专利名称：可用于检测与2型糖尿病相关的gck基因甲基化程度的试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助诊断2型糖尿病的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测与2型糖尿病相关的GCK基因甲基化程度的试剂盒及其应用
背景技术：
糖尿病是血中胰岛素绝对或相对不足，导致血糖过高，出现糖尿，进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱，临床上可出现多尿、烦渴、多饮、多食，消瘦等表现，重者容易发生酮症酸中毒等急性并发症或血管、神经等慢性并发症。糖尿病是一种常见的内分泌代谢性疾病，其患病率随着生活条件的改善生活水平提高都呈逐渐增长的趋势。据统计，目前中国糖尿病患病人数接近一亿，患病率高达9.7%。糖尿病不是单一疾病，是由遗传及环境因素在内的多种因素共同作用的结果。其中2型糖尿病发病人数约占糖尿病总发病人数的97%。2型糖尿病过去主要在超过40岁的成年人中发病，而现在2型糖尿病的发病正趋向低龄化。葡萄糖激酶(GCK)是影响2型糖尿病的重要基因，葡萄糖激酶(GCK)基因编码葡萄糖激酶的生成，葡萄糖激酶可催化葡萄糖转变成6-磷酸葡萄糖，是葡萄糖代谢的关键酶和限速酶。当GCK基因编码的葡萄糖激酶生成减少时，葡萄糖代谢会受影响，也不能维持血糖稳态。目前国内外对糖尿病机制的研究也越来越多。有研究背景表明基因的甲基化是在不改变DNA序列情况下，影响基因表达。但目前没有研究阐述证明基因甲基化和与2型糖尿病存在相关性。同时，国内外还没有公开任何关于可用于检测与2型糖尿病相关的GCK基因甲基化程度的试剂盒的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决 的技术问题是提供一种可用于检测与2型糖尿病相关的GCK基因甲基化程度的试剂盒及其应用，其中GCK基因甲基化水平与男性人群2型糖尿病患病率呈正相关，检测效率高，针对性强。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种可用于检测与2型糖尿病相关的GCK基因甲基化程度的试剂盒，该试剂盒包括一对GCK基因甲基化特异性扩增引物及甲基化特异性测序引物，其中
所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示 5，-TGGATGGTTTAGTGTATAAGTTGTATT-3，
所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示:
5，-Biotin-CACCTCATCCTCCACATTCAT-3，
所述的甲基化特异性测序引物如SEQ ID N0.3所示 5， -AAGTGGGGTTTAAAAAG-3，。一种可用于检测与2型糖尿病相关的GCK基因甲基化程度的试剂盒的应用，在外周血检测中，该试剂盒可用于男性人群2型糖尿病的辅助诊断、检测或筛查药物中。
与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明首次公开了可用于检测与2型糖尿病相关的GCK基因甲基化程度的试剂盒及其应用，GCK基因高甲基化水平导致GCK基因的低表达，从而使与糖尿病密切相关的葡萄糖激酶表达减少，从而使体内血糖发生变化导致胰岛素抵抗及糖尿病的发生。因此，GCK基因甲基化水平与2糖尿病的发生型呈正相关，以检测GCK基因甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对2型糖尿病的检测，检测效率高，针对性强，同时，以GCK基因甲基化为靶点的药物有望成为2型糖尿病辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。
图1为GCK基因被检测序列所在区域以及所检测的4个CpG点的关联分析结果(例如CpGl与CpG2的相关系数为0.685，CpG2与CpG3的相关系数为0.765)；
图2为甲基化水平检测结果示例，图中所示百分数为对应CpG位点的甲基化程度，如图示CpGl到CpG4的甲基化程度分别为43%，42%，53%，44%，图中阴影部分显示的是对应CpG位点的信号强度，结合该位点附近碱基种类可分析得到其甲基化水平(即阴影框对应的上方数字);
图3为在男性人群及女性人群中胆固醇与CpG4岛的DNA甲基化程度的相关性线性图； 图4为总人群中关于CpG4岛及CpGl-3岛的甲基化水平的ROC曲线 图5为男性人群中关于CpG4岛及CpGl-3岛的甲基化水平的ROC曲线 图6为女性人群中关于CpG4岛及CpGl-3岛的甲基化水平的ROC曲线图。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例1、研究对象的收集
从某医院收集48例2型糖尿病患者(24名男性+24名女性)，同时也收集了年龄性别匹配的48例正常者作为对照(24名男性+24名女性)。2、基因组DNA的提取
应用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪(中国厦门致善生物科技有限公司，500ul体系)提取样本的全血基因组DNA，再通过核酸蛋白测定仪检测所得DNA的浓度，以供GCK基因DNA甲基化水平的检测。3、DNA甲基化水平测定
本研究采用重亚硫酸盐焦磷酸测序技术对GCK基因的4个CpG位点(如图1)进行了DNA甲基化水平检测。此技术的基本原理:用试剂盒中的重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反应(PCR)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶(C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶(U)，然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design软件进行引物设计,用于实验的PCR扩增引物和测序引物如下:
(1)甲基化特异性上游引物(Forward primer):5’ -TGGATGGTTTAGTGTATAAGTTGTATT-3’ (SEQ ID N0.1),
(2)甲基化特异性下游引物(Reverseprimer):
5J -Biotin-CACCTCATCCTCCACATTCAT-3J (SEQ ID N0.2),
(3)甲基化特异性测序引物(Sequencingprimer)
5， -AAGTGGGGTTTAAAAAG-3，
上述扩增的具体步骤为:
(1)采用QIAGEN EpiTect 亚硫酸氢盐处理试剂盒(EpiTech Bisulfite Kits;Qiagen; #59104)对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；
(2)取步骤(I)中转化过的DNA样本20ng加入到PyromarkPCR试剂盒(Pyromark PCRKit; Qiagen; #978703)，并加入设计好的PCR引物，进行PCR扩增，扩增条件:首先95°C 15分钟的变性；接着95°C 15秒，Tm 30秒，72°C 20秒，共50个循环的退火反应；然后延伸反应72°C 5分钟。(注:Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定)
(3)焦磷酸测序的前期准备:在PSQ96板中预先加入45μ I含有0.3 μ M测序引物的退火缓冲液；将需要使用的混匀的琼脂糖凝胶磁珠总量(每样本3 μ I)转移到一个小离心管中；在琼脂糖凝胶磁珠中加入结合缓冲液，使得平均每个样品约有50 μ I的体积，将混合物混匀；将以上混合物加入PCR产物(50μ I反应体积)中，每样本50μ I ^fPCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合； 在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70%乙醇、洗涤缓冲液和120ml的变形缓冲液；打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具移到PCR板中，抓取琼脂糖凝胶磁珠(在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此操作);拿起PCR板，检查是否大部分beads都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70%乙醇中5秒；然后移到变形缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5 - 10秒；关掉泵；将真空准备工具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖凝胶磁珠(测序引物也可最后加入)；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在ThermoPlate上加热到80°C 2分钟，再冷却到室温，即可进行焦磷酸测序反应；
(4)焦磷酸测序:在PyroMarkQ24焦磷酸测序仪上,采用Pyromark Gold Q24试剂盒(Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen; #978802)对步骤(3)的 PSQ96 板中的样本进行测序，然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析(甲基化水平检测结果示例见组图3)。4、数据分析
本次研究采用SPSS 16.0对数据进行整理分析，我们发现:被检测的4个CpG位点，CpG2和CpG4之间没有相关性(Ρ>0.05)，CpGl和CpG4之间有一定相关性(R=0.281，P=0.006)，CpG3 和 CpG4 之间有显著相关性(R=0.438，P<0.001),其它(CpGl、CpG2、CpG3 )之间也有显著相关性(R>0.5，P〈0.001)(如表I及图1所示)，因此选取CpGl、CpG2、CpG3三个甲基化水平求平均值后参与到后续的分析中。从表2中可以看出，在总群体、男性群体、女性群体甲基化程度与2型糖尿病的相关程度是不相同。其中在总群体、男性群体、女性群体的病例对照中，年龄、胆固醇、甘油三脂、谷丙转氨酶、尿酸这四个表型及CpGl-3的平均DNA甲基化程度与2型糖尿病的发生没有相关性。而CpG4 DNA甲基化程度在病例对照中有显著的差异。在总人群中CpG4位点甲基化程度在2型糖尿病患者与正常对照者中有差异，同时在男性群体中此差异更显著，而在女性群体中几乎无差异。即CpG4位点甲基化程度与2型糖尿病的发生有相关性，尤其是在男性群体中。另外在胆固醇和CpG4甲基化程度的相关性研究中，我们发现在男性群体中两者成正相关(r=0.304，P=0.036)(如图3所示)。通过SPSS 16.0软件分析得到的ROC曲线(受试者工作特征曲线)图中，不论是在总人群(图4)还是男性人群(图5)，女性人群(图6)中，每条曲线下面积(AUC)都大于0.5，而由CpG4所代表的曲线下面积更大，尤其是在男性中此曲线的可信度更大(P=0.008)，这说明CpG4岛的甲基化程度用来辅助诊断2型糖尿病有一定诊断价值。通过试剂盒检测GCK基因甲基化程度来辅助诊断糖尿病是有一定意义，当然在男性人群中更明显。注:参考线即机会对角线，参考线下面积(AUC)为0.5，此线之下则该诊断方法完全没有诊断价值。
通过试剂盒对甲基化程度的测量分析，我们发现:在总群体中2型糖尿病患者与对照组之间有差别，在男性群体中则更有明显的差别，即在男性群体中2型糖尿病患者的甲基化程度要明显高于对照组。本发明可用于检测与2型糖尿病相关的GCK基因甲基化程度的试剂盒具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。本发明采用上述试剂盒对GCK基因甲基化水平进行检测，能够快速可靠地为2型糖尿病的辅助诊断、检测或筛查药物提供借鉴。上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范 围以权利要求书为准。
权利要求
1.一种可用于检测与2型糖尿病相关的GCK基因甲基化程度的试剂盒，其特征在于:该试剂盒包括一对GCK基因甲基化特异性扩增引物及甲基化特异性测序引物，其中 所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:5’ -TGGATGGTTTAGTGTATAAGTTGTATT-3’ ; 所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示:5，-Biotin-CACCTCATCCTCCACATTCAT-3， 所述的甲基化特 异性测序引物如SEQ ID N0.3所示:5， -AAGTGGGGTTTAAAAAG-3，。
2.一种如权利要求1所述的可用于检测与2型糖尿病相关的GCK基因甲基化程度的试剂盒的应用，其特征在于:在外周血检测中，该试剂盒可用于男性人群2型糖尿病的辅助诊断、检测或筛查药物中。
全文摘要
本发明公开了可用于检测与2型糖尿病相关的GCK基因甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是该试剂盒包括一对GCK基因甲基化特异性扩增引物及甲基化特异性测序引物，其中上游引物具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，甲基化特异性测序引物如SEQIDNO.3所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对2型糖尿病的检测，检测效率高，针对性强，同时，以GCK基因甲基化为靶点的药物有望成为2型糖尿病辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。
文档编号C12Q1/68GK103160582SQ20131008229
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月14日 优先权日2013年3月14日
发明者汤琳琳, 段世伟, 王钦文, 张莉娜, 徐雷艇, 步世忠 申请人:宁波大学