专利名称：病毒疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药用组合物或疫苗，该药用组合物或疫苗含有一种病毒蛋白分子混合物，这些病毒蛋白分子是单一病毒蛋白或其片段的序列变异体。本发明还特别涉及一种DNA疫苗，该DNA疫苗可编码不同结构病毒蛋白的一种混合物，该疫苗含有一种病毒DNA分子或其片段的序列变异体的混合物，这些序列变异体可编码一种病毒蛋白或其片段的序列变异体。根据本发明的优选形式，这些病毒蛋白是人免疫缺陷病毒(HIV)GP120蛋白的序列变异体，这些序列变异体的氨基酸序列在V2环和/或V3环区域各不相同，优选的是在V2及V3环区均不相同。本发明还涉及该病毒疫苗制剂，包括中间阶段或中间构建体，以及与其相关的制备方法和应用。
在许多种病毒感染中可观测到强烈的免疫防御，尤其是HIV-1感染，免疫防御能够在数年的时间里对病毒进行控制。病毒被控制并且不产生疾病症状的时期称为(HIV)疾病的无症状期。在患病过程中会反复形成新病毒变异体。因此，病毒可能会避开已产生的人体免疫防御并反复感染新的免疫系统防御细胞(参考M.Schreiber et al.，J.Virol.68 No.6(1994)3908-3916；J.Gen.Virol.77(1996)2403-2414；Clin.Exp.Immunol.107(1997)15-20；J.Virol.71No.12(1997)9198-9205)。
在先有技术中，对诸如脊髓灰质炎病毒(Horaud F et al.，Biologicals，1993，21311-316)、汉坦病毒(Ulrich R et al.，1998Vaccine 16272-280；Schmaljohn CS et al.，1992 vaccine1010-13)、拉沙病毒(Morrison HG et al.，1989 Virology171179-188；Clegg JC et al.，1987 Lancet 2186-188)、甲型肝炎病毒(Clemens et al.，1995 J.Infect.Dis.171Suppl.1p.44-p.49；Andre et al.，1990 Prog.Med.Virol.3772-95)和乙型肝炎病毒感染(McAleer et al.，1984 Nature 307178-180)以及HIV感染(Egan et al.，1995 J.Infect.Dis.1711623-1627；Kovac et al.，1993 J.Clin.Invest.92919-928)等病毒性疾病的治疗都是使用单一的未经遗传修饰的特定病毒抗原或单一的灭活病毒株来研究适当的接种策略。以HIV为例，如今已制备出两种病毒株的外包膜蛋白并用于人类疫苗实验(Zolla-Pazner et al.，J.Infect.Dis.178(1998)1502-1506)。两种GP120分子的氨基酸序列各不相同，尤其是可变区，如V3环区，的氨基酸序列。这两种病毒株正是由于V3区序列的不同而有着不同的表型特征。HIV-1 MN病毒株是一种可优先感染具有病毒共同受体CCR5的巨噬细胞与细胞的病毒变异体。与此不同的是，SF2型病毒优先在T细胞中复制，并且使用病毒共同受体CXCR4。因此，这些病毒也可被称为T细胞营养型病毒(如HIV病毒株)或巨噬细胞营养型病毒(如HIV病毒株MN)。这两种GP120变异体均已用于对黑猩猩的接种实验。实验结果表明，可诱导出一种不但具有抗MN和SF2这两种HIV病毒株的保护作用、而且能够预防其它病毒株感染甚至HIV-1患者分离株感染的免疫应答。相比之下，目前两种GP120变异体中只有一种已用于人体接种实验。MN GP120和SF2 GP120都不能提供可靠的抗病毒变异体感染的保护作用，例如由HIV-1感染者体内出现的病毒变异体(患者分离株或野生型病毒)导致的感染。J.A.Levy在ASM Press Washington，D.C.1998年出版的《HIV与AIDS发病机理》(第二版)第15章中对GP120包膜蛋白接种的有关研究状况进行了综合论述。
迄今为止，先有技术中论述或检验的接种策略都具有一些缺点，特别是所用疫苗不能在病毒性疾病过程中预防新病毒的不断形成。
因此，本发明的目的是提供一种疫苗，该疫苗尤其能够在病毒性疾病过程中预防或显著抑制新病毒变异体的形成，并且能够限制或避免病毒回避人体免疫防御而反复感染新的免疫系统防御细胞。
为实现该目标，本发明对以下权利要求描述的主题提出建议。
由此，本发明的主题首先是一种含有病毒蛋白分子混合物的蛋白疫苗，这些分子为单一病毒蛋白或其片段的序列变异体。
根据本发明，蛋白的序列变异体是指含有来源于天然病毒蛋白或其部分(片段)的氨基酸序列的分子，由于在序列或其片段的任意选定位置至少有一个氨基酸被替换，因而这些变异体彼此间各不相同。优选的是序列变异体在负责产量以及结合病毒中和抗体的序列的不同位点含有数个被替换氨基酸。被替换氨基酸的数量和位置取决于在适应性细胞培养过程中及野生型HIV分离物中观测到的GP120各区域的氨基酸可变性。根据本发明，这些序列变异体至少在原序列或其片段的两个氨基酸位置有所不同。特别优选的是在3-8个氨基酸位置有所不同，更优选的是在8个以上的氨基酸位置有所不同，所有氨基酸都可以在这些位置出现。全部构成疫苗的序列变异体的可能种类由每个位置上可能出现的不同氨基酸的组合来决定。
本发明特别涉及一种疫苗，该疫苗含有一种≥102种序列变异体的混合物，即102种以上不同氨基酸序列(同源物)的分子的混合物。特别优选的疫苗含有≥103种变异体，更优选的则含有≥104种变异体。
在本发明的框架内，该疫苗除含有序列变异体之外，还可考虑含有衍生出这些序列变异体的蛋白本身。
由此，本发明提供一种抗病毒活性成分，该抗病毒活性成分含有序列各不相同的病毒特异性蛋白或其片段。为实现这一点，可重新合成蛋白编码基因以产生新的DNA限制性酶切位点，这样可将特定区域进行替换。通过将编码所需蛋白区域的DNA片段进行化学合成，可产生该蛋白编码序列的基因库。然后将编码该蛋白的表达载体以混合物形式转染到细胞中。继而可由这些产蛋白细胞分离出不同病毒蛋白的混合物，即本发明的优选活性成分。
当病毒性疾病为HIV时，在该疾病过程中对免疫系统的慢性感染和相关的持续损害可导致特异性病毒防御的完全丧失。能够与特定抗原结构形成强特异性结合的中和抗体是特异性病毒防御的一部分。它可将外来抗原标记并阻断其与，例如，病毒受体的相互作用。构成病毒特异性防御的是抗GP120外包膜蛋白V3环的中和抗体。这些抗V3环抗体可阻止细胞感染。在动物模型中的实验结果表明，通过将V3环特异性单克隆抗体给药可预防HIV-1感染。将这种单克隆抗体给药也可治愈已有的感染。
但与实验体系相比，在HIV感染的自然过程中可观测到新病毒变异体的不断产生。而HIV-1恰恰在V3环位置的变异程度非常高，因此在单个患者体内一次就可发现数百种不同的V3环变异体。V3环是GP120的重要优势抗原域。因此，针对每种V3环都会形成一种非常特异的体液免疫应答。针对V3环产生高特异性免疫应答的结果是，抗HIV-1变异体A的V3环的中和抗体不能中和变异体B，反之亦然(Schreiber et al.，J.Virol.68(1994)3908-16，Abrahamssonet al..4(1990)107-12)。
在HIV病的无症状期，血清中游离于细胞的病毒变异体可被抗体中和。只有在此之后才会在血清中观测到可避开自体中和的病毒变异体。这些V3环逃逸变异体不再被V3环抗体识别，因而也不再被中和。但存在于患者血清中的其它所有病毒变异体可被自体V3环抗体识别。这表明在疾病过程中可产生不存在针对其V3环的抗体的病毒变异体如果一个患者的血清样品中的抗体含量在一段数年的期间内被检测到，则抗V3环逃逸变异体的V3环抗体，其发生于晚期，可以在采集于无症状期的开始阶段的血清样品中检测到。正如其他感染性疾病，该结果不是病原体通过全新抗原性变化而实现的标准逃逸，而是切断了患者体内应答于病毒复制的中和免疫。观察到的中和V3环抗体的缺如因此是类型-特异的V3环抗体持续丢失的结果。相应的病毒由于中和抗体的丢失而扩增，导致了患者血清中病毒荷载的升高。在疾病进程中，也观察到了淋巴结中病毒荷载的升高(Chun等，Nature 387(1997)183-188)。
能够使自身抵抗患者体内的免疫系统并逐步发展成为优势病毒变异体的病毒必须要克服免疫系统提供的所有抗病毒性障碍。细胞毒性T细胞与中和抗体一样，也可抑制病毒复制。细胞毒性T细胞能够使感染HIV的CD4+T细胞死亡。除发现中和抗体减少之外，还可观测到这种抗HIV感染细胞的细胞毒性T细胞的减少(Zerhoui et al，.Thymus 24(1997)203-219；Gould et al.，Semin Cell Dev Biol9(1998)321-328；Wagner et al.，J Gen Virol 74(1993)1261-1269；O’Toole et al.，AIDS Res Hum Retrovirsues 8(1992)1361-1368；Shearer et al.，137(1986)2514-2521)。因此，使用异质性疫苗的目的是要利用HIV的多种不同GP120包膜蛋白的混合物诱导或激活抗多种不同病毒变异体的中和抗体和细胞毒性T细胞。
如前所述，HIV疾病的特征是病毒在不断地发生变化。这是由病毒逆转录酶的错误率引起的，这种酶在病毒复制过程中会出现错误。由此产生的突变一方面会被其生物学特性和人体免疫系统抗病毒作用加以选择。就HIV而言，可导致形成多种变异体的还有在转录遗传信息时不进行错误校正的其它病原体。其中包括汉滩病毒、拉沙病毒以及甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎病毒。正因如此，在乙型肝炎接种的人中会有约2％的接种失败。在这2％的人体内可发现不能被该疫苗诱导的免疫应答所抑制的乙型肝炎“逃逸”变异体。
这些病毒的遗传变异性是疫苗、疗法以及免疫逃逸变异体形成的基础(Blum，Int J Clin Lab Res 27(1997)213-214；Jongeriuset al.，Transfusion 38(1998)56-59)。
迄今为止的技术水平仍不了解该如何对抗病毒中和抗体的这种减少。目前采用的策略只是在某些方面，即有关形成并维持抗特定病毒的特定变异体特异性抗体方面，具有成效，但目前设想的利用抗病毒药物或基于记忆物质的接种体的治疗方法不能解决针对病毒在疾病过程中形成的多种蛋白变异体的种类特异性抗体减少的问题。
利用本发明的异质性疫苗能够防止V3中和抗体减少，或至少能明显地对抗这种减少。
本发明首次提供一种对病毒感染患者，特别是HIV-1感染患者，进行免疫重构的治疗方法，该方法可以这样的方式和途径激活免疫系统，并通过重建和再刺激而自然获得针对多种病毒变异体群体的免疫防御，从而防止患者体内的已有病毒变异体扩增。
简单地说，本发明的基本思想是，制备一种GP120蛋白混合物作为抗HIV-1的活性成分，这些GP120蛋白在V2环和V3环这两种可变区有所不同，例如只在V2或V3环区不同或均不相同。为了实现这一点，必须重新合成GP120编码基因，同时要形成新的DNA限制性(单)酶切位点，这样可将，例如，V2区和V3区进行特定的替换。通过将编码V2环和V3环的DNA片段进行化学合成，可产生GP120的V2/V3基因库。最后将GP120表达载体以混合物形式转染到细胞中，继而可由这些产GP120的细胞分离出不同GP120蛋白的混合物，该混合物可作为活性成分用于HIV疾病或AIDS的预防和/或治疗。
由此，本发明的基本考虑包括准备一种免疫疗法或制备具有多种不同GP120分子的抗HIV-1疫苗，这些GP120分子带有的V3环序列(和/或V2环序列)也可在患者体内的病毒变异体中。
在细胞培养系统中产生天然病毒变异体混合物的方法非常昂贵。我们应特别牢记，由于细胞培养必须使用可被HIV-1感染的细胞，所以病毒混合物的组成会发生改变。因而一些具有选择优势，如生长更快，的病毒变异体只需数天即可在细胞培养系统中占据优势，同时排斥生长较慢的其它病毒变异体。当分离外周血单核细胞(PMBC)或患者血清中出现的不同病毒变异体时尤其如此。因为无法培养稳定的HIV变异体混合物，所以也不能由此产生或由病毒培养物中分离出相应的GP120蛋白混合物。
由此，在本发明的框架内，将基因工程方法作为制备HIV-1变异体和GP120变异体的选定方法。在制备病毒变异体和重组GP120时构建了含有两种载体的克隆系统。两种载体的主要组成部分都是一种由化学方法合成的可编码GP120蛋白的新型HIV-1包膜蛋白基因(HIV-1env基因)。一种载体含有HIV-1的整个基因组。在把该载体转染到细胞中后，被转染的细胞可产生传染性病毒颗粒。由于可以使用抗HIV-1感染的细胞，所以这样能促进病毒变异体混合物的产生。因而，由于病毒变异体的生物学特性，病毒混合物的成分在这种细胞培养系统中不会发生改变。第二种载体可促进GP120变异体在真核细胞内的表达。这种载体可直接用来制备接种体(疫苗)。
利用基因工程方法在真核细胞内制备和表达V3环GP120变异体时构建了HIV-1-env特定基因构建体，在下文中称为基因表达盒。根据本发明，在制备该基因表达盒时化学合成了整个env基因编码序列。利用这种方法可根据需要改变编码序列，并能够在env基因序列中加入新的DNA限制性酶切识别序列。我们必须牢记，尽管在env基因的DNA序列中可形成新的限制性酶切位点，但原始GP120(优选的为NL4-3和PI-932毒株的GP120)的氨基酸序列不能改变。同时，根据本发明，要去除env序列中反复出现的酶切位点，以使任何特定限制性酶，如BglII，的酶切位点都只有一个。根据本发明的优选形式，每隔约150个碱基对插入一种新的只出现一次的酶切位点，共插入10种。由此产生的新env基因在本发明的框架内亦被称为基因表达盒。新env片段则大体上类似于一种多聚接头。
限制性酶BstEII和BamHI的酶切位点构成了本发明的优选基因表达盒(SEQ ID NO9)。为了能够替换env基因中的区域，这两种酶切位点在gp120的pBSCenvATG表达载体(SEQ ID NO10)和逆转录病毒载体pNL4-3中都只出现一次。载体于1999年1月6日由DSMZ--Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，38124 Brunswick，Germany--保藏，并由保藏人指定pBSCenv-V3为参考码，根据Budapest Treaty，其保藏编号为DSM 12612。
通过替换由BstEII和BamHI确定的基因片段，可将同样由BstEII和BamHI确定的env基因新建片段克隆到两种载体内。利用化学或酶学方法合成PstI/BclI V2环及BglII/XbaI V3环env片段，然后克隆到诸如pUC18或19等常规载体中。通过测序检测该载体中的片段，然后经PstI/BclI或BglII/XbaI消化切除载体，再转移到pBSCenvATG中，然后转移到pNL4-3载体中。作为克隆到常规载体(pUC18、pUC19等)中这一中间步骤的替代方法，也可直接将PstI/BclI V2环及BglII/XbaI V3环片段克隆到pBSCenvATG中。
由于基因表达盒中每隔约100个碱基就有一种限制性酶切位点，因而env基因的所有区域，特别是V3环或V2环区域，都可被任何DNA片段所替换。编码V3环的区域可被替换成大小为244个碱基对的BglII-XbaI片段(参考SEQ ID NO9；第708-955位核苷酸)。其目的是用新DNA片段替换编码GP120蛋白可变环的基因片段。利用合成方法产生该片段，然后克隆到env基因表达盒中。如果该序列的某些位置在V2环及V3环片段的合成过程中可发生改变，即该位置可平等掺入所有四种核苷酸或是次黄嘌呤核苷酸，则可产生其编码的氨基酸序列带有预定变异的env基因变异体。患者分离物的V3环序列是制备GP120混合物的起始点。若将这些变异体克隆到gp120基因表达盒中，即能够在真核细胞内表达出带有可变抗原域的相应GP120蛋白。env基因的V3环区变异可依据HIV-1患者分离物的序列数据。患者分离物是指在实验室中直接由患者身体、血清或血液中被感染细胞培养出的病毒变异体。这些病毒具有与实验室中长期培养的HIV-1病毒不同的特别性质。它们对中和抗体和趋化因子具有更强的抗性。与适应细胞培养的病毒相比，患者分离物使用不同的共同受体来感染细胞。由于患者分离物与适应实验室培养的病毒之间有很大的不同，所以由这些病毒收集的env基因V2环或V3环序列数据可用于GP120混合物的制备。在本发明的框架内，处于V2和V3编码序列区之外的区域也可存在附加的碱基替换。
根据本发明的特定实施方案，可以使用一种含有人免疫缺陷病毒(HIV)GP120蛋白混合物的蛋白疫苗，其中GP120蛋白的V3环和/或V2环区氨基酸序列在任何情况下均彼此各不相同。
在本发明的框架内，利用基因工程方法制备蛋白混合物或蛋白疫苗时，优选的是在共有序列之外的V3环区域引入序列变异(参考，例如，M.Schreiber et al.，J.Virol.71 no.12(1997)9198-9205)。共有序列是指在不同病毒株之间基本保持不变，而且在病毒变异体随着病毒性疾病(HIV疾病)在体内发展而形成的过程中也基本保持不变的序列片段。在B亚型HIV-1的情况下，该片段的序列为Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe(GPGRAF)。该基序的左侧和右侧各有长4-10个氨基酸的一小段变化非常大的区域。
图1中的该序列是以患者分离物的V3环序列变异为实例来加以表示。
除了V3环区域内的变异之外，本发明所述蛋白疫苗中的分子还可以在V2环区域含有序列变异。此时优选的仍是共有序列区之外的氨基酸序列发生改变(见图2)。此外，V2和V3环之外的区域也可存在额外的氨基酸替换。
本发明一直使用标准的单字母或三字母代码来描述氨基酸。本发明所述蛋白疫苗中的氨基酸序列变异可以是任何可能的氨基酸替换。但无论何种情况，优选的都是将病毒GP120序列或V2环与V3环序列中的氨基酸替换成可在其它病毒变异体的相应序列位置出现的氨基酸(见图2，1997序列数据排位人类逆转录病毒与AIDS，核酸与氨基酸序列汇编及分析，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，NM 87545，U.S.A.，编辑B.Korber，B.Hahn，B.Foley，J.W.Mellors，T.Leitner，G.Myers，F.McCutchan，C.Kuiken)。
本发明首次提供一种利用基因工程方法制备的蛋白疫苗，该蛋白疫苗含有特定病毒抗原(蛋白)的序列变异体。下文将以V3环为实例来描述该疫苗的制备方法。下文所述的合成原理也可应用于其它病毒或病毒蛋白或其序列片段，这对该领域的技术人员来说是显而易见的。
简单地说，即制备一种带有V3可变序列的GP120蛋白混合物作为疫苗的主要成分，所述V3可变序列能够模仿HIV GP120蛋白V3环的可变性。
由此，可首先将GP120蛋白编码序列分段克隆到pUC18/19质粒中。这可通过多接头交换来实现，该方法使带有单一限制位点的所有目的片段的两侧都具有此前通过沉寂突变插入到gp120序列中的适当限制位点，因而可将目的片段切除和替换。
然后利用DNA合成仪制备两种同源的核酸寡聚体(长度约300个碱基对)。再进行杂交，使其与V3环的DNA序列形成双链DNA片段。制备V3环的双链DNA片段可采用不同的分子生物学常规方法。有一种方法是用次黄苷来引入变数，并且通过核苷酸混合物(AGCT、AGC、AG…)来增加互补链的变数。这种方法是用专门的化学手段来制备DNA片段。还有一种方法结合使用了化学与酶学的DNA合成方法，该方法利用核苷酸混合物来引入变数。然后使寡核苷酸在长度为20-30个碱基的不可变互补末端杂交。产生全双链分子的这种合成方法是利用DNA聚合酶以酶学方法来进行的。等温DNA聚合酶(Klenow片段)或热稳定性DNA聚合酶(Taq聚合酶)都可使用。若使用Taq聚合酶，则也可通过聚合酶链反应制备出更多的量，以用于V3环DNA片段的克隆。利用这些方法可制备出特定位置可以变化的双链DNA片段。这种简并DNA序列能够编码所需GP120蛋白混合物，即蛋白疫苗，中的相应V3环氨基酸序列。
合成的V2片段混合物在5’端具有PstI酶切位点，在3’端具有BclI酶切位点。合成的V3片段混合物在5’端具有BglII酶切位点，在3’端具有XbaI酶切位点。利用各自的两种酶切位点可将片段混合物克隆到诸如pUC18 delta-env或pUC18 BstEII-BamHI等载体中(图3)。在克隆完成后会形成pUC18载体的质粒DNAs混合物或库，具有全部的BstEII-BamHI env片段。所有质粒DNAs的env V2环或V3环序列都各不相同。通过插入V2或V3片段可阻止pUC18载体中env基因片段的缺失(delta env)。
把由此制备的带有可变env片段的质粒DNA混合物转化到大肠杆菌中并进行发酵。大肠杆菌能够扩增和复制该质粒DNA混合物。从而产生这些V2/V3环质粒的所有可能变异体。
然后分离该质粒库。再通过BstEII和BamHI消化由质粒DNA库切出env片段，并直接克隆到用来表达病毒gp120的载体中。该载体的优点是在真核细胞系统中也能够表达GP120。
然后把这种带有可变gp120构建体的BSCenvATG-载体DNA库转染到Cos或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中。继而这些真核细胞可表达该质粒库，因而从统计学上看能够将相应的蛋白翻译成各种变异体，并根据所使用的真核细胞对其进行相应的糖基化。然后收集蛋白并纯化，即获得终产物(带有可变氨基酸序列的蛋白混合物或GP120混合物)。
作为图示，图4清楚地说明了本发明制备蛋白疫苗的方法。
如前所示，在V2环和/或V3环内的变异也可以实现。产生V2环变异的方案可如V3环变异方案所述来进行。
如上所述，本发明的蛋白疫苗的制备方法要借助于不同的关键构建体，即核酸中间步骤与DNA构建体，这些构建体是实施本发明所必需的。
如前所示，可将编码GP120蛋白的核酸序列分段克隆到pUC18/19中，本发明的起始点是一种gp120序列，该序列中反复出现的限制位点要首先通过沉寂突变来加以修饰，以使保留的每种限制位点只在序列中出现一次。为了能够插入产生序列变异体所需的表达盒，必须在十分特定的位置上选择性地进行这种序列修饰，该特定位置由两种只在序列中出现一次的限制位点来确定。在核酸序列中引入沉寂突变的方法已该领域技术人员所熟知。
由此，本发明的主题还包括一种核酸序列，该核酸序列来源于SEQID NO1的env序列或其片段，该核酸序列通过修饰而含有唯一的单一限制位点。优选的是通过引入沉寂突变来进行修饰。根据本发明的优选形式，该核酸序列具有SEQ ID NO9的序列。对基因盒序列可进行修饰，使其含有来自患者的病毒分离物的整个env基因或env基因片段。优选而言，该基因盒可含有患者分离物PI-932的env序列(SEQ ID NO11)。基于PI-932序列的本发明所述优选基因盒显示于SEQ ID NO12。
由此，本发明的主题还包括一种单链核酸序列，该核酸序列含有编码V3环和/或V2环或其片段的区域，在V3环的情况下，该区域中的BglII-XbaI(247bp)或BglII-NheI(283bp)片段可被替换成一种至少在6个位置，优选的为9-20个位置，存在核酸互换或突变的修饰片段，在V2环的情况下，该区域中的PstI-BclI(139bp)或PstI-EcoRI(339bp)片段可被替换成一种至少在6个位置，优选的为9-20个位置，存在核酸互换或突变的修饰片段。无论何种情况，核酸序列中的核苷酸都可被次黄苷或一种2-4个核苷酸的混合物所替换。图5利用实施例对此进行了说明。若想在V3环21个氨基酸位置中的7个位置上联合引入不同的氨基酸以产生1152种变异体，则必须利用化学合成方法将两种核苷酸引入到单链核酸(寡核苷酸)序列中11个核酸位置的每个位置上(图5)。
这些单链核酸序列可如上文所述进行杂交或合成，以产生双链核酸序列。
由此，本发明还涉及含有上述单链核酸序列杂交体的双链DNA，其中，在任何情况下都是一条核酸序列(5’-3’链或3’-5’链)在一个或多个选定位置上含有次黄苷，另一条核酸序列(3’-5’链或5’-3’链)在随后的杂交过程中于相应的互补位置上含有两种、三种或四种适当的核苷酸(腺嘌呤，A；胸腺嘧啶，T；鸟嘌呤，G；胞嘧啶，C)。由此产生的序列在单链核酸序列(DNA)的相应位置随机分布着四种碱基，从而可产生所需的A、T、G或C的组合，作为相应的所需氨基酸密码子(一系列的三核苷酸形成密码子)。核苷酸位置的变化可产生随机分布的序列组合。因此，举例来说，(A，C)(ACT)(ACGT)的组合一共可产生2×3×4＝24种编码不同氨基酸的可能DNA形式。同时，可变位置的数量还可确定互补DNA序列中引入次黄苷的数量和位置。这种构建体的异质性计算方法显示于图5。
由于含有次黄苷的单链DNA在形成双链DNA时与相应位置随机分布着A、T、G或C的任何寡聚体都能够杂交，因而可获得双链gp120序列或其部分(片段)的混合物，这些核酸序列均来源于env序列(SEQID NO1或12)，并且彼此间的V2环编码区和/或V3环编码区都各不相同。这意味着该混合物所包含的核酸序列彼此各不相同，因而可编码一种所含蛋白的氨基酸序列在V2环和/或V3环区域彼此都各不相同的蛋白混合物。
根据本发明的优选形式，利用这种方法可至少在核酸水平(DNA水平)上获得102种序列变异体，优选的为至少103种，本发明的特别优选形式则为至少104种序列变异体。后文将把这种DNA混合物称为DNA库，有关的gp120序列变异体则称为可变gp120构建体库(gp120库)。
在本发明的框架内，术语“DNA序列的序列变异体”是指含有一种来源于天然病毒DNA分子或其部分(片段)的核酸序列的分子，由于在序列的任意选定位置至少有一个核苷酸被替换，因而这些变异体彼此间各不相同。优选的是序列变异体在原序列的不同位置含有数个被替换核苷酸。被替换核酸的数量和位置基本上取决于原核酸序列的长度。
一旦由产生的质粒-DNA混合物开始表达出env基因变异体，即可认为因其随机分布性而能够表达出所有可能的DNA序列。因此，根据预定的DNA混合物也可形成gp120分子或其片段的所有可能的序列变异体。gp120混合物的异质性可根据DNA序列的异质性和遗传密码对氨基酸的简并性来计算(也可参考图5)。
质粒-DNA混合物的异质性可通过单克隆的DNA测序来证明。为此，可将质粒DNA混合物转化到大肠杆菌中，并随机挑选单克隆以测定其V2和V3环的序列。总共约有100-200种不同的克隆需要测序。利用DNA序列的统计分布可计算出整个混合物的分布情况。这种方法与作为标准用于多种产品的质量控制的随机采样方法基本相当。
由于无法从混合物中分离出单一的GP120分子并加以检测，因此对GP120蛋白混合物的异质性直接进行分子检测的难度稍大。而且不同GP120变异体之间也只有个别氨基酸不同，所以这也是理所当然的。凝胶电泳分离方法或质谱分析方法可确定是否含有某种混合物形式的或单一形式的GP120分子。当把GP120混合物作为疫苗用于，例如，动物时，在该动物体内诱导出的免疫应答完全取决于GP120混合物的数量和成分。然后可通过病毒中和试验检测该动物的免疫应答，即中和抗体。中和试验可采用不同的HIV-1患者分离物，以监测相应变异体所覆盖的免疫应答。优选的是选择那些利用不同共同受体感染靶细胞的能力有所不同的患者分离物。继而可将中和能力作为一种质量测定标准。
由此，本发明的主题还包括一种含有GP120蛋白的蛋白混合物，这些GP120蛋白所包含的氨基酸序列在V2环和/或V3环区域彼此都各不相同，根据本发明的一种形式，该蛋白混合物至少含有102种序列变异体，根据本发明的优选形式则至少含有103种序列变异体，根据本发明的特别优选形式则至少含有104种序列变异体。
如前所述，通过含有次黄苷的单链DNA与含有随机分布的A-、T-、G-和/或C-的单链DNA的杂交产生的双链DNA混合物，即可变GP120构建体库，可被转化到原核或真核宿主细胞内进行发酵，优选的则为大肠杆菌。
由此，本发明的主题还包括含有双链DNA插入片段的质粒，这些质粒在任何情况下都含有含次黄苷单链核酸序列(见上文)与含所有四种核苷酸变异体(A、T、G、C)的单链核酸序列(见上文)的杂交体。此外，本发明还涉及一种含有混合形式的这些质粒的载体混合物，这些质粒的核酸序列在V3环编码区和/或V2环编码区彼此都各不相同。根据本发明的一种形式，该载体混合物至少含有102种特定质粒，优选的为至少103种，根据本发明的特别优选形式则至少含有104种特定质粒。根据用来表达这些载体(质粒)的宿主细胞，可考虑使用该领域技术人员所熟知的多种不同的表达系统和基本载体(参考Methods in Enzymology，Vol.185，Gene Expression Technology，1991，Publ.D.V.Goeddel，Academic Press，Inc.)。因此，当在大肠杆菌中表达时，优选的是使用pUC18/19质粒作为克隆核酸序列变异体的基本载体。在本发明的框架内，可在细菌宿主细胞，如大肠杆菌，或真核宿主细胞，优选的为来源于包括Cos、CHO或幼龄仓鼠肾细胞(BHK细胞)在内的真核宿主细胞，或其它宿主细胞内表达该载体混合物。
由此，本发明还涉及被本发明所述载体混合物转染的大肠杆菌宿主细胞或真核宿主细胞。
宿主细胞被DNA库(载体混合物)转染后，可认为形成的被差异转化的宿主细胞数量与DNA库中包含的序列变异体数量相等或至少大致相等。在制备疫苗时，应对个别克隆步骤中的产量给予特别关注。制备双链DNA片段时的产量、env基因中V3环与V2环DNA片段的连接以及细菌和细胞克隆的转化或制备均不能对混合物期望达到的异质性有所限制。这一点将通过实施例来加以说明。举例来说，如果要从两种颜色不同的大量球中取出一定数量的球，并且在挑选出的球中两种颜色同时存在的概率要达到99.9％，则必须要取出约13个球(G.Schreiber，Ein kombinatorisches Problem aus der Genetik；Bio-engineering 1988，232-35)。转换到HIV疫苗的克隆步骤上就意味着，如果要产生约6000种不同的病毒变异体，就要在每一克隆步骤中产生13倍的克隆。因而必须要制备含有约80,000种克隆的V3环基因库。继而才能够由该基因库开始制备用于转染CHO细胞的表达载体。因此，必须在CHO细胞转染过程中完成约80,000种转染体。然后才能由该CHO转染细胞混合物产生所需数量的6000种不同的gp120变异体。
本发明还涉及一种方法，用来制备编码病毒蛋白的核酸序列(表达盒)，其中该序列经过修饰，或优选的是被引入多种沉寂突变，使得该序列至少含有两种单一限制位点，优选的为互不相容的单一限制位点。特别优选的是该序列只含有单一限制位点。优选地，该核酸序列编码的蛋白为GP120，编码GP120的env野生型序列由于沉寂突变而有所改变。
本发明的另一主题是用来制备本发明所述载体混合物的一种方法，该载体混合物优选地含有一种质粒混合物，这些质粒的核酸序列在V2环编码区和/或V3环编码区彼此都各不相同，本发明的这些质粒被连接到能够在宿主细胞(优选的为大肠杆菌、Cos、CHO或BHK细胞)中表达的(基本)载体内。该(基本)载体优选地为pUC18、pUC19或BSCenvATG载体。
在本发明的框架内，还有一种可用来制备/产生宿主细胞的方法，优选的为选自包括大肠杆菌、Cos、BHK或CHO在内的宿主细胞，其中所述宿主细胞可被本发明的载体混合物转化，该载体混合物含有一种质粒混合物，这些质粒的核酸序列在V2环编码区和/或V3环编码区彼此都各不相同。
最后，本发明首次提供一种方法，用来制备一种DNA疫苗，其中包括实施本发明的制备载体混合物的方法，本发明的质粒在施用到宿主细胞(如人和动物的单核细胞)中后可表达gp120蛋白混合物。该DNA疫苗在使用时可任意地用药学容许的助剂进行配制，并且在给药于生物体后能够产生病毒蛋白的序列变异体。
本发明还涉及一种可编码混合物形式的不同结构病毒蛋白的药用组合物或DNA疫苗，该疫苗含有病毒DNA分子或其片段的序列变异体混合物即编码蛋白或其部分或片段的区域的核酸序列彼此各不相同的DNA分子。根据本发明，术语“不同结构的病毒蛋白”是指氨基酸序列来源于相应的野生型病毒蛋白序列的那些蛋白，其氨基酸序列彼此有所差异，使得这些蛋白也彼此各不相同，与野生型序列相比，这些蛋白在相同的或不同的位置上有一个或多个被替换的氨基酸。如前所述，根据本发明，疫苗中的核酸序列优选地应能够编码一种不同结构的HIV GP120蛋白(GP120序列变异体)的混合物，特别优选的疫苗应含有DNA分子的一种混合物，这些DNA分子的核酸序列在HIV-1 gp120的V2环编码区和/或V3环编码区彼此各不相同。本文的图3显示了GP120的一些已知的V3环结构差异或变异，以供参考。
本发明的DNA疫苗在基因治疗领域具有特别的重要性。
最后，本发明首次提供一种方法，用来制备一种药用组合物或蛋白疫苗，其中包括在能够使病毒蛋白的序列变异体混合物表达的条件下收集本发明的宿主细胞，即被含有本发明质粒的载体混合物转化的宿主细胞，这些质粒的核酸序列在V2环编码区和/或V3环编码区彼此各不相同。优选的宿主细胞为细菌宿主细胞，如大肠杆菌，或真核宿主细胞，优选的为来源于包括Cos、中国仓鼠卵巢(CHO)或幼龄仓鼠肾细胞(BHK细胞)在内的真核宿主细胞。
由此，通过本发明可获得一种含有可变GP120蛋白的疫苗，这些蛋白在HIV感染或AIDS的预防和/或治疗性处理中能够1.激活免疫系统，2.诱导HIV-1中和抗体的形成，3.防止中和抗体减少，以及4.由活性成分来监控对GP120特异性免疫应答的刺激。
优选的是通过获得足够的抗原来实现这一点，甚至在与AIDS突然蔓延有关的HIV中和抗体减少之前也是如此，获得的抗原由于其不同氨基酸序列(即序列变异体)的多样性而能够诱导那些在通常情况下，即没有根据本发明采取相应预防措施的情况下，会随着疾病的发展而衰减或浓度降低的HIV抗体的形成。除预防性处理外，本发明还涉及利用GP120混合物(蛋白疫苗)进行治疗性处理，该处理可通过激活免疫系统以及诱导新的或额外的HIV-1中和抗体的形成来对抗HIV中和抗体的减少或降低。
由此，根据本发明，可利用不同结构病毒蛋白的混合物来制备一种疫苗，用于人类病毒感染的预防和/或治疗，这些病毒蛋白是一种病毒蛋白(优选的为GP120)或其片段的序列变异体。此外，本发明还涉及一种DNA分子混合物的应用，这些DNA分子可编码一种病毒蛋白或其片段的序列变异体，以作为一种疫苗制剂，用于人类病毒感染的预防和/或治疗。根据优选形式，本发明涉及一种用来预防和/或治疗人类HIV感染的疫苗制剂的应用。
在本发明的框架内，病毒感染可以是任何能够在疾病过程中形成自复制病毒变异体的感染，根据本发明，那些氨基酸序列段或其编码核酸区段可作为选定的蛋白序列或蛋白编码核酸序列，其中，在病毒性疾病过程中能够始终或经常观测到变异体，即序列变异。此时，这些序列变异体优选地为GP120分子(在蛋白水平上)或GP120编码区(在DNA水平上)或其片段的序列变异体，特别是V3环或V2环的序列变异体，优选的则是在V3环和V2环内均存在变异的序列变异体。
由此，根据本发明可获得能够在对病毒性感染患者的免疫重构治疗中激活免疫系统的药用组合物或疫苗，通过激活免疫系统可重新产生针对该病毒的自然获得性免疫防御，并通过再刺激来防止该病毒变异体在患者体内增殖。根据本发明的优选形式可首次获得用来对HIV-1感染患者进行免疫重构治疗的疫苗。
在本发明的框架内，可将这些疫苗加以配制，也可将其本身直接给药，也就是可作为不含其它添加剂的DNA和/或蛋白混合物给药，或与其它活性成分一同给药，如白介素-2、CC和CXC-趋化因子等免疫刺激剂以及/或药学容许的助剂和载体。一般可将本发明的疫苗配制成用于静脉内给药，如通过静脉途径、肌内途径、皮下途径给药。此外，还可将这些疫苗配制成用于口服给药、粘膜给药(阴道内给药、直肠内给药)以及穿皮给药。
本发明具有以下优点通过对核酸序列的选择性基因操作，可利用基因盒制备出任何所需的病原体变异体或刺激物的基因变异体。这些变异优选地可影响那些能够针对其产生中和抗体或细胞毒性T细胞的区域。因而可制备出含有病原体变异体或病原体相应抗原的病原体的一种混合物形式的接种体。对病原体为HIV的情况而言，该思路的优势在于可制备出HIV-GP120——HIV外包膜蛋白——的一种混合物，人类可针对该混合物产生病毒中和性免疫应答。由于在HIV疾病的确定情况下，每个患者都暴露于多种GP120蛋白序列均各不相同的HIV病原体，因而以多种GP120变异体为接种体特别有利，该GP120混合物既可用于正常健康个体的免疫接种，也可用于已感染HIV个体的治疗。当利用该GP120混合物进行免疫时，可在人体内诱导出针对尽可能多的病毒变异体的尽可能广泛的免疫应答，在理想的情况下还会抵抗所有的HIV变异体。当利用该GP120混合物进行治疗时，能够对抗中和抗体的减少以及HIV特异性细胞免疫应答的丧失。
根据本发明还可首次制备出gp120克隆，这些克隆在观测到的序列变异的性质或种类方面与HIV感染患者或AIDS患者的血浆分离物相当(参考M.Schreiber et al.，J.Virol.68 No.6(1994)3908-3916)。与目前的其它多种方法相比，本文并不使用分离的GP120分子或其抗原性片段来进行免疫，而是使用含有多种序列变异体的蛋白混合物来进行免疫，这些序列变异体的特征在于一种完整的GP120序列，此外还含有符合GP120分子天然折叠的适当三级结构。疫苗中的病毒变异体的构象对由其产生的序列变异体和结构变异体而言十分重要，产生的这些变异体与病毒性疾病过程中检测到的GP120变异体相比应具有尽可能相似的序列变异，并且还应具有与CD4和共同受体结合所需的构象，这样采用能实现有效的免疫刺激。
本发明提供一种可作为蛋白疫苗的GP120蛋白混合物。同时，本发明还提供一种编码该蛋白混合物的基因混合物。这些基因可被转移到适于在人体内直接使用的载体中(DNA疫苗)(Ulmer et al.，1995Ann NY Acad Sci 772117-125；Donnelly et al.，1995 Ann NY AcadSci 1995 77240-46)。DNA疫苗的优势在于，DNA载体混合物的异质性要高于重组GP120蛋白混合物的异质性。产生高异质性DNA载体混合物也更容易。这种DNA疫苗所覆盖的HIV变异体谱要宽得多。从技术观点来看，制备DNA混合物也更容易。使用DNA疫苗的前提是要有一种带有BstEII和BamHI这两种酶切位点的gp120表达载体。这样才能够把V3环和V2环可变的env基因片段转换到载体中。
对于GP120蛋白，则应该牢记V3环区域中有5个潜在的N-糖基化位点。糖基能够使V3环不被中和抗体识别。与糖基化不完全的病毒变异体相比，含有糖基化V3环的病毒变异体的被中和能力更低。由于V3环被完全糖基化的病毒变异体可逃离中和免疫应答，因此它们是感染转移与建立的重点。如果某一部分中和抗体应答在疾病过程中丧失，则V3环未完全糖基化的病毒变异体可自行加以建立。由于其V3环不再被糖基所覆盖，这些病毒变异体能够比V3环完全糖基化的突变体复制得更快。因此，根据本发明，在构建GP120疫苗时应把GP120 V3环的各种糖基化作用考虑在内。
在本发明的框架内，根据HIV提出的原则也适用于能够在病毒性疾病过程中形成变异体的其它病毒。特别是可产生抗多种病毒的疫苗，该疫苗能够在人体内诱导出抗多种病毒变异体的广谱免疫应答，在理想的情况下可抗所有的变异体。在利用这些疫苗进行治疗时，可有效地对抗中和抗体的减少以及HIV特异性细胞免疫应答的丧失。对能够在疾病过程中形成若干种蛋白的多种序列变异体的病原体类型(病毒)而言，为了抑制针对所有可能的病毒变异体的中和抗体的减少，本文还可以使用，甚至推荐使用，若干种本发明的基因盒，每种基因盒所包含的核酸序列编码这些蛋白或其片段中的一种的变异体。
在本发明的框架内，为了提高对病毒性疾病的预防性和/或治疗性处理的成功率，可将蛋白疫苗和DNA疫苗的优点进行有机地结合。因此，本发明还提供一种药用组合物用于病毒性感染的预防和/或治疗，该药用组合物含有一种蛋白混合物和一种核酸混合物，蛋白混合物含有一种病毒蛋白或其片段的序列变异体，核酸混合物含有编码一种病毒蛋白或其片段的序列变异体的DNA分子。特别地，该药用组合物是含有蛋白混合物与核酸混合物的一种组合制剂，其中蛋白混合物含有上述GP120蛋白序列变异体中的一种，核酸混合物则来源于SEQID NO1或SEQ ID NO11的上述env序列或其片段。
以下将利用实施例、附图及序列议定书对本发明进行阐述。
实施例1.制备方法概述1.1 V3环编码寡核苷酸的克隆1.2 V3 env变异体的克隆1.3 可变性分析
2.材料与方法2.1缩略语2.1.1 一般缩略语2.1.2 核酸2.2细菌菌株2.3质粒2.4酶2.5化学试剂2.6寡核苷酸2.7分子量标准2.8所用试剂盒2.9培养基2.10 溶液灭菌2.11 细菌的培养和保存2.12 感受态细胞的制备2.13 转化至大肠杆菌2.14 质粒-DNA的制备2.15 在琼脂糖凝胶中分离DNA2.16 从琼脂糖凝胶中纯化DNA2.17 从聚丙烯酰胺凝胶中分离DNA2.18 DNA酶切2.19 DNA的连接2.20 DNA测序2.21 利用寡核苷酸制备双链DNA2.22 COS细胞和CHO细胞的转染2.23 GP120混合物的层析纯化2.24 DNA疫苗的制备1.制备方法概述1.1 gp120的V3环变异体混合物的克隆如2.6节所述合成寡核苷酸。V3环序列的实例是HIV-1患者分离物F1-01(M.Schreiber et al.，J.Virol.68 no.6(1994)3908-3916)的一种突变序列。也可以是其它任何序列或序列混合物。克隆V3环序列的多种不同变异体时使用的是混合物，而不是该序列特定位置的纯核苷酸成分。由此可获得一种寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的序列各不相同，从而可编码不同的V3环。这些寡核苷酸混合物也被称为带有简并序列的寡核苷酸。不同V3环的编码区起始于化学合成的这些带有简并序列的寡核苷酸。
按读码框方向(正向)合成一种由BglII酶切位点至第一个简并位点的env序列段寡核苷酸。根据从可变区起始点前15个碱基位置开始的序列，按互补方向(反向)合成第二种寡核苷酸(2.6节的方法)。通过3’区共15个碱基的重叠可将两种寡核苷酸进行杂交。随后用DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶或Klenow片段)进行反应，可由这两种杂交的寡核苷酸产生完整的双链DNA分子(2.21节的方法)。
用限制性内切酶BglII和XbaI将所得的DNA混合物消化。在BglII和XbaI酶切的表达载体ΔV3 pBSCenvV3中克隆该DNA混合物(2.15节和2.16节的方法)。
该载体含有HIV-1病毒株NL4-3(IIIB)的gp160编码序列。对NL4-3 env基因进行操作，使其具有BglII和XbaI以及ApaLI、PstI和BclI的限制酶切位点各一个。将位于BglII与XbaI酶切位点之间的V3环编码区切除并替换成一种含15个碱基对的序列，由此可引入AscI的一个分析酶切位点。将BglII-和SbaI-酶切的V3环DNA混合物克隆到该载体中(2.19节的方法)。最终的V3环pBSCenvV3载体中AscI酶切位点的丧失可用于V3环编码克隆的筛选(2.18节的方法)。
将所得的质粒混合物转化到DH5α细菌中(2.12节的方法)，所得转化率需＞105。由此可获得大小约105个克隆的V3环片段基因库。通过DNA测序分析该混合物(见1.3)。通过这种方法可获得各自编码不同的GP120蛋白V3环变异体的克隆混合物。该载体混合物可作为起始产物，用来制备充当接种体的蛋白混合物，也可作为DNA疫苗的起始产物。
当制备GP120蛋白混合物时，可将pBSCenvV3表达载体转染到COS细胞和CHO细胞中(2.22节的方法)。不同GP120蛋白，即活性成分混合物，的纯化可如文献所述根据2.23节的方法进行。
1.2 gp120的V2环变异体混合物的克隆以同样的方法可制备出V1环变异体和V2环变异体。表达载体ΔV3-pBSCenvV3中有3个额外的限制酶切位点可用于此目的。通过克隆到ApaLI与PstI酶切位点之间可获得V1环变异体。通过克隆到PstI与BclI酶切位点之间可获得V2环变异体。
1.3可变性分析通过DNA测序来对V3环混合物进行分析(2.20节的方法)。从统计学角度，计划挑选约100-200个克隆来测定其V1、V2和V3环的序列。如果这些克隆均不相同，则可通过统计核算来衡量基因库的异质性以及蛋白混合物的异质性。
2.材料与方法2.1缩略语缩略语2.1.1一般缩略语μg微克μl微升mol微摩尔APS过硫酸铵bp 碱基对dNTP 脱氧核糖核苷三磷酸DNA脱氧核糖核酸DTT二硫苏糖醇EDTA 乙二胺四乙酸g 克GP 糖蛋白h 小时HIV人免疫缺陷病毒IPTG 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷MOPS 3-吗啉代丙磺酸
OD光密度PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR 聚合酶链反应RT室温TEMED N，N，N’，N’-四甲基乙二胺2.1.2核酸A腺嘌呤C胞嘧啶G鸟嘌呤T胸腺嘧啶2.2细菌菌株大肠杆菌DH5αF-，endA1，hsdr17，(rk-mk+)，su-pE44，recA1，λ-，gyrA96，relA1，Φ80d lac zΔM152.3质粒pBSCenvATG自己设计，序列显示于SEQ ID NO102.4酶限制酶MBI-Fermentas，Gibco-BRL，BiolabsDNA聚合酶 MBI-Fermentas，Gibco-BRT4-DNA连接酶 MBI-Fermentas2.5化学试剂[α-35S]dATP Amersham Life Science琼脂糖，超纯 GIBCO BRL过硫酸铵 Merck氨苄青霉素US BiochemicalBacto-AgarBecton DickinsonBacto-Trypton Becton Dickinson硼酸 Merck
溴酚蓝 Merck氯化钙 Merck脱氧核糖核苷酸 MBI-Fermentas二硫苏糖醇 Biotechnik，St.Leon-Rot冰醋酸 Merck溴化乙锭 Sigma乙二胺四乙酸 Merck甘油 Merck脲 ICN Biomedicals酵母抽提物 Becton Dickinson氯化钾 Merck磷酸二氢钾 Merck氯化镁 Merck丙烯酰胺混合物 Roth醋酸钠 Merck氯化钠 Merck磷酸氢二钠 Merck磷酸二氢钠 Merck2-丙醇 MerekSigmacote(氯化聚硅氧烷)SigmaN，N，N’，N’-四甲基乙二胺 Merck三羟甲基氨基甲烷 GIBCO BRL2.6寡核苷酸下列所有寡核苷酸都是利用PE Biosystems(Weiterstadt)的ExpediteTM核酸合成仪来加以制备。这些寡核苷酸可用于仅V3环序列各不相同的env基因的克隆。以HIV-1患者分离物F1-01的V3环区克隆为实例可采用下列寡核苷酸序列。
V3环用于正向克隆到pNL4-3/BglII-NheI，F1-01中5′-AAG ATG TAG TAA TTA GAT CTG CCA ATT TCA CAG ACA ATG CTA AAACCA TAA TAG TAC AGC TGA ACA CAT CGT TAG AAA TTA ATT GTA CAA GACCCA ACA ACA AT ACA-3′(SEQ ID NO3)V3环用于克隆到pNL4-3/BglII-NheI，F1-01中5′-TTT TGC TCT AGA AAT GTT ACA ATG TGC TTG TCT TAT GTC TCC TGTTGC AGC TTC TGT TGC ATG AAA TGC TCT CCC TGG TCC GAT ATG GAT ACTATG-(GA)(AT)(GATC)TTT TCT TGT ATT GTT GTT GGG-3′(SEQ ID NO4)在对V3环克隆进行测序时，使用的是寡核苷酸7010、7011和M13标准引物(M13、M13r)。
引物70105′-CCA TGT ACA AAT GTC AG-3′(SEQ ID NO5)引物70115′-AAA ACT GTG CGT TAC AA-3′(SEQ ID NO6)M13引物5′-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3′(SEQ ID NO7)M13r引物5′-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3′(SEQ ID NO8)2.7分子量标准1kb梯度标准MBI-Fermentas100bp梯度标准MBI Fermentas2.8所用试剂盒T7测序试剂盒PharmaciaQiaquick PCR纯化试剂盒QiagenQiagen质粒试剂盒Qiagen2.9培养基YT 培养基10g 胰蛋白胨5g 酵母抽提物5g NaCldYT 培养基16g 胰蛋白胨
10g 酵母抽提物5gNaCldYT 琼脂平板10g 胰蛋白胨5g酵母抽提物5gNaCl15g 琼脂提供的量都需溶于1000ml去离子水。混合物于121℃和1.5巴条件下高压灭菌20分钟。若培养基中需加入抗生素或其它热敏试剂，则可将相应量的试剂过滤除菌，并在培养基冷却后加入。
氨苄青霉素 3.3ml/l(60mg/ml)IPTG3ml/l(100mM)xgal3ml/l(以2％浓度溶于DMF，无需过滤)2.10溶液及器具灭菌溶液、培养基以及移液枪头、Eppendorf管和玻璃仪器都是在121℃和1.5巴条件下高压灭菌20-40分钟。热敏溶液，如抗生素和IPTG，为过滤除菌。
2.11细菌的培养和保存细菌培养物均为单克隆接种培养。分离单克隆的方法是，将细胞的液体培养物涂布在琼脂平板上。经37℃保温过夜后生长出分离的克隆。细菌的短期保存方法是，用石蜡膜将琼脂平板密封后保存于4℃。细菌菌种的长期保存方法是，将0.75ml过夜培养的YT培养物与0.25ml无菌甘油混合，在液氮中快速冷冻后保存于-70℃。
2.12感受态细胞的制备将100μl过夜培养物接种到100ml YT培养基中。在37℃的振荡培养箱中使细菌生长至OD560＝0.4，然后于4℃和1000g条件下离心8分钟。以后的所有工作都是在冰上进行，并且使用预冷的容器和4℃的冷溶液。将细胞重悬于50ml 50mM CaCl2，再于冰上保温30分钟。再次离心，然后将细菌重悬于2.5ml无菌的TFBII缓冲液中，并分装成每份100μl。这些100μl每份的感受态细胞在无需进行立即转化时可在液氮中快速冷冻后保存于-70℃。
TFBII缓冲液10mMMOPS pH7.075mMCaCl210mMKCl15％甘油2.13转化至大肠杆菌(Hanahan，J.Mol.Biol.166(1983)557-580)取一份100μl的感受态细胞置冰浴上溶解，然后在0℃下与1-100ng质粒-DNA保温30分钟。再将转化混合物于42℃保温1分钟。然后加入1ml YT培养基，并在37℃下振荡1小时。为了筛选出被转化的细胞，可将100-500μl该混合物涂布在含有抗生素的YT琼脂平板上。37℃培养过夜后，生长出的克隆均带有质粒编码的抗性基因。在对不含有任何功能性β-半乳糖苷酶的细胞(lacZΔM15突变，如DH5α)进行转化时，所用的pUC等质粒可以借助质粒编码的β-半乳糖苷酶直接对重组细菌进行筛选(蓝白筛选)。进行蓝白筛选的方法是，将细菌涂布在Amp/IPTG/Xgal-YT琼脂平板上。β-半乳糖苷酶可将底物Xgal分解成一种蓝色染料。由于将外源DNA片段插入lacZ基因可使该基因的读码框被破坏，所以产生的为白色克隆。反之，蓝色克隆则意味着lacZ基因在克隆和连接过程中仍具有功能，因而没有任何DNA插入。
2.14质粒-DNA的制备(Qiagen，Hilden)从大肠杆菌中分离质粒-DNA使用的是Qiagen的QIAprep SpinMiniprep试剂盒。DNA的制备是根据厂商说明(Qiaprep Plasmid手册03/95)来进行。将含有质粒的大肠杆菌接种到dYT-amp培养基中并于37℃下振荡过夜。取3ml大肠杆菌过夜培养物用于分离质粒。收集细胞(Heraeus离心机14000rpm，1分钟)并重悬于250μl P1缓冲液。利用碱裂解方法(250μl，0.2N NaOH/1％-SDS)使细菌分解。加入3M醋酸钾(350μl，pH5.5)来中和所得混合物。根据质粒DNA与DEAE阴离子交换柱的特异性结合来纯化质粒DNA。质粒DNA在选定的盐浓度和pH条件下能够与DEAE填料结合。清洗DEAE填料(750μl，PE缓冲液，Qiagen)。然后用50μl H2O洗脱质粒DNA并保存于-20℃。
利用25ml过夜培养物来提取更大量的质粒DNA(约100μg)。DNA的纯化使用的是QIAGEN Plasmid Midi试剂盒。此时，纯化的基本原理如“QIAprep Spin Miniprep试剂盒”所述，并根据厂商说明(QIAGEN质粒纯化手册01/97)来进行。
2.15在琼脂糖凝胶中分离DNA通过琼脂糖凝胶电泳来分离DNA。根据待测片段的大小，在煮沸的TBE缓冲液(用于分析型琼脂糖凝胶)或TAE缓冲液(用于制备型琼脂糖凝胶)中溶解0.8-2％的琼脂糖。待凝胶液冷却至约60℃后，与1μl溴化乙锭(10mg/ml)混合，并倒入插有梳子的预制胶板中。待凝胶完全冷却后，放入电泳槽并用TBE或TAE缓冲液浸没，取出梳子。将DNA样品与1/5体积的包被缓冲液混合，然后加到样品孔中。在5-10伏/cm胶长的电压下电泳0.5-2小时，使各片段分离。电泳后的检测方法是将凝胶置UV透射光下照相。通过与同时电泳的DNA分子量标记的比较估算出DNA条带的分子量。
TBE缓冲液100mMTris100mM硼酸3mM EDTATAE缓冲液40mMTris2mM EDTA0.114％ 冰醋酸包被缓冲液0.25％溴酚蓝0.25％二甲苯蓝
30％甘油50mMEDTA2.16从琼脂糖凝胶中纯化DNA从琼脂糖凝胶中提取DNA使用的是“QIAquick凝胶提取试剂盒”(Qiagen，Hilden)。选择适当的缓冲液条件，使核酸能够与柱子的硅质膜结合，而小分子量的细菌组分则穿过该膜(2.15节的方法)。该方法是根据QIAquick Spin手册07/97的“QIAquick凝胶提取试剂盒流程”来进行的。然后均用50μl H2O将纯化的DNA从硅质膜上洗脱。
2.17从聚丙烯酰胺凝胶中分离DNA利用变性聚丙烯酰胺凝胶对放射性标记的DNA片段进行分离，以实现DNA测序。将两块干净的玻璃板用乙醇清洗，以去除油脂残留物，每块板用1ml Sigmacote包被，以获得疏水表面。通过包被可避免此后从玻璃板上剥离凝胶时将凝胶撕裂。在两块玻璃板间加上垫片，这样也可起到侧面密封的作用。再用若干个夹子固定整个装置。测序胶的制备方法是，将21g脲溶解在约20ml水中。再加入7.5ml丙烯酰胺混合物和5ml 10×TBE缓冲液(见2.15节)，然后用水将混合物定容至50ml。加入300μl APS和100μl TEMED使凝胶开始聚合。然后立即把凝胶溶液倒入装好的凝胶装置中，并插入齿状平接梳使孔底定形。将凝胶水平放置于室温下，直至完全聚合。把凝胶插入胶槽中，并在槽中加满TBE缓冲液。旋转齿状梳以形成加样孔。然后预电泳20分钟，以把凝胶加热到最佳工作温度。用TBE缓冲液彻底清洗加样孔，然后加入4-5μl样品。在2kV(150watt)电压下电泳约2-3小时。电泳完成后，从胶槽中取出凝胶，并小心地掀起一块玻璃板。通过敷设和轻压将凝胶转移到Schleicher & Schuell纸上(Whatman，England)。在80℃和真空条件下干燥，然后于室温下将凝胶在X射线胶片(Kodak BioMax MR-1，Sigma Deisenhofen)上暴露1-3天。
丙烯酰胺混合物40％ 聚丙烯酰胺
0.8％ 双丙烯酰胺2.18 DNA酶切限制性内切核酸酶可识别并水解长度约4-8个核苷酸的酶特并性DNA回文序列。水解后可根据酶的类型而产生平末端或单链DNA突出的末端。限制性消化的方法是在厂商指定的缓冲液中将0.1-60μgDNA与2-120单位限制酶37℃共保温2-5小时。总体积为10-300μl，10μl用于分析型混合物，300μl用于制备型混合物。用两种不同的酶进行限制性消化的方法是选择一种能够使两种酶均具有足够活力的缓冲液，如选择EcoRI缓冲液用于EcoRI/BamHI消化，或是与第一种酶保温后再调整成第二种酶所需的条件。
2.19 DNA的连接DNA连接酶可通过消耗NAD+或ATP而在游离的5’磷酸基和3’羟基之间形成磷酸二酯键，从而催化DNA分子的连接。在连接缓冲液中将3-5倍过量的DNA片段与100-500ng已酶切质粒、5单位的T4-DNA连接酶以及10nmol ATP一同12℃保温过夜。只有粘末端才会连接。
连接缓冲液40mMTris-HCl pH7.810mMMgCl210mMDTT0.5mM ATP2.20 DNA测序(Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977)5463-5467)DNA测序的实施采用的是链终止法。底物为双链质粒DNA。在dNTPs存在的情况下，可利用DNA聚合酶从寡核苷酸引物开始由单链DNA合成双链DNA。由于DNA聚合酶不能区别dNTPs与ddNTPs，因此当核苷酸混合物中含有一小部分双脱氧核苷酸(ddNTPs)时，会产生随机分布的ddNTPs结合。由于ddNTPs缺乏3’-羟基，所以这种结合会使双链合成终止，并且由于其发生位置符合统计学规律，因而会产生长度不同的DNA单链。由于合成混合物被分成四份样品，每份样品只含有四种ddNTPs中的一种，因此各混合物中产生的是碱基特异性的链终止。反应中可加入α-35S-dATP以标记合成的单链。在通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA变性并分离之后，可通过放射自显影检测DNA条带，并直接读出DNA链的序列。
测序是利用T7-测序试剂盒(Pharmacia)并根据厂商说明来进行。使用的寡核苷酸引物为M13通用引物(Pharmacia)或M13r引物。于室温下用8μl 2M NaOH将32μl(约2μg)纯化的双链质粒DNA变性10分钟。加入7μl 3M醋酸钠，pH4.8、4μl H2O和120μl-20℃的乙醇，然后于-70℃将DNA沉淀20分钟。离心(15分钟，4℃)分离DNA，并用-20℃的70％冷乙醇洗两次，再置真空离心机中干燥。然后将DNA沉淀重悬于10μl H2O，加入2μl退火缓冲液和2μl引物溶液(以10pmol浓度溶于水)，使其与寡核苷酸引物在65℃下杂交5分钟，再于37℃杂交10分钟，然后在室温下杂交5分钟。此后，为了使引物延长并标记上放射性，立即加入3μl标记混合物、1μl α-35S-dATP(1000 Ci/mmol，10μCi/μl)和2μl T7聚合酶溶液(用酶稀释缓冲液稀释至1∶5)，并于室温下保温5分钟。将该混合物分装成每份4.5μl，然后各加入2.5μl四种不同的dNTP/ddNTP混合物中的一种，再放到预热至37℃的MicroSamplePlate(Greiner)上。37℃保温5分钟以促进延长和碱基特异性终止，然后加入5μl终止液结束反应。将样品置80℃变性2分钟，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。样品可保存于-20℃。
退火缓冲液1M Tris-HCl pH7.6100mM MgCl2160mM DTT标记混合物1.375μMdCTP1.375μMdGTP1.375μMdTTP333.5mM NaCl酶稀释缓冲液20mMTris-HCl pH7.5
5mM DTT100μg/mlBSA5％ 甘油终止液10mM EDTA97.5％甲酰胺0.3％ 溴酚蓝0.3％ 二甲苯蓝A-混合物840μM dCTPC-混合物840μM dATP840μM dGTP 840μM dGTP840μM dTTP 840μM dTTP93.5μM dATP 93.5μM dCTP14μM ddATP 14μM ddCTP40mM Tris-HCl pH7.6 40mM Tris-HCl pH7.650mM NaCl 50mM NaClG-混合物840μM dATPT-混合物840μM dATP840μM dCTP 840μM dCTP840μM dTTP 840μM dGTP93.5μM dGTP 93.5μM dTTP14μM ddGTP 14μM ddTTP40mM Tris-HCl pH7.6 40mM Tris-HCl pH7.650mM NaCl 50mM NaCl2.21利用寡核苷酸制备双链DNA将寡核苷酸置60℃杂交，用来制备DNA混合物。每种核苷酸用100pmol。取1pmol杂交样品用于PCR，或取100pmol杂交样品用于Klenow反应。
PCR采用以下循环起始 10分钟 94℃30个循环 1分钟 94℃
1分钟 45℃1分钟 72℃结束10分钟 72℃取1pmol杂交的寡核苷酸作为PCR的DNA模板。所有PCR反应采用的PCR引物终浓度为0.1pmol/μl。每50μl反应混合物使用1单位Taq聚合酶。PCR混合物中的dNTPs浓度设定为0.1mM。
为了通过Klenow反应制备DNA混合物，将100pmol杂交的寡核苷酸溶解于Klenow缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0；50mM MgCl2，10mM DTT，0.05mM dNTP)。加入5单位DNA聚合酶I(Klenow片段)开始反应。于37℃反应30分钟，然后加热至75℃(10分钟)终止反应。
2.22 COS细胞和CHO细胞的转染将5-10μg线性化质粒DNA溶解于150μl细胞培养基(不含FKS和抗生素)。并在该溶液中加入30μl转染剂(SuperFect，Qiagen，Hilden)。将该混合物置室温保温10分钟，再加入1ml培养基，然后加入细胞。在60mm平板中培养COS细胞(生长至80％铺满)，用PBS冲洗细胞，然后立即进行转染。在37℃和5％CO2条件下保温3小时，然后去除转染剂。再用PBS将细胞冲洗四次，然后把细胞加到选择性培养基中(DMEM，5％FKS，600μg/ml Geneticin)。
2.23 GP120混合物的层析纯化根据常规方法(HIV Research，Aldovini & Walker，StocktonPress，1990；S.W.Pyle et al.，从人免疫缺陷病毒(HIV)感染的H9细胞培养液中纯化12000道尔顿的包膜糖蛋白，AIDS Res HumRetroviruses 1987，3387-400中的技术)进行层析纯化。分离GP120混合物使用的是表达GP120的COS细胞的细胞抽提物和细胞培养悬浮物。将裂解物离心(25,000g)，然后按如下步骤进行纯化1.凝胶过滤(Sephadex G-20)2.免疫亲和层析(与CH-sepharose 4B结合的抗GP120抗体)3.利用蛋白沉淀作用进行浓缩4.通过透析进行浓缩
2.24 DNA疫苗的制备制备DNA疫苗的原料是可用来制备GP120蛋白混合物的env基因BstEII-BamHI DNA片段混合物。将已被证明可用于DNA接种的HIV-1GP120真核表达载体(参考，例如，J.D.Boyer et al.，J Infect Dis1997，1761501-1509；J.D.Boyer et al.，Nat Med 1997，3526-532；M.L.Bagarazzi et al.，J Med Primatol 1997，2627-33)加以修饰，使env基因中的BstEII和BamHI酶切位点位于gp120读码框的相同位置。再把突变的可变env基因片段(BstEII-BamHI)克隆到该载体中。对env基因的V2环和V3环区域进行修饰的方法以及将其克隆到DNA疫苗载体中的方法类似于制备gp120混合物时采用的克隆步骤。
权利要求
1.含有病毒蛋白分子混合物的蛋白疫苗，其特征在于这些分子为单一病毒蛋白或其片段的序列变异体。
2.权利要求1的蛋白疫苗，其特征在于该混合物含有≥102种序列变异体。
3.权利要求2的蛋白疫苗，其特征在于该混合物含有≥103种序列变异体，优选的则含有≥104种序列变异体。
4.权利要求1-3之一的蛋白疫苗，其特征在于含有一种HIVGP120蛋白混合物，这些GP120蛋白的氨基酸序列在V2环区和/或V3环区彼此各不相同。
5.可编码结构不同的病毒蛋白的一种混合物的DNA疫苗，其特征在于该疫苗含有一种病毒DNA分子或其片段的序列变异体混合物。
6.权利要求2的DNA疫苗，其特征在于含有一种DNA分子混合物，这些DNA分子可编码一种病毒蛋白或其片段的序列变异体。
7.权利要求5或6的DNA疫苗，其特征在于该混合物含有≥102种DNA分子，这些DNA分子的核酸序列彼此各不相同。
8.权利要求7的DNA疫苗，其特征在于该混合物含有≥103种DNA分子，优选的则含有≥104种DNA分子，这些DNA分子的核酸序列彼此各不相同。
9.权利要求5-8之一的DNA疫苗，其特征在于可编码一种不同结构的HIV GP120蛋白的混合物，其中该疫苗含有一种DNA分子混合物，这些DNA分子的核酸序列在V2环编码区和/或V3环编码区彼此各不相同。
10.权利要求9的DNA疫苗，其特征在于含有一种DNA分子混合物，这些DNA分子的核酸序列彼此各不相同，从而可编码一种GP120蛋白混合物，这些GP120蛋白所包含的氨基酸序列在V2环和/或V3环区彼此各不相同。
11.来源于SEQ ID NO1所列env基因序列或其片段的核酸序列，其特征在于经过修饰而含有唯一的单一限制位点。
12.权利要求11的核酸序列，其特征在于该序列通过引入沉寂突变而被修饰。
13.权利要求11或12的核酸序列，其特征在于含有SEQ ID NO9的序列。
14.核酸序列，其特征在于含有SEQ ID NO11的序列。
15.核酸序列，其特征在于含有SEQ ID NO12的序列。
16.含有GP120的V3环和/或V2环编码区的单链核酸序列，其特征在于V3环中长247bp的BglII-XbaI片段或长283bp的BglII-NheI片段被替换成一种修饰片段，并且V2环中长139bp的PstI-BclI片段或长339bp的PstI-EcoRI片段被替换成一种修饰片段，这种/这些片段均在至少6个位置，优选的为9-20个位置，上含有次黄苷或存在核酸互换。
17.含有GP120的V2环和/或V3环编码区的单链核酸序列，其特征在于V3环中长247bp的BglII-XbaI片段或长283bp的BglII-NheI片段被替换成一种修饰片段，并且V2环中长139bp的PstI-BclI片段或长339bp的PstI-EcoRI片段被替换成一种修饰片段，这种/这些片段均在至少6个位置，优选的为9-20个位置，上含有一个突变。
18.双链DNA，含有权利要求16的单链核酸序列与权利要求17的单链核酸序列的杂交体。
19.含有双链DNAs的核酸混合物，这些双链DNA的核酸序列来源于SEQ ID NO1或SEQID NO11的env序列或其片段，其特征在于这些核酸序列在V2环编码区和/或V3环编码区彼此都各不相同。
20.权利要求19的核酸混合物，其特征在于这些核酸序列彼此各不相同，从而可编码一种蛋白混合物，这些蛋白的氨基酸序列在V2环和/或V3环区彼此都各不相同。
21.权利要求20的核酸混合物，其特征在于该混合物含有≥102种序列变异体。
22.权利要求21的核酸混合物，其特征在于该混合物含有≥103种序列变异体，优选的则含有≥104种序列变异体。
23.含有GP120蛋白序列变异体的蛋白混合物，其特征在于该混合物中的所包含的氨基酸序列在V2环和/或V3环区彼此都各不相同。
24.权利要求23的蛋白混合物，其特征在于该混合物含有≥102种序列变异体。
25.权利要求24的蛋白混合物，其特征在于该混合物含有≥103种序列变异体，优选的则含有≥104种序列变异体。
26.质粒，含有权利要求18的一种双链DNA插入片段。
27.表达载体，其特征在于含有权利要求11-15的一种核酸序列插入片段。
28.权利要求27的表达载体，其特征在于含有SEQ ID NO10的序列。
29.表达载体，其特征在于与DSM 12612相应。
30.含有权利要求26的质粒混合物的载体混合物，其特征在于所含质粒的核酸序列在V2环编码区和/或V3环编码区彼此都各不相同。
31.权利要求30的载体混合物，其特征在于该混合物含有≥102种质粒，这些质粒的核酸序列彼此各不相同。
32.权利要求31的载体混合物，其特征在于该混合物含有≥103种质粒，优选的则含有≥104种质粒，这些质粒的核酸序列彼此各不相同。
33.权利要求30-32之一的载体混合物，其特征在于这些质粒可在大肠杆菌宿主细胞内表达。
34.权利要求30-32之一的载体混合物，其特征在于这些质粒可在真核宿主细胞内表达，优选的可在Cos、CHO或BHK细胞内表达。
35.被权利要求33的载体混合物转化的大肠杆菌宿主细胞。
36.被权利要求34的载体混合物转化的真核宿主细胞。
37.权利要求36的真核宿主细胞，其特征在于该宿主细胞选自Cos、BHK或CHO细胞。
38.制备权利要求12的核酸序列的方法，其特征在于将一定数量的沉寂突变引入到编码一种病毒蛋白的核酸序列中，使所得核酸序列只含有单一限制位点。
39.权利要求38的方法，其特征在于编码一种病毒蛋白的该核酸序列为SEQ ID NO1或SEQ ID NO11的序列或其片段，该核酸序列被引入一定数量的沉寂突变，从而只含有单一限制位点。
40.制备权利要求33和34的载体混合物的方法，其特征在于将核酸序列在V2环编码区和/或V3环编码区彼此都各不相同的质粒连接到可在宿主细胞，优选的为大肠杆菌、Cos、CHO或BHK细胞内表达的载体中。
41.制备权利要求35或36的宿主细胞的方法，其特征在于用权利要求30-32的载体混合物对这些宿主细胞进行转化。
42.制备权利要求1-4之一的蛋白疫苗的方法，其特征在于将权利要求35-37之一的宿主细胞置于能够表达病毒蛋白的序列变异体混合物的条件下加以培养。
43.制备权利要求5-10之一的DNA疫苗的方法，其特征在于该方法是按照权利要求40来加以实施，将本发明的质粒连接到一种载体中，该载体能够在待接种生物体的宿主细胞内表达。
44.结构不同病毒蛋白的混合物的应用，这些蛋白是一种病毒蛋白或其片段的序列变异体，用于制备一种疫苗，以预防和/或治疗人体内的病毒感染。
45.权利要求23-25之一的蛋白混合物的应用，用于制备一种疫苗，以预防和/或治疗人体内的HIV感染。
46.一种DNA分子混合物的在制备一种疫苗中应用，这些DNA分子可编码一种病毒蛋白或其片段的序列变异体，该疫苗用以预防和/或治疗人体内的病毒感染。
47.权利要求19-22的核酸混合物的在制备一种疫苗中应用，该疫苗用以预防和/或治疗人体内的病毒感染。
48.权利要求19-22之一的核酸混合物在制备权利要求30-32之一的载体混合物中的应用，这些载体可在宿主细胞内表达，这些宿主细胞选自大肠杆菌、Cos、CHO和BHK细胞。
49.权利要求30-32之一的载体混合物的应用，用于表达权利要求23-25之一的蛋白混合物。
50.权利要求35-37之一的宿主细胞的应用，用于制备权利要求23-25之一的蛋白混合物。
51.用来预防和/或治疗病毒感染的药用组合物，其特征在于含有一种蛋白混合物和一种核酸混合物，所述蛋白混合物含有一种病毒蛋白或其片段的序列变异体，所述核酸混合物含有可编码一种病毒蛋白或其片段的序列变异体的DNA分子。
52.权利要求51的药用组合物，其特征在于含有权利要求23-25的一种蛋白混合物和权利要求19-22的一种核酸混合物。
全文摘要
本发明涉及一种药用组合物或疫苗,该药用组合物或疫苗含有一种病毒蛋白分子混合物,这些病毒蛋白分子是单一病毒蛋白或其片段的序列变异体。本发明还特别涉及一种DNA疫苗,该DNA疫苗可编码不同结构病毒蛋白的一种混合物,该疫苗含有一种病毒DNA分子或其片段的序列变异体的混合物,这些序列变异体可编码一种病毒蛋白或其片段的序列变异体。根据本发明的优选形式,这些病毒蛋白是人免疫缺陷病毒(HIV)GP120蛋白的序列变异体,这些序列变异体的氨基酸序列在V2环区和/或V3环区各不相同。本发明还涉及该病毒疫苗制剂,包括中间阶段或中间构建体,以及与其相关的制备方法和应用。
文档编号A61K35/76GK1348496SQ99816561
公开日2002年5月8日 申请日期1999年12月3日 优先权日1999年2月12日
发明者M·施雷贝尔 申请人:斯特拉思曼股份两合公司