些研究前 没有临床异常或疾病。在每个研究中的饲养相同。
[0026] 疫巧接种
[0027] 在所有研究中，对犬皮下接种两次，在6和10周龄接种1ml相应的疫苗。
[0028] 'MR
[0029] 使用的激发菌株是问号钩端螺旋体犬血清组犬血清变型菌株Moulton、问号 钩端螺旋体黄痘出血性血清组哥本哈根血清变型菌株CF1 (两个菌株均来自化tional Leptospirosis Reference Centre, UT Biomedical Research,阿姆斯特丹，荷兰），科氏 钩端螺旋体流感伤寒血清组Bananal/Liangguang血清变型菌株11808和问号钩端螺旋体 澳大利亚血清组布拉迪斯拉发血清变型菌株As-05-lOl (两种来自美国农业部，国家动物 疾病中也）。对于四个菌株中的每一个，进行下面的程序。实际的激发材料由胆存在液氮中 的培养物制备，并在Johnson和Harris改进的Ellin曲ausen-McQillou曲培养基（Faine 1994 ；Clinical leptospirosis in humans，and clinical leptospirosis in animals ； 1邱^3口;[抓311(11邱^3口;[1'0313，〔民〔出版社，1994;第1-13、199-225 页）中传代两次。贬 存在液氮中的培养物是来自实验感染动物的再分离物：菌株CFl和11808是仓鼠肾脏再分 离物，菌株Moulton是犬肾脏再分离物，菌株As-05-lOl是犬尿液再分离物。在所有的研究 中，使用两种激发途径的组合：腹膜内（I巧注射（2ml)和结膜滴注（每只眼的腹侧结膜囊 内0. 25ml)，在第二次接种H周后进行激发。所述激发材料中的细菌细胞浓度（细胞/ml) 通过暗视野显微镜下的直接镜检总数测定，并且在0. 5至10X 109细胞/ml之间。
[0030] 檢?輪
[0031] 在每个实验过程中定期检查犬，包括使用皮下应答机测量激发后的体温。在实验 过程中，W规律的间隔通过颈静脉穿刺取血液和血清样本，用于血小板计数、细菌培养、PCR 和钩端螺旋体抗体分析。通过镜检凝集试验（MAT)针对血清组Canicola、Ictero、G;rippo 和Australis对血清样品进行分析（Faine 1994)。镜检凝集滴度表示为诱导50%凝集的最 高血清稀释度的倒数。使用Cell-Dyn 3500细胞计数器（Abbott L油oratories,雅培公园， 伊利诺伊州，美国），将使用邸TA作为抗凝剂的血液样品用于评估激发后的血小板计数。
[0032] 使用邸TA或肝素化血液用于从血液再次分离激发生物体，直到激发后21天。出 于相同的目的，W规律的间隔通过膀脫穿刺收集尿样，并且对在激发4周后解剖尸体时 获取的肾脏组织进行取样，并如此前描述进行处理化laasen HLBM，Mo化enboer MJCH， Vrijenhoek MP等.Duration of immunity in dogs vaccinated against leptospirosis with a bivalent inactivated vaccine. Vet Microbial 2003;95:121-132)。将血液、尿 和肾脏组织匀浆的样品接种到EMJH培养基中，并将培养物培育，并如Klaasen描述进行检 验。
[003引使用祀向secY基因的实时PCR，检验来自激发后0、3和7天的血清样品中来自 激发生物体的DNA的存在。该PCR是得到确认的测定，并且适合检测来自所有致病性钩端 螺旋体属种的 DNA (Ahmed A, Elnge 化 erts MFM, Boer KR 等.Development and validation of a real-time PCR for detection of pathogenic Leptospira species in clinical materials.化oS 0肥2009;4巧）；e7093)。PCR由WHO/FAO/OIE和位于荷兰阿姆斯特丹的 National Leptospirosis Reference Centre, KIT Biomedical Research 进行。PCR 结果 记为阳性、疑似或阴性。
[0034] 将激发后具有严重临床症状的犬人道安乐死。在该些情况下，进行尸体检验，包括 组织病理学检查，并且特别注意间质性肾炎的检测怔laasen 2003]。
[00巧]感染阳性的犬被定义为具有在不同日的血液（通过培养）或血清（通过PCR)或 尿/肾脏（通过培养）的至少两个阳性样品的犬，或者具有激发诱导的肾炎或钩端螺旋体 病的临床或血液学证据（血小板减少症）的犬。肾感染阳性的犬（携带动物、持续发生体） 的定义是在从激发后14天起具有尿/肾脏的至少一个阳性样品，或者激发诱导的肾炎（经 组织病理学检查证实）的犬。
[0036] 结果
[0037] 下面是四种疫苗（未稀释和稀释的）的结果。结果显示，即使在25%的稀释度，所 述疫苗仍然有助于保护犬预防感染，并保护几乎所有受激发的动物预防肾感染。
[0038] 表1 ;犬型激发菌株
[0039]
【主权项】
1. 一种组合物，其包含在柠檬酸溶液中的灭活钩端螺旋体（Leptospira)细菌的免疫 原性细胞制剂。
2. 根据权利要求1的组合物，其特征在于，所述溶液每升包含20mmol柠檬酸。
3. 根据前面任一项权利要求的组合物，其特征在于，所述溶液被缓冲在5至6之间的 pH〇
4. 根据前面任一项权利要求的组合物，其特征在于，所述钩端螺旋体细菌选自：问 号钩端螺旋体犬血清组 Portland-Vere 血清变型（Leptospira interrogans serogroup Canicola serovar Portland-Vere)、问号钩端螺旋体澳大利亚血清组布拉迪斯拉发血 清变型(Leptospira interrogans serogroup Australis serovar Bratislava)、问号 钩端螺旋体黄疸出血性血清组哥本哈根血清变型（Leptospira interrogans serogroup lcterohaemorrhagiae serovar Copenhageni)和科氏钩端螺旋体流感伤寒血清组Dadas血 清变型（Leptospira kirschneri serogroup Grippotyphosa serovar Dadas) 〇
5. 根据权利要求4的组合物，其特征在于，所述钩端螺旋体细菌是问号钩端螺旋体澳 大利亚血清组布拉迪斯拉发血清变型。
6. -种保护动物预防钩端螺旋体细菌感染的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含根据前 面任一项权利要求所述的组合物。
7. 柠檬酸用于稳定液体载体中的灭活钩端螺旋体细菌的免疫原性制剂的用途，其通过 将所述朽1檬酸溶于所述载体中。
8. 根据权利要求7的用途，其特征在于，所述制剂在高于18°C的温度下的3个月贮存 期间，保留至少25%的其抗原质量。
9. 根据权利要求7或8的用途，其特征在于，所述制剂在18°C至37°C的温度下的3个 月贮存期间，保留至少25%的其抗原质量。
10. 根据权利要求7-9任一项的用途，其特征在于，所述制剂在37°C的3个月贮存期 间，保留至少25%的其抗原质量。
【专利摘要】本发明涉及一种组合物，其包含在柠檬酸溶液中的灭活钩端螺旋体细菌的免疫原性细胞制剂。还涉及一种保护动物抵抗钩端螺旋体细菌感染的疫苗，其中所述疫苗包含该组合物，以及涉及通过将柠檬酸溶于载体中，将柠檬酸用于稳定液体载体中的灭活钩端螺旋体细菌的免疫原性制剂的用途。
【IPC分类】A61K39-02
【公开号】CN104582719
【申请号】CN201380044246
【发明人】H·L·B·M·克拉亚森, P·洛伊夫芬, E·O·里克
【申请人】英特维特国际股份有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年8月16日
【公告号】EP2884996A1, US20150216976, WO2014027083A1