肿瘤的疫苗接种的制作方法
【专利说明】肿瘤的疫苗接种
[0001] 说明书
[0002] 本发明涉及由至少ー种免疫刺激物和使用电容耦合的射频波组成的疫苗，并且涉 及用于治疗原发性癌及其转移瘤（甚至处于散布性细胞状态下的，其不能通过目前可获得 的成像方法来检测）或用于预防癌症疾病的复发和特别地用于使得和支持患者自身的免 疫系统能够识别和杀死癌细胞并建立记忆以预防癌症疾病复发的方法，特别是原位和体内 疫苗接种方法。
[0003] 本发明使用患者自身的独特的肿瘤特异性抗原。然而，这些抗原不能被免疫细胞 和后续反应识别（它们是隐藏起来的）。这阻止恶性疾病受到免疫攻击，并且身体将肿瘤 识别为其自身的组织修复。免疫系统针对肿瘤细胞不起作用。本发明提供了ー种疫苗，其 能够释放肿瘤抗原以便它们被抗原呈递细胞（APC)识别以起始针对恶性疾病的特异性免 疫反应。这是本发明的疫苗所提供的特殊效应，即暴露隐藏的抗原、促进由APC(特别是树 突细胞）的识别和使所述APC和整个免疫系统准备好建立特异性免疫反应以清除肿瘤。因 此，本发明的疫苗产生天然的过程。
[0004] 简要地，由本发明的疫苗引起的免疫原性细胞死亡导致适应性免疫系统的激活以 对抗癌细胞。作为本发明疫苗的组分的免疫刺激物支持这样的对抗以便效应是完全全身性 的并具有长期记忆。
[0005] 发明背景
[0006] 定义
[0007] 如本文中所用，术语"隐藏的肿瘤细胞"或"非免疫原性肿瘤"包括通过减少肿瘤 特异性抗原（TSA)在其表面上的表达或不在其表面上表达所述抗原来逃避免疫系统检测 的肿瘤和肿瘤细胞。隐藏的肿瘤细胞包括"休眠肿瘤细胞"、散布性细胞和微转移瘤。休眠 肿瘤细胞在被研究的时候不显示恶性特征并且是化疗抗性的，但其并不耐热。散布性细胞 以低浓度在血液中循环。它们在血液中低的抗原呈递和浓度使得其检测是不可能的。微转 移瘤通常是恶性发育的最危险且不可见的部分。目前使用的成像系统的分辨率仅允许在微 转移瘤形成由几百万的细胞组成的聚集体之后被检测到。
[0008] 本申请中使用的术语"体内-疫苗接种"意指免疫所必需的抗原是在患者体内产 生的。大多数肿瘤-疫苗接种使用人工产生的抗原或利用体外实验室条件制备并再注射给 患者的患者自身的抗原。然而，在本发明中，免疫所必需的适当抗原是在体内即通过患者的 身体产生的。因此，本发明的疫苗接种方法还可被称作体内疫苗接种方法。
[0009] 如本文中所用，术语"原位疫苗接种"意指免疫（即特定TSA的识别）实际上是在 肿瘤中进行的。在大多数"经典的"肿瘤-疫苗接种中，被置于身体中的抗原远离期望的活 性分子作用的位置。然而，根据本发明，免疫过程在原位即在肿瘤的部位进行。因此，本发 明的疫苗接种方法还可被称作原位疫苗接种方法。
[0010] 如本文中所用，术语"中度的全身热疗（hyperthermia) "是指在38°C至39°C的温 度的全身加热。其也被本领域技术人员已知为"发热温度范围全身加热"并且通常被用于 增强免疫系统。可区分三种类型的全身热疗：
[0011] 一轻度的全身热疗是指在约38 °C的温度的全身加热；
[0012] 一中度的全身热疗如上定义；
[0013] -极度的全身热疗是指在40°C至41°C的温度的全身加热，其在一些时候可扩展 至高至42で。
[0014] 如本文中所用，术语"具有増加的癌症风险的人"是指因遗传了遗传突变而天生具 有显著增加的对癌症的易感性的人。遗传突变可足以极大地增加个人对ー种或多种类型的 癌症的易感性，并且该易感性可在代与代之间传递。这样的突变的遗传产生了其中许多个 体发生某一/某些类型的癌症的家族。已知的与遗传性癌症相关的基因包括増加乳腺癌风 险的异常BRCAl和BRCA2基因以及与结肠癌相关的HNPCC基因。此外，术语"具有増加的癌 症风险的人"还指通过暴露于环境致癌物而发生或最可能发生ー些突变从而具有増加的癌 症风险的人。暴露于癌症的风险因素可包括长期或反复暴露于辐射、使用烟草、暴露于致癌 化学药品和感染癌症病毒例如人乳头瘤病毒（HPV)。能够触发癌症发生的化学药品和辐射 被称作"致癌物"。致癌物通过起始一系列遗传改变（"突变"）和刺激细胞増殖来起作用。 在暴露于致癌物与癌症发作之间可存在几十年的延迟。暴露与疾病发作之间的该时期是迟 滞期。因此本申请的ー个方面是在迟滞期的終点处或终点附近治疗由暴露于致癌物而导致 的具有増加的癌症风险的人。因此，根据本发明的疫苗接种对于此类人是特别重要的。
[0015] 基于射频的方法和癌症
[0016]目前，将射频电流用于治疗癌症的方法是射频消融（RFA)法，其与本发明显著不 同。RFA法是将RF用于烧坏病损的有创性方法。RFA法应用针形的"天线"（參见图1)，其 被瘤内地插入实体瘤中，并且施用的局部电流变得如此大以致于肿瘤被烧伤从而引起剧烈 的坏死。
[0017] 本发明严格地避免了这样的条件。RFA法是其中使用从高频交流电产生的热来烧 蚀心脏、肿瘤或其它功能失调组织的电传导系统的部分以治疗医学障碍的医疗程序。RF电 流的优势（相较于先前使用的低频AC或DC的脉冲）是其不直接刺激神经或心肌并因而可 通常在不需要全身麻酔剂的情况下使用。RFA程序由介入疼痛专家例如麻醉科医师、介入放 射科医师或心脏电生理专家（心脏病专家的分科）在影像引导（例如X射线屏检查、CT扫 描或超声）下进行。
[0018] 将射频电流用于治疗癌症的另ー种医疗程序是使用脉冲射频的血管内刺激（參 见WO2011/078676)。该方法可用于治疗实体瘤和血源性瘤并包括具有低于100OQ的阻 抗的针样电极至血管中的插入和具有10-80V的电压以持续时间为0.I-IOOms的脉冲猝发 (pulseburst)和l/s-20/s的粹发频率（burstfrequency)的射频范围内的电流脉冲的电 信号的递送。据记载，血管内脉冲射频刺激通过刺激和诱集淋巴细胞来增强免疫系统，这导 致肿瘤细胞的攻击。血管内射频刺激是有创性的并导致整个身体中的血液的加热。此外， 由血管内射频刺激诱导的免疫应答是非特异性的。因此，没有免疫反应靶向"隐藏的"肿瘤 细胞，所述肿瘤细胞不受这样的医疗程序的影响。
[0019]WO2011/078676还公开了将利用脉冲射频的血管内刺激与疫苗接种组合使用的 可能性。然而，在WO2011/078676中利用脉冲射频的血管内刺激用于此的作用是增强免疫 系统，以便由疫苗接种疗法诱导的免疫反应被放大。据本申请人所知，到目前为止，几种癌 症疫苗处在由公司进行的开发过程中，但仅ー种产品得到了用于晚期前列腺癌的完全许可 (由FDA通过）。PrOVenge? (或sipuleucel-T)是用于前列腺癌的免疫疗法，其由已 用PAP-GM-CSF融合蛋白进行"离体"温育的患者自身的血细胞的混合物组成。迄今为止， 没有针对"隐藏的"肿瘤细胞的癌症疫苗接种被开发。因此，WO2011/078676公开的方法没 有提供任何关于以无创方式应用的脉冲射频可如何提供针对癌细胞的记忆和全身性免疫 应答和可如何用作疫苗接种疗法的信息。
[0020] 免疫系统和癌症
[0021] 免疫系统是复杂的结构并且其过程保护有机体抵抗紊乱和疾病。其具有两个基本 的子系统，固有免疫系统和适应性免疫系统。固有免疫系统发现于几乎所有的活体中，其不 产生免疫记忆并且作用（应答）是非特异性和即时的。固有免疫系统的主要细胞结构是巨 噬细胞（能够进行吞噬）、肥大细胞（释放炎症性促进分子）；粒细胞（响应炎症的三种细 胞类型的组）、树突细胞（呈递抗原的适应性免疫细胞）、天然杀伤细胞（破坏感染了病原 体的细胞）。发现于颚ロ类（具有颚的脊椎动物）中的适应性系统具有免疫记忆并通常具 有应答的滞后时间。属于适应性系统的主要的细胞组是产生中和侵入物的抗体的B细胞和 专门用于破坏感染细胞或协调免疫应答的T细胞。
[0022] 免疫系统的ー个作用是鉴定或破坏肿瘤。识别可因在肿瘤细胞表面上但不存在于 健康细胞上的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关性抗原而是可能的。在肿瘤细胞中产生的具有改 变的结构（因遗传突变而导致的）的任何蛋白可用作肿瘤抗原。可选择地，通常以非常低 的量产生但其产生在肿瘤细胞中增加的蛋白可在ー些时候触发免疫应答。这样的蛋白的一 个实例是酪氨酸酶。由于这些蛋白是内源蛋白，因此免疫应答是罕有的，但如果细胞膜上的 抗原密度足够高，癌细胞可被特异性T细胞识别并破坏。
[0023] 肿瘤抗原的另ー个重要的种类是通常仅在免疫系统完全发育之前在胚胎发育的 早期产生以便针对这些蛋白或抗原的自身耐受性不能发生的蛋白。此外，被肿瘤病毒例如 EBV和HPV感染的细胞包含病毒DNA，所述病毒DN