加速粘液纤毛的清除速率的方法

专利名称：加速粘液纤毛的清除速率的方法
技术领域：
本发明涉及包含丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的组合物，其刺激肺部气道中粘液和痰液的粘液纤毛清除速率。本发明还涉及刺激哺乳动物粘液纤毛清除速率的方法。
背景技术：
涉及的问题特征为纤毛上皮不能清除肺气道中的粘液和痰液的粘液纤毛功能紊乱，是慢性阻塞性肺病(如慢性支气管炎(CB)、支气管扩张(BE)、哮喘和尤其是囊性纤维变性(CF))的严重并发症。粘液纤毛功能紊乱的患者特别易受继发性细菌感染。已有人描述了对CF和其他与粘液纤毛功能紊乱相关的呼吸系统疾病的治疗和维持用药，及需要改进治疗方法。见如Braga“支气管mucology的药物”，Raven Press，NewYork，1989；Lethem等人，Am Rev.Respir.Dis.1421053-1058，1990；美国专利No.5,830,436。
囊性纤维变性囊性纤维变性(CF)是一种导致外分泌上皮中液体和电解质运输异常的常染色体隐性疾病。事实上在所有CF患者中都已发现编码称为囊性纤维变性跨膜传导调节器(CFIR)的蛋白质的DNA中有突变。肺细胞尤其受影响。Di Santagrese等人，Am J.Med.66121-132(1979)。
在CF中，气道粘膜细胞的腔边缘对膜氯离子通道的cAMP依赖性蛋白激酶活化没有反应。细胞对Cl-的渗透性受损，且透过细胞膜对Na+的吸收加速。这些电解质的失衡导致气道粘液水合水平的降低，产生CF的粘滞性肺分泌特征。Knowles，Clin.Chest.Med.1175(1986)。偶然细菌和支原体进入肺气道，并在粘液中定居。与CF相关的稠厚的粘液将这些病原体与免疫系统隔离。由于在CF患者中粘液纤毛的清除作用降低，细菌的清除也降低。因此肺充血和感染是常见的。这些病原性因子的长期存在必然引发损害肺功能的炎症反应。Bedrossian等人，HumanPathol.7195-204，1976。
CF肺中粘液的粘度部分由于粘液水合的减少，其与气道表面液体(ASL)中Cl-通道的机能紊乱和钠(Na～)离子浓度的调整有关，它们改变了气道粘液纤毛的清除能力(MCC)。已在体内和体外研究了参与粘液转运的机理。除去粘液的牛气道(MDBT)的哺乳动物纤毛上皮缓慢地转运CB、CF和BE痰液(Wills等人，J.Clin.Invest.97(1)9-13，1995)。MDBT中病理痰液的缓慢转运可能与其电解质/渗透成分低相联系(Wills等人，J.Resp.Crit.Care Med.151(4)1255-1258，1997)。的确，已知相对于血浆，病理痰液的电解质含量低(Matthews等人，Am.Rev.Resp.Dis.88199-204，1963；Potter等人，Am.Rev.Resp.Dis.67(1)83-87，1967；Tomkiewicz等人，Am.Rev.Resp.Dis.1484(4，Pt.1)1002-1007，1993)。
对MDBT的进一步研究显示用氯化钠处理后病理粘液的转运性得到明显改善(Wills等人，1995)。另外，临床研究显示吸入高渗盐水或上皮钠通道(ENaC)阻滞剂阿米洛利能明显增加患者的MCC(Robinson等人，Thorax 52(10)900-903，1997；App等人，Am.Rev.Resp.Dis.141，605-612，1990)。最近，已有人阐明了在气道粘液清除速度(TMV)的豚鼠模型体内粘液清除与其离子组合物之间的关系。体内研究显示5分钟喷雾高渗盐水将暂时增加TMV。喷雾高渗盐水(14.4％)后1分钟观察到TMV增加。用0.9％盐水处理的动物的TMV为5.1±1.0mm/分钟(n＝9)，与此相比用高渗盐水处理的动物则为11.3±1.3mm/分钟(n＝9；p≤0.001)(Newton&Hall，1997)。吸入阿米洛利也增加TMV。20分钟喷雾阿米洛利(10mM)后15分钟观察到TMV明显增加。用水处理的动物的TMV为3.2±2.5mm/分钟(n＝9)，与此相比用阿米洛利处理的动物则为8.1±0.3mm/分钟(n＝8，p≤0.05)(Newton等人，Ped.Pulm.S17，Abs.364，1998)。这些制剂看来是通过增加气道表面液体(ASL)的离子含量来起作用的。
从患全身假性醛固酮减少症(SPHA)病人得到的临床遗传证据也支持以下的观点下调气道上皮钠通道的活性将加强肺中粘液纤毛的清除作用。丧失上皮钠通道基因功能性突交的SPHA患者，气道表面不吸收钠，与正常人相比他们的鼻表面液体中钠离子浓度增加，而且与正常人相比他们的肺粘液纤毛清除率增加了4倍Kerem等人，New England J.Med.341，156-162，1999)。
最近，在两栖动物非洲蟾蜍(Xenopus)上皮细胞(A6细胞)的顶膜中发现了称为通道活化蛋白酶1(CAP-1)的丝氨酸蛋白酶(Vallet等人，Nature 389(6651)607-610，1997)。CAP-1看来调节这些细胞的Na+通道活性。将顶膜与原型牛Kunitz(孔尼兹)抑制剂-抑肽酶接触，减少了透上皮Na+转运(Vallet等人，1997；Chraibi等人，J.Gen.Pghysio.111(1)127-138，1998)。比库蛋白(Bikunin)(1-170)(牛抑肽酶的人同源物的两个Kunitz结构域)的作用，已用体外培养的人正常支气管上皮细胞(HBE)的短环电流(Isc)进行了评估(McAulay等人，Ped.Pulm.S17，Abs.141，1988)。在正常HBE细胞中比库蛋白(人体inter-α-inhibitor的双突变蛋白酶)(1.5μg/ml，70nM)明显抑制了54％Na+Isc(n＝5-8，p≤0.05)。总的来说，比库蛋白(70nM)在90分钟内抑制了Isc基线的58％，在另一研究中比库蛋白(5μg/ml)明显抑制了正常HBE细胞84％Na+Isc(n＝6，p≤0.01)，而丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂α(1)-蛋白酶抑制剂(α1-PI)(50μg/ml)却没有明显的作用。在体外培养的人囊性纤维变性气道上皮细胞中，比库蛋白(1-170)(1μg/ml)抑制了Isc’，且抑蛋白酶肽(20μg/ml)也抑制Isc。
一研究组最近的两项研究证明了蛋白酶抑制剂诱导对TMV的作用。在抗原攻击前30分钟或在攻击后1小时给予α1-PI(10mg)，攻击后6小时弱化抗原诱导了变应性羊的TMV降低(O′Riordan等人，Am.J.Resp.Crit.Care Med.97(5)1522-1528，1997)。在O′Riordan等人1997文献的

图1中，作者显示了对变应性羊的气道仅给予α1-PI本身(无抗原攻击)，在6小时过程中对基线TMV无影响。在第二项研究中，抗原攻击后6小时给予α1-PI，仅在攻击后24小时明显逆转了抗原诱导的TMV下降(O′Riordan等人，J.App.Physio.85(3)1086-1091，1998)。作者指出α1-PI的作用机理与其抗嗜中性白细胞弹性蛋白酶特性相关，其中认为嗜中性白细胞弹性蛋白酶是负责降低模型中粘液纤毛清除速率的酶。他们推论可用α1-PI来治疗由于哮喘中变应原诱导的嗜中性白细胞弹性蛋白酶的释放所造成的粘液纤毛功能紊乱(O’Riordan等人，1998)；他们没有考虑在其他呼吸系统疾病中的潜在作用。
发明概述本发明涉及Kunitz家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂的使用，其刺激肺气道中粘液和痰液的粘液纤毛清除(MCC)速率。可用Kunitz-丝氨酸蛋白酶抑制剂来治疗肺病如囊性纤维变性(CF)、慢性支气管炎(CB)和支气管扩张(BE)，这些疾病中粘液的滞留和堆积是主要的临床问题。迄今，已有的技术都从未将蛋白酶抑制剂与增加MCC速率高于基线速率的能力相关连。还可用Kunitz类丝氨酸蛋白酶抑制剂来治疗慢性鼻窦炎和胶耳病(咽鼓管堵塞)，这些疾病的临床问题也是粘液滞留和堆积。
本发明考虑了丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白质的用途，其包括Kunitz结构域或Kunitz样结构域用于刺激MCC的方法。在本发明的一个实施例中，牛丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白质如抑蛋白酶肽和其变体或片段(如1998年1月28日公开的EP821007中所描述的)可用于本发明的实践中。
在本发明的另一实施例中，设想将人丝氨酸蛋白酶抑制剂用于刺激MCC速率的方法中。人丝氨酸蛋白酶抑制剂的代表性例子包括比库蛋白及其变体和片段，如1997年9月18日公开的WO 97/33996(Bayer Corp.)和1995年4月18日公开的美国专利No.5,407,915(BayerAG)中所述的，本文将它们全部纳入作为参考。
附图简述由以下的详述和权利要求并结合附图将会对本发明有更好的理解，其中图1显示了EST R35464(SEQ ID NO12)的核苷酸序列和该DNA序列的翻译(SEQ ID NO13)，得到一个某些序列与抑蛋白酶肽类似的开放读框。此翻译产物以正确的间距包含六个半胱氨酸中的五个，这是Kunitz样抑制剂结构域的特征(以粗体显示)。通常由剩下的半胱氨酸(密码子38)所占据部位包含一个苯丙氨酸(以星号表示)。
图2显示了EST R74593(SEQ ID NO14)的核苷酸序列和该DNA序列的翻译(SEQ ID NO15)，得到一个与Kunitz类丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域同源的开放读框。此翻译产物以正确的间距包含六个半胱氨酸，这是Kunitz样抑制剂结构域的特征(以粗体显示)。但此开放读框序列在密码子3和23包含终止密码子。
图3显示了人胎盘比库蛋白推导出的核苷酸序列(SEQ ID NO9)标记为“共有序列”和相配的翻译蛋白质氨基酸序列标记为“翻译的”(SEQ ID NO10)。作为比较，还显示了ESTs H94519(SEQ ID NO16)、N39798(SEQ ID NO17)、R74593(SEQID NO14)和R35464(SEQ ID NO12)的核苷酸序列。共有序列中加下划线的核苷酸相应于实施例中所述的PCR引物的位置。在翻译的共有序列中加下划线的氨基酸是其身份已通过纯化的天然人胎盘比库蛋白的氨基酸测序而确认的残基，核苷酸和氨基酸密码子用标准单字母代码表示，核酸密码子中的“N”表示未命名的核酸，“*”表示氨基酸序列中的终止密码子。
图4A显示含有某些与编码人胎盘比库蛋白的ESTs或其蛋白质同源的核酸序列的一系列ESTs起始重叠情况。以参考比库蛋白(7-64)和比库蛋白(102-159)(分别标记为KID1和KID2)的相对位置显示。
图4B显示了其他更典型的ESTs重叠渗入额外的EST。X轴上部的数字指碱基对的长度，起始于大部分5′EST序列的第一个碱基。各长方块的长度与各ESTs(包括间隙)碱基对的长度成比例。在各个EST长方块的右边显示了它们的EST登录号。
图4C显示了图4B中所列出的各重叠ESTs寡核苷酸序列的相应排列对比。标记为比库蛋白的上部序列(SEQ ID NO51)表示在各位置由重叠核苷酸衍生出的共有寡核苷酸序列。数字指EST图中碱基对的位置。ESTR74593中加粗下划线的寡核苷酸(在图中位置994和1005)是在R74593中观察到的插入碱基，其他各重叠ESTs中均没有。
图4D显示了图4C显示的比库蛋白共有寡核苷酸序列的氨基酸翻译(SEQ IDNO45)。
图4E显示了自人胎盘cDNA文库通过PCR扩增衍生出的胎盘比库蛋白编码序列的核苷酸序列(SEQ ID NO46)和相应的氨基酸翻译(SEQ ID NO47)。
图4F显示了菌落杂交自人胎盘λcDNA文库分离出的天然人胎盘比库蛋白编码克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO48)和相应的氨基酸翻译(SEQ ID NO49)。
图4G比较了由EST重叠(SEQ ID NO45)、PCR克隆(SEQ ID NO47)和常规λ菌落杂交(SEQ ID NO49)得到的胎盘比库蛋白翻译寡核苷酸序列的氨基酸排列对比。
图5显示了Superdex 75凝胶过滤后从胎盘组织中纯化的人胎盘比库蛋白的图。绘制了由OD280nm测得的蛋白质洗脱曲线(实线)，胰蛋白酶抑制试验中洗脱的蛋白质的活性(用圆圈显示％抑制)，和激肽释放酶抑制试验中洗脱的蛋白质的活性(用方框显示％抑制)。
图6显示了用C18反相层析从胎盘组织纯化的人胎盘比库蛋白的图。绘制了由OD215nm测得的蛋白质洗脱曲线(实线)，胰蛋白酶抑制试验中洗脱的蛋白质的活性(用圆圈显示％抑制)，和激肽释放酶抑制试验中洗脱的蛋白质的活性(用方框显示％抑制)。
图7显示了高度纯化的胎盘比库蛋白的银染色SDS-PAGE凝胶(泳道2)，和一系列分子大小标记物蛋白质(泳道1)(以千道尔顿表示大小)。自顶部到底部迁移。
图8显示了生长酵母菌株SC101(图8A)或WHL341(图8B)的无细胞发酵肉汤中的胰蛋白酶抑制活性量，其中SC101和WHL341已用指导胎盘比库蛋白(102-159)表达的质粒(pS604)稳定地转化。
图9显示了用指导牛抑蛋白酶肽或胎盘比库蛋白(102-159)表达的质粒稳定转化的酵母菌株SC101(重组2.4和2.5)生长的无细胞发酵肉汤作的银染色SDS-PAGE(图9A)和用抗胎盘比库蛋白(102-159)pAb作的Western印迹(9B)。
图10显示了高度纯化的胎盘比库蛋白(102-159)(泳道2)和一系列分子大小标记物蛋白质(泳道1)的银染色SDS-PAGE(以千道尔顿表示大小)。自顶部到底部迁移。
图11显示了各种人组织的mRNA作的Northern印迹结果，其中mRNA与32P标记的编码胎盘比库蛋白(102-159)(图11A)或编码胎盘比库蛋白(1-213)(图11B)的cDNA探针杂交。自顶部到底部迁移。各图右边的数据表示相邻RNA标记物的大小(以千道尔顿表示)。图中各泳道下方显示了衍生出mRNA的器官。
图12显示了胎盘衍生的胎盘Bkiunin与抗合成性还原的胎盘比库蛋白(7-64)(图12A)或102-159(图12B)的兔抗血清的免疫印迹。在各图中表示分子大小标记物(泳道1)；分离自人胎盘的天然胎盘比库蛋白(泳道2)；合成的胎盘比库蛋白(7-64)(泳道3)和合成的胎盘比库蛋白(102-159)(泳道4)。N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)10-20％SDS-PAGE凝胶印迹，用蛋白质A纯化的第一多克隆抗体(8μgIgG，用20ml 0.1％BSA/Tris缓冲盐水(pH7.5)配制)，然后再用碱性磷酸酶偶联的山羊抗兔第二抗体显色。自顶部到底部迁移。
图13显示了3微克杆状病毒/Sf9表达系统(泳道2)衍生的高度纯化的胎盘比库蛋白(1-170)考马斯蓝染色的10-20％N-三(羟甲基)甲基甘氨酸SDS-PAGE凝胶。泳道1含有分子大小标记物。自顶部到底部迁移。
图14比较了浓度增加的Sf9-衍生的人胎盘比库蛋白(1-170)(实心圆)、合成的胎盘比库蛋白(102-159)(空心圆)或抑蛋白酶肽(空心方块)对人血浆活化的部分促凝血酶原激酶时间的作用。用CaCl2启动凝血。绘制这些蛋白质的浓度相对于凝血时间延长倍数的图。未抑制的凝血时间为30.8秒。
图15显示了在剂量2μM和0.2μM，比库蛋白相对于阿米洛利(100μM)和Hanks平衡盐水溶液(HBSS)运载体(对照)对豚鼠气道(处理后3小时)电势差的作用。
图16显示了(a)滴注针筒和β探针相对于豚鼠气道的位置；(b)用32P标记的啤酒八叠球菌(S.cerevisae)测定气道平均(清除)速度(TMV)的代表性图；和(c)相对于HBSS运载体对照，在气道滴注比库蛋白(5μg)1.5、1.75、2.0、2.25和2.5小时后，对比库蛋白反应豚鼠体内TMV的持续增加。
图17显示了相对于阿米洛利(10μM)，比库蛋白(70nM)降低了体外培养的人支气管上皮细胞中的钠流动。
图18显示了豚鼠气道中5分钟喷雾高渗盐水(14.4％)对提高TMV的作用。
图19显示了豚鼠气道中20分钟喷雾阿米洛利(10mM)对TMV的作用。
图20显示了比库蛋白(5μg/ml)、抑蛋白酶肽(5μg/ml)和抑蛋白酶肽双突变蛋白(0.5μg/ml、1.5μg/ml和5μg/ml)降低体外培养的人支气管细胞中的钠短环电流。
图21显示了抑蛋白酶肽(1mg/ml)抑制体外人CF支气管上皮细胞的Isc。
图22显示了相对于PBS对照，比库蛋白气雾剂(3ml 3mg/ml)明显增加羊的TMV。
图23显示了比库蛋白(100μg/ml)抑制体外豚鼠气道上皮细胞的钠流达30分钟。
图24显示了比库蛋白(100μg/ml)明显抑制体体外牛气道上皮细胞的钠流达90分钟。
图25显示了(a)与LPS接触引起PMN流明显增加，和(b)比库蛋白明显抑制预先接触LPS豚鼠的电势差。
图26显示了相对于HBSS，抑蛋白酶肽双突变蛋白(10μg)在给予后1.5-2.5小时的持续时间内提高体外豚鼠的TMV。
图27显示了pBC-BK(CMV-IE＝巨细胞病毒立即早期；DHFR＝二氢叶酸还原酶；AMP-r＝氨苄青霉素抗性)的质粒图。
图28显示了(a)CHO表达的比库蛋白(1-170)(10μg/ml)降低体外人CF支气管上皮细胞的钠流超过90分钟，和(b)喷雾给予1、5和10μg/ml的CHO比库蛋白(1-170)和20μg/ml抑蛋白酶肽后，降低体外人CF支气管上皮细胞钠流超过90分钟。
图29显示了从CHO细胞表达系统纯化比库蛋白(1-170)的加工步骤。
图30A显示了用C18反相层析纯化的CHO比库蛋白(1-170)同种型的迁移图。该图是在280nm吸光度测定的蛋白质洗脱曲线(实线)，用0.1％三氟乙酸配制的乙腈的百分比来洗脱此蛋白(菱形)。
图30B显示CHO细胞表达系统表达的纯化比库蛋白(1-170)糖基化同种型(泳道45-55)和一系列分子大小标记物蛋白(泳道54和55间)(以千道尔顿表示)的银染色SDS-PAGE的照片。自顶部到底部迁移。
图31是显示N-糖苷酶F处理的(泳道2和4)和未处理的(泳道1和3)CHO纯化比库蛋白(1-170)同种型和一系列分子大小标记物蛋白(以千道尔顿表示)的银染色SDS-PAGE的照片。自顶部到底部迁移。
发明概述本发明涉及包含Kunitz类型丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白质及其片段的组合物，它们能刺激肺气道中粘液和痰液的粘液纤毛清除速率。该组合物还包含新鉴定的称为人胎盘比库蛋白的人蛋白质，其含有Kunitz类的两个丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域。
本发明还提供刺激粘液纤毛功能紊乱患者的粘液纤毛清除速率，其中给予患者有效剂量的本发明所公开的丝氨酸蛋白酶抑制剂和生物相容的运载体。
胎盘比库蛋白、分离的结构域和其他变体的优选应用是刺激CF患者的粘液纤毛清除，作为疾病治疗和处理的一部分。这些方法和组合物能减少或消除慢性阻塞性肺病患者肺气道中累积的粘液和痰液，从而降低继发性肺感染和其他不良的副作用的危险，并避免或延迟CF患者对肺移植手术的需要。
本发明的方法设想用抑蛋白酶肽来刺激MCC。抑蛋白酶肽已显示出能降低两栖非洲蟾蜍肾上皮细胞顶膜中的透上皮Na+转运(Vallet等人，1997；Chraibi等人，1998)。估计抑蛋白酶肽作用的机理是参与抑制CAP-1，A6细胞中一种参与调节Na+通道活性的蛋白酶。比库蛋白(1-170)，牛抑蛋白酶肽的两个Kunitz结构域的人同源物(Delaria等人1997；Marlor等人，1997)，已显示出能明显抑制体外体外培养的正常人支气管上皮细胞(HBE)短环电流(Isc)(McAulay等人，1998)。比库蛋白(1.5μg/ml；70nM)明显抑制正常HBE细胞(n＝5-8，p≤0.05)的Na+Isc。总而言之，在90分钟内比库蛋白(70nM)抑制了58％基线Isc。在进一步的研究中，比库蛋白(5μg/ml)明显抑制了正常HBE细胞(n＝6，p≤0.01)的84％Na+Isc，而丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂α(1)-白酶抑制剂(α1-PI)(50μg/ml)没有明显作用。在体外培养的人囊性纤维变性气道上皮细胞中，比库蛋白(1-170)(1μg/ml)抑制Isc，而且抑蛋白酶肽(20μg/ml)也抑制Isc。
根据上述观察考虑用Kunitz类型的丝氨酸抑制剂如抑蛋白酶肽、胎盘比库蛋白和它们的片段作为治疗剂来治疗粘液纤毛功能紊乱，包括囊性纤维变性。
“Kunitz抑制剂”指蛋白酶抑制剂；从结构而言，“Kunitz抑制剂”或“Kunitz结构域”是一种蛋白质或蛋白质结构域，通常长约60个氨基酸，含有三个二硫键(见Laskowske&Kato，Ann.Rev.Biochem.49，593-626，1980)。
本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂比库蛋白及其片段和类似物的Kunitz结构域的明显优点是它们是人蛋白质，且比Trasylol(实施例1)带的正电荷少，从而降低了给予大剂量该蛋白质伤害肾的危险性。由于来源于人，可将本发明的蛋白质给予病人，与给予相似剂量的Trasylol相比，引起不良免疫反应的危险性明显降低。另外，还发现Bkiunin(102-159)、比库蛋白(7-64)和比库蛋白(1-170)与Trasylol相比，在体外明显是血浆激肽释放酶更强的抑制剂(实施例3，4和10)。所以预计比库蛋白及其片段在体内比抑蛋白酶肽更有效。
药物组合物所用的量取决于待治疗的接受者和其病症。无需过多的实验本领域技术人员靠已知的规程就可确定所需的用量。另外，根据治疗疾病必需抑制的靶蛋白酶如纤溶酶、激肽释放酶或前列腺蛋白酶所确定的量可计算出所需的用量。由于本发明所考虑的活性物质认为是无毒的，因而治疗较佳地可包括给予的活性物质量超过最佳所需剂量。
为了刺激慢性阻塞性肺病患者粘液纤毛清除速率，可如抑蛋白酶肽Trasylol那样使用本发明的蛋白质，同时考虑效力的差异。在Physician DeskReference，1995(Trasylol添加剂A的名单)中列出了Trasylol的使用方法。简单地说，对仰卧的患者而言，通过为时20分钟到30分钟的缓慢注射，给予胎盘比库蛋白其分离的结构域或其他变异体的负荷剂量，通常所用的总剂量在2×106KIU(血管舒缓素抑制剂单位)到8×106KIU，这取决于许多因素如患者的体重及其病症。优选的负荷剂量是那些含有总剂量为1-2百万单位(KIU)的血管舒缓素抑制剂剂量。
可按本领域已知的方法将本发明的蛋白质用于药物组合物。这种组合物含有活性组分和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、黏合剂和其他赋形剂，取决于给药的形式和所考虑的剂型。治疗用惰性无机或有机载体的例子是本领域技术人员已知的，包括(但不限于)乳糖、玉米粉或其衍生物、滑石粉、植物油、石蜡、脂肪、聚烯烃(如聚乙二醇)、水、蔗糖、乙醇、甘油等。也可添加各种防腐剂、乳化剂、分散剂、香料、润湿剂、抗氧化剂、甜味剂、色素、稳定剂、盐、缓冲剂等，以帮助稳定制剂，或帮助增加活性成分的生物可利用性，或在口服、鼻用或肺用剂型时产生可接受的香味或气味。在这种组合物中可用的抑制剂可以是该化合物本身的最初形式或任选地以药学上可接受的盐的形式。可用本领域技术人员已知的适当模式按照给予该抑制剂所需选择如此配制的组合物。
肠胃外给药模式包括静脉(i.v.)、皮下(s.c.)、腹腔内(i.p.)和肌内(i.m.)途径。静脉给药可用于获得可能需要的迅速调节药物血浆浓度的峰值。另外，可用i.v.导管以所需的速度连续给药。合适的运载体包括无菌、无热源水性稀释剂，如注射用的无菌水、无菌缓冲液或无菌盐水。在手术前和/或手术间通过静脉注射或输液给予患者如此制备的组合物。
通过将药物包裹在脂质体中可实现药物半衰期的改善和药物对吞噬体(如参与炎症的嗜中性白细胞和巨噬细胞)的靶向。通过将其掺入到脂质体配体(结合于对靶器官/组织(如肠胃道和肺)特异性的大分子)的外部，可改善脂质体靶向的选择性。另外，可用i.m.或s.c.沉降注射(deposit injection)，将或不将药物包裹到可降解的微球体(如含有聚-DL-丙交酯-共乙交酯)中或含有胶原的保护性制剂中，从而延长药物的缓慢释放。为了改善剂型使用的方便性，可以使用i.p.植入式储器和隔膜如Percuseal系统。也可用注射笔(injector pen)(如Novo Pin或Q-pen)或无针喷射注射器(如购自Bioject的Mediject或Becton Dickinson)，来改善其方便性使患者易接受。可用可植入的泵通过套管送递到所需的位点，进行精确控制的释放。例子包括购自ALZA的皮下植入式渗透泵如ALZET渗透泵。
将药物掺入片剂、糖衣药片、糖衣丸、硬或软明胶胶囊、溶液、乳剂、悬浮液或肠溶衣胶囊(被设计成将药物释放到消化蛋白酶活性低的结肠中)，可实现口服给药。肠溶衣胶囊的例子包括ALZA的OROS-CT/OsmetTM系统、和Scherer DrugDelivery Systems的PULSINCAPTM系统。其他系统使用偶氮交联的聚合物(可被结肠特异性细菌的偶氮还原酶降解)或pH敏感性聚丙烯酸聚合物(被结肠中升高的pH激活)。上述系统可以与大范围的吸收增强剂联合使用。将药物掺入栓剂可实现直肠给药。
将药物掺入生物附着性颗粒载体(＜200mm)如那些含有纤维素、聚丙烯酸酯或聚卡波非，并与适当的吸收增强剂(如磷脂或酰肉碱)联用，可实现鼻腔给药。可购得的系统包括由Dan Biosys和Scios Nova开发的系统。
为了刺激粘液纤毛的清除速率，本发明胎盘Bikinin变体的优选给药模式是肺给药。本文所公开的Kunitz类丝氨酸蛋白酶抑制剂可用适当的装置给予患者的肺部，但优选的是给予患者含有活性化合物的可吸入的颗粒的气雾悬浮剂。可吸入的颗粒可以是液态或固态的。在适当的载体如甘露醇、蔗糖或乳糖中含有该药物的微米级干粉，可用干粉吸入器如InhaleTM、DuraTM、Fisons(SpinhalerTM)和Glaxo(RotahalerTM)或Astra(TurbohalerTM)的那些推进式计量的吸入器输送至肺气道表面。可用喷雾器输送含有或无脂质体的溶液制剂。
可用任何合适的方法如用压力驱动的喷雾式汽化器或超声波雾化器，产生含有蛋白质的液态颗粒的气溶胶。见如美国专利No.4,501,729。喷雾器是可以购得的装置，通过压缩气体(通常为空气或氧气)加速通过狭窄的细管，或通过超声搅拌，可将活性组分的溶液或悬浮液转化成治疗性气溶胶喷雾。适用于气雾剂的制剂由液态载体中的活性组分构成。载体通常是水(最优选无菌、无热源水)或稀释的含水酒精溶液，优选用添加例如氯化钠的体液形成的等渗溶液。如果制剂不是无菌的，任选的添加剂包括防腐剂，如羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂、香精、挥发油、缓冲剂和表面活性剂。
同样，也可用任何固态颗粒药物气溶胶生成器，可同样制备含蛋白质的固态颗粒气溶胶。将固态颗粒药物送递给患者的气溶胶生成器产生的颗粒是可吸入的(如上所述)，且以适用于人给药的速率，产生含预定剂量药物体积的气溶胶。固态颗粒气溶胶发生器的一典型实例是吹药器。适用于由吹药器给药的制剂包括粉碎得很细的粉末，可通过吹药器输送或以鼻烟的形式吸入鼻腔。在吹药器中，粉末(如含有能有效进行上述治疗的剂量)包含在通常由明胶或塑料制成的胶囊或药筒中，在原位穿入或打开，由吸入装置或手动的泵通过引流气体来输送粉末。吹药器中所用的粉末由单独的蛋白质或含有蛋白质、合适的粉末稀释剂(如乳糖)和任选的表面活性剂的粉末混合物构成。气溶胶生成器的另一种说明性例子包括计量吸入器。计量吸入器是增压气溶胶分送器，通常在液化发射剂中包含活性组分的悬浮液或溶液制剂。在使用过程中，这些装置将制剂排出通过一阀门以输送确定的容量(通常为10到200μL)，以产生含蛋白质的细颗粒喷雾。合适的发射剂包括某些氟氯化合物如二氟二氯甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷和它们的混合物。制剂可附带含有一种或多种共溶剂(如乙醇)、表面活性剂(如油酸或去水山梨糖醇三油酸酯)、抗氧化剂和合适的芳香剂。
对计量吸入器或干粉吸入器装置而言，可以约5-150升/分钟，较佳地以10-100升/分钟，最佳的是以约10-50升/分钟(对计量吸入器而言)和60升/分钟(对干粉气雾剂而言)的速率，用气溶胶生成器制备由固态或液态颗粒形成的气雾。可以约1-100升/分钟、较佳地是以4-10升/分钟的速度，用气溶胶生成器制备可由喷雾器、喷射或超声波产生的气溶胶。含有较多蛋白质的气溶胶可更迅速地给药。
蛋白酶抑制剂的剂量可以变化，取决于治疗的病症和患者的状况。每天的剂量可以分成一或若干单位剂量给药。对病人而言，每天的剂量(重量)的范围为约0.01到20毫克可吸入的颗粒，取决于患者的年龄和病症。
含有本发明蛋白酶抑制剂的固态或液态颗粒药物制剂包括可吸入尺寸的颗粒，即颗粒的尺寸足够小，吸入时能通过嘴和喉，并进入肺的支气管和肺泡。通常，尺寸范围为约1-8微米(更佳的是小于约6微米)的颗粒是可吸入的。气溶胶中所含的不能吸入尺寸的颗粒倾向于沉积在喉道中并被吞咽，所以较佳地要将气溶胶中不能吸入的颗粒的量降至最低。对鼻腔给药而言，颗粒大小范围在10-500微米是优选的以确保在鼻腔中滞留。
在本发明制剂的制备中，通常将蛋白酶抑制剂与可接受的载体混合。当然载体可接受意味必须与制剂中其他任何成分相容，且对患者无害。载体可以是固态或液态，或两者都可，且较佳地与化合物一起配制成单位剂量制剂(如胶囊)，可含有0.5％-99％(重量)的活性化合物。在本发明的制剂中可掺有一种或多种活性化合物，可用任何熟知的药学方法来制备此制剂，基本上包括将这些化合物混合起来。
用研钵和研棒研磨抑制剂，然后让微米级的组合物通过400目筛以分散或分出大的团粒，来制备含有可吸入的蛋白酶抑制剂干颗粒的组合物。
此药物组合物可任选地含有分散剂，以便于气溶胶的形成。合适的分散剂是乳糖，可将其以合适的比例(如1∶1的重量比例)与活性组分混合。
如果需要，可用活体外和体内基因治疗策略，来输送编码Kunitz类丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白质如比库蛋白、抑蛋白酶肽或其片断和变体(如在WO97/33996(Bayer Corp.)和美国专利No.5,407,915(Bayer AG)中所述的)的核酸构建物。可用主要以病毒为基础的基因治疗技术来转化肺细胞，作为治疗肺和相关肺外组织中的CF症状。见1993年3月3日出版的WO93/03709，其描述了用逆转录病毒和非病毒载体(如腺病毒和腺病毒相关病毒)来稳定地表达CF患者的CFTR基因。另外，也已知可用非病毒方法来输送外源核酸，本发明中也考虑到此种用法。见于1993年6月24日出版的WO93/12240及本文的参考文献，描述了将包含CFTR分子编码序列的表达盒或转录盒操作性地连接于哺乳动物的功能性调节序列。然后可用许多方法包括单独或与脂类复合物(如LipofectinTM)混合，气雾化输送，将此核酸构建物输送到肺的气道和肺泡。于1995年10月5日出版的WO95/26356描述了用于转染的脂质的代表性例子。本发明以合适的基因治疗方法作为对需要该治疗的患者刺激其粘液和痰液的粘液纤毛清除速率的手段，将编码Kunitz类丝氨酸蛋白酶抑制剂(如比库蛋白、抑蛋白酶肽或其变体和片断)的核酸分子以类似方法给予肺气道。
人序列数据的检索在NCBI(国家生物信息中心，Maryland)对输入到表达-序列-标记数据库(以下称为dbEST)的序列进行唯一分析后，推导出存在一种与抑蛋白酶肽功能同源的独特人蛋白质。用TblastN算法(BLAST，或使用Altschul等人(1990)J.Mol Biol215-00403-410方法的基本局部排列对比检索工具，检索了查询序列和数据库中所有序列之间，任何组合中蛋白质或核酸的相似性)，检索了数据库中与牛预-前-抑蛋白酶肽Trasylol序列同源的核苷酸序列。对众多克隆的该种检索选择性地局限到两个特殊的克隆，它们可编码相应于与抑蛋白酶肽功能同源的人蛋白质推导出的氨基酸序列。选出的核酸序列是R35464(SEQ ID NO12)和R74593(SEQ IDNO14)，它们是从人胎盘核酸文库产生的。在R35464(SEQ ID NO13)最长开放读框中翻译的蛋白质序列缺失了6个半胱氨酸中的一个(对形成Kunitz结构域共价结构是关键的)，意味着R35464的核酸序列不能产生功能性抑制剂。类似地，克隆R74593(SEQ ID NO15)的最长翻译的开放读框在编码Kunitz类序列区域的5’含有一终止密码子，这意味着不能翻译该序列以产生功能性分泌的Kunitz结构域。这些序列单独的重要性尚不清楚。它们可能代表a)假基因的产生，b)未翻译的mRNA的区域，或c)不正确定序的活mRNA的产物。
人比库蛋白的发现为了特异性分离和测定人的实际序列，设计cDNA引物，其能与R35464和R74593中发现的编码我们所建议的Kunitz样序列的cDNA片断的5’和3’位置的序列杂交。用于扩增编码R74593的Kunitz样序列的片断的引物是CGAAGCTTCATCTCCGAAGCTCCAGACG(3’引物含有一HindIII位点，SEQ ID NO33)和AGGATCTAGACAATAATTACCTGACCAAGGA(5’引物含有一XbaI位点，SEQ ID NO34)。
用这些引物从购自Clontech(MATCHMAKER，Cat#HL4003AB，ClontechLaboratories，Palo Alto，CA)的人胎盘cDNA文库中，以PCR(30轮)扩增一500碱基对的产物，随后将其亚克隆入Bluescript-SK+中，用SequenaseTM试剂盒2.0版本用T3引物测序。令人惊讶的是，用我们引物产生的该片断的序列与克隆R74593的dbEST数据库中所列出的序列不同。具体说，我们的新序列含有一个额外的鸟苷碱基，其3’插入在该推定的终止密码子处，5’插入在编码Kunitz样序列的片断处(图3)。一个额外的G的插入使该终止密码子迁移出Kunitz样结构域的开放读框(G在R74593校正序列的碱基对114处；图3)。
随后查询dbEST中与R74593的Kunitz样肽序列同源的序列，得到人视网膜文库衍生的H94519和N39798。这二序列含有Kunitz样序列，与R35464中编码的Kunitz样结构域几乎相同，除了它的含有所有6个特征性半胱氨酸外。每个核苷酸序列R74593(在bp144插入G以校正)和R35464的核苷酸序列的重叠，获得部分的人胎盘比库蛋白的共有核苷酸序列(SEQ ID NO9，图3)。翻译的共有序列产生了从残基-18延伸到+179(图3；SEQ ID NO10的全翻译)的一个开放读框，其分别在氨基酸残基17-64和102-159区域中含有两个完全的Kunitz样结构域序列。
通过用R35466的序列查询dbEST，进一步努力尝试得到其他5’序列。然后进而利用这些检索得到的拥有其他5’序列的可能匹配来再查询dbEST。以这种重复模式，鉴定了一系列重叠的5’序列，其中包括克隆H16866、T66058、R34808、R87894、N40851和N39876(图4)。对这些序列中的一些作排列对比提示存在一个与5’ATG，它可能作为该共有序列翻译的蛋白质序列合成的起始位点。由这种所选定的信息来看，选择性地筛选和鉴定与抑蛋白酶肽功能同源的人蛋白质的核酸和多肽序列目前已有可能。
重查询dbEST揭示了许多新的EST输入(如图4B所显示)。与这些其他的EST重叠使我们构建长得多的共有寡核苷酸序列(图4C)，它的5’和3’延伸都超过了原始的寡核苷酸序列(如图3所示)。事实上，总长为1.6千个碱基的该新序列一直延伸至3’聚-A尾部。沿该序列中各碱基对位置上重叠性EST数量的增加，改善了某些区域(如与ESTR74593的3’末端重叠的序列)的置信水平(图3)。在该区域若干重叠的EST确证了两个关系到R74593的关键性碱基缺失(位于图4C中粗下划线显示的994和1005位置)。翻译编码比库蛋白读框中该新的共有序列(图4D)，产生了一种形式的胎盘比库蛋白，比原始共有序列(SEQ ID NO1)编码的成熟序列(179氨基酸)大(248个氨基酸)，并终止于该寡核苷酸共有序列内一框终止密码子。大小的增加是由于读框在3’编码区域的迁移，这是除去ESTR74593独有的两个碱基插入件而产生的结果。读框的迁移将原始共有序列(图3)的终止密码子移出读框外，从而使能够读入新的编码其他氨基酸序列的读框。新翻译产物在残基+1到+175(编码Kunitz结构域)之间与原始蛋白质共有序列(SEQ ID NO1)相同，但其含有新的C端延伸，展示出推定的24个残基长度的跨膜结构域(图4D下划线)随后为一短的31个残基的胞质结构域。启动子甲硫氨酸和信号肽周围的精确序列是有点假定的，因为在该区域重叠性EST中有相当的不均匀性。
用GeneworksTM分析该蛋白质序列突出了30和67位的天冬酰胺残基为推定的N-连接的糖基化的共有序列。在人胎盘分离的该全长蛋白质N端测序时未观察到天冬酰胺30，这与其被糖基化一致。
人比库蛋白的克隆如下确证了相应于推定的人比库蛋白核苷酸序列(图3分析中推测的)的人mRNA的存在。使用核酸引物将5’杂交于R35464(图3中的b.p.3-27共有核苷酸序列)编码Kunitz的cDNA序列GGTCTAGAGGCCGGGTCGTTTCTCGCCTGGCTGGGA(自R35464序列衍生的5’引物，含有一XbaI位点，SEQ ID NO35)，和将核酸引物3’杂交于R74593(图3中的b.p.680-770共有核苷酸序列)，进行PCR扩增，从Clontech人胎盘文库中扩增到一片断(ca.670b.p.)，是根据从编码图3中的胎盘比库蛋白序列的cDNA共有核苷酸序列所预计的大小(如图4A所示)。
用杂交于R87894中某序列的5’引物(从5’到上述的推定ATG起始位点为126b.p.)，加上对R74593相同的3’引物(如图4A所示在b.p.110)，有可能从Clontech人胎盘文库扩增到一段根据EST重叠所预计的预定大小的片断(约872b.p.)(如图4所示)。
该872b.p.片断的测序显示在其5’端含有相应于ESTR87894的b.p.110到218的核苷酸节断，在其3’端含有EST重叠分析(图3)推定的胎盘比库蛋白的共有序列的b.p.310-542。该3’核苷酸序列含有胎盘比库蛋白(102-159)编码的所有Kunitz样结构域。
为了获得编码此蛋白质的整个细胞外结构域的cDNA，使设计的如下5’PCR引物CACCTGATCGCGAGACCCC(SEQ ID NO36)与ESTR34808中的一序列杂交，和与EST74593相同的3’引物一起使用，从人胎盘cDNA文库扩增(30轮)到一条长约780个碱基对的cDNA产物。将此产物进行凝胶纯化，克隆入TA载体(Invitrogen)中，用以下引物以双脱氧方法(Sanger F.，等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci(USA)，74，第5463-5467页)进行DNA测序特异性载体GATTTAGGTGACACTATAG(SP6)(SEQ ID NO37)TAATACGACTCACTATAGGG(T7)(SEQ ID NO38)特异性基因TTACCTGACCAAGGAGGATGTGC(SEQ ID NO39)AATCCGCTGCATTCCTGCTGGTG(SEQ ID NO40)CAGTCACTGGGCCTTGCCGT(SEQ ID NO41)图4E这显示了得到的cDNA序列及其翻译产物。在核苷酸水平，该序列显示出与共有EST序列只有微小差异(图4D)。翻译此序列得到包含一框内启动子ATG位点、信号肽和成熟胎盘比库蛋白序列和跨膜结构域的编码序列。该PCR产物的翻译序列缺失了胞浆结构域的最后12个氨基酸残基，这是选择此3’引物进行PCR扩增所造成的。3’PCR引物的这种选择(基于R74593的序列命名)也导致在翻译的PCR衍生序列的氨基酸211位引入了一个人造的S到F的突变。从该PCR片断翻译推导的信号肽与EST共有序列所推导的有些差异。
为了得到全长的胎盘比库蛋白cDNA，凝胶纯化了该PCR衍生的产物(图4E)，并由于分离代表比库蛋白序列的非PCR为基础的全长克隆。通过HighPrime(Boehringer Mannheim)用32P-CTP标记该PCR衍生的cDNA序列，并通过克隆杂交技术用于探测胎盘cDNA文库(Stratagene，UnizapTMλ文库)。对约2×106个噬菌体空斑进行3轮筛选和空斑纯化。由限制酶分析并依据与EST共有序列大小的比较(如上)，确定了推测为全长(～1.5千碱基)的两个克隆。用双脱氧方法测定这二克隆中一个的序列，产生图4F所示的寡核苷酸序列。该序列的翻译产物产生一个含框内启动子甲硫氨酸、信号肽和成熟胎盘比库蛋白序列的蛋白质。此成熟胎盘比库蛋白序列与EST共有序列翻译所衍生的成熟蛋白质的序列相同，而信号肽序列长度及序列不同。与该PCR衍生的产物不同，菌落杂交衍生的cDNA含有完整的胞外结构域、跨膜结构域、胞浆结构域和框内终止密码子。实际上，该克隆一直延伸至3’聚-A尾部。启动子甲硫氨酸后跟随着一疏水信号肽，其与该PCR衍生的克隆中所编码的信号肽相同。由此，我们从Sf9细胞(实施例9)和CHO细胞(实施例17)表达和纯化了胎盘比库蛋白的可溶性片断比库蛋白(1-170)，并发现它们是功能性蛋白酶抑制剂(实施例10和18)。另外，我们从人胎盘分离到胎盘比库蛋白的一种可溶性片断，它也是一种活性蛋白酶抑制剂(实施例7)。
根据上述观察，看来全长胎盘比库蛋白具有呈细胞表面呈跨膜蛋白质以及可溶性蛋白质存在的能力。已知其他含有Kunitz结构域的跨膜蛋白质经历解蛋白水解加工，产生可溶性和膜相连形式的混合物。这包括两种形式的淀粉样蛋白前体，称为APP751(EschF.，等人，(1990)Science，248，第1122-1124页)和APP770(Wang R.，等人(1991)，J.Biol Chem，266，第16960-16964页)。
接触激活是一种使受损伤的血管表面与血凝级联反应成分接触而被激活的过程。血管生成的过程包括在内皮表面局部激活血纤蛋白溶酶。胎盘比库蛋白的特异性及其推定的锚定于细胞表面的能力，提示跨膜性胎盘比库蛋白的生理功能可能包括调节接触激活和血管生成。
用Genetics Computer Group program Fast A，对PIR(版本46.0)和PatchX(版本46.0)蛋白质数据库以及GeneSeq(版本20.0)专利序列的蛋白质数据库，检索了胎盘比库蛋白(7-64)、比库蛋白(102-159)和全长胎盘比库蛋白(图4F)的氨基酸序列。用Genetics Computer Group program Fast A(Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444-2448)对GenBank(版本92.0，1/26/96更新的数据)和EMBL(改进的版本45.0)核苷酸数据库及GeneSeq(版本20.0)专利序列的核苷酸数据库中的6一读框翻译，检索了这些相同的蛋白质序列。GenBank和EMBL的EST和STS亚组不包括在本次检索中。由这些检索产生的最佳匹配包括的序列，全长上与我们分析的克隆R74593和R35464衍生的58个氨基酸蛋白质序列仅有大约50％相同。
人比库蛋白的分离如上所述，可再重叠以下合成肽相应于由比库蛋白翻译的共有序列所确定的比库蛋白(7-64)和比库蛋白(102-159)，产生活性激肽释放酶抑制剂蛋白质(分别为实施例3和4)。我们利用该出人意料的特性，来设计纯化方案从人组织分离出天然胎盘比库蛋白。
用一种纯化方案(其中使用激肽释放酶-琼脂糖亲和层析作为第一步)，分离得到了高度纯化的天然的强激肽释放酶抑制剂。该分离的天然人比库蛋白具有与预测的序列(通过翻译共有核酸序列(图3)氨基酸残基+1到+50)相同的N末端(50氨基酸残基序列)。这首次证实存在着一种新的分离自人胎盘的天然激肽释放酶抑制剂。
以下列出了已知的Kunitz样结构域。其中强调(加粗/下划线)了有特殊兴趣的、认为导致与靶蛋白酶接触的残基。如标记Xaa所示，这些特殊的残基以位置Xaal-16为具体参考命名。
比库蛋白(7-64)(SEQ ID NO4)xaa 1 1 111 1112 3 456789 0 1 234 56IHDFCLVSKVV GRCRASMPRW WYNVTDGSCQ LFVYGGCDGN SNNYLTKEEC LKKCATV比库蛋白(102-159)(SEQ ID NO6)YEEYCTANAVT GPCRASFPRW YEDVERNSCN NFIYGGCRGN KNSYRSEEAC MLRCFRQ组织因子路径抑制剂前体1(SEQ ID NO18)-HSFCAFKADD GPCKIMAKRF FFNIFTRQCE EFIYGGCEGN QNRFESLEEC KKMCTRD组织因子路径抑制剂前体1(SEQ ID NO19)-PDFCFLEEDP GICRGYITRY FYNNQTKQCE REKYGGCLGN MNNFETLEEC KNICEDG组织因子路径抑制剂前体(SEQ ID NO20)-PSWCLTPADR GLCRANENRF YYNSVIGKCR PFKYSGCGGN ENNFTSKQEC LRACKKG组织因子路径抑制剂前体2(SEQ ID NO21)-AEICLLPLDY GPCRALLLRY YYRYRTQSCR QFLYGGCEGN ANNFYTWEAC DDACWRI组织因子路径抑制剂前体2(SEQ ID NO22)-PSFCYSPKDE GLCSANVTRY YFNPRYRTCD AFTYTGCGGN DNNFVSREDC KRACAKA淀粉样蛋白前体同源物(SEQ ID NO23)-KAVCSQEAMT GPCRAVMPRT TFDLSKGKCV RFITGGCGGN RNNFESEDYC MAVCKAM抑蛋白酶肽(SEQ ID NO24)RPDFCLEPPYT GPCKARIIRY FYNAKAGLCQ TFVYGGCRAK RNNFKSAEDC MRTCGGA内-α-胰蛋白酶抑制剂前体(SEQ ID NO25)----CQLGYSA GPCMGMTSRY FYNGTSMACE TFQYGGCMGN GNNFVTEKEC LQTC内-α-胰蛋白酶抑制剂前体2(SEQ ID NO26)VAACNLPIVR GPCRAFIOLWAFDAVKGKCV LFPYGGCOGN GNKFYSEKEC REYCGVP淀粉样蛋白前体(SEQ ID NO27)-EVCCSEQAET GPCRAMISRW YFDVTEGKCA PFFYGGCGGN RNNFDTEEYC MAVCGSA胶原α-3(VI)前体(SEQ ID NO28)----CKLPKDE GTCRDFILKW YYDPNTKSCA RFWYGGCGGN ENKFGSQKEC EKVCHKI-B9(SEQ ID NO29)-PNVCAFPMEK GPCOTYMTRW FFNFETGECE LFAYGGCGGN SNNFLRKEKC EKFCKFT可用标准的固相肽合成，使用Merrifield R.B.和Barany G.在“肽、分析、合成”，Biology，2，Gross E.等编辑，Academic Press(1980)第一章中所述的t-Boc化学方法，或使用Carpino L.A.，和Han G.Y.，(1970)J.Amer ChemSoc.，92，57480-5749中所述的F-moc化学方法，产生本发明的胎盘比库蛋白、其分离的结构域或其他变体，且见实施例2的叙述。另外，可用编码胎盘比库蛋白变体的DNA的表达来生成重组胎盘比库蛋白变体。
本发明提供了纯化的人丝氨酸蛋白酶抑制剂的用途，它可特异性抑制激肽释放酶，它是通过亲和层析从人胎盘组织分离出的。人丝氨酸蛋白质抑制剂，本文称为人胎盘比库蛋白，含有两个Kunitz类型的丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域。在一实施例中，本发明包括具有如下氨基酸序列的蛋白质ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100NYEEYCTAN AVTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGAVS179(SEQ ID NO1)在一优选实施例中，本发明提供了具有如下氨基酸序列的比库蛋白(比库蛋白(1-170))ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK170(SEQ ID NO52)一方面，用于实施本发明的蛋白质的生物活性是，其能结合于并基本抑制胰蛋白酶、人血浆和组织激肽释放酶、人血纤蛋白溶酶和因子XIIa的生物活性。在一优选实施例中，本发明提供糖基化形式的天然人胎盘比库蛋白。在另一实施例中，本发明包括的天然人比库蛋白，含有至少一个半胱氨酸一半胱氨酸二硫键。在一优选实施例中，该蛋白质含有至少一个在选自以下的一对半胱氨酸CYS11-CYS61、CYS20-CYS44、CYS36-CYS57、CYS-106-CYS156、CYS115-CYS139和CYS131-CYS152之间，形成的链内半胱氨酸-半胱氨酸二硫键，其中半胱氨酸的码号根据天然人胎盘比库蛋白的氨基酸序列。普通技术人员可以懂得本发明的蛋白质可以折叠成适当的三维构象，从而能维持天然人比库蛋白的生物活性，其中不存在或存在一个或多个或全部的天然链内半胱氨酸-半胱氨酸二硫键。在一最优选实施例中，本发明的蛋白质适当折叠，形成具有全部适当的天然半胱氨酸-半胱氨酸二硫键。
通过从人组织如胎盘纯化，或通过以下实施例所述的合成蛋白质化学方法，可得到本发明的活性蛋白质。也可以理解，可用分子生物方法获得用于本发明的蛋白质，其中自我复制的载体能够从转化的细胞表达本发明的蛋白质。这些蛋白质可以制成非分泌型的或从转化的细胞分泌。为了有利于转化细胞的分泌，为了提高翻译的蛋白质的功能稳定性，或为了帮助比库蛋白的折叠，可将一些信号肽序列加到天然人比库蛋白的NH2-末端部分。
在一实施例中，本发明还提供带有至少一部分天然信号肽序列的天然人比库蛋白。在本发明的另一实施例中，提供了至少带有部分信号肽的天然人比库蛋白，具有如下的氨基酸序列AGSFL AWLGS LLLSG VLA-1ADRER SIHDF CLVSK VVGRC RASMP25RWWYN VTDGS CQLFV YGGCD GNSNN50YLTKE ECLKK CATVT ENATG DLATS75RNAAD SSVPS APRRQ DSEDH SSDMF100NYEEY CTANA VTGPC RASFP RWYFD125VERNS CNNFI YGGCR GNKNS YRSEE150ACMLR CFRQQ ENPPL PLGSK VVVLA175GAVS 179(SEQ ID NO2)在一优选实施例中，本发明提供了天然人胎盘比库蛋白的用途，该蛋白质包含完整前导序列的一部分、具有SEQ ID NO52的氨基酸序列，完整前导节段具有如下氨基酸序列MLRAEADGVSRLL GSLLSGVLA -1(SEQ ID NO54)在本文所用的优选编号系统中，编号为+1的氨基酸为天然人胎盘比库蛋白的氨基酸序列的NH2末端。不难明白可从天然人胎盘比库蛋白衍生出功能性蛋白质片断，其能至少能维持天然人胎盘比库蛋白的部分生物活性，可作为丝氨酸蛋白酶抑制剂。
在一实施例中，用于本发明方法的蛋白质含有天然人胎盘比库蛋白的片断，其中含有至少一个功能性Kunitz一样结构域，具有天然人胎盘比库蛋白氨基酸7-159的氨基酸序列，本文以后称其为“比库蛋白(7-159)”。因此本发明包括使用如下氨基酸序列的蛋白质的方法
IHDF CLVSK VVGRC RASMP 25RWWYN VTDGS CQLFV YGGCD GNSNN50YLTKE ECLKK CATVT ENATG DLATS75RNAAD SSVPS APRRQ DSEDH SSDMF100NYEEY CTANA VTGPC RASFP RWYFD125VERNS CNNFI YGGCR GNKNS YRSEE150ACMLR CFRQ 159(SEQ ID NO3)其中氨基酸的编号对应于天然人胎盘比库蛋白的氨基酸序列。该实例的另一功能性变体可以是天然人胎盘比库蛋白的片断，其包含至少一个功能性Kunitz样结构域，具有天然人胎盘比库蛋白氨基酸11-156的氨基酸序列，比库蛋白(11-156)CLVSK VVGRC RASMP25RWWYN VTDGS CQLFV YGGCD GNSNN50YLTKE ECLKK CATVT ENATG DLATS75RNAAD SSVPS APRRQ DSEDH SSDMF100NYEEY CTANA VTGPC RASFp RWYFD125VERNS CNNFI YGGCR GNKNS YRSEE150ACMLR C 159(SEQ ID NO50)可以看出单个的Kunitz样结构域也是天然胎盘比库蛋白的片断。具体说，本发明考虑了含有第一Kunitz样结构域的氨基酸序列的蛋白质的用途，其中Kunitz样结构域由天然人胎盘比库蛋白氨基酸7-64(本文以后称其为“比库蛋白(7-64)”)的氨基酸序列组成。因此在一实施例中，本发明包括的蛋白质含有至少一个具有以下氨基酸序列的Kunitz样结构域IHDF CLVSK WGRC RASMP25RWWYN VTDGS CQLFV YGGCD GNSNN50YLTKE ECLKK CATV 64(SEQ ID NO4)其中氨基酸的编号对应于天然人胎盘比库蛋白的氨基酸序列。本发明蛋白质的另一种形式可以是由天然人胎盘比库蛋白氨基酸11-61的氨基酸序列构成的第一Kunitz样结构域，“比库蛋白(11-61)”具有以下的氨基酸序列CLVSK WGRC RASMP 25RWWYN VTDGS CQLFV YGGCD GNSNN50YLTKE ECLKK C61(SEQ ID NO5)本发明还提供具有Kunitz样结构域的氨基酸序列的蛋白质，其中Kunitz样结构域由天然人胎盘比库蛋白氨基酸102-159的氨基酸序列构成，本文以下称为“比库蛋白(102-159)”。因此在一实施例中，本发明包括的蛋白质含有至少一个具有以下氨基酸序列的Kunitz样结构域YEEY CTANA VTGPC RASFP RWYFD 125VERNS CNNFI YGGCR GNKNS YRSEE150ACMLR CFRQ159(SEQ ID NO6)其中氨基酸的编号对应于天然人胎盘比库蛋白的氨基酸序列。这种结构域的另一种形式可以是由天然人胎盘比库蛋白氨基酸106-156的氨基酸序列构成的Kunitz样结构域，其中“比库蛋白(106-156)”具有如下的氨基酸序列CTANA VTGPC RASFP RWYFD 125VERNS CNNFI YGGCR GNKNS YRSEE 150ACMLR C 156(SEQ ID NO7)因此普通技术人员可以明白产生的天然人比库蛋白的这些片断将至少保留部分该天然蛋白质的生物活性。这些片断可以不同取向混合或多重混合，以提供能部分保留、相同或更好的天然人比库蛋白活性的蛋白质。
不难明白用于本发明方法的生物活性蛋白质可包括一个或多个Kunitz样结构域，并结合其他来源的Kunitz样结构域。本发明方法的生物活性蛋白质可包含一个或多个Kunitz样结构域，并结合其他来源的其他蛋白质结构域(具有各种生物活性)。用于实施本发明的生物活性蛋白质可与其他已知的蛋白质联合，以提供具有预定生物活性的多功能融合蛋白。因此在一实施例中，本发明的方法包括一种蛋白质的用途，该蛋白质包含至少一个与SEQ ID NO5或SEQID NO7氨基酸序列相同或功能相当的氨基酸序列片断。
终止于早期终止密码子的开放读框还可编码一种功能性蛋白质。本发明包括这种可供选择的终止，在一实施例中提供了如下氨基酸序列的蛋白质的用途ADRER SIHDF CLVSK VVGRC RASMP25RWWYN VTDGS CQLFV YGGCD GNSNN50YLTKE ECLKK CATVT ENATG DLATS75RNAAD SSVPS APRRQ DS 92(SEQ ID NO8)在一实施例中，本发明提供了基本纯的或重组产生的天然人比库蛋白的用途，该蛋白质具有前导序列的完整节段和完整天然跨膜结构域的至少一部分。因此本发明的一个实施例提供了天然人比库蛋白的用途，该蛋白质具有完整前导序列和跨膜结构域的(下划线)至少一部分，具有选自如下的氨基酸序列EST MLR ARADGVSRLL GSLLLSGVLA -1PCR MAQLCGL RRSRAFLALL GSLLLSGVLA -1λcDNA MAQLCGL RRSRAPLALL GSLLLSGVLA -1ESTADRERSIRDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCOLFV YGGCDGNSNN 50PCRADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50λcDNA ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50ESTYLTKHECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100PCRYLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRRAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100λcDNA YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100ESTNYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150PCRNYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNENSYRSEE 150λcDNA NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150RSTACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 200PCRACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 200λcDNk ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 200ESTQERALRTVWS SGDDKEQLVK NTYVL225PCRQERALRTVWS FGD 213λcDNA QERALRTVWS SGDDKEQLVK NTYVL225其中EST是EST衍生的共有序列SEQ ID NO45，PCR是PCR克隆SEQ IDNO47，λcDNA是λcDNA克隆SEQ ID NO49。在一优选实施例中，用于本发明方法的蛋白质包含SEQ ID NO45、47或49的氨基酸序列之一，其中在最后的Kunitz结构域末端和跨膜结构域(下划线)之间的区域切断该蛋白质。
本发明还包括信号肽缺失的蛋白质的用途。由此，本发明的方法提供了具有SEQ ID NO52氨基酸序列并续有如下跨膜氨基酸序列的蛋白质ESTVVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN200ESTQERALRTVWS SGDDKEQLVK NTYVL 225(SEQ ID NO69)如下的跨膜氨基酸序列PCRVVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN200PCRQERALRTVWS FGD 213(SEQ ID NO68)或如下的跨膜氨基酸序列λcDNAVVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 200λcDNAQERALRTVWS SGDDKEQLVK NTYVL 225(SEQ ID NO67)用于本发明的蛋白质氨基酸序列可以使本领域技术人员清楚知道适当的核酸序列，其可用于分子生物方法中产生用于本发明的蛋白质。所以，本发明的一实施例提供了编码具有图3共有DNA序列(SEQ ID NO9)的人比库蛋白的核酸序列的用途，其将翻译成图3天然人胎盘比库蛋白序列的氨基酸序列(SEQID NO10)。在另一实施例中，本发明提供了图4C的共有核酸序列(SEQ IDNO51)，其编码图4D的氨基酸序列(SEQ ID NO45)。
在一优选实施例中，本发明提供了编码具有图4F的DNA序列(SEQ IDNO48)的天然人胎盘比库蛋白的核酸序列，其编码SEQ ID NO49的蛋白质序列。在另一实施例中，本发明提供了图4E的核酸序列(SEQ ID NO46)，其编码SEQ ID NO47的蛋白质序列。
不难明白可以在该核酸序列中产生某些等位基因突变和保守性替换，其仍将产生本发明方法所包含的蛋白质氨基酸序列。本领域技术人员可以懂得本发明蛋白质的某些天然等位基因突变，和本发明蛋白质中氨基酸的保守性替换，不会明显改变该蛋白质的生物活性，这些也包括在本发明的范围中。
本发明还提供了含人胎盘比库蛋白及其片断的药物组合物，可用于刺激粘液纤毛功能紊乱患者的MCC。
本发明还提供了刺激患粘液纤毛功能紊乱患者的MCC的方法，其中在生物相容性载体中将有效剂量的本发明所公开的人丝氨酸蛋白酶抑制剂给予患者。
本发明还提供了刺激MCC的方法，其中使用了胎盘比库蛋白的变体和上述的特异性Kunitz结构域，它们含有能改变该蛋白酶特异性的氨基酸替换。以下描述了优选的替换位置，如在天然胎盘比库蛋白的氨基酸序列中的位置Xaa1到Xaa32。在Xaa1到Xaa16的替换对比库蛋白(7-64)变体而言也是优选的，而在Xaa17到Xaa32的替换对比库蛋白(102-159)变体而言是优选的。
由此，本发明的方法包括具有如下氨基酸序列的蛋白质的用途Ala Asp Arg Glu Arg Ser Ile Xaa1Asp Phe 10Cys Leu Val Ser Lys Val Xaa2Gly Xaa3Cys 20Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Trp Trp Tyr Asn30Val Thr Asp Gly Ser Cys Gln Leu Phe Xaa1040Tyr Xaa11Gly Cys Xaa12Xaa13Xaa14Ser Asn Asn 50Tyr Xaa15Thr Lys Glu Glu Cys Leu Lys Lys 60Cys Ala Thr Xaa16Thr Glu Asn Ala Thr Gly 70Asp Leu Ala Thr Ser Arg Asn Ala Ala Asp 80Ser Ser Val Pro Ser Ala Pro Arg Arg Gln 90Asp Ser Glu Asp His Ser Ser Asp Met Phe 100Asn Tyr Xaa17Glu Tyr Cys Thr Ala Asn Ala 110Val Xaa18Gly Xaa19Cys Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24120Xaa25Trp Tyr Phe Asp Val Glu Arg Ash Ser 130Cys Ash Asn Phe Xaa26Tyr Xaa27Gly Cys Xaa28140Xaa29Xaa30Lys Asn Ser Tyr Xaa31erGlu Glu 150Ala Cys Met Leu Arg Cys Phe Arg Xaa32Gln 160Glu Asn Pro Pro Leu Pro Leu Gly Ser Lys 170Val Val Val Leu Ala GlyAla Val Ser 179(SEQ ID NO11)
其中Xaa1-Xaa32各自代表除Cys以外的天然氨基酸残基，条件是氨基酸残基Xaa1-Xaa32中至少一个与天然序列中相应的氨基酸残基不同。
在本发明的说明书中，术语“天然氨基酸残基”指20个常见氨基酸中的任何一个，即Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。
如上所述，在一个或单个位置上一个或多个氨基酸的替换，可以改变天然胎盘比库蛋白或各Kunitz样结构域、比库蛋白(7-64)或比库蛋白(102-159)的抑制剂特异性，从而其可较佳地抑制其他丝氨酸蛋白酶如(但不限于)补体级联反应中的酶、TF/FVIIa、Fxa、prostasin、凝血酶、嗜中性白细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G或蛋白酶-3。
胎盘比库蛋白优选变体的例子包括Xaa1是选自以下的氨基酸残基His、Glu、Pro、Ala、Val或Lys，尤其当Xaa2是His或Pro时，或Xaa2是选自以下的氨基酸残基Val、Thr、Asp、Pro、Arg、Tyr、Glu、Ala、Lys，尤其当Xaa2是Val或Thr时；或其中Xaa3是选自以下的氨基酸残基Arg、Pro、Ile、Leu、Thr，尤其当Xaa3是Arg或Pro时；或Xaa4是选自以下的氨基酸残基Arg、Lys、和Ser、Gln，尤其当Xaa4是Arg或Lys时；或Xaa5是选自以下的氨基酸残基Ala、Gly、Asp、Thr，尤其当Xaa5是Ala时；或Xaa6是选自以下的氨基酸残基Ser、Ile、Tyr、Asn、Leu、Val、Arg、Phe，尤其当Xaa6是Ser或Arg时；或Xaa7是选自以下的氨基酸残基Met、Phe、Ile、Glu、Leu、Thr和Val，尤其当Xaa7是Met或Ile时；或Xaa8是选自以下的氨基酸残基Pro、Lys、Thr、Gln、Asn、Leu、Ser或Ile，尤其当Xaa8是Pro或Ile时；或Xaa9是选自以下的氨基酸残基Arg、Lys或Leu，尤其当Xaa9是Arg时；或Xaa10是选自以下的氨基酸残基Val、Ile、Lys、Ala、Pro、Phe、Trp、Gln、Leu和Thr，尤其当Xaa10是Val时；或Xaa11是选自以下的氨基酸残基Gly、Ser和Thr，尤其当Xaa11是Gly时；或Xaa12是选自以下的氨基酸残基Asp、Arg、Glu、Leu、Gln、Gly，尤其当Xaa12是Asp或Arg时；或Xaa13是选自以下的氨基酸残基Gly和Ala；或Xaa14是选自以下的氨基酸残基Ash或Lys；或Xaa15是选自以下的氨基酸残基Gly、Asp、Leu、Arg、Glu、Thr、Tyr、Val和Lys，尤其当Xaa15是Leu和Lys时；或Xaa16是选自以下的氨基酸残基Val、Gln、Asp、Gly、Ile、Ala、Met和Val，尤其当Xaa16是Val和Ala时；或Xaa17是选自以下的氨基酸残基His、Glu、Pro、Ala、Lys和Val，尤其当Xaa17是Glu和Pro时；或Xaa18是选自以下的氨基酸残基Val、Thr、Asp、Pro、Arg、Tyr、Glu、Ala或Tys，尤其当Xaa18是Thr时；或Xaa19是选自以下的氨基酸残基Arg、Pro、Ile、Leu或Thr，尤其当Xaa19是Pro时；或Xaa20是选自以下的氨基酸残基Arg、Lys、Gln和Ser，尤其当Xaa20是Arg或Lys时；或Xaa21是选自以下的氨基酸残基Ala、Asp、Thr或Gly，尤其当Xaa21是Ala时；或Xaa22是选自以下的氨基酸残基Ser、Ile、Tyr、Asn、Leu、Val、Arg或Phe，尤其当Xaa22是Ser或Arg时；或Xaa23是选自以下的氨基酸残基Met、Phe、Ile、Glu、Thr和Val，尤其当Xaa23是Phe或Ile时；或Xaa24是选自以下的氨基酸残基Pro、Lys、Thr、Asn、Leu、Gln、Ser或Ile，尤其当Xaa24是Pro或Ile时；或Xaa25是选自以下的氨基酸残基Arg、Lys或Leu，尤其当Xaa25是Arg时；或Xaa26是选自以下的氨基酸残基Val、Ile、Lys、Leu、Ala、Pro、Phe、Gln、Trp和Thr，尤其当Xaa26是Val或Ile时；或Xaa27是选自以下的氨基酸残基Gly、Ser和Thr，尤其当Xaa27是Gly时；或Xaa28是选自以下的氨基酸残基Asp、Arg、Glu、Leu、Gly或Gln，尤其当Xaa28是Arg时或Xaa29是选自以下的氨基酸残基Gly和Ala；或Xaa30是选自以下的氨基酸残基Asn或Lys；或Xaa31是选自以下的氨基酸残基Gly、Asp、Leu、Arg、Glu、Thr、Tyr、Val和Lys，尤其当Xaa31是Arg或Lys时；或Xaa32是选自以下的氨基酸残基Val、Gln、Asp、Gly、Ile、Ala、Met和Thr，尤其当Xaa32是Gln或Ala时。
本发明还涉及编码本发明胎盘比库蛋白变体的DNA构建物。可用合成方法(如Beaucage S.L.和Caruthers M.H.(1981)Tetrahedron Lett，22第1859-1862页；Matteucci M.D和Caruthers M.H.(1981)，J.Am.Chem.Soc.103第3185页中所述的)制备这些构建物，或用cDNA探针(设计成与编码胎盘比库蛋白的DNA序杂交)筛选基因组或cDNA文库得到的基因组或cDNA来制备。可在一个或多个位置修饰基因组或cDNA序列，以得到编码任何本文所述的氨基酸替换或缺失的cDNA。
本发明还涉及含有编码本发明胎盘比库蛋白、分离的结构域或其他变体的DNA构建物的表达载体，可用于产生重组胎盘比库蛋白变体。将cDNA连接于合适的启动子序列(该启动子在所选的宿主细胞中显示出转录活性)，具有合适的终止子和聚腺苷酰化信号。可将编码胎盘比库蛋白变体的cDNA融合于5’信号肽，这将导致该cDNA编码的蛋白质分泌。信号肽可以是宿主生物能识别的信号肽。对哺乳动物宿主细胞而言，信号肽可以是全长胎盘比库蛋白中存在的天然信号肽。用于制备表达胎盘比库蛋白变体的载体的方法是本领域熟知的，如Sambrook等人在“分子克隆实验室手册”，Cold Spring Harbor.NeWYork，(1989)中所述。
本发明还涉及含有编码本发明胎盘比库蛋白、分离的结构域或其他变体的DNA构建物的转化细胞，可用于产生重组胎盘比库蛋白变体。存在各种不同的表达载体和宿主生物的组合，可用于产生胎盘比库蛋白变体。合适的宿主细胞包括杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞、哺乳动物细胞如BHK、CHO、Hela和C-127，细菌如大肠杆菌和酵母菌如酿酒酵母。用于哺乳动物、昆虫和微生物表达系统来实现胎盘比库蛋白表达的方法是本领域熟知的，且可参见如AusubelF.M.等人的“最新分子生物学方案”，John Wiley&Sons(1995)，第16章。对含有单个Kunitz抑制剂结构域的胎盘比库蛋白片断，如比库蛋白(7-64)和(102-159)而言，酵母菌和大肠杆菌表达系统是优选的，且酵母菌系统是最优选的。通常，可如美国专利5,164,482对抑蛋白酶肽变体所述，进行酵母菌的表达，且适用于本发明实施例5的胎盘比库蛋白(102-159)。可按美国专利5,032,573所述的方法进行大肠杆菌的表达。对表达含有两个抑制剂结构域的较大胎盘比库蛋白变体如变体比库蛋白(7-159)而言，用哺乳动物和酵母菌系统是优选的。
可用Kunkel T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci USA82第488-492页的方法，制备编码胎盘比库蛋白变体(在天然氨基酸序列中含有氨基酸替换)的DNA，来表达重组蛋白质。简单地说，可将待诱变处理的DNA克隆入单链噬菌体载体如M13中。将跨越待改变区域和编码取代基的寡核苷酸杂交于此单链DNA，并用标准分子生物方法制成双链。然后将此DAN转化入适当的细菌宿主，用双脱氧核苷酸测序法验证。然后将正确的DNA克隆入表达质粒。另外，可用标准PCR方法诱变靶DNA、测序并插入到合适的表达质粒中。
以下提供了用于说明而并非限制的实施例、本发明的某些方面和优选实施例。本文所引用的所有专利、专利出版物和参考文献本文都全部纳入作为参考。
实施例1合成的胎盘比库蛋白(102-159)的制备所用的材料和方法/试剂从Bachem BioScience Inc(King of Prussia，PA)购得荧光底物Tos-Gly-Pro-Lys-AMC。从Sigma(St.Louis，MO)购得PNGB、Pro-Phe-Arg-AMC、Ala-Ala-Pro-Met-AMC、牛胰蛋白酶(III型)、人血浆激肽释放酶和人血纤蛋白溶酶。
从Bayer AG(Wuppertal，Germany)购得重组抑蛋白酶肽(Trasylol)。预加样的Gln Wang树脂是从Novabiochem(La Jolla，CA)购得的。从Aldrich(Milwaukee，WI)购得苯硫基甲烷、乙二硫醇(ethanedithiol)和叔丁基甲醚。
功能性胎盘比库蛋白(7-64)(SEQ ID NO4)和(102-159)的定量用GPK-AMC作为底物，测定了纯化不同阶段重折叠样品中存在的胰蛋白酶抑制活性的量。将牛胰蛋白酶(200pmol)与纯化不同阶段的比库蛋白(7-64)或(102-159)，在缓冲液A(50mM Hepes，pH 7.5，0.1M NaCl，2mM CaCl2和0.01％triton X-100)中37℃培育5分钟。加入GPK-AMC(20μM、终浓度)，在Perkin-Elmer LS-508荧光计上测定荧光(ex＝370nm，em＝432nm)2分钟，来确定产生的香豆素的量。按方程式1计算了各测试样品的％抑制，方程式1中R0是存在抑制剂时荧光增加的速率，R1是未加入样品时所测得的的速率。抑制剂一个单位活性定义为用所述的条件在该试验中达到50％抑制所需的量。
％抑制＝100×[1－R0/R1](1)合成。用NMP-HBTU Fmoc化学物，在Applied Biosystems 420A型肽合成仪上合成胎盘比库蛋白(102-159)(SEQ ID NO6)。每次偶联用8倍过量的氨基酸，在预填装Gln树脂上合成此肽。室温在84.6％三氟乙酸(TFA)、4.4％苯硫基甲烷、2.2％乙二硫醇、4.4％液态苯酚和4.4％H2O中，进行切割和去保护2小时。将粗制的肽沉淀下，离心，用叔丁基甲醚洗涤2次。在Dynamax 60A C18反相HPLC柱上，用TFA/乙腈梯度，纯化该肽。最终制备物(61.0mg)得到正确的氨基酸组合物，用Electrospary质谱对预定的序列进行分子质量分析(MH＝6836.1；计算值＝6835.5)YEEYCTANAV TGPCRASFPR WYFDVERNSC NNFIYGGCRGNKNSYRSEEA CMLRCFRQ(SEQ ID NO6)纯化。按Tam等人(J.Am.Chem.Soc.1991，113；6657-62)所述的方法，进行胎盘比库蛋白(102-159)的重折叠。将部分纯化的肽(15.2mg)溶解于4.0ml 0.1MTris(pH6.0)和8M脲中。滴加含有23％DMSO和0.1M Tris(pH6.0)的溶液，进行二硫键的氧化得到在20％DMSO、0.1M Tris(pH6.0)和1M脲的溶液中终浓度为0.5mg/ml的肽。25℃搅拌溶液24小时，然后用含有50mM Tris(pH8.0)和0.1MNaCl的缓冲液1∶10稀释。用激肽释放酶亲和柱(按制造商的说明，将30mg牛胰腺激肽释放酶(Bayer AG)共价附着于3.5ml CNBr活化的琼脂糖(Pharmacia)纯化该物质。以1ml/分钟流速，将重折叠的物质加样到此亲和柱上，用50mMTris(pH8.0)和0.1M NaCl洗涤，直到不再能测到洗液280nm的吸光度。用各3体积的0.2M乙酸(pH8.0和pH1.7)洗脱该柱。合并活性组分(见下)，将溶液的pH调节至2.5。直接将该物质加样到Vydac C18反相柱(5微米，0.46×25cm)，该柱已用0.1％TFA配制的22.5％乙腈平衡。用22.5-40％乙腈(在0.1％TFA中)的线性梯度，以1.0ml/分钟进行分离40分钟。合并活性组分，冻干，再溶解在0.1％TFA中，储存于-20℃直至使用。
结果。如上所述用20％DMSO作为氧化剂，重叠了合成的胎盘比库蛋白(102-159)，如下所述分两步纯化，得到活性胰蛋白酶抑制剂(下表1)。
表1合成的胎盘比库蛋白(102-159)的分离纯化表表1纯化步骤体积(ml) mg/mlmg 单位(U)cSpA(U/mg) 收率8.0M尿素 4.0 3.75a 15.0 0 0 -20％DMSO 32.00.47a 15.0 16,162 1,078100激肽释放酶亲和柱 9.80.009b 0.09 15,700170,00097C18柱 3.00.013ab 0.04 11,964300,00074a蛋白质是由AAA测定的b蛋白质是在OD280nm，用消光系数测定的纯化蛋白质(1.7×104mol-1cm-1)。
c一个单位定义为在标准试验中抑制50％胰蛋白酶活性所需的物质的量。
在固定牛胰腺激肽释放酶的柱上层析该粗制重折叠产物，选择性分离得到6.0％蛋白质，和存在的97％胰蛋白酶抑制剂活性。随后用C18反相层析进一步两倍纯化，总回收率为74％。在RPHPLC中，还原和重折叠的胎盘比库蛋白(102-159)的洗脱时间分别为26.3和20.1分钟。质谱分析纯化的物质揭示其分子量为6829.8，相当于起始物丢失了6个质量单位。这证明从该肽序列预测的3个二硫键完全形成。
用Multiphor II Electrophoresis系统(Pharmacia)，按制造商的建议，与pI标准品一起，用预制的AmpholinePAG板(pH3.5到9.5)测定了纯化的、重折叠的、合成胎盘比库蛋白(102-159)的等电点，聚焦进行1.5小时。染色后，测定了从凝胶阴极边缘到不同蛋白质条带的迁移距离。用标准品迁移距离对相应的pI’s绘图产生的标准曲线确定各未知物质的pI。用这种技术，测得胎盘比库蛋白(102-159)的pI为8.3，这与氨基酸序列预计的相符。这比抑蛋白酶肽的pI所确定的值10.5低(Tenstad等人，1994，Acta Physiol.Scand.15233-50)。
实施例2合成的胎盘比库蛋白(7-64)的制备基本如实施例1中对于胎盘比库蛋白(102-159)(SEQ ID NO6)所述，合成、重折叠和纯化了胎盘比库蛋白(7-64)(SEQ ID NO4)，但在修饰后，重折叠过程中，将合成的肽在25℃，20％DMSO溶液中搅拌30小时；以25-45％乙腈(在0.1％TFA中)的线性梯度，用C18 RP-HPLC纯化40分钟(1ml/分钟)。将第一次C18跑样后的活性组分再加样到柱中，用20-40％乙腈(在0.1％TFA中)线性梯度分级(60分钟，1ml/分钟)。
结果。最终纯化的还原肽显示MH+＝6563，与以下序列一致IHDFCLVSKV VGRCRASMPR WWYNVTDGSC QLFVYGGCDG NSNNYLTKEECLKKCATV(SEQ ID NO4)重折叠和纯化产生了功能性Kunitz结构域，其具有胰蛋白酶抑制剂活性(下表2)。
表2A分离合成的胎盘比库蛋白(7-64)的纯化表表2A纯化步骤 体积(ml) mg/ml mg单位(U) SpA(U/mg) 收率8.0M尿素8.0 2.5 20.0 0 0-20％DMSO 64.0 0.31 20.0 68,6993,435 100激肽释放酶亲和柱pH4.0 11.7 0.10 1.16 43,333 36,110 62激肽释放酶亲和柱pH1.7 9.0 0.645.84972 857 7.2C18-1 4.6 0.14 0.06 21,905 350,143 31.9C18-2 1.0 0.08 0.027,937 466,882 11.5纯化的重折叠蛋白质显示MH+＝6558，即5±1质量单位小于还原肽。这表明重折叠导致形成了至少一个适当的二硫键。
用测定胎盘比库蛋白(102-159)pI的方法确定了胎盘比库蛋白(7-64)的pI。胎盘比库蛋白(7-64)显示pI比预计的值(pI＝7.9)高许多。重折叠的胎盘比库蛋白(7-64)迁移到凝胶的阴极边缘(pH9.5)，在这种条件下不能确定精确的pI。
合成的胎盘比库蛋白(7-64)的连续制备由于在纯化和重折叠前，合成的胎盘比库蛋白(7-64)可能没有经过完全的去保护，用已确定完全去保护的蛋白质重复重折叠。基本采用制备胎盘比库蛋白(102-159)所述的方法，合成、重折叠和纯化了胎盘比库蛋白(7-64)，但在修饰后重折叠过程中，将合成的肽(0.37mg/ml)在20％DMSO中25℃搅拌30小时；以22.5-50％乙腈(在0.1％TFA中)线性梯度，用C18RP-HPLC进行纯化40分钟(1ml/分钟)。
结果。纯化的还原肽显示MH+＝6567.5，与以下序列一致IHDFCLVSKV VGRCRASMPR WWYNVTDGSC QLFVYGGCDG NSNNYLTKEECLKKCATV(SEQ ID NO4)重折叠和纯化产生了功能性Kunitz结构域，其具有胰蛋白酶抑制剂的活性(下表2B)。
表2B分离合成的胎盘比库蛋白(7-64)的纯化表表2A纯化步骤 体积(ml) mg/ml mg 单位(U) SpA(U/mg) 收率8.0M尿素4.9 2.1 10.50 0 -20％DMSO 39.0 0.27 10.5 236,000 22,500 100激肽释放酶亲和柱(pH2) 14.5 0.3 0.43 120,000 279,070 50.9C18反相柱 0.2 1.2 0.24 70,676 294,483 30.0纯化的重折叠蛋白质显示MH+＝6561.2，即小于还原肽6.3质量单位。这证明重折叠导致形成预计的三个二硫键。
用测定胎盘比库蛋白(102-159)pI的方法来测定胎盘比库蛋白(7-64)的pI。重折叠的胎盘比库蛋白(7-64)的pI值为8.85，比预计值(pI＝7.9)略高。
实施例3功能性胎盘比库蛋白片断(102-159)的体外特异性蛋白酶用上述的HCl胍基苯甲酸叔-硝基苯酯，通过活性位点滴定进行牛胰蛋白酶、人血纤蛋白溶酶和牛胰腺激肽释放酶的定量测定(Chase，T.，和Shaw，E.，(1970)Methods Enzmol.19，20-27)。用牛抑蛋白酶肽作为标准品、PFR-AMC作底物(假定1∶1复合物形成)，通过活性位点滴定定量测定人激肽释放酶。在各酶作用的条件下，GPK-AMC与胰蛋白酶和血纤蛋白溶酶的Km分别为29μM和726μM；PFR-AMC对人血浆激肽释放酶和牛胰腺激肽释放酶的Km分别为457μM和81.5μM；AAPR-AMC与弹性蛋白酶的Km为1600μM。如上所述，用HCl胍基苯甲酸叔-硝基苯酯，通过活性位点滴定进行了人组织激肽释放酶(Bayer Germany)的定量测定(Chase，T.，和Shaw，E.，(1970)MethodsEnzmol.19，20-27)。
抑制动力学将50pM胰蛋白酶与胎盘比库蛋白(102-159)(0-2nM)或抑蛋白酶肽(0-3nM)在缓冲液A(终体积为1.0ml)中培育，测定了胎盘比库蛋白(102-159)(实施例1所述)或抑蛋白酶肽对胰蛋白酶的抑制。5分钟后，37℃，加入15μl 2mM GPK-AMC，监测荧光(上述)的变化。用血纤蛋白溶酶(50pM)和胎盘比库蛋白(102-159)(0-10nM)或抑蛋白酶肽(0-4nM)，在含有50mMTris-HCl(pH7.5)、0.1M NaCl和0.02％triton x-100的缓冲液中，测定胎盘比库蛋白(102-159)和抑蛋白酶肽对人血纤蛋白溶酶的抑制。37℃培育5分钟后，加入25μl20mM GPK-AMC，监测荧光的变化。用激肽释放酶(2.5nM)和胎盘比库蛋白(102-159)(0-3nM)或抑蛋白酶肽(0-45nM)，在含有50mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM NaCl和0.02％triton x-100的缓冲液中，测定了胎盘比库蛋白(102-159)或抑蛋白酶肽对人血浆激肽释放酶的抑制。5分钟后，37℃加入15μl 20mM PFR-AMC，监测荧光的变化。以类似的方法，用激肽释放酶(92pM)、胎盘比库蛋白(102-159)(0-1.6nM)和抑蛋白酶肽(0-14pM)，最终底物浓度100μM，测定了胎盘比库蛋白(102-159)和抑蛋白酶肽对牛胰腺激肽释放酶的抑制。用非线性回归数据分析程序Enzfitter软件(Biosoft，Cambridge，UK)测定表观抑制常数Ki*按紧密结合性抑制剂方程式，分析了各试验的动力学数据Vi/Vo＝1－(Eo＋Io＋Ki*－[(Eo＋Io＋Ki*)2－4EoIo]1/2)/2Eo(2)其中Vi/Vo是分数酶活性(被抑制的对未被抑制的比例)，Eo和Io分别是酶和抑制剂的总浓度。按以下方程式，通过校正底物的作用获得Ki值Ki＝Ki*/(1＋[So]/Km) (3)(Boudier，C.，和Bieth，J.G.，(1989)Biochim Biophys Acta，99536-41)对胎盘比库蛋白(102-159)和抑蛋白酶肽抑制人嗜中性白细胞弹性蛋白酶而言，在含有0.1M Tris-HCl(pH8.0)和0.05％triton x-100的缓冲液中，与胎盘比库蛋白(102-159)(150nM)或抑蛋白酶肽(0-7.5μM)一起，培育弹性蛋白酶(19nM)。在37℃5分钟后，加入AAPM-AMC(500μM或1000μM)，测定荧光2分钟。以两种不同的底物浓度进行，从1/V对[I]绘制的Dixon图确定Ki值(Dixon等人，1979)。
在1ml含有50mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)、50mM NaCl和0.1％triton x-100的反应容量中，将胎盘比库蛋白(7-64)(0-40nM)或胎盘比库蛋白(102-159)(0-2.5nM)或抑蛋白酶肽(0-0.5nM)与0.35nM人组织激肽释放酶一起培育，来测定抑蛋白酶肽、胎盘比库蛋白片断(7-64)或胎盘比库蛋白片断(102-159)对人组织激肽释放酶的抑制。37℃，5分钟后，加入5μl 2mM PFR-AMC，至终浓度10μM，监测荧光的变化。在所用的条件下，人组织激肽释放酶对PFR-AMC的Km为5.7μM。通过在含有20mM Tris(pH 7.5)、0.1M NaCl和0.1％BSA的缓冲液中，与递增量的抑制剂一起培育0.87nM人因子Xa，测定了合成的胎盘比库蛋白(102-159)、重组胎盘比库蛋白和抑蛋白酶肽对人因子Xa(AmericanDiagnostica，Inc，Greenwich，CT)的抑制。37℃ 5分钟后，加入30μl 20mM LGR-AMC(Sigma)，监测荧光的变化。通过在总体积为1ml的含有50mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM NaCl和0.1％triton x-100的缓冲液中，与抑制剂一起培育尿激酶(2.7ng)，测定了Kunitz抑制剂对人尿激酶(Sigma)的抑制。37℃5分钟后，加入35μl 20mM GGR-AMC(Sigma)，监测荧光的变化。在含有50mM Hepes(pH7.5)、100mM NaCl、2mM CaCl2、0.01％triton x-100和1％BSA的总体积为1ml的缓冲液中，与0-800nM胎盘比库蛋白(7-64)、0-140nM胎盘比库蛋白(102-159)或0-40μM抑蛋白酶肽一起培育因子XIa(0.1nM)，测定了对因子Xia(由EnzymeResearch Labs，Southbend，IN提供)的抑制。37℃ 5分钟后，加入10μl 40mMBoc-Glu(Obzl)-Ala-AMC(Bachem Biosciences，King of Prussia，PA)，监测荧光的变化。
结果在相同的条件下，测定它们与各种不同蛋白酶的抑制常数，直接比较了胎盘(102-159)和抑蛋白酶肽的抑制特性。下表3列出了Ki值。
表3比库蛋白(102-159)抑制各种蛋白酶的Ki值表3蛋白酶比库蛋白(102-159) 抑蛋白酶 底物 Km(浓度) Ki(nM) 肽Ki(nM) (浓度) (mM)胰蛋白酶 0.40.8GPK-AMC 0.022(48.5pM) (0.03mM)胰凝乳蛋白酶 0.24 0.86 AAPF-Pna 0.027(5nM)(0.08mM)牛胰腺激肽释放酶 0.40.02 PFR-AMC 0.08(92.0pM) (0.1Mm)人血浆激肽释放酶 0.319.0 PFR-AMC 0.46(2.5nM)(0.3Mm)人血纤蛋白溶酶 1.81.3GPK-AMC 0.73(50pM) (0.5Mm)人嗜中性白细胞弹性 323.0 8500.0 AAPM-AMC 1.6蛋白酶(19nM) (1.0μM)因子XIIa ＞300.012,000.0 PFR-AMC 0.35(0.2μM)人组织激肽释放酶 0.13 0.004 PFR-AMC 0.005(0.35nM) (10μM) 7因子Xa 274 在3μM为 LGR-AMCN.D.
(0.87nM) N.I. (0.6Mm)尿激酶110004500 GGR-AMCN.D.
(0.7Mm)因子Xia 15 288E(Obz)AR- 0.46(0.1nM) AMC(0.4Mm)在所用的条件下，胎盘比库蛋白(102-159)和抑蛋白酶肽抑制牛胰蛋白酶和人血纤蛋白溶酶达到相同的程度。抑蛋白酶肽抑制弹性蛋白酶的Ki为8.5μM。胎盘比库蛋白(102-159)对牛胰腺激肽释放酶抑制的Ki值比抑蛋白酶肽的抑制高20倍。与此相反，与抑蛋白酶肽相比，胎盘比库蛋白(102-159)是人血浆激肽释放酶更强的抑制剂，它的结合亲和力要高56倍。
由于作为激肽释放酶的抑制剂，胎盘比库蛋白(102-159)比Trasylol要强50倍，为维持有效的患者抑制剂剂量(单位为KIU)，人胎盘比库蛋白或其片断(即胎盘比库蛋白(102-159)所需的量比Trasylol小。这就降低了该药物每剂的成本，还降低了患者重复服用药物而产生不良肾中毒的可能性。另外，这种蛋白质是从人衍生的，因而在人体中比从牛衍生的抑蛋白酶肽的免疫原性要低得多。这明显降低了反复服用药物对患者产生难治愈的不良免疫反应的危险性。
实施例4功能性胎盘比库蛋白片断(7-64)的体外特异性用上述实施例所述的材料和方法测定了实施例2所述的功能性人胎盘比库蛋白(7-64)的体外特异性。
结果下表显示了体外胎盘比库蛋白(7-64)作为各种不同丝氨酸蛋白酶抑制剂的效果。比较了用胎盘比库蛋白(102-159)或抑蛋白酶肽(Trasylol)筛选抑制得到的数据，显示以下数据。
表4A比库蛋白(7-64)对各种不同蛋白酶抑制的Ki值表4A蛋白酶比库蛋白(7-64) 抑蛋白酶肽 比库蛋白(102-159)(浓度) Ki(nM)Ki(nM) Ki(nM)胰蛋白酶(48.5pM)0.17 0.8 0.4牛胰腺激肽释放酶0.4 0.02 0.4(92.0pM)人血浆激肽释放酶2.4 19.0 0.3(2.5nM)人血纤蛋白溶酶(50pM)3.11.3 1.8牛凝乳蛋白酶(5nM) 0.60.9 0.2因子XIIa ＞300 12000 ＞300弹性蛋白酶 ＞100 8500 323结果显示编码胎盘比库蛋白(7-64)的氨基酸序列可以重折叠，形成能有效对抗至少四种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的活性丝氨酸蛋白酶抑制剂。
下表4B显示了体外重折叠的胎盘比库蛋白(7-64)作为各种不同丝氨酸蛋白酶抑制剂的效果。从已确定在纯化和重折叠前完全去保护的蛋白质制备了重折叠的胎盘比库蛋白(7-64)。比较了用胎盘比库蛋白(102-159)或抑蛋白酶肽(Trasylol)进行筛选抑制得到的数据，显示以下数据。
表4B重折叠的比库蛋白(7-64)抑制各种不同蛋白酶的Ki值表4B蛋白酶比库蛋白(7-64) 抑蛋白酶肽 比库蛋白(102-159)(浓度) Ki(nM) Ki(nM) Ki(nM)胰蛋白酶(50pM) 0.2 0.80.3人血浆激肽释放酶0.7 19.0 0.7(0.2nM)人血纤蛋白溶酶(50pM)3.7 1.31.8因子XIIa 未进行试验 12,000 4,500因子Xia(0.1nM) 200 288 15人组织激肽释放酶2.3 0.004 0.13令人惊奇地，在抑制人血浆激肽释放酶时，胎盘比库蛋白(7-64)比抑蛋白酶肽更强，且效果至少与血纤蛋白溶酶抑制剂的相似。这些数据显示胎盘比库蛋白(7-64)至少与抑蛋白酶肽一样有效(用体外试验)，且预计在体内的效力将更好或类似。
实施例5胎盘比库蛋白变体(102-159)在酵母中的表达用合成的寡核苷酸产生编码胎盘BB102-159(SEQ ID NO6)的DNA序列。最终的DNA产物由15个核苷酸(5’到3’)构成，自融合的酵母的α-交配因子前肽序列到编码胎盘比库蛋白(102-159)的框内cDNA序列，然后为框内终止密码子。克隆入酵母表达载体pS604后，cDNA将指导融合蛋白的表达，包括融合的N端酵母α-交配因子前肽到胎盘比库蛋白(102-159)的58氨基酸序列。在KEX-2加工此融合蛋白，切断α-交配因子和Kunitz结构域之间的连接部位，设计此部位用于在Kunitz结构域的天然N端释放此Kunitz结构域。
合成了以下序列的5’有义寡核苷酸，其含有用于克隆的HindIII位点GAA GGG GTA AGC TTG GAT AAA AGA TAT GAA GAA TAC TGC ACC GCCAAC GCA GTC ACT GGG CCT TGC CGT GCA TCC TTC CCA CGC TGG TACTTT GAC GTG GAG AGG(SEQ ID NO42)合成了以下序列的3’反义寡核苷酸，其含有用于克隆的BamHI位点和终止密码子CGC GGA TCC CTA CTG GCG GAA GCA GCG GAG CAT GCA GGC CTC CTCAGA GCG GTA GCT GTT CTT ATT GCC CCG GCA GCC TCC ATA GAT GAAGTT ATT GCA GGA GTT CCT CTC CAC GTC AAA GTA CCA GCG(SEQ ID NO43)将寡核苷酸溶解在含有1mM EDTA的10mM Tris缓冲液(pH8.0)中，加入12μg各寡核苷酸，混合，加入0.25M NaCl。为了杂交，煮沸5分钟使寡核苷酸变性，然后从65℃冷却至室温2小时。用Klenow片断延伸重叠序列，用HindIII和BamIII消化。将得到的消化的双链片断克隆入pUC19中，测序确认。用BamHI/HindIII消化含有正确序列的克隆，以释放出含有如下＋链序列的比库蛋白片断GAA GGG GTA AGC TTG GAT AAA AGA TAT GAA GAA TAC TGC ACC GCCAAC GCA GTC ACT GGG CCT TGC CGT GCA TCC TTC CCA CGC TGG TACTTT GAC GTG GAG AGG AAC TCC TGC AAT AAC TTC ATC TAT GGA GGCTGC CGG GGC AAT AAG AAC AGC TAC CGC TCT GAG GAG GCC TGC ATGCTC CGC TGC TTC CGC CAG TAG GGA TCC(SEQ ID NO44)然后凝胶纯化，连接入BamHI/HindIII切割的pS604中。用苯酚/氯仿提取连接混合物，在S-200微型旋转柱上纯化。直接将连接的产物转化入酵母菌株SC101和WHL341中，接种尿嘧啶选择平板。将单个克隆接种入2ml尿嘧啶DO培养基中，30℃培育过夜。1400×g离心2分钟沉淀细胞，评估上清液中胎盘比库蛋白(102-159)的含量。
在转化的酵母中指导胎盘比库蛋白(102-159)的表达首先用实施例1所述的试验方法(1ml试验体积)，评估了上清液(每次试验用50μl)体外抑制胰蛋白酶活性的能力。以无培养基仅含有样品以及表达抑蛋白酶肽失活变体的酵母克隆，作为阴性对照。表达天然抑蛋白酶肽的酵母克隆作为阳性对照，进行比较显示。
第二种定量测定胎盘比库蛋白(102-159)表达的方法，使用了针对该合成肽的多克隆抗体(pAbs)，用Western印迹来监测该重组肽的积累。这些研究只用菌株SC101衍生的重组体，因为这些重组体比WHL341菌株衍生的重组体产生的抑制活性强。
为了产生pAb，在第0天，用以完全弗氏佐剂(Complete Freund)配制的250μg纯化的还原的合成胎盘比库蛋白(102-159)，免疫接种了2只6-8周龄的老新西兰白色雌兔(Hazelton Research Labs，Denver，Pa)，然后在第14、35和56和77天各用不完全弗氏佐剂配的125μg同一抗原加强。本研究所用的抗血清是在第三次加强免疫后收集的。用蛋白质A从抗血清中纯化得到多克隆抗体。
30℃在50ml尿嘧啶DO培养基中，培育转化酵母SC101(图8)的克隆2.4和2.5以及抑蛋白酶肽对照。沉淀细胞，用Centriprep3(Amicon，Beverly，MA)浓缩器浓缩上清液100倍。按供应商的流程，将各(30μl)样品加样到10-20％N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲凝胶上进行SDS-PAGE(Novex，San Diego，CA)。用银染色试剂盒(Integrated Separation Systems，Nantick，MA)显影一式两份的凝胶，或将它们转移到硝基纤维素上，再用纯化的针对合成比库蛋白(102-159)的多克隆抗体显影。按供应商的说明，用碱性磷酸酶偶联羊抗兔抗体作为第二抗体(Kirkegaard and Perry，Gaithersburg，MD)。
从转化的SC101菌株纯化胎盘比库蛋白(102-159)通过离心(4,000g×30分钟)，收获1L培养的SC101菌株2.4的发酵肉汤，然后将其加到1.0ml无水凝乳蛋白酶-琼脂糖(Takara Biochemical Inc.，CA)柱上，该柱预先用50mM Hepes缓冲液(pH7.5)(含有0.1M NaCl、2mM CaCl2和0.01％(v/v)triton X-100)平衡。用同一缓冲液但所含的NaCl为1.0M，洗涤该柱，直到A280nm降至0，然后用0.1M甲酸(pH2.5)洗脱该柱。合并洗脱的组分，加到C18柱(Vydac，5μm，4.6×250mm)上，该柱预先用0.1％TFA平衡，然后用0.1％TFA配的20％-80％乙腈线性梯度洗脱50分钟。合并含有胎盘比库蛋白(102-159)的组分，在C18柱上重层析，用0.1％TFA配的22.5％-50％乙腈梯度洗脱。
结果图8显示了各菌株SC101和WHL341转化衍生的12个克隆所抑制的胰蛋白酶活性的百分比。结果显示，与不能抑制胰蛋白酶的阴性对照相比，用胰蛋白酶抑制剂胎盘比库蛋白(102-159)转化的酵母菌株SC101的所有12个菌落都有能力产生充足量的胰蛋白酶抑制活性。因此该活性与胎盘比库蛋白变体(102-159)转化的细胞中特异性抑制剂的表达相关。酵母WHL341样品含有最小胰蛋白酶抑制剂活性。这可能与在所用的条件下观察到该菌株的生长缓慢相关。
图9显示了酵母SC101上清液的SDS-PAGE和Western分析。表达胎盘比库蛋白(102-159)的重组酵母2.4和2.5的上清液和表达抑蛋白酶肽酵母的上清液银染色的SDS-PAGE，得到大约6kDa的一蛋白质条带，其相应于各重组Kunitz结构域的预计大小。Western分析显示菌株2.4和2.5表达的6kDa条带能与针对胎盘比库蛋白(102-159)的pAb反应。在抑蛋白酶肽对照中相同的6kDa条带不与上述抗体反应，表明该抗体对胎盘比库蛋白变体(102-159)有特异性。
银染色SDS-PAGE显示胎盘比库蛋白C端结构域的最终制品是高纯的(图10)。该最终制品中肉汤衍生的胰蛋白酶抑制剂的活性总回收率为31％。该纯化抑制剂的N端测序表明40％该蛋白质是正确加工的，从而得到了胎盘比库蛋白(102-159)的正确N端，而约60％物质含有部分酵母α-交配因子。该纯化物质由活性丝氨酸蛋白酶抑制剂组成，在体外抑制血浆激肽释放酶中它的表观Ki为0.35nM。
总之，蛋白酶抑制剂活性和在免疫化学上与合成的比库蛋白(102-159)相关的蛋白质二者的累积性，以及自某一转化细胞系分离出胎盘比库蛋白(102-159)，证明了本文所述的重组酵母菌株中有胎盘比库蛋白的表达，首次显示可用酵母来产生胎盘比库蛋白片断。
为了提高胎盘比库蛋白102-159中Kunitz结构域的表达水平，以及为了提高包含正确N端的蛋白质的产量，制备了其他构建物。我们假设胎盘比库蛋白102-159的N端残基(YEEY-)可能存在-酵母KEX-2蛋白酶弱识别的切割位点，此酶经酶促作用去除此酵母-因子-前区。因此，我们制备了用于产生胎盘BB103-159(EEY…的N端)、101-159(NYEEY…的N端)和98-159(DMFNYEEY…)的酵母表达构建物，以修饰KEX-2切割位点周围的P’亚位点(subsite)。为了提高重组蛋白质表达的水平，我们用酵母偏爱的密码子而不是哺乳动物偏爱的密码子来制备以下的一些构建物。基本上如胎盘BB102-159(称为构建物#1)所述制备了这些构建物，但具有以下修饰构建物#2胎盘比库蛋白103-159，酵母密码子使用A5’有义寡核苷酸GAAGGGGTAA GCTTGGATAA AAGAGAAGAA TACTGTACTG CTAATGCTGTTACTGGTCCATGTAGAGCTT CTTTTCCAAG ATGGTACTTT GATGTTGAAAGA(SEQ ID NO55)和3’反义寡核苷酸ACTGGATCCT CATTGGCGAA AACATCTCAA CATACAGGCT TCTTCAGATCTGTAAGAATT TTTATTACCT CTACAACCAC CGTAAATAAA ATTATTACAAGAATTTCTTT CAACATCAAA GTACCATCT(SEQ ID NO56)如上述产生表达胎盘比库蛋白102-159的表达构建物(上述的构建物#1)那样进行操作。
构建物#3胎盘比库蛋白101-159，酵母密码子使用A5’有义寡核苷酸GAAGGGGTAA GCTTGGATAA AAGAAATTAC GAAGAATACT GTACTGCTAATGCTGTTACT GGTCCATGTA GAGCTTCTTT TCCAAGATGG TACTTTGATGTTGAAAGA(SEQ ID NO57)和与用于构建物#2的相同的3’反义寡核苷酸，如上述产生表达胎盘比库蛋白102-159的表达构建物(上述的构建物#1)那样进行操作。
构建物#4胎盘比库蛋白98-159，酵母密码子使用A5’有义寡核苷酸GAAGGGGTAA GCTTGGATAA AAGAGATATG TTTAATTACG AAGAATACTGTACTGCTAAT GCTGTTACTG GTCCATGTAG AGCTTCTTTT CCAAGATGGTACTTTGATGT TGAAAGA(SEQ ID NO58)和与用于构建物#2的相同的3’反义寡核苷酸，如上述产生表达胎盘比库蛋白102-159的表达构建物(上述的构建物#1)那样进行操作。
用含有上述各cDNA的质粒转化酵母菌株SC101(MATα，Ura3-52，suc2)，并用上述使用人密码子产生胎盘比库蛋白102-159的方法表达了这些蛋白质。得到约250ml各酵母培养物，分别将离心(15分钟×3000RPM)得到的上清液在上述的1ml激肽释放酶-琼脂糖柱上纯化。下表7列出了测试中胰蛋白酶抑制活性的相对量，回收的纯化蛋白质的量和纯化蛋白质的N端序列。
表7含有胎盘比库蛋白的C端Kunitz结构域的不同蛋白质的相对生产水平表7构建物测试中抑制剂的N端测序 注译相对浓度 量 序列(pmol)#2 103-159 没有检测到无 无没有表达#3 101-159 25％抑制 无 无 低表达#4 98-159产物93％抑制 910 DMFNYE- 很好表达，正确#1 102-159 82％抑制 480 AKEEGV- 表达了活性、不正确加工的蛋白质结果显示含有C端Kunitz结构域的不同长度的胎盘比库蛋白片断，表现出表达功能性分泌的蛋白质的能力有很大的差异。在纯化前，上清液中表达片断101-159和103-159的构建物产生极少或低的酶活性，且对0.05ml等分的各纯化组分进行N端测序产生不能检测到可数量的抑制剂。另一方面，纯化前胎盘比库蛋白102-159或98-159的表达产生了明显量的蛋白酶活性。但N端测序显示由102-159表达回收的纯化蛋白质仍旧在很大程度上未正确加工，显示N端与酵母α-交配因子前序列中某位点上的大部分前蛋白的加工相一致。而从胎盘比库蛋白98-159表达回收的纯化蛋白质是在正确位点加工的，产生正确的N端。另外，与胎盘102-159的回收相比，回收了约多2倍的蛋白质。所以对通过α-交配因子前一原序列/酿酒酵母的KEX-2加工系统，产生胎盘比库蛋白的C端Kunitz结构域而言，胎盘比库蛋白98-159是优选的片断长度。
实施例6酵母表达的其他方法在DNA测序后，还可从克隆入TA载体TM(Invitrogen，San Diego，CA)的R87894-R74593 PCR产物或从人胎盘cDNA中，经PCR扩增产生R74593翻译产物衍生的58个氨基酸的肽。扩增的DNA产物由酵母α-交配因子前导序列的19个核苷酸(与编码YEEY-CFRQ(58个残基)的R74593序列匹配)构成，从而产生框内的翻译产物，构建α交配因子/Kunitz结构域融合蛋白。该蛋白序列还包含kex2切割，将在其天然N端释放出Kunitz结构域。
含有用于克隆的HindIII位点的5’有义寡核苷酸包含以下序列GCCAAGCTTG GATAAAAGAT ATGAAGAATA CTGCACCGCC AACGCA(SEQ ID NO30)含有用于克隆的BamHI位点以及终止密码子的3’反义寡核苷酸为以下序列GGGGATCCTC ACTGCTGGCG GAAGCAGCGG AGCAT(SEQ ID NO31)将以下序列的全部206个核苷酸的cDNA序列克隆入酵母表达载体CCAAGCTTGG ATAAAAGATA TGAAGAATAC TGCACCGCCAACGCAGTCAC TGGGCCTTGC CGTGCATCCT TCCCACGCTGGTACTTTGAC GTGGAGAGGA ACTCCTGCAA TAACTTCATCTATGGAGGCT GCCGGGGCAA TAAGAACAGC TACCGCTCTGAGGAGGCCTG CATGCTCCGC TGCTTCCGCC AGCAGTGAGGATCCCC(SEQ ID NO32)PCR扩增后，用HindIII、BamHI消化此DNA，并克隆入经HindIII和BamHI消化的酵母表达载体pMT15(见美国专利No.5,164,482，文将其全部纳入作为参考)中。用美国专利No.5,164,482中所述的方法，将得到的质粒载体用于转化酵母菌株SC106。分离URA3+酵母转化体，在可诱导的条件下培养。用上述体外试验方法根据培养物上清液中累积的胰蛋白酶抑制剂活性的量，确定重组胎盘比库蛋白变体的产量。9000rpm离心发酵肉汤30分钟。然后用0.4μm滤器过滤上清液，再用0.2μm滤器过滤，稀释至电导率为7.5ms，用柠檬酸将pH调节至3。然后将样品批量吸附到50mM柠檬酸钠(pH3)中的200ml快速流动S琼脂糖上，搅拌60分钟。随后依次用各2L的50mM柠檬酸钠(pH3.0)、50mMTris-HCl(pH9.0)、20mM HEPES(pH6.0)洗涤该凝胶。将洗涤后的凝胶移入合适的柱中，用20mM HEPES(pH6.0)配的0到1M氯化钠线性梯度洗脱。然后合并含有体外胰蛋白酶抑制活性的洗脱组分，进一步纯化a)用固定有无水胰蛋白酶的柱层析(基本如实施例2所述)；b)用固定有牛激肽释放酶的柱层析；或c)合用常规的层析步骤包括凝胶过滤和/或阴离子交换层析。
实施例7
从胎盘分离天然人胎盘比库蛋白及其特性分析从完整的冷冻胎盘(Analytical Biological Services，Inc，Wilmington，DE)将比库蛋白纯化至表观均一。将胎盘(740gm)解冻至室温，切成0.5到1.0cm的薄片，置于冰上，用600ml PBS缓冲液洗涤。倾析掉洗涤液，将240ml胎盘薄片置于Waring搅拌器中。加入含有0.1M Tris(pH8.0)和0.1MNaCl的300ml缓冲液后，高速混合此混合物，倾倒入750.0ml离心管中，置于冰上。重复此流程直到处理完所有材料。4℃4500×g离心此混合浆液60分钟。用粗棉布过滤上清液，然后按制造商的说明，将70mg牛胰腺激肽释放酶(BayerAG)共价结合于5.0ml CNBr活化琼脂糖上(Pharmacia)，制成的激肽释放酶亲和柱纯化胎盘比库蛋白。以2.0ml/分钟流速将材料加样到该亲和柱上，用0.1MTris(pH8.0)、0.1M NaCl洗涤，直至不再探测到280nm时洗涤液的吸光度。用0.1M Tris(pH8.0)、0.5M NaCl进一步洗涤该柱，然后用3倍体积的0.2M乙酸(pH4.0)洗脱。将含有激肽释放酶和胰蛋白酶(见下文)抑制活性的组分合并，冷冻并冻干。用连接Beckman System Gold HPLC系统的Superdex 7510/30(Pharmacia)柱凝胶过滤层析进一步纯化胎盘比库蛋白。简单地说，该柱以0.5ml/分钟的流速，用0.1M Tris、0.15M NaCl和0.1％triton X-100平衡。以1.0ml 0.1M Tris(pH8.0)重建冻干的样品，以200μl等分将其注入凝胶过滤柱中。收集各组分(0.5ml)，分析胰蛋白酶和激肽释放酶抑制活性。合并活性组分，加入TFA将溶液的pH调节至2.5。直接将材料加样到Vydac C18反相柱(5微米，0.46×25cm)上，该柱预先用0.1％TFA中的20％乙腈平衡。最初用0.1％TFA配的20％乙腈洗涤20分钟后，以1.0ml/分钟，用0.1％TFA配的20％-80％乙腈线性梯度进行分离50分钟。收集各组分(1ml)，分析胰蛋白酶和激肽释放酶抑制活性。用快速真空浓缩器(Savant)浓缩含有抑制活性的组分，并作N端序列分析。
胎盘比库蛋白的功能试验通过测定其抑制牛胰蛋白酶和人血浆激肽释放酶的能力，鉴定了功能性胎盘比库蛋白。胰蛋白酶抑制活性是在室温96孔微量滴定板(Perkin Elmer)中，用Gly-Pro-Lys-氨基甲基香豆素为底物，在试验缓冲液(50mM Hepes，pH7.5，0.1M NaCl，2.0mM CaCl2.，0.1％triton X-100)中测定的。用配备有平板读数计的Perkin-Elmer LS-50B荧光计测定荧光(ex＝370nm，em＝432nm)，来确定胰蛋白酶产生的香豆素的量。将肺蛋白酶(100μl缓冲液23μg)与20μl待测试的样品混合，25℃培育10分钟。加入试验缓冲液配制的50μl底物GPK-AMC(终浓度33μM)开始反应。测定荧光强度，并用以下方程式确定各组分的％抑制％抑制＝100×[1－Fo/F1]其中Fo为未知荧光，F1为仅对照的胰蛋白酶荧光。类似地，用试验缓冲液(50mM Tris，pH8.0，50mM NaCl，0.1％triton x-100)配的7.0nM激肽释放酶和66.0μM Pro-Phe-Arg-AMC作为底物类似地测定了各组分中激肽释放酶的抑制活性。
确定胎盘比库蛋白的体外特异性用上述实施例的材料和方法测定了天然人胎盘比库蛋白的体外特异性。用GPK-AMC为底物，通过对已知浓度的胰蛋白酶活性位点的滴定定量测定了胎盘比库蛋白，以监测未结合的胰蛋白酶组分。
蛋白质的测序在Speed Vac中将1ml组分(C18-29 Delaria)浓缩至体积300ml，以减少有机溶剂的量。然后将样品加样到Hewlett-Packard微型二相反应柱中，用1ml2％三氟乙酸洗涤。用Edman降解方法，在Hewlett-Packard Gi005A型蛋白质测序系统上测序该样品。Hewlett-Packard提供了所有试剂和3.0版本的测序方法。测序进行50轮。
结果依次用激肽释放酶亲和层析、凝胶过滤和反相层析将胎盘比库蛋白纯化至表观均一(见以下纯化表)表5天然胎盘比库蛋白(1-179)的纯化表表5步骤 体积OD280 OD280单位a单位/OD(ml)(/ml) (U)280胎盘上清液 1800.0 41.7 75,060 3,000,00040.0激肽释放酶亲和层析Ph4.0 20.00.173.3616,000 4,880激肽释放酶亲和层析pH1.7 10.20.454.5612,000 2,630
Superdex7515.0 0.0085 0.13 3,191 24,546a一个单位定义为在标准试验中抑制50％胰蛋白酶活性的量。
用pH4.0洗脱液从激肽释放酶亲和柱洗脱得到大部分激肽释放酶和胰蛋白酶抑制剂活性。随后的凝胶过滤层析(图5)得到了激肽释放酶和胰蛋白酶抑制剂活性的一个峰，在相同条件下跑样分子量标准品产生的标准曲线判断其分子量范围为10到40kDa。反相C18层析(图6)得到在约30％乙腈最强洗脱的抑制剂活性4个峰。与从C18洗脱的第一峰相关的活性(组分29)显示，一氨基酸序列起始于胎盘比库蛋白的预计氨基酸序列的氨基酸1(ADRER…；SEQ ID NO1)，并且与50轮测序的预计序列(图3中加下划线的氨基酸)相同。如氧化蛋白测序所预计的那样，该序列一段中的半胱氨酸是沉默的。此后由S-吡啶基乙基化蛋白测序鉴定到在成熟胎盘比库蛋白的氨基酸位置11和20为半胱氨酸残基，在第11和20轮回收到PTH-吡啶基乙基半胱氨酸。
令人感兴趣的是，该序列的30号氨基酸残基天冬酰胺是沉默的，显示该位点易被糖基化。组分29得到一主要的序列，其相应于在残基#1上起始的胎盘比库蛋白序列的序列加上在残基6起始的也由胎盘比库蛋白(SIHD…)衍生的微小序列(2pmol)。这表明组分29中测序的终产物是高纯的，此蛋白酶抑制活性很可能与此组分相关(图6)。
另外，根据银染色SDS-PAGE分析(图7)可知，经C18层析的胎盘比库蛋白的终产物是高纯的，在10-20％丙烯酰胺N-三(羟甲基)甲基甘氨酸凝胶(Novex，San Diego，CA)上该蛋白质迁移的表观分子量为24kDa，该分子量用以下分子量标记物标准化胰岛素(2.9kDa)、牛胰蛋白酶抑制剂(5.8kDa)、溶菌酶(14.7kDa)、β-乳白蛋白(lactaglobulin)(18.4kDa)、碳酸酐酶(29kDa)和卵白蛋白(43kDa)。在SDS-PAGE上胎盘比库蛋白的上述大小与全长编码序列(图4F)所预计的相一致。
如同根据上述N端测序结果所预计的那样，纯化的该蛋白质能与针对胎盘比库蛋白(7-64)的抗体反应，产生的条带与在银染色的凝胶上(图7)所观察到的纯化制备物的分子量(图12A)相同。但，当将相同的制备物与针对合成的胎盘比库蛋白(102-159)的抗体反应时，未观察到相应于该全长蛋白质的条带。却观察到与大约6kDa的合成性比库蛋白(102-159)共迁移的片断。将这些结果的解释简单化就是在纯化后，纯的制备物发生了降解，产生了含有N端结构域的N端片断和含有C端结构域的C端片断。估计对胎盘比库蛋白(7-64)抗血清反应的片断无该全长蛋白质的C端，其24kDa的大小提示糖基化状态高。表6显示胎盘比库蛋白体外抑制各种丝氨酸蛋白酶的能力，数据与用抑蛋白酶肽获得的数据相比较。
表6胎盘比库蛋白抑制各种蛋白酶的Ki值
结果显示从天然来源(人胎盘)分离的胎盘比库蛋白是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的强抑制剂。
实施例8胎盘比库蛋白在不同人器官和组织中的表达模式从Clontech购得多种组织的Northern，包含2μg人心脏、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾和胰的聚A+RNA。使用两种不同的cDNA探针1)编码胎盘比库蛋白(102-159)的凝胶纯化的cDNA；2)780碱基对PCR衍生的cDNA(图4E)，它是由EcoRI消化和凝胶纯化的TA克隆释放出的。将各探针用32P-dCTP和随机引发标记试剂盒(Boehringer Mannheim Biochemicals(Indiana))标记，然后按制造商的说明，用于与多种组织的Northern杂交。用Biomax底片曝光18小时得到放射自显影照片，用Umax Scanner显影，并用Adobe Photoshop扫描。
结果用胎盘比库蛋白(102-159)探针(图11A)或较大的含有胎盘比库蛋白的两个Kunitz结构域的探针所观察到的组织表达模式，基本与预计的相同。在胰和胎盘中最丰富的是胎盘比库蛋白mRNA。还在肺、脑和肾中观察到明显水平，而在心脏和肝中观察到的水平较低，骨骼肌中未检测到该mRNA。所有情况下转录物大小为1.95干碱基，这与从EST重叠和全长cDNA克隆(上述)推导的胎盘比库蛋白的预计大小非常接近。
该mRNA在组织中的广泛分布表明胎盘比库蛋白是广泛表达的。由于该蛋白质还包含一前导序列，它可能充分接触人免疫系统，要求它能作为自身蛋白质被识别。其他表明胎盘比库蛋白mRNA表达在组织中广泛分布的证据，是从如下事实推论的存在着成年人和婴儿脑和人视网膜、乳房、卵巢、嗅上皮和胎盘衍生的胎盘比库蛋白同源的一些EST进入位点(entry)。因此结论是将这种天然的人蛋白质给予人类患者不可能引发免疫应答。
令人感兴趣的是，胎盘比库蛋白的表达模式使人有所联想到牛抑蛋白酶(在牛肺和胰腺中高水平存在)肽的表达模式。为了进一步阐明胎盘比库蛋白的表达模式，测定了以下人细胞总RNA的RT-PCR没有刺激过的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)、HK-2(从肾近曲小管(proxiaml tubule)衍生的细胞系)，TF-1(红白细胞白血病细胞系)和佛波酯(PMA)刺激的人外周血白细胞。设计使用了以下探针CACCTGATCG CGAAGACCCC(有义；SEQ ID NO59)；CTGGCGGAAG CAGCGGAGCA TGC(反义；SEQ ID NO60)来扩增600b.p编码胎盘比库蛋白的cDNA片断。通过包括用肌动蛋白引物来扩增800b.p.肌动蛋白片断对比较进行归一化。用溴化乙锭在琼脂糖凝胶上所鉴定的800b.p.片断在所有泳道上强度相同，而HUVECs中无600b.p.胎盘比库蛋白片断，但在其他各细胞系中存在的量都非常明显。我们得到如下结论胎盘比库蛋白至少在一些内皮细胞中不表达，但在一些白细胞群中表达。
实施例9从杆状病毒/Sf9表达系统高度纯化的胎盘比库蛋白(1-170)的纯度和特性鉴定如下在Sf9细胞中表达了含有两个Kunitz结构域(比库蛋白(1-170)(SEQID NO52)的胎盘比库蛋白大片断。用HindIII和Xbal消化释放出由PCR获得的和包含在TA载体中的胎盘比库蛋白cDNA(图4E)(见上述实施例)，产生了侧翼为5’XbaI位点和3’HindIII位点的一片断。将该片断凝胶纯化，然后克隆入M13mp19载体(New England Biolabs，Beverly，MA)中。用体外诱变(KunkelT.A.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488-492)，产生Pst1位点3’至5’端的XbaI位点，而5’至编码ATG起始位点的序列、天然胎盘比库蛋白信号肽和成熟胎盘比库蛋白编码序列。用于诱变的寡核苷酸的序列如下5’CGC GTC TCG GCT GAC CTG GCC CTG CAG ATG GCG CAC GTG TGCGGG3’(SEQ ID NO61)类似地，用如下寡核苷酸，将终止密码子(TAG)和BgIII/XmaI位点工程改造入此cDNA的3’端5’CTG CCC CTT GGC TCA AAG TAG GAA GAT CTT CCC CCC GGG GGGGTG GTT CTG GCG GGG CTG3’(SEQ ID NO62)此终止密码子在编码胎盘比库蛋白序列的读框内，并在紧靠氨基酸残基170位赖氨酸后引起终止，从而编码了一缺失推定的跨膜结构域的截短的胎盘比库蛋白片断。分离了用Pst1和BglII消化的产物，并克隆入BacPac8载体中以表达胎盘比库蛋白片断(1-170)，其包含两个Kunitz结构域，但在紧靠推定的跨膜节段的N端被截断。
当感染后72小时收获培养基时，在感染复数1对1优化Sf-9昆虫细胞表达比库蛋白。收获后，加入Tris-HCl将杆状病毒细胞培养物上清液(2L)的pH调节至8.0。用5ml牛胰腺激肽释放酶亲和柱(如实施例7从胎盘纯化天然胎盘比库蛋白所述)层析纯化比库蛋白。用TFA将洗脱物质的pH调节至2.5，以1ml/分钟的流速，用10％乙腈(以0.1％TFA配)平衡C18反相柱(1.0×2.5cm)后，进行层析。用10％-80％线性梯度乙腈(以0.1％TFA配)洗脱比库蛋白40分钟。合并活性组分、冻干，重溶于50mM Hepes(pH7.5)、0.1M NaCl、2mM CaCl2和0.1％triton x-100中，-20℃储存直至使用。通过氨基酸分析测定重组比库蛋白的浓度。
结果使用以下的纯化程序从杆状病毒细胞培养上清液纯化重组比库蛋白，得到活性胰蛋白酶抑制剂(如下表8)。
表8从转化的培养物上清液纯化重组比库蛋白
用固定有牛胰腺激肽释放酶的亲和柱层析上进行粗制材料层析，选择性分离得到0.013％蛋白质，其存在0.67％胰蛋白酶抑制活性。在起始上清液中存在的大部分胰蛋白酶抑制活性不结合于固定的激肽释放酶，且与比库蛋白无关(没有显示结果)。随后用C18反相层析进行一步得到5倍纯化，回收率0.2％。SDS-PAGE证明最终制备物是高纯的(图13)，Mr为21.3kDa，在免疫印迹中能与兔抗胎盘比库蛋白102-159反应(未显示)。N端测序(26轮)得到预计的成熟胎盘比库蛋白的序列(图4F)，起始于残基+1(ADRER…)，显示该信号肽在Sf9细胞中已被正确加工。
使Sf9细胞的纯化胎盘比库蛋白(100pmol)吡啶基乙基烷基化，CNBr消化，然后未将得到的片断重溶解就进行测序。20轮测序得到如下的N-末端
所以回收得到了相应于各预计的四个片断的N-末端。这证实Sf9表达的蛋白质包含了胎盘比库蛋白(1-170)的整个胞外结构域序列。
实施例10纯化的Sf9细胞衍生的胎盘比库蛋白(1-170)的特异性抑制用实施例3、4和7所述的材料和方法测定了重组比库蛋白的体外特异性。另外，通过在含有50mM Tris(pH9.0)、50mM NaCl和0.01％triton x-100的缓冲液中培育0.35nM人组织激肽释放酶重组比库蛋白，测定了比库蛋白对人组织激肽释放酶的抑制作用。37℃5分钟后，加入5μl 2mMPFR-AMC，监测荧光的变化。
如下还测定了对组织血纤蛋白溶酶原激活剂(tPA)的抑制室温在20mMTris缓冲液(pH7.2)(含有150mM NaCl和0.02％叠氮钠)中，与抑制剂一起预培育tPA(从Sigma Chemical Co，St Louis，MO购得的人黑色素瘤细胞培养物得到的单链形式)2小时。随后将反应物转移到含有以下引发成分浓度的反应系统中以引发反应tPA(7.5nM)，抑制剂0-6.6μM，以28mM Tris缓冲液(pH8.5)配的Dile-Lpro-Larg-对硝基苯胺(1mM)，该缓冲液含有0.004％(v/v)triton x-100和0.005％(v/v)叠氮钠。37℃培育2小时后，经A405测定确定形成了对硝基苯胺。
下表显示了体外重组比库蛋白作为各种丝氨酸蛋白酶抑制剂的效果。将显示的数据与用重组比库蛋白或抑蛋白酶肽进行筛选抑制得到的数据相比较。
表9比较重组胎盘比库蛋白(1-170)或抑蛋白酶肽对各种蛋白酶抑制的Ki值
结果显示在昆虫细胞中可以表达重组比库蛋白，得到的活性蛋白酶抑制剂对至少五种不同的丝氨酸蛋白酶抑制剂有效。对人血浆激肽释放酶、胰蛋白酶和血纤蛋白溶酶而言，重组比库蛋白比抑蛋白酶肽更强。令人惊奇的是，对所有测试的酶重组比库蛋白比合成衍生的比库蛋白片断(7-64)和(101-159)更强。这些数据表明重组比库蛋白比抑蛋白酶肽更有效(用体外试验)，且可以预计其在体内效力更好。
除了测定对特定蛋白酶的效力外，还评估了胎盘比库蛋白(1-170)延长激活的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的能力，并与抑蛋白酶肽相关活性相比较。将抑制剂以20mM Tris缓冲液(pH7.2)(含有150mMNaCl和0.02％叠氮钠)稀释，加到MLA ElectraR800自动凝血时间血凝测定仪(Medical LaboratoryAutomation，Inc.，Pleasantville，N.Y.)所附带的比色杯中。将该装置设置到APTT模式，300秒激活时间及一式二份模式。然后自动将0.1ml血浆(特制试验参考用血浆批号1-6-5185，Helena Laboratories，Beaumont，TX)、APTT试剂(Automated APTT批号102345，由Organon Teknika Corp.，Durhan，NC提供)和25mM CaCl2加入以引发凝结，并自动监测凝结时间。结果(图14)显示两倍的凝结时间需要约2μM终浓度的抑蛋白酶肽，而只需要0.3μM Sf9产生的胎盘比库蛋白。这些数据表明胎盘比库蛋白是一种有效的抗凝剂，可用作药物来治疗包括病理性激活凝固内源路径等疾病。
实施例11测定豚鼠气道电位差本研究的目的是研究Kunitz丝氨酸蛋白酶抑制剂比库蛋白和钠通道阻断剂阿米洛利对豚鼠气道电位差(处理后3小时)的影响。将这些试剂以局部滴注法送递到向头侧气道。2小时后监测TPD 60分钟。本实施例所用流程的描述见Newton等人的“纤毛、粘液和粘液纤毛间的相互作用”，Baum，G.L.等人编辑，Marcel Dekker，New York，1998；Newton等人，Ped.Pulm，S17，Abs.364，1998)。
所用的材料和方法/试剂制备比库蛋白(1-170)(5和50μg/ml(SEQ ID NO52))(如下实施例17所述)和阿米洛利(由Sigma Chemical，St.Louis，MO，USA提供)(100μM)的含水制剂，无菌过滤，且在试验前进行内毒素测试。以Hank平衡盐溶液(HBSS)制备这些制剂，制剂含137mM NaCl、3mM KCl、3mM KH2PO4、8mM Na2HPO4、0.2％Tween-80(pH7.1)，无菌过滤，进行内毒素测试以用于本实施例。将HBSS用作对照溶液。从Janssen Animal Health得到Hypnorm(枸橼酸芬太尼0.315mg/ml和氟阿尼酮10mg/ml)，由Roche提供Hypnovel(Midazolam5mg/ml)。由David Hall，UK提供雄性Dunkin-Hartley豚鼠。由Kane-Mary Letd，UK提供热敏电阻探头。
进行麻醉并将比库蛋白送递到气管气道中用氟烷麻醉动物。一旦麻醉水平令人满意在下颌作一小切口。暴露气道，用针和注射器将100μl体积的载体、比库蛋白(0.5μg或5μg)或阿米洛利(100μM)滴注到气道表面。一旦注射完，用Vetbond(氰基cacrylate组织胶)将皮肤切口封闭。然后让动物复苏。
准备豚鼠用于测定气道电位差给予试剂后2小时，用Hypnom和Hypnovel第二次麻醉豚鼠，并将它们固定于仰卧位置。用热敏电阻探头测定直肠温度，并人工调节加热灯将肛温维持在37℃。从下颌到锁骨作一腹侧面中线切口。用钝器解剖法暴露气道的长度，并在胸骨上缘对切二等分。暴露外颈静脉并插入导管。然后在气道的尾部插入导管让动物能自发地呼吸室内空气。然后将动物仰卧，用加热灯维持动物的体温。肌内麻醉后20分钟，将气道琼脂电极插入向头侧的气道，测定气道电位差60分钟。
结果如图15所示，相对于运载体而言，用比库蛋白(5μg)体内处理后3小时，比库蛋白抑制了豚鼠气道的电位差。显示阿米洛利(100μM)和比库蛋白(0.5μg)的效果以进行比较。
实施例12比库蛋白对豚鼠气道粘液速度的影响本研究的目的是研究Kunitz家族丝氨酸蛋白酶抑制剂比库蛋白对豚鼠气道粘液速度的作用(处理后1.5小时)。通过局部滴注将该试剂送递到向头侧气道中。1.5小时后监测TMV60分钟。本实施例所用流程的描述见Newton等人的“纤毛、粘液和粘液纤毛间的相互作用”，Baum，G.L.等人编辑，MarcelDekker，New York，1998；Newton等人，Ped.Pulm，S17，Abs.364，1998)。
所用的材料和方法/试剂以HBBS(含有137mM NaCl，3mM KCl，3mM KH2PO4，8mM Na2HPO4，0.2％Tween-80，pH7.1)制备比库蛋白(1-170)制剂。无菌过滤该制剂，在用于本实施例之前进行内毒素测试。将HBSS用作对照溶液。从Janssen Animal Health得到Hypnorm(枸橼酸芬太尼0.315mg/ml和氟阿尼酮10mg/ml)，由Roche提供Hypnovel(Midazolam 5mg/ml)。由David Hall，UK提供雄性Dunkin-Hartley豚鼠(550-750克)。由Kane-Mary Letd，UK提供热敏电阻探头。
进行麻醉并将比库蛋白送递到气道用氟烷麻醉动物。一旦麻醉水平令人满意在下颌作一小切口。暴露气道，用针和注射器将100μl体积的运载体、比库蛋白(5μg)滴注到气道表面。一旦注射完，用Vetbond(氰基cacrylate组织胶)将皮肤切口封闭。然后让动物复苏。
测定气道粘液速度(TMV)用铅准垂直校准的β微粒探测器探头监测TMV，安置该探头探测注入的等分32P-标记的酿酒酵母菌发射的放射性(当将其移到被麻醉的豚鼠的气道粘液纤毛层时)(Newton和Hall 1998)。图16(a)显示注射器和β探头的配置。图16(b)显示当将32P标记的酿酒酵母移到气道粘液纤毛层时，该探头所测到的计数。
滴注比库蛋白后70分钟，用Hypnom和Hypnovel第二次麻醉各动物，并将它们固定于仰卧位置。20分钟后进行第一次TMV测定。随后每15分钟测定一次。TMV测定流程的描述详见Newton等人的“纤毛、粘液和粘液纤毛间的相互作用”，Baum，G.L.Preil，Z.，Roth，Y.，Liron.，Ostfield，E.，Marcel Dekker.New York，1990和Newton等人，“儿科肺学”，S17，Abs364，1998。
结果如图16(c)所示，在给药后1.5到2.5小时的持续过程中，相对于盐水，比库蛋白(5μg)增加了豚鼠体内的TMV。
实施例13比库蛋白降低了体外培养的人支气管上皮(HBF)细胞短环电流(Isc)中的钠流将生长至汇合(confluence)的第三代HBE细胞单层固定在改进的Ussing室内，浸泡在Krebs缓冲液(KBR)中，用95％O2/5％CO2吹气，升温至37℃。
在校准背景嘈音和流体阻力之前，将细胞平衡20分钟。然后用WPI EVC 4000电压夹板将透上皮电位差夹在0mV。用Ag/AgCl电极监测Isc。一旦实现基线稳定(通常为10-20分钟)，用阿米洛利(10μM)处理细胞。一旦观察到对阿米洛利的反应，就用KBR溶液将其洗涤掉。回到基线并平衡，加入比库蛋白(1-170)(如下实施例17所述)(0.5-50μg/ml，以PBS配)或PBS对照。用试剂处理后90分钟，加入阿米洛利(10μM)。一旦电流稳定，加入毛喉萜(10μM)，然后加入丁尿胺(100μM)。
结果如图17所示，在90分钟的过程中，比库蛋白(70nM)抑制了体外人支气管上皮细胞中的钠流。毛喉萜诱导的cAMP介导的氯分泌和单层阻力未受影响。
实施例14高渗盐水对豚鼠TMV的影响本对比研究的目的是研究高渗盐水(14.4％×5分钟)对豚鼠气道粘液速度的影响。用气雾剂将此试剂送入向头侧气道。立即监测TMV，每15分钟一次监测30分钟。本实施例所用流程的描述见Newton等人的“纤毛、粘液和粘液纤毛间的相互作用”，Baum，G.L.等人编辑，Marcel Dekker，New York，1998；Newton等人，Ped.Pulm，S17，Abs.364，1998)。
所用的材料和方法/试剂从Janssen Animal Health得到Hypnorm(枸橼酸芬太尼0.315mg/ml和氟阿尼酮10mg/ml)，由Roche提供Hypnovel(Midazolam 5mg/ml)。由HarlanUK Ltd.提供雄性Dunkin-Hartley豚鼠(550-750克)。由Kane-Mary Letd，UK提供热敏电阻探头。
测定气道粘液速度用Hypnorm和Hypnovel麻醉动物。用铅准垂直校准的β微粒探测器探头监测TMV，安置该探头探测注入的等分32P-标记的酿酒酵母菌发射的放射性(当将其移到被麻醉的豚鼠的气道粘液纤毛层时)(Newton和Hall 1998)。
给药后20分钟进行第一次TMV测定(第一次)。随后每15分钟进行一次测定。在第二次测定前6分钟时，喷雾5分钟给予盐水(0.9％)或高渗盐水(14.4％)。通过气道上作的0.5μm孔给予放射标记的示踪颗粒。用Pari压力喷雾器产生乙醚盐水(0.9％)或高渗盐水(14.4％)气溶胶。在第二次测定前1分钟关闭气溶胶。所述的TMV测定流程详见Newton等人的“纤毛、粘液和粘液纤毛间的相互作用”，Baum，G.L.Preil，Z.，Roth，Y.，Liron.，Ostfield，E.，MarcelDekker编辑.New York，1990和Newton等人，“儿科肺学”，S17，Abs364，1998。
结果如图18所示，用气雾剂后，高渗盐水(14.4％×5分钟)立即引起了TMV的瞬时增加。
实施例15阿米洛利对豚鼠TMV的影响本研究的目的是研究阿米洛利(10mM×20分钟)对麻醉的、自发性呼吸的豚鼠的气道粘液的影响。如实施例14所述，通过气雾化将该试剂送入向头侧气道。本实施例所用的TMV测定流程的描述见Newton等人的“纤毛、粘液和粘液纤毛间的相互作用”，Baum，G.L.等人编辑，Marcel Dekker，NewYork，1998；Newton等人，儿科肺学S17，Abs.364，1998)。
所用的材料和方法/试剂在本实施例中，用水制备了阿米洛利制剂(10mM)。从Janssen AnimalHealth得到Hypnorm(枸橼酸芬太尼0.315mg/ml和氟阿尼酮10mg/ml)，由Roche提供Hypnovel(Midazolam 5mg/ml)。由Harlan，UK Ltd.提供雄性Dunkin-Hartley豚鼠(550-750克)。由Kane-Mary Letd，UK提供热敏电阻探头。
气道粘液速度的测定用Hypnorm和Hypnovel麻醉动物。用铅准垂直校准的β微粒探测器监测TMV，安置探头探测由注入的等分32P-标记的酿酒酵母菌发射的放射性(当将其转移到被麻醉的豚鼠的气道粘液纤毛层时)(Newton和Hall 1998)。在0时用Hypnorm和Hyponovel麻醉豚鼠。通过气雾剂给予阿米洛利(10mM×20分钟)。然后立即进行第一次TMV测定，随后每15分钟进行一次测定。
结果如图19所示，在喷雾后5分钟，阿米洛利(10mM×20分钟)引起了TMV有统计学意义的增加。
实施例16抑蛋白酶肽双突变蛋白降低了培养的人支气管上皮(HBE)细胞的短环电流(Isc)本研究的目的是研究Kunitz家族丝氨酸蛋白酶抑制剂抑蛋白酶肽双突变蛋白体外对Isc的影响。将生长至汇合(confluence)的第三代HBE细胞单层固定在改进的Ussing室内，浸泡在Krebs缓冲液(KBR)中，用95％O2/5％CO2吹气，升温至37℃。抑蛋白酶肽双突变蛋白是Des Pro2-Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑蛋白酶肽，见EP 821007的实施例1中的描述(于1998年1月28日公开)，本文将其全部纳入作为参考。
在校准背景嘈音和流体阻力之前，将细胞平衡20分钟。然后用WPI EVC 4000电压夹板将透上皮电位差夹在0mV。用Ag/AgCl电极监测Isc。一旦实现基线稳定(通常为10-20分钟)，用阿米洛利(10μM)处理细胞。一旦观察到对阿米洛利的反应，就用KBR溶液将其洗涤掉。回到基线并平衡，加入比库蛋白(5μg/ml)、抑蛋白酶肽双突变蛋白(0.5到5μg/ml)、抑蛋白酶肽(1.5到5μg/ml)或PBS对照。试剂处理后90分钟，加入阿米洛利(10μM)。
结果如图20所示，在90分钟的过程中抑蛋白酶肽双突变蛋白(0.5到5μg/ml)剂量依赖性地抑制了体外人支气管上皮细胞中的钠流。
实施例17在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达的胎盘比库蛋白(1-170)的表达、纯化和蛋白酶抑制剂活性的比较(a)开发稳定的、高产地表达比库蛋白的CHO细胞系用图27所示的表达载体转染CHO(dhfr-)细胞，开发了分泌大量比库蛋白的稳定的生产细胞系。用标准重组DNA技术构建此载体。可以在发明人SamChan于1999年11月12日申请的题为“产生糖基化比库蛋白的方法”的U.S.S.N.09/441,654中找到对构建表达载体和CHO细胞表达系统的描述。简单地说，表达载体pBC-BK的构建可通过将比库蛋白cDNA克隆于紧接巨细胞病毒立即早期启动子的下游和聚腺苷信号序列的上游。此表达载体pBC-BK由比库蛋白的转录组件、二氢叶酸还原酶和氨苄青霉素抗性构成。通过限制性内切酶从此克隆载体中释放出比库蛋白cDNA，将其平头，连接到线性化的pBC中。pBC的线化是通过用一限制性内切酶消化完成的。测序确认比库蛋白cDNA的方向。
按制造商的说明，通过Lipofectin试剂(Life Technology，Bethesda，Maryland)用10μg pBC-BK转染约1×106CHO(中国仓鼠卵巢)细胞。然后在50nM氨甲蝶呤存在下筛选细胞，在无胸苷和次黄嘌呤的DME/F12培养基(加入5％透析过的胎牛血清)中培养。用显色试验筛选细胞的比库蛋白产物。简单地说，将比库蛋白标准品或培养液连续稀释，37℃与等体积的激肽释放酶培养30分钟，然后加入显色底物N-苯甲酰基-Pro-Phe-Arg-pNA。培育此反应物15分钟，随后加入50％乙酸。在405nM测定释放出的对-硝基酰苯胺的量。在含有递增浓度的氨甲蝶呤(100到400nM氨甲蝶呤)的培养基中进一步筛选高产细胞群，以筛选产生比库蛋白。然后应用有限稀释克隆来衍生具有高和稳定产量的克隆。用标准组织培养技术，在缺少氨甲蝶呤时，于96孔板上每孔1个细胞进行克隆。选出一命名为FD3-1的克隆，在生物反应器中进行产量评估，该克隆于1999年11月12日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，命名为专利保藏号PTA-940。
(b)在灌流生物反应器中无血清生产比库蛋白用连续灌流发酵进行比库蛋白的连续生产。在1.5升Wheaton发酵器中以2×106个细胞/ml接种稳定的CHO细胞系，以0.5升/天的交换速率灌流。生产培养基是DME/F12-基培养基，补充有胰岛素(10μg/ml)和FeSO4·EDTA(50μM)。将细胞密度维持在4×106个细胞/ml。发酵器每天的平均收率为～20mg/天。比库蛋白的产物可稳定维持21天。
(c)对CHO细胞表达系统产生的比库蛋白(1-170)的纯化用标准层析方法，包括图29所列出的离子交换、金属螯合和大小排阻层析，纯化了CHO细胞产生的比库蛋白。
用快速流动的SP-琼脂糖(Pharmacia)准备SP柱(18×40cm，2.5L)，并平衡。冷过滤的CHO细胞收获物用冷无菌水以1∶2.5稀释，将pH调节至5.0。室温用冷缓冲液进行层析。将冷起始原料以800ml/分钟(189cm/小时)速度加样到该柱上。加样到该柱上的比库蛋白量范围为0.888-1.938g(约14mg/L)。加样后，用平衡缓冲液洗涤该柱，用洗脱缓冲液洗脱比库蛋白。在2-8℃(冰浴)中收集洗脱物，并用6N NaOH立即将pH调节至7。洗涤柱，用冷(2-8℃)1N NaOH消毒，保存于2-8℃的20％乙醇中直至使用。平衡和洗涤缓冲液含有50mMNaCl、30mM NaH2PO4，pH5.0；洗脱缓冲液含350mM NaCl、30mM NaH2PO4pH5.0；pH调节缓冲液是1M柠檬酸、1M NaH2PO4，pH2.4。
超滤(UF)浓缩解冻的SP-琼脂糖洗脱物约10倍，以减少体积，然后进行5到7倍渗滤(DF)以准备上阴离子交换层析。所有操作都在室温、水平流超净台中进行。UF/DF使用了Millipore(Bedford，MA)的Pellicon 2“迷你”过滤系统和双10kDa再生纤维素柱(P2C010C01)。该双柱系统的流通速率约为130±20ml/分钟，并通过将输入和输出压力分别调节到22-26psi和12-16psi之间来维持。用蠕动泵进行循环；在跨膜压力调节前将循环设置在500到600ml/分钟。用冷10mM NaH2PO4缓冲液(pH8.1)进行渗滤。
如下进行Q-琼脂糖柱层析。用5倍柱体积(CV)的无菌水洗涤13×9cm，1.2L体积的Q-琼脂糖快速流动柱(Pharmacia)，用约10倍CV的平衡缓冲液平衡。将渗滤的SP洗脱物调节至pH8.1，并以100ml/分钟(45cm/小时)加样到Q-琼脂糖柱上。加样到该柱上的比库蛋白的量范围为1121-2607mg(约15mg/ml)。加样后，用平衡缓冲液洗涤该柱，直至A280的UV吸光度达到基线；然后将比库蛋白洗脱。收集洗脱物，作为Zn-IMAC(固定锌的金属离子吸附层析)的进样原料。用1M NaOH洗涤该柱，用无菌水淋洗，保存在20％乙醇中。所有操作都在2-8℃进行。用于Q-琼脂糖柱的平衡和洗涤缓冲液含有10mMNaH2PO4，pH为8.1。洗脱缓冲液含有10mM NaH2PO4、100mMNaCl，pH为8.1。
含大约200ml螯合快速流琼脂糖的流床体积的Zn-IMAC柱(5×10cm)(Pharmacia)用3体积ZnSO4溶液(如下)加料；用2体积无菌水洗涤，用6体积缓冲液(如下)平衡。将Q-琼脂糖洗脱物调节至pH7.4，以30ml/分钟(92cm/小时的线性速度)速度将300mM NaCl(通过加入NaCl固体)加入Zn-IMAC中，然后用平衡缓冲液洗涤该柱直到UV吸光度达到基线。加到该柱的比库蛋白量的范围为0.097-1.681g(约0.63mg/ml)。收集流穿液和洗液用于UF。解吸附该柱，用0.5M NaOH消毒。该步骤的所有操作都在2-8℃进行。Zn-IMAC的平衡缓冲液含有10mM NaH2PO4、300mM NaCl、pH7.4；解吸缓冲液含有50mM EDTA、10mM NaH2PO4、300mM NaCl、pH7.4；加料溶液含有2mg/ml ZnSO4·7H2O。
用Sephacryl S-200层析的Pellicon 2系统(Millipore)5倍超滤浓缩Zn-IMAC流穿物。渗流速率约为60-70ml/分钟，且如上所述地维持。以400-500ml/分钟再循环。用137mM NaCl、2.7mM KCl、2.9mM KH2PO4、10mM NaH2PO4、8mM Na2HPO4、2mg/L Tween 80、pH7.2平衡含有4.59L Sephacaryl S-200 HighResolution(Pharmacial)的柱(10×58.5cm)。流速为30ml/分钟(23cm/小时)。在一典型运作中，将含有1475mg比库蛋白的95ml体积的溶液加到该柱中。
以分批模式用Etox树脂处理-S-200后的合并物，以除去任何潜在的热源。用1M NaOH洗涤ActiClean Etox，2705树脂(Sterogene Bioseparations，Inc)，室温在1M NaOH中搅拌培育5小时。用PBS(pH7.2)洗涤该树脂并平衡。将80ml过滤过的和平衡过的树脂加到1063ml比库蛋白S200合并物(5460.11mg)中，2-8℃搅拌过夜。用0.2微米的Nelgene细瓶过滤器过滤除去ETOX树脂。
结果表10列出了各步骤的平均收率。
表10
比库蛋白的总收率约为30％，纯度为95％。质谱数据表明在纯蛋白质合并物中除了全长比库蛋白(1-170)分子外，存在比库蛋白(1-170)的羧基端缺少三个氨基酸(G-S-K)和缺少四个氨基酸(L-G-S-K)的品种。当在室温或37℃(中性pH)培育72小时时，这些产生的物质表现稳定不降解。N端测序、凝胶电泳、免疫印迹和氨基酸分析表明该比库蛋白是基本纯的(没有测到其他序列)。其他反相测序步骤表明CHO-衍生的纯化的比库蛋白依旧能被组分成几个品种(图30A)。用三氟乙酸(TFA，终浓度为0.1％)将CHO比库蛋白(8.5mg)调节至pH2.5，并以2ml/分钟的流速在17.5％乙腈和0.1％TFA平衡的C18反相柱(Vydac，2.5×25cm)上层析。用线性梯度的17.5-40％乙腈(以0.1％TFA配)洗脱CHO比库蛋白60分钟。图30B显示这些组分的银染色SDS-PAGE图(54和55之间的泳道代表分子大小标记物)。
在糖基化的同工型CHO比库蛋白(MW范围约为21kDa到约38kDa)上进行初步碳水化合物分析。发现总糖含量为7.5％。发现两个N-连接的位点(Asn-30和Asn-67)都被碳水化合物结构所占据。层析和质谱分析证实存在非常异源的高度分支的寡核苷酸结构，其导致纯化的比库蛋白所观察到的大小异源性。约90％寡糖是唾液酸化(sialylated)的，其余的结构为中性。当用N-糖苷酶F处理时，CHO比库蛋白的糖基化同工型(图30)转化成一种18kDa同工型(见图31)。
在带帽的微型离心管(microfuge)中，与15mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)配的唾液酸酶一起培育18小时，分析了比库蛋白的唾液酸含量。以1ml/分钟的流速，在Carbo Pac PAl阴离子交换柱上，用20-250mM乙酸钠缓冲液梯度(在100mM NaOH中)分离唾液酸50分钟。用脉冲电化学探测器进行探测，并将样品的保持时间和峰面积与标准唾液酸(N-乙酰神经氨酸和N-戊二酰神经氨酸)相比。表11列出了结果。
表11比库蛋白的唾液酸组成
实施例18比较中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达的胎盘比库蛋白(1-170)的蛋白酶抑制剂活性概述.用实施例3、4、7和10所述的材料和方法测定了重组比库蛋白的体外特异性。下表12显示重组比库蛋白作为各种不同丝氨酸蛋白酶抑制剂的体外效果。所显示的数据是用重组比库蛋白或抑蛋白酶肽作的试验。
蛋白酶.如上所述(Chase，T.，和Shaw，E.，(1970)Methods Enzmol.19，20-27)，用对-硝基苯基p’-胍基苯甲酸酯HCl，通过活性位点滴定进行了人血纤蛋白溶酶和人血浆激肽释放酶的定量测定。用牛抑蛋白酶肽作为标准品、PFR-AMC为底物(采取1∶1复合物形式)，通过活性位点滴定对人组织激肽释放酶(Bayer，Germany)定量。在所用条件下，血纤蛋白溶酶与GPK-AMC的Km为726μM；人血浆激肽释放酶与PFR-AMC的Km为457μM；人组织激肽释放酶与PFR-AMC的Km为5.7μM。
抑制动力学在含有50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.1M NaCl和0.02％tritonx-100的缓冲液中，用血纤蛋白溶酶(50pM)和CHO表达的胎盘比库蛋白(1-170)(0-2nM)或抑蛋白酶肽(0-4nM)，测定了CHO表达的胎盘比库蛋白(1-170)和抑蛋白酶肽对人血纤蛋白溶酶的抑制。37℃培育30分钟后，加入25μl 20mMGPK-AMC，监测荧光的变化。在50mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM NaCl和0.02％triton x-100中，用激肽释放酶和CHO表达的胎盘比库蛋白(1-170)(0-4nM)或抑蛋白酶肽(0-45nM)，测定了CHO表达的胎盘比库蛋白(1-170)或抑蛋白酶肽对人血浆激肽释放酶的抑制。37℃30分钟后，加入5μl 20mM PFR-AMC，监测荧光的变化。
在含有50mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)、50mM NaCl和0.1％triton x-100的1ml反应体积中，与CHO表达的胎盘比库蛋白(1-170)(0-10nM)或抑蛋白酶肽(0-0.5nM)一起培育0.35nM人组织激肽释放酶，测定了抑蛋白酶肽或CHO表达的胎盘比库蛋白(1-170)对人组织激肽释放酶的抑制。37℃5分钟后，加入2mM PFR-AMC，达到终浓度10μM，监测荧光的变化。
在含有50mM Hepes(pH7.5)、100mM NaCl、2mM CaCl2、0.01％triton x-100和1％BSA的总体积为1ml的缓冲液中，与0-40nM CHO表达的胎盘比库蛋白(1-170)或0-4μM抑蛋白酶肽一起培育FXIa(0.1nM)，测定了对因子Xia(由Enzyme Research Labs，South Bend，IN提供)的抑制。37℃30分钟后，加入10μl 40mM Boc-Glu(Obzl)-Ala-Arg-AMC(Bachem Biosciences，King ofPrussia，PA)，监测荧光的变化。
用非线性回归数据分析程序Enzfitter软件(Biosoft，Cambridge，UK)确定了表观抑制常数Ki*。用紧密结合抑制剂方程式的形式，分析了各试验的动力学数据Vi/Vo＝1－(Eo＋Io＋Ki*－[(Eo＋Io＋Ki*)2－4EoIo]1/2)/2Eo(2)式中Vi/Vo是酶活性分数(抑制对未抑制的比例)，Eo和Io分别是酶和抑制剂的总浓度。按以下方程式校正底物的作用得到Ki值Ki＝Ki*/(1＋[So]/Km(3)(Boudier，C.，和Bieth，J.G.，(1989)Biochim Biophys Acta.99536-41)。
结果下表12列出了Ki值。
表12.比较CHO比库蛋白(1-170)或抑蛋白酶肽对各种蛋白酶抑制的Ki值
结果显示CHO细胞可表达的重组比库蛋白，能得到活性蛋白酶抑制剂对至少三种不同丝氨酸蛋白酶有效。对人血浆激肽释放酶和人FXIa而言，重组比库蛋白比抑蛋白酶肽更强。对抑制人血纤蛋白溶酶而言其与抑蛋白酶肽相当。
实施例19抑蛋白酶肽降低体外培养的人囊性纤维变性支气管上皮细胞短环电流(Isc)中的钠流从CF患者的肺移植组织中分离出HBE细胞，并在涂有胶原的烧瓶中培养1星期。然后传代细胞，接种在涂有胶原的Costar Transwell滤器(0.33cm2)上，在补充有2％Ultroser G的DMEM/F12培养基中培养。细胞在气液界面生长，接种后2-4周使用。
将Transwell滤器上的细胞固定到改进的Costar Ussing室中，在Isc条件下进行研究。记录(0-10分钟)基线Isc值，然后将抑蛋白酶肽(1mg/ml，以PBS配)加入到顶面。记录Isc100分钟，用新鲜缓冲液替换顶部浴液。将胰蛋白酶(100BAEE单位/ml)加到顶面，记录Isc10分钟。然后将阿米洛利(10μM)加到顶部，再记录Isc10分钟。
结果如图21所示，抑蛋白酶肽(1mg/ml，以PBS配)抑制了体外人CF支气管上皮细胞中的Isc100分钟。洗涤后，用丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶处理顶表面增加了Isc。最后，加入阿米洛利(10μM)表明Isc的变化是钠流变化造成的。
实施例20喷雾后评估比库蛋白(1-170)的活性本研究的目的是评估喷雾后实施例17所述的比库蛋白(1-170)的抗蛋白酶活性。所有研究都是用磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)(137mM NaCl、3mM KCl、3mMKH2PO4、8mM Na2HPO4、0.02g/L Tween 80)配制的比库蛋白进行的。
喷雾的方法Raindrop药物喷雾器以1和3mg/ml浓度将比库蛋白制成气溶胶。用2.5ml比库蛋白溶液填满喷雾器杯。以7.35L/分钟或35psi下进行气溶胶化。
Collison喷雾器以4.7mg/ml浓度将比库蛋白制成气溶胶。用2.5ml比库蛋白溶液填满喷雾器杯。在35psi下进行气溶胶化。
收集喷雾的样品用双重撞击器(在60L/分钟的系统中平均空气动力颗粒截留尺寸为6.4μm)收集气溶胶化的比库蛋白。该撞击器的工作原理是液体撞击和将气雾分成不能吸入的成分(在阶段1收集的成分，＞6.4μm)和可吸入的成分(在阶段2收集的成分，＜6.4μm)。
抗蛋白酶活性的测定比库蛋白活性的测定是体外通过其对人血浆激肽释放酶的抑制测定的。
结果Raindrop药物喷雾器喷雾化前和后样品活性(Ki)值如下1mg/ml比库蛋白Ki值分别为0.47(±0.02)和0.76(±0.04)；对3mg/mlBB(1-170)的Ki值分别为0.52(±0.03)和0.62(±0.03)。
Collison喷雾器喷雾化前和后样品的活性(Ki)值分别为0.27(±0.03)和0.45(±0.03)。
结论Raindrop和Collison喷雾器喷雾化之前和之后的比库蛋白样品表现出相似活性(试验变化中的Ki值类似)，表明比库蛋白(1-170)对气溶胶化稳定，且在喷雾化后保留了其抗蛋白酶活性。
实施例21比库蛋白对羊气道粘液速度的作用本研究的目的是研究实施例17所述的Kunitz家族丝氨酸蛋白酶抑制剂比库蛋白(1-170)对羊气道粘液速度的作用(在处理后8小时的过程中)。通过喷雾式气溶胶给药将此试剂送入气道。本实施例所用流程的描述见O’Riordan等人，J.Applied Physiol.85(3)，1086-1091，1998。
TMV的测定将成年羊限制在直立位置，将它们的头固定在特殊的身体套具中。在它们的鼻内插入气道内导管，封套(cuff)置于声带正下面。加热和润湿吸入的空气。为了最大程度减少充气封套可能造成的TMV损伤，除气雾给药期间外，在整个研究过程中抽掉气道内管封套的气。
为了测定TMV，通过气道内导管中所安置的导管将5-10个不透射线的Teflon颗粒(约1mm直径，0.8mm厚，1.5-2mg重量)吹入气道。然后在1分钟过程中测定Teflon颗粒的运动。本实施例所用流程的描述见Russi等人，J.Applied Physiol.59(5)，1416-1422，1985。将包含已知长度的不透射线标记物的套环用于动物的外部，用作将颗粒在电视屏幕上穿程距离转化成精确移动距离的标准。根据每分钟5-10个Teflon颗粒在向头侧移动的平均距离，计算出TMV。在给予气溶胶之前立即测定基线TMV。
测试底物PBS、以PBS配的1mg/ml比库蛋白、或以PBS配的3mg/ml比库蛋白；将Raindrop喷雾器产生的气溶胶(3ml)送入羊的气道，以能产生中等质量空气动力学直径为3.6μm的滴液的流速进行。在给予测试底物(0小时)后立即测定TMV，然后在第0.5、1、2、3、4、5、6、7和8小时测定。
结果如图22所示，送入羊气道的9mg比库蛋白气溶胶(3ml 3mg/ml)明显增加了第0、0.5、3、4、5、6、7和8小时的TMV(与接受PBS载体气溶胶的动物组的相同时间点相比)。在第24小时，比库蛋白和PBS载体处理组中TMV都回复到基线速度。
在较低的剂量(3mg比库蛋白气溶胶(3ml 1mg/ml))，在任何研究的时间点处理组和载体组间TMV没有观察到明显的差异。
实施例22比库蛋白(50μg/ml)降低培养的豚鼠气道上皮(GPTE)细胞短环电流(Isc)中的钠流本研究的目的是研究比库蛋白(1-170)(见实施例17)对体外GPTE细胞的Isc的作用。将GPTE细胞接种在1.2cm直径、0.4μm孔径的SnapwellTM衬垫(Costar UK)上。在置于气液界面后2-4天后，细胞生长至汇合，固定到改进的Ussing室中。将衬垫浸泡在Kerbs缓冲液(KBR)中，用95％O2/5％CO2鼓气(升温至37℃)。
平衡20分钟后，用WPI EVC 4000电压夹板将透上皮电位差夹在0mV。用Ag/AgCl电极监测Isc。一旦实现基线稳定(通常为20-30分钟)，用阿米洛利(30μM)处理细胞。一旦观察到对阿米洛利的反应，就用KBR溶液将其洗涤掉。回到基线并平衡，加入如实施例17所述的比库蛋白(1-170)(10-50μg/ml)或PBS。试剂处理后30分钟，加入阿米洛利(30μM)。
结果如图23所示，比库蛋白(1-170)(50μg/ml)抑制了体外豚鼠气道上皮细胞中的钠流30分钟。
实施例23比库蛋白(1-170)(100μg/ml)降低培养的绵羊气道上皮(OTE)细胞短环电流(Isc)中的钠流本研究的目的是研究比库蛋白(1-170)(见实施例17)对体外OTE细胞中Isc的作用。将GPTE细胞接种在1.2cm直径、0.4μm孔径的SnapwellTM衬垫(Costar UK)上。在置于气液界面后3-5天后，细胞生长至汇合，固定到改进的Ussing室中。将衬垫浸泡在Kerbs缓冲液(KBR)中，用95％O2/5％CO2鼓气(升温至37℃)。
平衡20分钟后，用WPI EVC 4000电压夹板将透上皮电位差夹在0mV。用Ag/AgCl电极监测Isc。一旦实现基线稳定(通常为30分钟)，用阿米洛利(10μM)处理细胞。一旦观察到对阿米洛利的反应，就用KBR溶液将其洗涤掉。回到基线后，加入如实施例17所述的比库蛋白(1-170)(25、50或100μg/ml)或PBS。试剂处理后90分钟，加入阿米洛利(10μM)。
结果如图24所示，比库蛋白(1-170)(100μg/ml)明显抑制了体外绵羊气道上皮细胞中的钠流90分钟。
实施例24比库蛋白(1-170)对用LPS预处理的豚鼠中气道电位差的作用通常多形核(PMN)白细胞(嗜中性白细胞)占优势的气道炎症是CF肺病的特征。在豚鼠，与大肠杆菌脂多糖(LPS)气雾剂接触，诱导了明显的PMN流入支气管肺泡洗液(攻击后24小时)。本研究的目的是研究权利要求17所述的比库蛋白(1-170)对预接触过PLS气雾剂的豚鼠气道电位差的作用。通过局部滴注将该试剂送入向头侧气道。与LPS接触后23小时，监测TPD60分钟。
材料/试剂以Hank平衡盐水溶液(HBSS)配制比库蛋白(1-170)。从Sigma Chemicals得到阿米洛利，并以HBSS配制。HBSS作为载体对照。从Janssen Animal Health得到Hypnorm(枸橼酸芬太尼0.315mg/ml和氟阿尼酮10mg/ml)，由Roche提供Hypnovel(Midazolam 5mg/ml)。由Harlan，UK提供雄性Dunkin-Hartley豚鼠。由Kane-Mary Ltd，UK提供热敏电阻探头。
PMN流入的诱导使各动物与0.03mg/ml LPS或PBS气溶胶接触10分钟。
准备豚鼠用于测定气道电位差在LPS处理后23.4小时，用Hypnorm和Hypnovel麻醉豚鼠，且将它们固定于仰卧位置。从下颌到锁骨作一腹侧面中线切口。用钝器解剖法暴露气道的长度，并在胸骨上缘对切二等分。暴露外颈静脉并插入导管。然后在气道的尾部插入导管让动物能自发地呼吸室内空气。然后将动物仰卧，并人工调节加热灯将体温维持在37℃。用热敏电阻探头监测直肠温度。
肌内麻醉后20分钟，将比库蛋白(50μg/ml)或阿米洛利(100μM)局部滴注入向头侧气道。然后将气道琼脂电极插入向头侧气道，测定气道电位差60分钟。将参比电极置于向头侧气道下与气道软骨接触。覆盖伤口以防止干燥。
结果如图25(a)所示，接触LPS，使PMN明显流入。如图25(b)所示比库蛋白明显抑制了预先接触LPS的豚鼠的电位差。
实施例25抑蛋白酶肽双突变蛋白对豚鼠气道粘液速度的作用本研究的目的是研究实施例16所述的抑蛋白酶肽双突变蛋白对豚鼠气道粘液速度的作用(处理后1.5小时)。通过局部滴注将该试剂送入向头侧气道。1.5小时后监测TMV60分钟。
材料/试剂从Biotechnologie，Bayer AG，Germany USA得到抑蛋白酶肽双突变蛋白(见实施例16)，并用Hank平衡缓冲液(HBSS)配制。从Janssen Animal Health得到Hypnorm(枸橼酸芬太尼0.315mg/ml和氟阿尼酮10mg/ml)，由Roche提供Hypnovel(Midazolam 5mg/ml)。由Harlan，UK提供雄性Dunkin-Hartley豚鼠。由Kane-Mary Ltd，UK提供热敏电阻探头。
进行麻醉用氟烷麻醉动物。一旦麻醉水平令人满意在下颌作一小切口。暴露气道，用针和注射器将100ml体积的载体或抑蛋白酶肽双突变蛋白(10μg)注射到气道腔内。一旦注射完，就修补气道注射位置上的皮肤。然后让动物复苏。
气道粘液速度的测定用铅准垂直校准的β微粒探测器监测气道粘液速度(TMV)，安置探头探测注入的等分32P一标记的酿酒酵母菌发出的放射性(当将其移到被麻醉的豚鼠的气道粘液纤毛层时)(Newton和Hall 1998)。滴注测试试剂后70分钟，用Hypnorm和Hypnovel第二次麻醉豚鼠，并将它们固定于仰卧位置。20分钟后进行第一次TMV测定。
结果如图26所示，在给药后1.5到2.5小时的持续过程中，相对于HBSS，抑蛋白酶肽双突变蛋白(10μg)增加了豚鼠体内的TMV。
实施例26比库蛋白(1-170)降低体外培养的人囊性纤维变性支气管上皮细胞短环电流(Isc)中的钠流从CF患者的肺移植组织中分离出HBE细胞，并在涂有胶原的烧瓶中培养1星期。然后传代细胞，接种在涂有胶原的Costar Transwell滤膜(0.33cm2)上，在补充有2％Ultroser G的DMEM/F12培养基中培养。细胞在气液界面生长，接种后2-4周使用。
将Transwell滤膜上的细胞固定到改进的Costar Ussing室中，在Isc条件下进行研究。记录(0-10分钟)的基线Isc值，然后将比库蛋白(1-170)(见实施例17)(10μg/ml，以PBS配)加到顶面。记录Isc90分钟，然后加入阿米洛利(10μM)，再记录Isc10分钟。用新鲜缓冲液替换顶部浴液，再记录Isc15分钟。将胰蛋白酶(1μM)加到顶面，记录Isc15分钟。然后将阿米洛利(10μM)加到顶部，再记录Isc10分钟。
结果如图28(a)所示，比库蛋白(1-170)(10μg/ml，以PBS配)抑制了体外人CF支气管细胞中的Isc 90分钟。加入阿米洛利(10μM)后进一步降低了Isc。洗涤后，Isc增加返回到加入阿米洛利之前所达到的电流。15分钟后，用胰蛋白酶(1μM0处理顶面，这进一步将Isc增加至基线电流水平(即在20分钟所观察到的)。最后，加入阿米洛利(10μM)抑制了大部分电流，表明Isc的变化是钠电流变化造成的。
图28(b)显示顶部给予体外人CF支气管上皮细胞后90分钟，1、5和10μg/ml的比库蛋白(1-170)和20μg/ml抑蛋白酶肽对Isc的抑制。
虽然出于说明的目的，已详细描述了本发明的一些实施例，但本领域技术人员能理解本文所述的方法和制剂可进一步改进，但它们依旧在本发明的精神和范围之中。另外，本发明仅受所附带的权利要求的限制。
非文本序列表<210>9<223>/注＝“在622、679、707位置的n是任何核酸”<210>10<223>/注＝“在201、226和233位置的Xaa是反义或终止密码子”<210>11<223>/注＝“在8、17、21-26、40、42、45-47、52、64、103、112、114、116-121、135、137、140-142、147和159位置上的Xaa是任何氨基酸残基”<210>12<223>/注＝“残基361是任何核酸”<223>/注＝“残基367是任何核酸”<223>/注＝“残基384是任何核酸”<223>/注＝“残基390是任何核酸”<210>13<223>/标记＝信号肽<223>/注＝“在111、120、122、128和130位置上的Xaa代表反义或终止密码子”<210>14<223>/注＝“在425、482和510位置上的n是任何核酸”<210>15<223>/注＝“在2、23、132、160和167位置上的Xaa代表反义或终止密码子”<210>16<223>/注＝“在3、11、12、17、51和429位置上的n是任何核酸”<210>17<223>/注＝“在6、310和408位置上的n代表任何核酸”<210>18<223>/注＝“组织因子途径抑制剂前体1”<210>19<223>/注＝“组织因子途径抑制剂前体1”<210>20<223>/注＝“组织因子途径抑制剂前体”<210>21<223>/注＝“组织因子途径抑制剂前体2”<210>22<223>/注＝“组织因子途径抑制剂前体2”<210>23<223>/注＝“淀粉样蛋白前体蛋白质同系物”<210>24<223>/注＝“抑蛋白酶肽”<210>25<223>/注＝“内α-胰蛋白酶抑制剂前体”<210>26<223>/注＝“内α-胰蛋白酶抑制剂前体”<210>27<223>/注＝“淀粉样蛋白前体蛋白质”<210>28<223>/注＝“胶原α-3(VI)前体”<210>29<223>/注＝“HKI-B9”<210>32<223>/注＝“人比库蛋白片断的cDNA”<210>45<223>/标记＝信号肽<210>47<223>/标记＝信号肽<210>49<223>/标记＝信号肽<210>50<223>/注＝“人比库蛋白片断”<210>51<223>/注＝“人比库蛋白片断”<210>52<223>/注＝“人比库蛋白片断”<210>53<223>/注＝“人比库蛋白的一信号肽”<210>54<223>人比库蛋白片断<210>55<223>/注＝“制备表达构建物的低聚物”<210>56<223>制备表达构建物的低聚物<210>57<223>/注＝“制备表达构建物的低聚物”<210>58<223>/注＝“制备表达构建物的低聚物”<210>61<223>/注＝“制备比库蛋白表达构建物的低聚物”<210>62<223>/注＝“制备比库蛋白构建物的低聚物”<210>63<223>/注＝“人比库蛋白片断”<210>64<223>/注＝“人比库蛋白片断”<210>65<223>/注＝“人比库蛋白片断”<210>66<223>/注＝“人比库蛋白片断”<210>67<223>/注＝“人比库蛋白片断”<210>68<223>/注＝“人比库蛋白片断”<210>69<223>/注＝“人比库蛋白片断”<210>70<223>/注＝“人比库蛋白片断”<210>71<223>/注＝“人比库蛋白片断”
权利要求
1.一种在需要治疗的患者中加速粘液纤毛清除速率的方法，其特征在于，所述的方法包括给予该患者刺激粘液纤毛清除有效量的一种组合物，该组合物包含Kunitz类丝氨酸蛋白酶抑制剂和生理上可接受的载体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述的组合物给予肺气道。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过气溶胶化直接给予所述的组合物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将组合物作为气溶胶悬液直接给予哺乳动物的呼吸道。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的气溶胶悬液包括大小范围从约1到约10微米的可吸入颗粒。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的气溶胶悬液包括大小范围约从1到约5微米的可吸入颗粒。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，通过压力驱动的喷雾器将所述的气溶胶悬液送递给所述的患者。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，通过超声喷雾器将所述的气溶胶悬液送递给所述的患者。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，通过无毒推进剂将所述的气溶胶悬液送递给所述的患者。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的载体选自生理缓冲溶液、等渗盐水、普通盐水和它们的混合物。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Kunitz类丝氨酸蛋白酶抑制剂是抑蛋白酶肽。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Kunitz类丝氨酸蛋白酶抑制剂包括如下序列的氨基酸MAQLCGL RRSRAFLALL GSLLLSGVLA -1ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 200ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 225QERALRTVWS SGDDKEQLVK NTYVL(SEQ ID NO49)
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Kunitz类丝氨酸蛋白酶抑制剂包含如下序列的氨基酸AGSFLAWL GSLLLSGVLA-1ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGAVS 179(SEQ ID NO2)，MLR AEADGVSRLL GSLLLSGVLA-1ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 200QERALRTVWS SGDDKEQLVK NTYVL 225(SEQ ID NO45)MAQLCGL RRSRAFLALL GSLLLSGVLA-1ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 200QERALRTVWS FGD 213(SEQ ID NO47)ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 200QERALRTVWS SGDDKEQLVK NTYVL 225(SEQ ID NO70)和ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 200QERALRTVWS FGD 213(SEQ ID NO71)
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Kunitz类丝氨酸蛋白酶抑制剂包含如下的氨基酸序列IHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK CATV 64(SEQ ID NO4)CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK C 61(SEQ ID NO5)YEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE150ACMLRCFRQ159(SEQ ID NO6)CTANAVTGPC RASFPRWYFD VERNSCNNFI YGGCRGNKNS YRSEE 150ACMLRC 159(SEQ ID NO7)IHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 75NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 125ACMLRCFRQ 159(SEQ ID NO3)CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150ACMLRC 156(SEQ ID NO50)ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 25YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 75NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 125ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGAVS 179(SEQ ID NO1)和ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK 170(SEQ ID NO52)
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Kunitz类丝氨酸蛋白酶抑制剂包括如下的氨基酸序列ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DS 92(SEQ ID NO8)
16.如权利要求12、13、14或15任一所述的方法，其特征在于，所述的Kunitz类丝氨酸蛋白酶抑制剂是糖基化的。
17.如权利要求12、13、14或15任一所述的方法，其特征在于，所述的Kunitz类丝氨酸蛋白酶抑制剂含有至少一个链内的半胱氨酸一半胱氨酸二硫键。
18.如权利要求12、13、14或15任一所述的方法.其特征在于，所述的Kunitz类丝氨酸蛋白酶抑制剂包含至少一个选自以下半胱氨酸一半胱氨酸对的链内的半胱氨酸-半胱氨酸二硫键，CYS11-CYS61、CYS20-CYS44、CYS36-CYS57、CYS106-CYS156、CYS115-CYS139和CYS131-CYS152，其中按天然人胎盘比库蛋白的氨基酸序列编导半胱氨酸残基。
全文摘要
本发明提供一种组合物和方法,是用Kunitz类丝氨酸蛋白酶抑制剂如抑蛋白酶肽或比库蛋白,来刺激患粘液纤毛功能紊乱如囊性纤维变性患者的肺气道中粘液和痰液的粘液纤毛清除速率。
文档编号A61K38/55GK1334743SQ9981614
公开日2002年2月6日 申请日期1999年12月22日 优先权日1998年12月22日
发明者R·霍尔, C·T·波洛, B·B·纽顿, W·J·A·泰勒 申请人:拜尔公开股份有限公司