诱导心肌梗塞的修复再生的多能性干细胞的制作方法
【专利说明】
【技术领域】
[0001]本发明涉及再生医疗中的细胞制剂。更具体而言，涉及含有对由心肌梗塞受损伤的心脏组织的修复及再生有效的多能性干细胞的细胞制剂。
【【背景技术】】
[0002]由冠动脉的闭塞造成的心肌坏死起因的心肌梗塞由于引起急性心脏死及慢性心脏死，成为临床医学中要解决的重要课题。特别是，在急性心肌梗塞的情况中，死亡率高达35?50%，其死亡例的60?70%是发症后I?2小时以内的死亡。另外，即使平安地度过急性期，在初次发作的心肌坏死巢大时，陷于心肌梗塞的再发或伴随其的心力衰竭的危险性高。从而，在心肌梗塞的治疗中，要求发生发作时迅速地处置，使止于尽可能小的坏死的心肌的大小，即梗塞尺寸是重要的。
[0003]例如，在重症大型心肌梗塞等的心肌梗塞中，进行左心室重塑，但知由于陷可心力衰竭而生命预后差。一般而言，对于心肌梗塞，实施血栓溶解疗法或血行再建术等的再开通疗法。但是，由再开通未得到效果，或相反由再灌流障碍等给心肌细胞损伤的情况多，用再开通疗法单独未知满足能得到治疗效果。因此，作为再开通疗法的辅助疗法进行期待心肌保护作用的药剂的探讨，尚未发现可满足的药剂。另外，在重症大型心肌梗塞的情况，使坏死心肌组织再生，只要可改善左心室重塑，预后就改善。但是，对于上述疾病，目前不存在有效的内科治疗法。
[0004]如上述一样，在心肌梗塞的治疗中，尽管要求发生发作时迅速地处置，尚无使梗塞尺寸止于小的确定的治疗方法，进行对坏死的心肌组织的再生的配合。在其中也是，近年、可贡献于组织再生的活体来源的细胞持续受到关注。作为有从成体得到的分化能力的细胞，例如，知有向骨、软骨、脂肪细胞、神经细胞、骨骼肌等的分化能的骨髓间质细胞级分(MSC)(非专利文献I及2)，但这是含各种各样的细胞的细胞组，不知其分化能力的实质，治疗效果偏差较大。另外，作为成体来源的多能性干细胞报告有iPS细胞(专利文献I等)，在iPS细胞的建立中，不仅需要向作为间质细胞的皮肤成纤维细胞级分，将特定的基因或特定的化合物导入体细胞的极其复杂的操作，也由于iPS细胞有高的肿瘤形成能力，所以存在向临床应用的极其高的障碍。
[0005]由作为本发明人之一人的出澤氏的研宄，知在间质细胞级分中存在的，无需诱导操作得到的，以SSEA-3(阶段特异性胚胎抗原-3)作为表面抗原表达的多能性干细胞(多系统分化压力耐久细胞;MuSe细胞)担负间质细胞级分具有的多能性，有可应用于目指组织再生的疾病治疗的可能性。另外知，Muse细胞可通过将间质细胞级分用各种应激刺激来浓缩。(专利文献2 ;非专利文献3)。但是，对于将Muse细胞用于重症大型心肌梗塞等的心肌梗塞及伴随其的心力衰竭的预防及/或治疗，得到期待的治疗效果尚无报道。
[0006]【现有技术文献】
[0007]【专利文献】
[0008]专利文献1:专利第4183742号公报
[0009]专利文献2:国际公开第W02011/007900号单行本
[0010]【非专利文献】
[0011]非专利文献I:Dezawa,M.，etal.，J.Clin.Invest.,Vol.113,p.1701-1710(2004)
[0012]非专利文献2:Dezawa, Μ.，etal.，Science，Vol.309，p.314-317(2005)
[0013]非专利文献3:ffakao, S，etal.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, Vol.108，p.9875-9880(2011)
【
【发明内容】
】
[0014]【发明要解决的技术课题】
[0015]本发明以在再生医疗中，提供使用多能性干细胞(Muse细胞)的新的医疗用途作为目的。更具体而言，本发明旨在提供含Muse细胞的、用于心肌梗塞(特别是重症大型心肌梗塞)的治疗、以及伴随其的心力衰竭的预防及/或治疗的细胞制剂。
[0016]【解决课题的技术方案】
[0017]本发明人使用日本白色种兔，对于由冠动脉缺血(30分钟)诱导的心肌梗塞，通过由静脉注射施用Muse细胞，发现Muse细胞在障碍心肌组织的局部蓄积，在此障碍心肌组织内分化为心肌细胞，造成梗塞尺寸的缩小及心功能的改善或恢复，从而完成本发明。
[0018]BP，本发明如下。
[0019][I]用于治疗心肌梗塞的细胞制剂，其含从活体的间质组织或培养间质细胞分离的SSEA-3阳性的多能性干细胞。
[0020][2] [I]所述的细胞制剂，其中由外部应激刺激而呈SSEA-3阳性的多能性干细胞含浓缩的细胞级分。
[0021][3]上述[I]及[2]所述的细胞制剂，其用于预防及/或治疗人的重症大型心肌梗塞后的心力衰竭。
[0022][4]上述[I]?[3]所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞呈⑶105阳性。
[0023][5]上述[I]?[4]所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞呈CD117阴性及CD 146阴性。
[0024][6]上述[I]?[5]所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞呈⑶117阴性、⑶146阴性、NG2阴性、⑶34阴性、vWF阴性、及⑶271阴性。
[0025][7]上述[I]?[6]所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞呈⑶34阴性、⑶117阴性、CD 146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、SoxlO阴性、Snail阴性、Slug阴性、Tyrpl阴性、及Dct阴性。
[0026][8]上述[I]?[7]所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞是有以下全部性质的多能性干细胞:
[0027](i)端粒末端转移酶活性低或无；
[0028](ii)具有分化为三胚层之任何胚层的细胞的能力；
[0029](iii)不显示肿瘤性增殖；及
[0030](iv)具有自我更新能力。
[0031][9]上述[I]?[8]所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞有在心肌梗塞部位蓄积的能力。
[0032][10]上述[I]?[9]所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞有分化为血管内皮细胞的能力。
[0033][11]上述[I]?[9]所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞有分化为心肌细胞的能力。
[0034][12]上述[I]?[11]所述的细胞制剂，其中在缺血后I个月以内，向对象的静脉或冠动脉，将上述多能性干细胞以作为治疗上有效量IX13细胞/个体?I X 10 6细胞/个体施用I?10次。
[0035][13]上述[I]?[12]所述的细胞制剂，其与未施用的对照相比较，使心肌梗塞尺寸缩小。
[0036][14]上述[I]?[13]所述的细胞制剂，其使选自左心室中的经时的血压变化、左心室扩张末期径(LVDd)、射血分数(EF)、左心室内径缩短分数(FS)、及左心室收缩末期径(LVDs)的至少I个的心功能指标恢复到正常值。
[0037]【发明效果】
[0038]本发明对于患心肌梗塞、特别是重症大型心肌梗塞的对象，通过由静脉等施用Muse细胞，在障碍心肌组织选择性地蓄积，由在该组织内Muse细胞分化为心肌的心肌组织再生机制，可显著缩小心肌梗塞尺寸。
【【附图说明】】
[0039]【图1】示含兔心肌梗塞模型的梗塞部位的心脏组织的切片。由三苯基四唑鑰一氯化物(TTC)染色法，确定梗塞部位。虚线包围的非染色区域是梗塞部位。右图是缺血30分钟后，再使灌流，再灌流24小时后，静脉施用Muse细胞的，再灌流14天后的组织切片。左图是代替Muse细胞而静脉施用生理盐水的组织切片。由Muse细胞的移植，梗塞部位显著地减少。
[0040]【图2】由TTC染色法确定梗塞部位，将梗塞尺寸作为相对于缺血区域的梗塞区域的比例)算出。左示生理盐水的对照(η = 3)中的梗塞尺寸的平均值，右示Muse细胞移植组(η = 4)中的梗塞尺寸的平均值。由Muse细胞的移植，梗塞尺寸显著地缩小。
[0041]【图3】示由马森三色(MT)染色法，组织化学探讨梗塞尺寸的缩小效果的结果。在此MT染色法中，含活细胞的组织被染成红色，另一方面，胶原纤维化的梗塞区域的组织由于不被染色而被观察是青白色。与施用生理盐水的对照组(η = 3)比较，在Muse细胞移植组(η = 4)中，梗塞区域小，梗塞尺寸显著地减少。另外，在移植骨髓间质细胞级分(MSC)的组织中，观察到梗塞尺寸的减少，但与Muse细胞移植组比较，梗塞尺寸的缩小效果小。
[0042]【图4】示心脏组织中的Muse细胞的向心肌细胞的分化。梗塞部位和非梗塞部位将左图中的虚线作为分界线区别。由若丹明一鬼笔环肽染色而心肌细胞被染成红色(中图)。另外，知在移植前使用慢病毒预先导入绿色荧光蛋白质(GFP)的基因的Muse细胞局限于梗塞部位(右图)。使这2个图像重合的图像示于左图。由此，在梗塞部位存在多个红色及绿色重成合的细胞，这提示移植的Muse细胞分化为心肌细胞。
[0043]【图5】示探讨在梗塞部位蓄积的Muse细胞的分化