一种制备高支化多糖-丝素水凝胶支架的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种制备高支化多糖-丝素水凝胶支架的方法。属于天然高分子材料
技术领域，该种高支化多糖-丝素水凝胶H维贯通多孔支架可广泛应用于组织工程材料和 生物医用药物可控释放等行业。
【背景技术】
[0002] 高分子水凝胶具有一定弹性、H维贯通多孔结构，适合模拟细胞外基质、提供适 合细胞生长所需的H维微环境及细胞和细胞外基质之间的生物物理信号，维持细胞正常表 型与生理功能。多糖是一类可降解天然高分子，来源丰富，在组织工程及药物控制释放材料 中应用广泛。天然多糖可W与蛋白质、其他多糖或其他生物大分子通过氨键或静电引力进 行络合，或通过化学修饰后交联形成水凝胶。多糖水凝胶作为一种良好的支架材料，不仅仅 取决于它的生物相容性，更重要的是它的独特化学结构、可生物降解性、低毒等特性，而且 该些特性可被反复重新设计及改造，因此优于合成高分子水凝胶。研究证实，天然多糖及其 衍生物水凝胶已可W成功将细胞植入其中，为细胞增殖及组织再生提供生长条件。目前，研 制理想的人工支架材料代替器官移植手术修复组织缺损或病变，是生物材料科学和医学领 域的重要课题之一。然而，在人工支架材料中，随着细胞不断生长和分化，边界处的细胞将 耗尽氧气和营养物质，使得支架内部细胞坏死，从而限制均一性人工骨组织的形成。由于缺 乏必要的血管组织导致较大尺寸人工组织内部得不到营养供应而坏死，因此无法满足移植 手术之所需。血管化组织工程材料可维持细胞增殖、分化所需的营养物质、氧气持续供应及 代谢产物的及时排出，W期满足临床应用的实际需要。值得注意的是：多糖水凝胶不仅在结 构上与细胞外基质相似，更重要的是，其易于灵活调控物理性能或携带各种化学信号分子， 从而诱导细胞特定的分化行为。多糖水凝胶在组织工程、药物控制释放、化妆品及日用护肤 等领域具有广阔的应用前景。
[0003] 正因为天然多糖水凝胶存在极大的应用价值，因此其制备及应用开发成为目前国 内、外研究热点之一。目前多糖水凝胶制备主要采用海藻酸轴、壳聚糖、普鲁兰等作原料。例 女口；在海藻酸轴水凝胶中包埋血管内皮细胞生长因子（VEGF)可促使内皮细胞增殖和分化 成毛细血管网络。中国专利公开号为CN102600493 A，公开日为2012年7月25日，发明名 称为"天然普鲁兰多糖水凝胶伤口敷料及其制备方法"的申请案。该申请案公开了将天然 普鲁兰多糖駿甲基化，用1- (3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亚胺盐酸盐将駿甲基化普鲁 兰多糖与脱或二元胺交联制备天然普鲁兰多糖水凝胶伤口敷料。该方法的缺点在于：所采 用的普鲁兰多糖是线性多糖，因此在药物控制释放过程中，药物在水凝胶中释放迅速，而且 有机原料二元胺或脱用量很大，存在细胞毒性等问题。中国专利公开号为CN101920045A， 公开日2010年12月22日，发明名称为"一种明胶-壳聚糖-透明质酸-硫酸肝素复合支 架及其制备方法"申请案。该申请案公开了采用明胶、壳聚糖、透明质酸及硫酸肝素四中材 料，W不同配比混合得到不同浓度的混合物，通过冷冻干燥法制取复合支架，支架成型后再 用碳二亚胺，N-轻基玻巧醜亚胺和己醇等交联、清洗，冷冻干燥后得复合H维支架。该方法 的不足在于；由于采用冷冻成型后再交联，交联剂难w扩散到支架内部，，导致交联可能只 发生在支架表面，支架内部和表面交联不均匀。上述方法的共同缺点是；该些多糖呈线性链 构象或支化度不高，所得水凝胶支架的强度较弱，药物在水凝胶中释放迅速，因此，作为生 物医用材料应用或作为药物载体时，难W支撑细胞粘附和增殖生长，并且药物释放过快，达 不到预期的效果。因此急需寻求更好的制备方法或者利用其它独特结构的天然多糖作为水 凝胶原料。
【发明内容】
[0004] 针对上述技术存在的不足，本发明的目的是提供一种工艺简便，污染小，所得产品 具有很好的力学性能、药物可控性释放、良好的生物相容性和生物降解性的水凝胶支架制 备方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供的技术方案是： 一种制备高支化多糖-丝素水凝胶支架的方法，所述的制备方法包括W下步骤： a将干燥的虎奶茹菌核粉碎，依次用己酸己醋、丙丽进行索氏提取去除脂肪，然后将去 脂肪后的虎奶茹菌核浸泡在生理盐水中，在高压120 C温度下提取，离也得提取液，冷却提 取液后再离也且收集残渣；残渣用去离子水离也清洗且冷冻干燥得到高支化虎奶茹多糖。
[0006] b在冰水浴条件下，将虎奶茹高支化多糖分散在20 wt%化0H和异丙醇混合溶液 中，揽拌2 h后形成虎奶茹高支化多糖-NaOH-异丙醇均匀息浮液，其中虎奶茹高支化多糖 与异丙醇的质量体积比为；60:l，20wt%化0H与异丙醇的体积比为1:2. 5。
[0007] C将氯己酸溶于异丙醇中，并缓缓逐滴到经b步骤得到的虎奶茹高支化多 糖-NaOH-异丙醇均匀息浮液中，在60 C温度下反应3 h，停止反应后冷却至室温，然后用 0.5 M己酸溶液中和至抑=7,将经上述反应所得的产物用蒸觸水透析，旋转蒸发浓缩，冷 冻干燥即得駿甲基化高支化多糖，其中，高支化多糖轻基与氯己酸的摩尔比为1:5,氯己酸 与异丙醇的质量体积比为2. 63:5。
[000引 d将蚕丝在0. 5 wt%的Na2C03水溶液中煮沸40 min,用去离子水清洗甩干后得到 丝素蛋白纤维，真空干燥，干燥温度为50 C，干燥时间为12 h，将干燥后的丝素蛋白纤维磨 制成平均粒径￡3 mm的丝素粉体。
[0009] e将经d步骤得到的平均粒径￡3 mm的丝素粉体分散在9. 3 mol/血的Li化水溶 液中，在60 C温度下揽拌6 h配成丝素溶液，所得丝素溶液的浓度为5%。
[0010] f将经e步骤得到的丝素溶液在去离子水中透析3?7天，去除丝素溶液中的 LiBr，然后在20%的聚己二醇水溶液中透析，浓缩得浓度为15%的丝素溶液。
[0011] g将经C步骤得到的駿甲基化高支化多糖溶解在抑=7. 4的磯酸缓冲盐溶液中得 20?60%的溶液，将100 mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亚胺盐酸盐和150 mg/血的N-轻基玻巧醜亚胺加入到上述溶液中，揽拌15 min?4 h得活化体系，将活化体 系加入到经f步骤得到浓度为15%的丝素溶液中，在4?37 C温度下交联反应6?48 h， 得高支化多糖-丝素水凝胶支架。
[0012] 由于采用了 W上技术方案，本发明的技术方案针对高支化多糖和丝素粉体的结构 特点，制备药物可控释放且力学性能良好的高支化多糖-丝素水凝胶支架，将药物或细胞 生长因子包埋在该水凝胶支架中，利用丝素蛋白与高支化多糖的含量比例来调节水凝胶的 力学性能。高支化多糖的高支化结构形成的"小内腔"与水凝胶交联网络形成的贯通性"大 孔腔"可调控药物或细胞生长因子W不同的速率释放，从而模拟生长因子在细胞外基质中 的控制释放行为及可控诱导细胞增殖分化。此外，丝素是由结构排列规整的结晶区和疏松 的非结晶区组成，其中结晶区中的有序排列的纳米纤维和短程有序排列的聚合物链性质稳 定，对水凝胶的强度有良好的增强效果，而丝素蛋白中的非结晶区对水凝胶的初性起重要 作用。
[0013] 本发明制备高支化多糖-丝素水凝胶支架的方法与已有技术相比具有W下优点： 本发明制备方法具有操作简单，成本低廉，可在适合细胞生长的生理条件下原位制备 水凝胶，由此制备方法得到的高支化多糖-丝素水凝胶支架，用作药物载体时可控制药物 缓慢释放，提高药效；作为组织工程支架材料时可装载细胞生长因子且模拟细胞外基质控 制细胞生长因子缓慢释放的功能，从而诱导细胞增殖分化成再生组织，并且丝素蛋白的存 在，可大大提高水凝胶支架的力学性能。实验表明，本方法所得的高支化多糖-丝素水凝胶 支架具有H维贯通的多孔结构，模型分子牛血清蛋白在该水凝胶中包埋量大，且具有良好 的可控释放行为，冷冻干燥后所得的高支化多糖-丝素支架具有良好的力学性能及较高的 溶胀性能。因此，该方法可广泛应用于制备人工组织支架材料，而且在药物控制释放及食品 等领域也具有广阔的应用前景。