专利名称：适合于制备具有延长释放期限的皮下植入物的含有一种肽和聚乳酸－乙醇酸的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及适合于制备皮下植入物的包括一种肽和聚乳酸-乙醇酸的组合物。
这些组合物适合于非肠道给药并具有在设定的时间期限内释放有效量药物的特性。
可以按照任意公知的技术来混合药物和聚合物或可以按照公知技术的操作用聚合物给药物颗粒包衣。
美国专利4.767.628(ICI)中描述了含有肽和乳酸聚合物或乳酸与乙醇酸共聚物的组合物。
当制备所述组合物时，将所述肽和所述共聚物溶于一种溶剂且然后两种溶液混合，其中所述溶剂对两种物质来说可以相同或不同，例如是二噁烷或水。
随后的操作步骤包括在低温下除去溶剂并以挤压方式获得粉末。
在这种方式中，获得圆柱形组合物，其中所述肽均匀分布在所述聚合物中。
已经从美国专利5.366.734(Zeneca)中了解到可以将涉及上述内容的美国专利4.767.628中包括的组合物用于制备皮下植入物。
乳酸聚合物和乳酸与乙醇酸的共聚物与所述肽不相容，由此所述肽通过所述聚合物扩散是不可能的。
当将这些植入物在37℃下导入缓冲溶液中时，水透过和扩散入植入物并分布在所述聚合物和所述肽之间，从而形成水合肽类的区。
美国专利5.336.734中所述的释放肽的第一个阶段是由聚合物膨胀导致的扩散阶段。
当聚合物膨胀时，使得水合肽的通道形成，其中所述肽扩散至表面。
如果膨胀终止，那么所述肽不再释放。
第二个释放阶段由聚合物基质降解产生。
在该阶段中，在基质内形成孔和缝隙，它们可释放仍然在基质中分离的水合肽类。
将总释放时间限定在各阶段释放时间的总和。
然而，所观察到的最长释放时间大约为3个月。
在国际专利申请WO98/09613(Deghenghi)中，描述了一种用于制备能够释放生物活性肽类的皮下植入物的方法。
该方法由下列步骤组成·研磨乳酸与乙醇酸的共聚物；·用肽的含水淤浆(在实施例中使用的是乙酸avoreline的水溶液)使所述共聚物湿润；·将该共聚物与上述淤浆混合以便获得一种均匀混合物；·在不超过25℃的温度下干燥该混合物；·在70-110℃下挤压该混合物以便获得适合于用作皮下植入物的可挤压的小圆柱体。
该方法不能使用工业化方法进行，因为不能够从混合物中充分消除水。WO98/109613中推断的结果由此不能再现。
然而，涉及上述内容的该专利中用于皮下植入物的组合物的基本特征由肽在聚合物中均匀分布组成，这是由于使用两种成分中的至少一种的溶液导致的。
目前市场上的植入物具有在有限时间期限、一般约为3个月左右释放肽类的缺陷。
本申请人目前已经发现了适合于制备在至少6个月时间期限内释放活性物质的皮下植入物的组合物。
这些组合物由聚乳酸-乙醇酸(PLGA)和一种肽组成且它们具有肽颗粒分布在PLGA中的特征，其中在显微镜检验中，所述的颗粒大小极其不均匀，分散在聚合物基质中的肽颗粒的直径为1-60微米。
将本发明的组合物及其制备方法的这些和其它特征在下面的具体描述中更深入地解释。
附图2代表现有技术植入物截面的显微镜检验。
附图3代表从实施例1植入物中释放的avoreline的累积量。
附图4代表从实施例2植入物中释放的avoreline的累积量。
附图5代表使用具有10mg avoreline含量的植入物进行临床实验获得的LH、FSH和睾酮的血浆浓度。
附图6代表使用具有15mg avoreline含量的植入物进行临床实验获得的LH、FSH和睾酮的血浆浓度。
附图7代表使用具有10mg avoreline含量的植入物进行临床实验获得的avoreline和睾酮的血浆浓度。
附图8代表使用具有15mg avoreline含量的植入物进行临床实验获得的avoreline和睾酮的血浆浓度。
发明详述本发明涉及由聚乳酸-乙醇酸(PLGA)和一种肽组成的适合于制备长期释放皮下植入物的组合物。由本发明组合物制备的植入物由掺入具有极其不均匀大小的颗粒形式的肽的高分子量PLGA基质组成。
这种结构使得所述肽分三个阶段释放，它们分别是单纯扩散、通过使PLGA膨胀而扩散和通过PLGA降解而导致释放。
这使得总体释放时间明显增加。
当将这些植入物导入水性环境中时，水通过聚合物基质扩散、达到最接近于表面的肽颗粒且然后是更深的内部区域，从而导致形成水合肽的多孔网格，肽通过单纯扩散释放(第一个阶段)的现象通过这一结果发生。
植入物保持不变约6周且在该期限内释放约30％的肽。
这种单纯扩散阶段的期限主要由肽颗粒大小的不均匀度来决定且速度主要由PLGA基质中所述肽的含量来决定。
作为肽颗粒大小差异大的结果，在第一个溶出阶段后有足量的肽保留下来以便在随后的阶段内释放。
在第二个阶段中，所述肽通过使用聚合物膨胀的扩散而释放。
在第三个阶段中，残余肽在基质被破坏时释放出来。
释放所述肽而没有死时间的三个阶段的连续取决于对组合物中组分的适当选择，特别是·肽颗粒大小的不均匀性质决定第一个阶段的释放；·PLGA的特性(分子量和摩尔比)对膨胀和基质降解阶段具有影响。
本发明的技术难点在于在整个制备植入物的过程中保持肽颗粒大小的不均匀性。
这一难点既不能通过使用由两种化合物共溶于一种溶剂或两种化合物中的一种溶于一种溶剂而混合的公知技术来克服，也不能通过以熔融态混合的技术来克服。在本发明中已经通过将PLGA与肽进行湿法制粒而解决了这一难题。这种操作和后续操作可使得保持肽颗粒的起始不均匀性。
本发明还涉及这些组合物的制备方法并涉及前述的皮下植入物。
一种这类方法是一种湿法制粒法。
该方法由下列步骤组成a)将具有1-60微米直径的颗粒形式的肽在干燥时与粒度分析(granulometry)为10-150微米、优选50-150微米的颗粒形式的PLGA均匀混合；b)通过加入一种例如乙醇或水这样的合适液体、使用湿法制粒使获自步骤a)的混合物成粒；
c)将所述颗粒干燥至残余液体含量按重量计为0.1-3.0％、优选0.5-2.0％为止。这种液体含量是重要的，因为它可以使颗粒产生足够的粘结力而防止混合物中的组分在后续处理步骤中分离；d)挤压获自步骤c)的混合物。在进入挤压机时的20℃、优选30℃到离开挤压机时的不超过120℃、优选110℃的温度分布范围内在挤压机中的暴露时间为1-10分钟、优选4-6分钟。在这些条件下，PLGA熔化而形成包裹肽颗粒的连续基质，同时维持这些颗粒大小的不均匀性质。
e)可以将由挤压步骤获得的圆柱体稍微拉伸且然后切割以获得适合于皮下植入物的大小，即直径为1.0-1.7mm、优选1.3-1.5mm且长度为10-30mm、优选15-24mm的植入物；f)最后，如果需要，将获自步骤e)的圆柱体进行灭菌。
适用于本发明的合适的聚乳酸-乙醇酸共聚物具有50,000-150,000的分子量且包括的乳酸单体与乙醇酸单体之间的摩尔比50∶50-95∶5。
用于本发明方法的优选的聚乳酸-乙醇酸(PLGA)具有100,000-150,000D的高标称分子量且乳酸单体与乙醇酸单体之间的摩尔比为70/30-75/25。
可以用于本发明的肽类优选，但不排除它地，是LHRH的类似物且包括、例如avoreline5-氧代-L-脯氨酰基-L-组氨酰基(histidil)-L-色氨酰基(tryptophil)-L-丝氨酰基-L-酪氨酰基(tyrosil)-2-甲基-D-色氨酰基(tryptophil)-L-亮氨酰基-L-精氨酰基-N-乙基-脯氨酰胺；tryptoreline5-氧代-L-脯氨酰基-L-组氨酰基-L-色氨酰基(tryptophil)-L-丝氨酰基-L-酪氨酰基(tyrosil)-D-色氨酰基(tryptophil)-L-亮氨酰基-L-精氨酰基-L-脯氨酰基-甘氨酰胺；亮丙瑞林(leuproreline)5-氧代-L-脯氨酰基(profil)-L-组氨酰基-L-色氨酰基(tryptophil)-L-丝氨酰基-L-酪氨酰基(tyrosil)-D-亮氨酰基-L-亮氨酰基-L-精氨酰基-N-etil-脯氨酰胺；戈舍瑞林(gosereline)5-氧代-L-脯氨酰基-L-组氨酰基-L-色氨酰基(tryptophil)-L-丝氨酰基-L-酪氨酰基(tyrosil)-叔丁基-D-丝氨酰基-L-亮氨酰基-L-精氨酰基-L-脯氨酰基-NH-NH-CO-NH2。
优选在本发明中使用的肽是avoreline。
该组合物中的肽含量按重量计为20-40％、优选20-36％。
为制粒所添加的液体的量与混合物相比为10-60重量份、优选20-45重量份。
步骤c)中涉及的干燥过程发生在20-50℃、优选20-30℃温度下，在干燥气流中。
在显微镜下，获自步骤f)的圆柱体的横截面显示了含有肽颗粒的不均匀结构，所述的肽颗粒具有与浸入由PLGA构成的基质中的起始肽相同的粒度分析。
可以将获自步骤f)的圆柱体成功地用于皮下植入物。
具有直径为1.0-1.7mm、优选1.3-1.5mm且长度为10-30mm、优选15-24mm的各植入物具有5-20mg的肽含量。
肽在体外和体内试验过程中释放发生在至少6个月的时间期限内。
然而，通过改变植入物的直径和长度可以控制释放肽的总时间。
使用本发明的皮下植入物在患有前列腺肿瘤的患者中进行的临床试验已经在4周内显示睾酮抑制，而这种作用会持续约7个月至约12个月。
为了解释本发明，列举了下列实施例。
avoreline具有下列特征·酸-碱计量滴定度按重量计88.1％；
·pKa6.15-9.70-12.02；·粒度分析分布1-60微米。
PLGA具有下列特征·分子量116,500D；·乳酸单体与乙醇酸(glycol)单体的摩尔比70∶30；·特性粘数(CHCl3)在25℃下测定为0.98dl/g；·粒度分析分布90％的情况是50-150微米。
通过加入16ml乙醇、使用16mm筛网(grid)对获得的混合物进行湿法制粒。
在干燥气流中25℃温度下干燥获得的颗粒。
干燥后颗粒中乙醇的含量按重量计为0.66％。
最终使用带有1.5mm直径和17.55mm长冲头的挤压机挤压所述颗粒。
螺杆的旋转速度为5转/分钟且进入挤压机时的温度为30℃而离开挤压机时的温度为100℃。
将通过挤压步骤获得的圆柱体稍微拉伸且然后切成18mm长的段，最后将其进行放射灭菌。在这种方式中，获得了直径为1.5mm、长18mm且avoreline含量按重量计为25.3％的皮下用植入物。
在×275放大倍数的显微镜下检测的这些植入物的横截面显示在PLGA物质团中avoreline颗粒的不均匀分布，正如附
图1中所示。特别地，avoreline颗粒保留了其1微米-60微米的起始粒度分析。
对使用US5.366.734中获得的公知技术产生的植入物进行相同的显微镜检测，在1100×放大倍数下显示附图2中所示的两种成分的均匀分布。体外释放动力学在体外测试按照实施例1制备的植入物以便检测释放avoreline的动力学特性。
本试验在下列条件下进行。
将5个植入物导入一个烧瓶并加入5ml的pH7.4的磷酸盐缓冲液。本试验在37℃下进行210天，使用100转/分钟持续搅拌该溶液。
每周对相同期限内释放的含活性组分的缓冲溶液进行取样并分析，同时如上所述向烧瓶中加5ml磷酸盐缓冲液。
通过HPLC在下列条件下测定avoreline在所述溶液中的含量柱 Vydac 218TP 54300A介质，5μm；大小250×4.6mm流动相 将750ml、0.1M磷酸加入到250ml的乙腈中并用三乙胺将pH调节至2.5并通过FH型滤膜(微孔)将混合物过滤。输出 1.5ml/分钟温度 30℃测定 220nm处的UV注射 10μl体积分析时间 15分钟结果如附图3中所示，其中X轴表示用天数表示的时间且Y轴表示用mg表示的avoreline释放的累积量。
显微镜检测产生了与实施例1类似的结果。体外释放试验结果如附图4中所示，其中参数与附图3中的参数相同。
显微镜检测和释放试验结果产生了与实施例1相似的结果。
将9克avoreline与24克聚乳酸-乙醇酸(PLGA)充分混合。
avoreline具有下列特征·酸-碱计量滴定度按重量计90.1％；·pKa6.15-9.70-12.02；·粒度分析分布1-60微米。
PLGA具有下列特征·分子量121,900D；·乳酸单体与乙醇酸单体的摩尔比70∶30；·粒度分析分布90％的情况是50-150微米。
通过加入6ml水、使用1.6mm筛网(grid)对获得的混合物进行湿法制粒。
在25℃温度下于干燥气流中将获得的颗粒干燥12小时。
干燥后颗粒中水的含量按重量计为1.8％。
如实施例1中所述进行挤压和随后的操作步骤。
所获得的植入物具有的avoreline滴定度按重量计为27.6％。
显微镜检测和释放试验产生了与实施例1相似的结果。
tryptoreline具有的滴定度按重量计为90.5％且粒度分析分布为1-60微米。
PLGA具有的分子量为121,900D、乳酸单体与乙醇酸单体的摩尔比为70∶30且90％的粒度分析分布情况为50-150微米。
通过加入8ml乙醇、使用1.6mm筛网(grid)对获得的混合物进行湿法制粒。
在25℃温度下于干燥气流中将获得的颗粒干燥12小时。
干燥后颗粒中乙醇的含量按重量计为1.0％。
如实施例1中所述进行挤压和随后的操作步骤。
所获得的植入物具有的avoreline滴定度按重量计为24.7％。显微镜检测和释放试验产生了与实施例1相似的结果。实施例6将6克戈舍瑞林与14克PLGA充分混合。
戈舍瑞林具有的滴定度按重量计为89.5％且粒度分析分布为1-60微米。
PLGA具有的分子量为121,900D、乳酸单体与乙醇酸单体的摩尔比为70∶30且90％的粒度分布情况为50-150微米。
通过加入8ml乙醇、使用1.6mm筛网(grid)对获得的混合物进行湿法制粒。
在25℃温度下于干燥气流中将获得的颗粒干燥12小时。
干燥后颗粒中乙醇的含量按重量计为1.1％。
如实施例1中所述进行挤压和随后的操作步骤。
所获得的植入物具有的戈舍瑞林滴定度按重量计为24.9％。显微镜检测和释放试验产生了与实施例1相似的结果。临床实验使用按照本发明制备的皮下植入物在60位患有前列腺肿瘤的患者中进行临床试验。
用具有10mg avoreline含量的植入物治疗一组患者并用具有15mg avoreline含量的植入物治疗第二组患者。
实验结果如附图5-8中所示。
可以将这些附图的曲线解释如下·曲线a)代表FSH的平均血浆浓度；·曲线b)代表睾酮的平均血浆浓度；·曲线c)代表LH的平均血浆浓度；·曲线d)代表avoreline的平均血浆浓度；·线e)是关于睾酮的阉割(castration)线。
附图5和附图7涉及具有10mg avoreline含量的植入物的用途，而附图6和8涉及具有15mg avoreline含量的植入物的用途。
就附图5和6而言，左侧的纵坐标表示以IU/L计的LH和FSH的血浆浓度，而右侧的纵坐标表示以nmol/L计的睾酮的血浆浓度。
就附图7和8而言，左侧的纵坐标表示以pg/mL计的avoreline的血浆浓度，而右侧的纵坐标表示以nmol/L计的睾酮的血浆浓度。
在所有附图中，将自植入物插入的时间(表示为周)列在X轴上。
正如从这些附图中观察到的，使用本发明的植入物在植入物插入后4周内抑制了睾酮，其作用持续约7个月至约12个月的期限。
在插入植入物后约6个月内测定可以测定的avoreline的血浆浓度。
权利要求
1.适合于制备具有延长释放时间的皮下植入物的由聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)和一种肽构成的组合物，其特征在于分布的肽颗粒具有极其不均匀的大小，具有1-60微米直径的肽颗粒分散在PLGA基质中。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于当与生理类型的水溶液接触时，这种肽分三个阶段释放第一个释放阶段涉及单纯的扩散；第二个释放阶段涉及PLGA膨胀且第三个释放阶段涉及PLGA降解。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述PLGA具有50,000-150,000的分子量且包括的乳酸单体与乙醇酸单体之间的摩尔比为50∶50-95∶5。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于所述PLGA具有100,000-150,000的分子量且乳酸单体与乙醇酸单体之间的摩尔比为70/30-75/25。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述肽选自包括avoreline、tryptoreline、亮丙瑞林和戈舍瑞林的组。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述肽是avoreline。
7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述肽是tryptoreline。
8.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述肽是戈舍瑞林。
9.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述肽的含量按重量计为20-40％、优选20-36％。
10.适合于制备权利要求1的皮下植入物的组合物的制备方法，其特征在于a)将具有1-60微米直径的颗粒形式的肽在干燥时与PLGA均匀混合；b)通过加入一种液体、借助于湿法制粒使获自步骤a)的混合物成粒；c)将所述颗粒干燥至残余液体含量按重量计优选为0.5-2.0％为止；并d)挤压获自步骤c)的混合物且如果需要将它们切割并灭菌。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于在进入挤压机时的30℃到离开挤压机时的不超过110℃的范围内的温度下，在步骤d)的挤压机中的暴露时间为4-6分钟。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于与由所述肽和PLGA构成的混合物相比，步骤a)中所用的肽的量按重量计为20-40％且优选20-36％。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于当这种成粒液体是乙醇或水时，每100重量份的混合物中所加入的液体量为10-60重量份、优选20-45重量份。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于通过从步骤d)中挤压而获得的圆柱体具有1.0-1.7mm、优选1.3-1.5mm的直径和10-30mm、优选15-24mm的长度。
15.获自如权利要求1所述的组合物的皮下植入物。
16.使用权利要求10-14所述方法制备的皮下植入物。
17.根据权利要求15和16所述的皮下植入物，它具有1.3-1.5mm的直径、15-24mm的长度和5-20mg的肽含量。
18.根据权利要求17所述的皮下植入物，其特征在于所述肽选自包括avoreline、tryptoreline、亮丙瑞林和戈舍瑞林的组。
全文摘要
本发明涉及适合于制备具有至少等于6个月的释放时间的皮下植入物的包括一种肽和聚乳酸－乙醇酸(PLGA)的组合物,其中所述肽在PLGA中的颗粒大小分布产生高度的不均匀性。
文档编号A61K9/00GK1329485SQ99814241
公开日2002年1月2日 申请日期1999年12月6日 优先权日1998年12月10日
发明者A·玛奎恩, P·茂瑞埃克, P·玛瑞恩 申请人:梅迪奥拉纳姆药制品股份公司