋白，或权利要求15的衣壳或权利要求15的病毒样颗粒。
19.在动物中诱导免疫反应的方法，它包含向动物施用权利要求1的蛋白。
20.权利要求4的合成系统，其中该系统选自转化的昆虫细胞，转化的酵母细胞，转化的细菌细胞，转化的真菌细胞，转化的植物细胞和转化的动物细胞。
21.权利要求20的系统，其中酵母选自包含酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)，多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)，巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)，脆壁克鲁维氏酵母(Kluyvermyces fragilis)，和栗酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
22.权利要求21的系统，其中酿酒酵母选自株系2150-2-3，U9，1372，1372-ura3，1372-his3，1558，1524，1537，1541，1582和1569。
全文摘要
编码乳头状瘤病毒的L1和L2蛋白的重组体表达载体，制造和使用重组体蛋白和包含重组体蛋白的纯化病毒样颗粒的方法被提供。
文档编号A61P31/12GK1152935SQ95194158
公开日1997年6月25日 申请日期1995年5月15日 优先权日1994年5月16日
发明者K·U·扬森, J·C·库克三世, H·A·乔治, K·J·霍夫曼, J·G·乔伊斯, E·D·莱曼, H·Z·马卡斯, M·罗索洛斯基, L·D·舒尔茨 申请人:麦克公司