专利名称：体内糖尿病检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及用自身反应性物质产生一种用于诊断影响免疫系统的细胞介导的疾病或细胞介导的疾病的体质的物质。
近年来，对诸如类风湿性关节炎和少年糖尿病(IDDM)这类自身免疫性疾病的产生过程中的分子关系的解释已有了迅速的进展，而且已经出现了对这类疾病的早期诊断和随后的治疗的具体的应用。
目前已经证实，在这类疾病的产生过程中，除了遗传的疾病体质外，环境因素也起了一定的作用。在遗传的危险因素方面，例如在IDDM中，只有MHC II型抗原的一些等位基因与这类疾病密切相关。因此可以通过分析这些等位基因而为IDDM定义一个易感人群(如参见Thomson等人，J.Hum.Genet.43(1988)，799-816或Todd等人，Nature 329(1987)，599-604)。
在IDDM产生过程中的环境因素可能是外源的免疫原性的活性肽序列。在这方面已经对病毒抗原进行了讨论，它们与内源性结构有部分同源性。在特殊情况下，尤其是在出生后的一段时间，通过食物而被吸收的抗原如牛血清白蛋白能够引起免疫反应，由于与内源性结构的同源性，这种反应会引起一个自身攻击性的过程。
在IDDM中的发病过程中，典型的现象就是由细胞毒性淋巴细胞引起的胰脏β细胞的逐渐破坏。这一过程远远早于葡萄糖代谢被破坏这一现象变得明显之时。当糖尿病的症状可被检测到时，80％以上的β细胞已经被破坏了。因此，在较早的时期在易感人群中检测到这些自身攻击性T细胞就显得十分地重要，这样就能够为被感染的人提供及时的治疗。
目前已经证实，在自身免疾性疾病中，内源性组织的破坏在开始时进行得十分缓慢。在这一过程的开始阶段，自身攻击性T细胞可能只识别一种或几种自身抗原。在Kaufman等人(Nature 368(1993)，69-72)和Tisch等人(Nature 368(1993)，72-78)的报道中，I型糖尿病的动物模型(NOD小鼠)显示，当这种小鼠自然发生糖尿病时，初始的T细胞介导的自身免疫反应是针对谷氨酸脱羧酶的。在该过程的初始阶段，在NOD小鼠体内只在谷氨酸脱羧酶(GAD)的C-末端识别1至2个表位。上面已经提到，葡萄糖代谢的改变在这一阶段还不能被检测到，而此时perinsulitis已经能够被检测到了。只有当疾病进一步发展时，通过自身攻击性T细胞来识别的GAD的肽的谱才能变得更宽。一旦糖尿病已经明显，也就可以检测到预先活化的T细胞，它们对抗其它的岛细胞抗原，例如外周蛋白、热激蛋白HSP65和羧肽酶H。
有证据表明，在人中针对GAD的免疫反应也与I型糖尿病的产生有因果关系。因此举例来说，在大约80％的前期糖尿病中可以检测到针对GAD的自身抗体，尽管人们估计这些自身抗体不是主要的病原。而且有人推测在I型糖尿病中T淋巴细胞对胰脏β-细胞有逐步破坏。已经有一些研究小组(Harrison等.，J.Clin.Invest.89(1992)，1161；Honeyman等.，J.Exp.Med.177，(1993)，535)检测到了针对GAD的上述T淋巴细胞。这些小组发现的T淋巴细胞与GAD 67kd分子的肽片段反应，该片断含有氨基酸208至404。
EP-A-0 519 469公开了得自人GAD 65kd分子的自身免疫反应多肽。这些多肽的氨基酸序列如下X-P-E-V-K-(T或E)-K-Z其中X是从1至10个氨基酸中选出的一个任选序列，Z是从1至8个氨基酸中选出的一个任选序列。
欧洲专利申请号95 100 764.0中也提出了得自人GAD 65的自身反应肽序列以及一种含有这些肽的药物组合物。该申请还描述了使用这种药物组合物来产生一种物质，该物质被用来诊断影响免疫系统的疾病或疾病体质，或用来诊断肿瘤疾病或肿瘤疾病的体质。
本发明的目的之一是提供一种用于免疫系统的细胞介导的疾病，特别是自身免疫性疾病的诊断方法，该方法一方面尽可能地减少病人的不适感，另一方面能够进行快速和可靠的诊断。
该目的是通过用自身反应性物质产生一种用于诊断细胞介导的疾病或细胞介导的疾病的体质的物质实现的，其中该物质被皮内给药，诊断依据是在给药部位是否出现阳性反应。
本发明的诊断方法与目前市场上可得到的方法不同，目前使用的方法被用于细胞介导免疫的一般性检测，不同之处在于，这些检测使用了病人已经接触过的外源性抗原，例如纯化的蛋白质衍生物(PPD)、破伤风类毒素、念珠菌属(Candida)等。这些检测被用于确定被检测者的免疫系统的一般状态。免疫系统的细胞介导病没有被检测。
在另一个被广泛用来确定变应性反应的检测，例如穿刺(prick)检测中，抗原不是在皮内给药。不是由T细胞介导的阳性反应可以在四小时内被检测到，其特征是表面出现肿胀，而不是出现结节。
本发明提供了一种用于在体内检测针对自身反应性物质的细胞介导免疫反应的发生的方法。这种细胞介导免疫反应显示了免疫系统的特定疾病，特别是自身免疫性疾病或这类疾病的体质的存在。另外，细胞介导免疫反应还显示肿瘤疾病或其体质的存在。
适合于本发明方法的自身反应性物质或自身抗原是天然、合成或重组物质，例如核酸、脂类、糖类、多肽、蛋白质、肽类以及它们的复合物，例如肽与诸如MHC分子或肽结合衍生物这样的多肽所形成的复合物。另外的合适的自身反应物质是特定的免疫原性表位、片断、类似物、拟形物或例如通过化学修饰而产生的衍生物以及上述这些物质的混合物。可将自身反应性物质原样给药或以载体结合形式给药，例如以脂肽形式给药。自身反应性物质可被单独给药或与附加的物质，例如附加的刺激组分或佐剂一同给药。通过重组DNA技术或例如肽的固相合成的合成方法，可以由天然来源制得自身抗原。
在内源性抗原方面，除了自身反应物质外，还可以使用那些尽管是外源性抗原但与自身抗原有免疫学关系的自身反应物质。这类外源抗原的例子就是与得自内源性蛋白质的自身反应性肽序列有同源性的肽。具体的例子有具有序列L-V-Y-P-G-P-I-P-N(氨基酸60-68)的得自牛β-酪蛋白A的肽，它与内源性葡萄糖转运蛋白GLUT-2在序列Q-I-G-P-G-P-I-P-W(氨基酸412-420)区域中有同源区的部分；具有序列K-V-K-I-L-P-E-V-K-E-K-H-E(氨基酸33-45)的得自柯萨基病毒蛋白质P2-C的肽，它与谷氨酸脱羧酶在序列R-F-K-M-F-P-E-V-K-E-K-G-M(氨基酸155-167)区域中有同源性。
本发明的方法包括将不同的自身抗原在皮内给药并确定在给药部位是否发生局部的阳性细胞反应。该阳性反应在T细胞介导的免疫反应所特有的时刻进行确定，其确定时间优选是在给药至少24小时之后，更优选是在给药后的24小时至1周之内，最优选是在给药后的40-80小时之间。
阳性反应优选地包括在给药部位出现肿块，可以通过目测或/和触诊对其进行定性确定，也可以通过诸如超声波或照相的方法对其进行定量测定。
在另一方面，还可以确定阳性反应的产物，例如诸如γ-干扰素的细胞因子，它是由诸如白细胞的浸润细胞在给药部位释放的。
本发明的方法尤其适合于诊断自身免疫性疾病或自身免疫性疾病的体质。
举例来说，可用本发明的方法诊断的自身免疫性疾病有糖尿病，尤其是I型糖尿病(IDDM)、多发性硬化、类风湿性关节炎、巴西多氏病、类风湿性脊柱炎、急性前眼色素层炎、Good-pasture综合征、重症肌无力、系统性红斑狼疮、寻常天疱疮、免疫甲状腺炎、硬皮病、克罗恩氏病、Sjogren综合征、莱特尔氏综合症、肠炎或Graves病。本发明的方法尤其优选地用于诊断T细胞介导的疾病，例如IDDM、类风湿性关节炎或多发性硬化，本发明的方法最优选地用于诊断IDDM。
举例来说，用于诊断IDDM的自身反应物质有谷氨酸脱羧酶(GAD)65kd或67kd、酪氨酸磷酸酶(38kd的抗原)、羧肽酶H、胰岛素、热激蛋白、38kd的胰岛素分泌颗粒蛋白质或其部分。人GAD 65kd或它的部分肽序列被更优选地用作自身反应性物质。
然而类似的诊断也可用于其它的自身免疫性疾病。这类自身免疫性疾病的例子有多发性硬化，其中可以检测到对抗髓鞘碱性蛋白质或蛋白脂质蛋白质等的反应性T细胞；类风湿性关节炎，其中可以检测到对抗II型胶原、细胞角蛋白、得自大肠杆菌(E.coli)的dnaJ蛋白和Hsp65的反应性T细胞；巴西多氏病，其中可以检测到对抗甲状腺过氧化物酶的反应性T细胞。在患重症肌无力时可以检测到对抗乙酰胆碱受体或其它有关的自身反应物质的反应性T细胞。在患红斑狼疮时可以检测到对抗HSP90的反应性T细胞，而在Graves病中则有对抗TSH受体的反应性T细胞。
总之，该诊断可以用于影响免疫系统的所有疾病，例如也可以用于动脉硬化。在这种情况下，已经证实该病与对抗热激蛋白Hsp65的免疫反应有关(Xu等人，Lancet 341，8840(1993)，255-259)。
一个更进一步的应用是诊断性地检测与肿瘤抗原反应的T细胞。例如检测对抗与黑素瘤有关的抗原MAGE1的T细胞，该T细胞分离自黑素瘤患者(van der Bruggen等人，Science 254(1991)，1643-1647)。在用传统的方法还不能检测到肿瘤(由于细胞物质还太少)之前就可以检测到这些T细胞了。另外，特异性反应性T细胞还可被用于监测一种抗肿瘤的疫苗接种。
另外，使用肽、肽的衍生物或类似地结合的分子作为自身反应性物质也是可能的。为了诊断IDDM，优选地使用一种或几种得自GAD、尤其是得自人GAD 65kd的肽，或者由其衍生的肽衍生物或肽拟形物。
为了诊断IDDM，十分优选地使用含有如下氨基酸序列的肽或肽衍生物(a)氨基酸序列 (I)D-V-N-Y-A-F-L-H-A-T-D-L-L-P-A-C-D-G-E-R，(b)氨基酸序列 (II)S-N-M-Y-A-M-M-I-A-R-F-K-M-F-P-E-V-K-E-K，(c) 氨基酸序列 (III)N-W-E-L-A-D-Q-P-Q-N-L-E-E-I-L-M-H-C-Q-T，(d) 氨基酸序列 (IV)T-L-K-Y-A-I-K-T-G-H-P-R-Y-F-N-Q-L-S-T-G，(e) 氨基酸序列 (V)P-R-Y-F-N-Q-L-S-T-G-L-D-M-V-G-L-A-A-D-W，(f) 氨基酸序列 (VI)T-Y-F-I-A-P-V-F-V-L-L-E-Y-V-T-L-K-K-M-R，
(g)氨基酸序列 (VII)F-F-R-M-V-I-S-N-P-A-A-T-H-Q-D-I-D-F-L-I，(h)氨基酸序列 (VIII)G-M-A-A-L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F-S-L-K-K-G-A-A，(i)氨基酸序列 (IX)E-R-G-K-M-I-P-S-D-L-E-R-R-I-L-E-A-K-Q-K，(j)示于
图1或图2的氨基酸序列中的一个，(k)长度至少有6个氨基酸的示于(a)至(i)中的氨基酸序列的部分区域，或/和(l)与示于(a)至(j)中的氨基酸序列有基本上相同的对MHC分子的结合特异性或/和亲合力的氨基酸序列。
氨基酸序列(I)至(VII)相应于人GAD 65kd的氨基酸残基86-105(I)、246-265(II)、146-165(III)、166-186(IV)、176-195(V)、206-225(VI)和556-575(VII)。在序列SEQ ID NO.1-7中对氨基酸序列I-VII进行了陈述。
氨基酸序列(VIII)相应于人GAD 65kd的氨基酸残基266-290，氨基酸序列(IX)相应于人GAD 65kd的氨基酸残基306-325。示于图1和2中的氨基酸序列也是人GAD 65kd的部分序列。在序列SEQ ID NO.8-28中给出了图1和2的氨基酸序列。在序列SEQ ID NO.29和30中给出了氨基酸序列(VIII)和(IX)。
人们惊奇地发现，含有人GAD 65上述区域的肽与从最近发现的I型糖尿病中分离出来的T细胞亚群发生特异性反应。因而本发明中的肽是早期的自身表位，它的应用使对I型糖尿病的极早期的诊断成为可能。
氨基酸序列(I)至(IX)是得自人谷氨酸脱羧酶(GAD)的65kd的同型物的部分区域，GAD完整的氨基酸序列描述于Bu等人(Proc.Nat.Acad.Sci USA 89(1992)，2115ff.)的文章中。氨基酸序列(I)至(IX)是这样被发现的，即先建立得自I型糖尿病的外周血的T细胞系，然后在体外用得自猪脑的GAD或用重组的人GAD刺激它们并在增殖检测中用得自人GAD序列的合成肽序列检测这些T细胞系。
可以通过使用化学方法的已知合成过程来生产这些肽，也可以通过基因工程来生产，基因工程方法是在一个合适的宿主细胞，尤其是大肠杆菌(E.coli)中克隆并表达编码这些肽的DNA序列。
具有特定的(I)至(IX)的氨基酸序列或示于图1和2中的氨基酸序列的部分区域的肽也是优选的，其长度至少为6个氨基酸，优选为至少8个氨基酸，更优选为至少10个氨基酸，最优选为至少15个氨基酸。本发明的氨基酸的最小长度是通过它识别MHC分子、与该分子特异性地结合以及与相应的T细胞受体反应的能力来确定的。
得自GAD并与MHC结合的本发明肽的部分的最大长度优选为100个氨基酸，更优选为50个氨基酸，最优选为25个氨基酸。
除了上述的肽外，也可以使用与上述的肽序列有基本相同的对MHC分子的结合特异性或/和亲合力的肽，它们优选地得自上述的氨基酸序列，方法是对不同的氨基酸残基或对氨基酸残基的一小部分或对以类似方式结合的修饰后的物质进行取代、缺失或插入。
特别地，本发明还涉及肽的变种，它们的序列与上述的氨基酸序列不是完全相同，而是只含有相同或密切相关的“锚位”。术语“锚位”是指一种对于与一种MHC分子，尤其是与DR3、DR4或DQ类的MHC分子相结合必不可少的氨基酸残基。举例来说，Hammer等人在Cell 74(1993)，197-203中对用于DRB10401结合基元的锚位进行了陈述。这类锚位被保留在本发明的肽中或被具有在化学性质上密切相关的侧链的氨基酸残基所取代(例如缬氨酸取代丙氨酸，异亮氨酸取代亮氨酸，反之亦然)。存在于本发明的肽中的锚位可以用一种简单的方式测定，方法是检测上述特定肽的变种与MHC分子的结合能力。本发明的肽的特点是它们具有与上述的肽基本相同的对MHC分子的结合特异性或/和亲和力。与初始的肽或其部分序列相比，得自这些肽的肽优选具有至少30％的序列同源性，更优选为至少50％，最优选为至少60％。
特定的肽的变种的例子有得自人GAD 67的相应的同源肽部位，Bu等人也对其完整的氨基酸序列进行了描述，同上文。
“基本相同的对MHC分子的结合特异性或/和亲和力”这一概念也包括一种与(I)至(VIII)的氨基酸序列相比或与示于图1和2中的氨基酸序列相比得到了提高的结合特异性或/和亲和力，这尤其多见于长度优选为8至15个氨基酸的缩短的肽中。
本发明还涉及肽的衍生物。这一术语包括那些其中一个或几个氨基酸已经被化学反应所衍生化了的肽。本发明的肽衍生物的例子尤其指这些分子，即那些主链或/和反应性的氨基酸侧基，例如自由氨基、自由羧基或/和自由羟基已经被衍生化了的分子。氨基衍生物的具体例子有磺胺类或羧酰胺、硫代氨基甲酸乙酯衍生物以及铵盐，例如氢氯化物。羧基衍生物的例子有盐类、酯类和酰胺类。羟基衍生物的例子有O-酰基或O-烷基衍生物。根据本发明，肽的衍生物这一概念还包括这样一些肽，其中的一个或几个氨基酸被与20个“标准”氨基酸为同系物的天然存在或非天然存在的氨基酸所取代。这些同系物的例子有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸、β-丙氨酸和4-氨基丁酸。
另外的合适的肽衍生物是肽和辅剂组分之间的络合物或共价键，它们与诸如脂类的自身抗原被一同给药。在这种情况下，肽也可以被用作脂肽。
本发明还包括多肽，其中结合MHC的肽部位是一个更大的多肽单元的组分，其中结合MHC的肽与多肽单元的残余部分之间的连接处优选有一个事先确定的断点，例如一个蛋白酶切位点。
本发明还涉及肽拟形物，它们与上述的肽或肽的衍生物有基本相同对MHC分子的结合特异性或/和亲和力。就其与MHC分子的相互作用而言，肽拟形物是可以取代肽的化合物，而且与天然的肽相比，它们有更高的代谢稳定性、更好的生物可获得性和更长的作用持续性。制备肽拟形物的方法描述于Giannis和Kolter，Angew.Chem.105(1993)，1303-1326；Lee等人，Bull.Chem.Soc.Jpn.66(1993)，2006-2010以及Dorsch等人，Kontakte(Darmstadt)(1993)(2)，48-56。就本发明的肽拟形物的制备而言，参考了这些文献中公开的内容。
一种更合适的自身反应性物质是一种复合物，它包含至少一种肽、肽的衍生物或肽拟形物以及至少一种MHC分子或一种MHC分子的肽结合衍生物。在这种复合物中，结合常数优选为至少10-7l/mol、更优选在10-810-9l/mol之间的肽、肽的衍生物或肽拟形物与MHC分子或MHC分子的肽结合衍生物相结合。另外，肽、肽的衍生物或肽拟形物也可以通过光接头与MHC分子共价结合，或者是共价的遗传性肽-MHC融合体。这种肽-MHC融合蛋白质优选含有一种HLA-DRβ链以及一种与其遗传性地融合的自身反应性肽。这种复合物更优选地含有II型MHC分子或其肽结合衍生物。
编码II型MHC分子的基因的核苷酸序列参见Corell等人(Mol.Immunol.28(199D，533-543)。该文献被包括在本发明的内容中。
“MHC分子的肽结合衍生物”这一概念包括MHC分子的片断，它们是通过对天然MHC分子的蛋白水解酶切或通过重组DNA技术来制备的，而且它们基本上保持了它们的肽结合特性。也可以将这一概念理解为包括融合蛋白质，其中除了含有负责结合肽的MHC部分外，还含有其它多肽组分。
肽-MHC复合物的制备优选是通过将不含肽的MHC分子或MHC分子衍生物与本发明的肽、肽衍生物或肽拟形物相结合而实现的。举例来说，不含肽的MHC分子的制备是通过伸展天然MHC分子以解离结合的肽并使空MHC分子重折叠而实现的(参见Dornmair and McConnell，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)，4134-4138以及WO91/14701)。其它用于制备肽和MHC分子的复合物的方法描述于欧洲专利申请NO.95 100 764.0中。该文献被包括在本发明的内容中。
本发明还涉及一种组合物在一种诊断方法中的使用，该组合物包括一种作为活性成分的自身反应性物质，例如蛋白质、多肽、肽、肽的衍生物、肽拟形物或/和肽-MHC复合物，它们选择性地与佐剂或其它通常的药物添加剂相组合，该方法包括将这种组合物在皮内给药。该组合物还可以含有一种附加的刺激组分，例如诸如IL-2和IL-4或/和表面抗原B7的细胞因子(参见Wyss-Coray等人，Eur.J.Immunol.23(1993)，2175-2180；Freeman等人，Science 262(1993)，909-911)，该刺激组分可以结合在T细胞的表面分子CD-28之上。这种附加的刺激组分的存在可以改进或/和改善该组合物的诊断效果。
另外，在本发明的方法中进行具有阳性或/和阴性对照的附加的检测也是优选的。例如，可以使用一种不反应的多肽，例如人血清白蛋白，或者只含添加剂的制品，例如缓冲液作为阴性对照。例如，得自培养了瘤细菌的培养基的纯化后的蛋白质衍生物(例如购自Statens Serum Institute，Copenhagen Denmark)或已知在许多人中可以导致强烈的T细胞刺激的破伤风类毒素可以被用作阳性对照抗原。
在本发明的某些实施方案中，将自身反应性物质与一种佐剂一同给药也是优选的。合适的佐剂的例子有氢氧化铝、不完全弗氏佐剂，磷酸铝以及适合于与肽连接的脂类(脂肽)。
自身反应性物质可以通过已知的方法给药，例如使用具有大小为26G针头的一般的皮内注射器。含有自身反应性物质的组合物的优选的皮内给药剂量为20μl至500μl，更优选为50μl至200μl，给药的合适体位以使所提供的自身抗原最便于达到免疫系统的细胞为准。例如为诊断IDDM，可将该药注射进前臂(正面)。
在组合物中的自身抗原的浓度可以根据各种情况下所使用的自身抗原在一个很宽的范围内变化。1至100μg/ml的浓度，尤其是5至2μg/ml的浓度是优选的。
另外，也可以在一台装置中进行给药，该装置包含一个用于存储含有自身反应性物质的制剂的容器、一个用于存储阳性对照制剂的容器以及一个用于存储阴性对照制剂的容器。举例来说，该装置可以包含2到10个用于存储含有自身反应性物质的制剂的容器。可以以一种简单的方式使用该装置以便同时检测许多自身反应性物质。
本发明的另一主题是确定一种特异性T细胞亚群，其中含有T细胞的样品与自身反应性物质相接触，而该样品优选地得自给药部位的组织样品，然后测定T细胞与自身反应性物质的反应。举例来说，T细胞与自身抗原的特异性反应可以通过T细胞繁殖的增加来检测到，而繁殖的增加可以通过放射性的掺入而加以测量。在另一方面，T细胞的反应也可以通过使用一种被标记了的自身抗原来直接检测，例如该自身抗原与可溶性的MHC分子以复合物的形式存在。在这一实施方案中，自身反应性物质优选地是与连接在其上的荧光标记基团一同使用。举例来说，可通过FACS分析来进行评价，其中T细胞与连接有T细胞特异抗体的第一个荧光标记物相接触，然后与连接有第二个荧光标记物的自身抗原相接触，然后通过荧光显影分析法来确定双重标记细胞的存在。以这种方式就可以确定一个T细胞亚群，其特征就是它与一种自身抗原的反应性。该方法还可以选择性地包括对预先活化的T细胞的选择，例如通过与IL-2的培养或/和通过与IL-2受体抗体的培养、随后例如使用免疫-磁方法对抗体结合细胞的分离来选择性地富集IL-2受体-阳性T细胞。在另一方面，在T细胞与自身抗原接触后，可以首先选择预先活化的细胞。
在对该方法的一个修正中，还可以确定预先活化的自身反应性T细胞(具有作为表面标记的IL-2受体的T细胞)与没有活化的自身反应性T细胞(没有IL-2受体的T细胞)的比率。
本发明的另一主题是分离与一种自身抗原反应的T细胞亚群。在该方法中，取自给药部位的含有T细胞的组织样品与一种自身抗原相接触，然后识别这些与自身抗原反应的T细胞并选择性地将它们与其它的T细胞分离。在这种情况下，在T细胞与自身抗原接触之前或/和之后，也可以对预先活化的T细胞，即含有IL-2受体的T细胞进行选择。在该方法中，举例来说，可以以下列形式使用自身抗原自身抗原与MHC分子形成的复合物、自身抗原被固定化在载体上，这就简化了将阳性反应的T细胞群与其它T细胞分离的过程。通过重新刺激，从以这种方式分离出的T细胞亚群中可以建立起T细胞系。然后就可以使用这些自身反应性T细胞系使病人免疫。
在用于识别特异性T细胞亚群的诊断方法中，也可以使用一种抗独特型抗体来代替自身抗原，该抗体模仿了MHC肽复合物的作用。通过把对一个特定的抗原有特异性的T细胞亚群用作生产抗体用的免疫源(例如在小鼠中)，或通过首先产生一种对抗自身抗原的第一抗体，然后再产生一种对抗第一抗体的抗独特型抗体，就可以很方便地得到上述抗体。
通过识别这些在体内被激活的T细胞的产物而不是分离这些T细胞，也可以识别特异的T细胞亚群。这可以通过收集组织样品(例如精细的针吸出物)并测定其中所含的细胞因子来实现。另外，也可以原位测定细胞因子，方法是使用一种长效药膏，其中固定化有针对各种细胞因子的抗体。通过一种传统的固相免疫分析法来检测细胞因子，其中使用了酶底物，它可以产生一种不溶性的有色产物，该产物可被直接读取或使用扫描仪读取。
最后，本发明涉及一种试剂盒，它用于在体内诊断细胞介导的疾病或这种病的体质，其中包括a)至少一种以可接受的药物组合物形式存在的自身反应性物质，b)任选的至少一种以可接受的药物组合物形式存在的对照物质，c)用于自身反应性物质和对照物质的皮内给药的装置，以及d)任选的用于对检测结果的诊断性评价的装置。
用于自身反应性物质以及对照物质的组合物中优选地含有佐剂并且可选择性地含有其它普通的药物载体物质、稀释剂和添加剂。
与图1和2以及序列SEQ ID NO.1-30相结合的下述实施例是为了进一步阐明本发明。
图1显示得自人GAD 65kd的自身反应性氨基酸序列，图2显示得自人GAD 65kd的其它自身反应性氨基酸序列，SEQ ID NO.1-7显示得自人GAD(I)-(VII)的自身反应性氨基酸序列，SEQ ID NO.8-11显示得自图1中的人GAD的自身反应性氨基酸序列，SEQ ID NO.12-28显示得自图2中的人GAD的自身反应性氨基酸序列，SEQ ID NO.29和30显示得自人GAD(VIII)和(IX)的自身反应性氨基酸序列。
实施例1(对比例)体外试验从8个最近感染了IDDM的病人体内以及12个健康人体内收集外周静脉血。通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离外周血淋巴细胞，然后将其与下述物质一起用于体外刺激a)重组人GAD 65kd，作为检测抗原；b)纯化后的蛋白质衍生物(PPD)，作为阳性对照抗原；c)人血清白蛋白(HSA)，作为阴性对照抗原。
在上述抗原存在或只有培养基存在的条件下，在具有96个孔的圆底培养器的1个孔内将1×105个外周血淋巴细胞(PBL)在37℃和5％CO2的条件下在100μl的培养基内培养五天(RPMI 1640培养基，5％人血清，2mmol/l谷氨酰胺，10U/ml青霉素，10μg/ml链霉素和50nmol/l 2-巯基乙醇)。
5天以后，向每一个孔内加入20μl含有0.5μCi 3H胸苷的RPMI 1640培养基。继续培养16小时，然后收集细胞。通过液体闪烁计数计量胸苷的掺入。将结果作为刺激指数(SI，即用抗原存在时的cpm除以抗原不存在时即只有培养基存在时的cpm)。
得自IDDM病人和对照组正常人的淋巴细胞针对不同的抗原的繁殖反应结果被列于表1和2中。
表1
表2
对试验结果的统计分析显示，使用rhGAD 65kd时，得自最近诊断的IDDM病人的PBL增殖可以被认为是阳性的，其SI高于4.7(对照组正常人的平均值为+2SD)。
因此，在50％的IDDM病人(病人2、3、7和8)中观察到了针对rhGAD 65kd的体外T细胞反应。在病人1、2、4和8中发现了针对GAD的抗体，而在病人3和5中没发现。没有对病人6和7的针对GAD的抗体进行检测。对照组的正常人对GAD 65kd无反应。
在对于作为对照的HSA和PPD的反应中，糖尿病人和对照组正常人根本没有显示出统计学上的明显差异。
实施例2体内试验将100μl浓度为10μg/ml的rhGAD 65kd皮内注射到实施例1中的八个IDDM病人的右前臂中。
用含有1％HSA，pH7.3的生理盐水稀释抗原。将同样体积(100μl)的浓度为10μg/ml的HSA注射到右上臂作为阴性对照。
在18个IDDM病人中的5个中以PPD作为阳性对照抗原。在所有病人中都将HSA作为阴性对照。
在体内诊断中，在给药部位的结节的形成(真皮厚度的特异性增加)即被认为是阳性反应。在给药48小时之后进行诊断。通过在给药部位的超声波测量来确定和计量结果。没有观察到副作用。
该试验的结果列于表3中。
表3
在八个被检测的IDDM病人中，有五个对rhGAD 65有阳性反应。序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称Boehringer Mannheim GmbH(B)街道Sandhofer Str.112-132(C)城市Mannheim(E)国家丹麦(F)邮码(ZIP)68305(ii)发明名称体内糖尿病检测(iii)序列数30(iv)计算机可读形式(A)数据载体软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，version#1.30(EPA)(vi)原始申请的资料(A)申请号DE19526561.0(B)申请日20-July-1995(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO1Asp Val Asn Tyr Ala Phe Leu His Ala Thr Asp Leu Leu Pro Ala Cys Asp1 5 10 15Gly Glu Arg20(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO2Ser Asn Met Tyr Ala Met Met Ile Ala Arg Phe Lys Met Phe Pro Glu Val1 5 10 15Lys Glu Lys20(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO3Asn Trp Glu Leu Ala Asp Gln Pro Gln Asn Leu Glu Glu Ile Leu Met His1 5 10 15Cys Gln Thr20(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO4Thr Leu Lys Tyr Ala Ile Lys Thr Gly His Pro Arg Tyr Phe Asn Gln Leu1 5 10 15Ser Thr Gly20(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO5Pro Arg Tyr Phe Asn Gln Leu Ser Thr Gly Leu Asp Met Val Gly Leu Ala1 5 10 15Ala Asp Trp20(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO6Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Leu Glu Tyr Val Thr Leu Lys1 5 10 15Lys Met Arg20(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)20个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO7Phe Phe Arg Met Val Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr His Gln Asp Ile Asp1 5 10 15Phe Leu Ile20(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO8Ile Leu Ile Lys Cys Asp Glu Arg Gly Lys Met Ile Pro Ser1 5 10(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO9Leu Gly Ile Gly Thr Asp Ser Val Ile Leu Ile Lys Cys Asp1 5 10(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO10Leu Ala Phe Leu Gln Asp Val Met Asn Ile Leu Leu Gln Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO11Tyr Asp Leu Ser Tyr Asp Thr Gly Asp Lys Ala Leu Gln Cys1 5 10(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO12Val Ser Tyr Gln Pro Leu Gly Asp Lys Val Asn Phe Phe Arg1 5 10(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO13Leu Ala Ala Asp Trp Leu Thr Ser Thr Ala Asn Thr Asn Met1 5 10(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO14Leu Leu Tyr Gly Asp Ala Glu Lys Pro Ala Glu Ser Gly Gly1 5 10(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO15Val Asn Tyr Ala Phe Leu His Ala Thr Asp Leu Leu Pro Ala1 5 10(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO16Leu Leu Gln Tyr Val Val Lys Ser Phe Asp Arg Ser Thr Lys1 5 10(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO17Phe Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Leu Glu Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO18Leu Glu Tyr Val Thr Leu Lys Lys Met Arg Glu Ile Ile Gly1 5 10(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO19Asn Met Tyr Ala Met Met Ile Ala Arg Phe Lys Met Phe Pro1 5 10(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO20Lys Ile Trp Met His Val Asp Ala Ala Trp Gly Gly Gly Leu1 5 10(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO21Trp Gly Gly Gly Leu Leu Met Ser Arg Lys His Lys Trp Lys1 5 10(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO22Glu Gly Tyr Glu Met Val Phe Asp Gly Lys Pro Gln His Thr1 5 l0(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO23Arg Tyr Phe Asn Gln Leu Ser Thr Gly Leu Asp Met Val Gly1 5 10(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO24Trp Leu Thr Ser Thr Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu1 5 10(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO25Thr Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val1 5 10(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO26Leu Val Ser Ala Thr Ala Gly Thr Thr Val Tyr Gly Ala Phe1 5 10(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO27Tyr Ile Pro Pro Ser Leu Arg Thr Leu Glu Asp Asn Glu Glu1 5 10(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO28Val Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr His Gln Asp Ile Asp Phe1 5 10(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO29Gly Met Ala Ala Leu Pro Arg Leu Ile Ala Phe Thr Ser Glu His Ser His1 5 10 15Phe Ser Leu Lys Lys Gly Ala Ala20 25(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO30Glu Arg Gly Lys Met Ile Pro Ser Asp Leu Glu Arg Arg Ile Leu Glu Ala1 5 10 15Lys Gln Lys20
权利要求
1.用自身反应性物质产生一种用于诊断细胞介导的疾病或细胞介导的疾病的体质的物质的应用，其中该物质被皮内给药，诊断的根据是在给药部位是否出现阳性反应。
2.如权利要求1的用于诊断自身免疫病或自身免疫病体质的应用。
3.如权利要求1的用于诊断肿瘤疾病或肿瘤疾病体质的应用。
4.如权利要求1至3的应用，其中核酸、脂类、糖类、蛋白质、多肽以及它们的复合物、免疫原性表位、片断、类似物、拟形物或衍生物以及它们的混合物选择性地以一种载体结合的形式用作自身反应性物质。
5.如权利要求4的应用，其中肽、肽衍生物或肽拟形物选择性地以与MHC分子或其肽结合衍生物所形成的复合物的形式用作自身反应性物质。
6.如权利要求1至5中的任一项的应用，用于诊断糖尿病、多发性硬化、风湿性关节炎、巴西多氏病、类风湿性脊椎炎、急性前眼色素炎、Good-pasture综合征、重症肌无力、系统性红斑狼疮、寻常性天疱疮、免疫甲状腺炎、硬皮病、克罗恩氏病、Siogren综合征、莱特尔氏综合症、肠炎或Graves病。
7.如权利要求6用来诊断I型糖尿病(IDDM)的应用。
8.如权利要求7的应用，其中谷氨酸脱羧酶(GAD)或它的部分被用作自身反应性物质。
9.如权利要求7或8的应用，其中人GAD 65kd被用作自身反应性物质。
10.如权利要求7的应用，其中一种或几种得自GAD的肽或其肽衍生物或肽拟形物选择性地以与MHC分子或其肽结合衍生物所形成的复合物的形式用作自身反应性物质。
11.如权利要求10的应用，其中使用了肽或肽衍生物，它们包括(a)氨基酸序列 (I)D-V-N-Y-A-F-L-H-A-T-D-L-L-P-A-C-D-G-E-R，(b)氨基酸序列 (II)S-N-M-Y-A-M-M-I-A-R-F-K-M-F-P-E-V-K-E-K，(c)氨基酸序列 (III)N-W-E-L-A-D-Q-P-Q-N-L-E-E-I-L-M-H-C-Q-T，(d)氨基酸序列 (IV)T-L-K-Y-A-I-K-T-G-H-P-R-Y-F-N-Q-L-S-T-G，(e)氨基酸序列 (V)P-R-Y-F-N-Q-L-S-T-G-L-D-M-V-G-L-A-A-D-W，(f)氨基酸序列 (VI)T-Y-E-I-A-P-V-F-V-L-L-E-Y-V-T-L-K-K-M-R，(g)氨基酸序列 (VII)F-F-R-M-V-I-S-N-P-A-A-T-H-Q-D-I-D-F-L-I，(h)氨基酸序列 (VIII)G-M-A-A-L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F-S-L-K-K-G-A-A，(i)氨基酸序列 (IX)E-R-G-K-M-I-P-S-D-L-E-R-R-I-L-E-A-K-Q-K，(j)示于图1或2的氨基酸序列中的一种，(k)长度至少为6个氨基酸的示于(a)至(i)中的氨基酸序列的部分区域，或/如(l)与示于(a)至(j)中的氨基酸序列具有基本相同的对MHC分子的结合特异性或/和亲和力的氨基酸序列。
12.如权利要求5、10或11中任一项的应用，其中肽或肽衍生物的长度至少为8个氨基酸。
13.如权利要求12中的应用，其中肽或肽衍生物的长度至少为10个氨基酸。
14.如权利要求5、10或11中任一项的应用，其中肽或肽衍生物的长度可达到25个氨基酸。
15.如前述权利要求中任一项的应用，其中阳性反应的测定时刻至少在给药的24小时之后。
16.如权利要求15的应用，其中，阳性反应的测定时刻在给药后的24小时至1周之内。
17.如前述权利要求中任一项的应用，其中阳性反应通过在给药部位出现结节测定。
18.如权利要求16的应用，其中阳性反应通过对给药部位的视觉观察或/和对相关皮肤区域的触摸来测定。
19.如权利要求16的应用，其中阳性反应优选地通过超声波或照相方法定量测定。
20.如前述权利要求中任一项的应用，其中阳性反应通过检测在给药部位由浸润细胞释放的物质来测定。
21.如权利要求20的应用，其中检测细胞因子。
22.如前述权利要求中任一项的应用，其中用阳性或/和阴性对照进行附加的测定。
23.如前述权利要求任一项的应用，其中自身反应性物质与一种佐剂一同给药。
24.如前述权利要求中任一项的应用，其中给药在一台装置中进行，该装置包含至少一个用于存储自身反应性物质的制剂的容器、一个用于存储阳性对照制剂的容器以及一个用于存储阴性对照制剂的容器。
25.如前述权利要求中任一项的应用，还包括确定或分离一种特异性自身反应性T细胞亚群，其中将得自给药部位的组织样品与一种自身反应性物质接触，与自身反应性物质反应的T细胞被识别并被选择性地与其它T细胞分离。
26.用于在体内诊断细胞介导的疾病或细胞介导的疾病的体质的方法，其中自身反应性物质被皮内给药，诊断的根据是在给药部位是否出现阳性反应。
27.用于在体内诊断细胞介导的疾病或其体质的试剂盒，它包括(a)至少一种以可接受的药物组合物形式存在的自身反应性物质，(b)可选择的至少一种以可接受的药物组合物形式存在的对照物质，(c)用于自身反应性物质和对照物质的皮内给药的装置，以及(d)用于诊断性地评价检测结果的可选装置。
28.如权利要求27的试剂盒，其中用于自身反应性物质和对照物质的组合物中含有佐剂。
全文摘要
本发明涉及用自身反应性物质产生一种用于诊断细胞介导的疾病或细胞介导的疾病的体质的物质的应用,其中该物质被皮内给药,诊断的根据是在给药部位是否出现阳性反应。
文档编号A61K49/00GK1191493SQ96195689
公开日1998年8月26日 申请日期1996年7月19日 优先权日1995年7月20日
发明者J·安德尔, M·甘兹, P·斯塔尔, R·基恩施恩盖尔, G·G·朱恩格, P·波兹里, F·多尼 申请人:伯伦格曼海姆有限公司