治疗杜兴氏肌营养不良的卵泡抑素的制作方法
【专利说明】治疗杜兴氏肌营养不良的卵泡抑素
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年1月25日提交的美国临时专利申请序列号61/756, 996和2013 年12月13日提交的美国临时专利申请序列号61/915, 733的优先权，所述美国临时专利申 请的公开内容据此整体并入本文。
[0003] 背景
[0004] 杜兴氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD)是隐性X染色体关联形 式的肌营养不良，其导致肌肉退化以及最终死亡。所述病症是由位于人X染色体上的肌营 养不良蛋白（dystrophin)基因的突变引起，所述基因编码蛋白质肌营养不良蛋白，所述肌 营养不良蛋白是肌肉组织内的一种对细胞膜的肌营养不良蛋白聚糖复合物（DGC)提供结 构稳定性的重要结构组分。肌营养不良蛋白连接内部细胞质肌动蛋白微丝网状结构和细胞 外基质，从而对肌肉纤维提供物理强度。因此，改变肌营养不良蛋白或不存在肌营养不良蛋 白会导致肌纤维膜功能异常。尽管两种性别的人士均可携带突变，但男孩通常具有伴有早 期失能和死亡的重度表型，而携带突变的女性通常展现轻度得多的表型。
[0005] 目前，不存在用于DMD的已知治愈方法。已探宄许多治疗途径，包括基因疗法和皮 质类固醇的各种施用方案。尽管这些治疗中的一些可延迟某些征象和症状，但目前不存在 用于DMD患者的满意治疗选项。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明尤其提供用于基于卵泡抑素（follistatin)蛋白疗法来治疗肌营养 不良，具体来说杜兴氏肌营养不良（DMD)和/或贝克尔肌营养不良（Becker Muscular Dystrophy)的改进方法和组合物。如本文中，包括以下实施例中所述，本发明者首次证明 向DMD动物模型中全身性施用重组卵泡抑素蛋白（例如卵泡抑素-Fc重组融合蛋白）导致 全身各种组织中的有效肌肉生长，并且减轻DMD的特征性症状肌肉纤维化和/或坏死。此 外，本发明者也已证明本发明的卵泡抑素-Fc融合蛋白具有多达约5天的延长血清半衰期。 在不希望受任何理论束缚下，预期出乎意料长久的血清半衰期可已促成优越体内功效。实 际上，在本发明之前，已知卵泡抑素是肌抑素和活化素的调节剂，所述肌抑素和活化素均是 肌肉生长的重要负性调控剂。然而，在本发明之前，据报道卵泡抑素具有特别短暂的血清半 衰期，此构成将卵泡抑素开发成蛋白质治疗剂的重大障碍。举例来说，典型可商购获得的野 生型卵泡抑素（FS315)蛋白具有血清半衰期约1小时。Fc-融合蛋白已用于延长卵泡抑素 的血清半衰期。然而，由于Fc结构域的尺寸较大，以及卵泡抑素蛋白的尺寸相对较小，认为 Fc结构域直接融合于卵泡抑素蛋白可干扰野生型卵泡抑素蛋白的正常结构和功能。所报道 的卵泡抑素的不良药物动力学/药力学（PK/PD)性质和与卵泡抑素-Fc融合蛋白相关的不 确定性已阻碍科学家和临床医师进一步将卵泡抑素开发成用于DMD或其它肌营养不良的 蛋白质疗法。实际上，在本发明之前，基因疗法已成为用于DMD的基于卵泡抑素的疗法的焦 点。由本发明者显示的出乎意料优越的体内功效和半衰期首次确定卵泡抑素可为用于治疗 DMD的有效蛋白质治疗剂。
[0008] 在一个方面，本发明提供治疗杜兴氏肌营养不良（DMD)的方法，其包括向罹患或 易患DMD的个体施用有效量的重组卵泡抑素蛋白以使DMD的至少一种症状或特征在强度、 严重性或频度方面得以降低，或延迟发作。在一些实施方案中，DMD的至少一种症状或特征 选自由以下组成的组：肌肉消耗、肌肉无力、肌肉脆弱、关节挛缩、骨骼变形、脂肪浸润肌肉、 肌肉被非收缩性组织替换（例如肌肉纤维化）、肌肉坏死、心肌病、吞咽受损、肠和膀胱功能 受损、肌肉缺血、认知功能损害（例如学习困难、神经行为病症的危险较高、认知缺陷）、行 为功能障碍、社交损害、脊柱侧凸和呼吸功能受损。
[0009] 在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白包括与野生型人卵泡抑素蛋 白
[0010] GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCE NVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDV FCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCE DIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISE DTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW(SEQ ID N0:1)至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同的氨基酸序列。
[0011] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与野生型人卵泡抑素蛋白SEQ ID NO: 1至少70%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与野生型人 卵泡抑素蛋白SEQ ID NO: 1至少80%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑 素蛋白包括与野生型人卵泡抑素蛋白SEQ ID NO: 1至少90%相同的氨基酸序列。在一些实 施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与野生型人卵泡抑素蛋白SEQ ID NO: 1至少95%相同的 氨基酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与野生型人卵泡抑素蛋白SEQ ID NO: 1相同的氨基酸序列。
[0012] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白相较于野生型人卵泡抑素蛋白包含一个或 多个缺失、突变或插入。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包含SEQ ID NO: 1的氨基酸 残基212-288(其对应于结构域3)的缺失。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包含肝 素结合位点。
[0013] 在一些实施方案中，本发明提供治疗杜兴氏肌营养不良（DMD)的方法，其包括向 罹患或易患DMD的个体施用有效量的重组卵泡抑素蛋白以使DMD的至少一种症状或特征在 强度、严重性或频度方面得以降低，或延迟发作，其中所述重组卵泡抑素蛋白包含与GNCWLR QAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKN KPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYC VTCNRICPEPAS SEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCISISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILE W(SEQ ID N0:2)至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%)相同的氨基酸序列。
[0014] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与SEQ ID NO:2至少70%相同的氨基 酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与SEQ ID NO:2至少80%相同的氨基 酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与SEQ ID NO:2至少90%相同的氨基 酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与SEQ ID NO:2至少95%相同的氨基 酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白包括与SEQ ID N0:2相同的氨基酸序列。
[0015] 在一些实施方案中，DMD的至少一种症状或特征选自由以下组成的组：肌肉消耗、 肌肉无力、肌肉脆弱、肌肉肥大、肌肉假性肥大、关节挛缩、骨骼变形、心、肌病、吞咽受损、肠 和膀胱功能受损、肌肉缺血、认知损害、行为功能障碍、社交损害、脊柱侧凸和呼吸功能受 损。
[0016] 在一些实施方案中，使重组卵泡抑素蛋白融合于Fc结构域。在一些实施方案中， 适于本发明的Fc结构域包含与
[0020] 在一些实施方案中，Fc结构域包含与SEQ ID NO:3、4或14至少80%相同的氨基 酸序列。在一些实施方案中，Fc结构域包含与SEQ ID N0:3、4或14至少90%相同的氨基 酸序列。在一些实施方案中，Fc结构域包含与SEQ ID N0:3、4或14至少95%相同的氨基 酸序列。
[0021] 在一些实施方案中，合适的Fc结构域包含一个或多个改进Fc结构域与FcRn受体 之间的结合，从而导致血清半衰期延长的突变。在一些实施方案中，合适的Fc结构域在对 应于人 IgGl 的 Thr 250、Met 252、Ser 254、Thr 256、Thr 307、Glu 380、Met 428、His 433 和/或Asn 434的一个或多个位置处包含一个或多个突变。在特定实施方案中，合适的Fe 结构域含有突变H433K(His433Lys)和/或N434F(Asn434Phe)。在特定实施方案中，合适的 Fc结构域包含以下所示的并有突变H433K(His433Lys)和N434F(Asn434Phe)的序列：
[0023] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是通过接头融合于Fc结构域。在一些实施 方案中，接头是包含3-100个氨基酸的肽。在一些实施方案中，接头不是由ALEVLFQGP组 成的接头。在一些实施方案中，接头包含在10-100个、10-90个、10-80个、10-70个、10-60 个、10-50个、10-40个、10-30个、10-20个、10-15个之间的氨基酸。在一些实施方案中，接 头包含至少 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 或 95 个氨基酸。在 一些实施方案中，接头包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP (GAG接头，SEQ ID NO: 5)至少50% (例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%) 相同的序列。在一些实施方案中，接头包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGA ￡(GAG2 接头，SEQ ID N0:6)至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%或99%)相同的序列。在一些实施方案中，接头包含与^AEGG GGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG3 接头，SEQ ID NO:7)至 少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%)相同的序列。在一些实施方案中，接头包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7相同的序列。
[0024] 在一些实施方案中，本发明提供一种重组卵泡抑素融合蛋白，其包括卵泡抑素多 肽、Fc结构域和使所述卵泡抑素多肽与所述Fc结构域缔合的长度是至少10 (例如至少15、 20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 或 95)个氨基酸的接头。在一些实施 方案中，本发明提供一种重组卵泡抑素融合蛋白，其包括卵泡抑素多肽、Fc结构域和使所述 卵泡抑素多肽与所述Fc结构域缔合的接头，其中所述接头不是由ALEVLFQGP组成的接头。 在一些实施方案中，合适的卵泡抑素多肽包含与野生型人卵泡抑素蛋白（SEQ ID N0:1)至 少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%)相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素融合蛋白能够结合活 化素、肌抑素和/或GDF-11，并且具有在约0. 5-10天的范围内的体内半衰期。
[0025] 在特定实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白包含与SEQ ID N0:8
97%、98%、99%或100% )相同的氨基酸序列。
[0030] 在特定实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白包含与SEQ ID NO: 10
97%、98%、99%或100% )相同的氨基酸序列。
[0039] 在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白是由哺乳动物细胞产生。在 一些实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵 巢（CHO)细胞或HT1080细胞。
[0040] 应了解本发明的实施方案可通过多种途径来递送。在一些实施方案中，重组卵泡 抑素蛋白是全身性施用。在一些实施方案中，全身性施用选自静脉内、皮内、吸入、经皮（表 面）、眼内、肌肉内、皮下、肌肉内、经口和/或经粘膜施用。
[0041] 实施方案可通过许多给药方案来施用。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是 每两月、每月、每三周、每两周、每周、每日或在可变间隔下施用。
[0042] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是向一种或多种选自横纹肌（例如骨骼 肌、心肌）的靶标组织递送。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是向心脏递送。在一些 实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是向骨骼肌递送。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是 向一种或多种选自表1的骨骼肌递送。在一些实施方案中，横纹肌（例如骨骼肌）选自由 三头肌、胫骨前肌、比目鱼肌、腓肠肌、二头肌、斜方肌、三角肌、四头肌和膈肌组成的组。
[0043] 在一些实施方案中，施用重组卵泡抑素蛋白会导致肌肉再生、纤维化减轻、肌肉力 量增加、灵活性增加、活动范围增加、耐力增加、易疲劳性降低、血流增加、认知改进、肺功能 改进、炎症抑制、肌肉纤维化和/或坏死减轻。
[0044] 在另一方面，本发明提供用于本文所述的各种方法中的组合物。在一些实施方案 中，本发明提供重组卵泡抑素融合蛋白，其包括卵泡抑素多肽、Fc结构域和使所述卵泡抑素 多肽与所述Fc结构域缔合的接头，其中所述卵泡抑素多肽包含与野生型人卵泡抑素蛋白 (SEQ ID N0:1)至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%)相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组卵泡抑素融 合蛋白能够结合活化素、肌抑素和/或GDF-11。在一些实施方案中，重组卵泡抑素融合蛋 白的体内半衰期大于约2天（例如大于约2. 5天、约3天、约3. 5天、约4天、约4. 5天、约 5天、约5. 5天、约6天）。在一些实施方案中，重组卵泡抑素融合蛋白的体内半衰期在约 2-10天的范围内（例如在约2. 5-10天、约3-10天、约3. 5-10天、约4-10天、约4. 5-10天、 约5-10天、约3-8天、约3. 5-8天、约4-8天、约4. 5-8天、约5-8天、约3-6天、约3. 5-6天、 约4-6天、约4. 5-6天、约5-6天的范围内）。在一些实施方案中，体内半衰期是在小鼠、大 鼠、非人灵长类动物和/或人中的一个或多个中测量。在一些实施方案中，卵泡抑素多肽具 有与野生型人卵泡抑素蛋白（SEQ ID NO: 1)至少70%相同的氨基酸序列。在一些实施方 案中，卵泡抑素多肽具有与野生型人卵泡抑素蛋白（SEQ ID NO: 1)至少80%相同的氨基酸 序列。在一些实施方案中，卵泡抑素多肽具有与野生型人卵泡抑素蛋白（SEQ ID N0:1)至 少90 %相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，卵泡抑素多肽具有与野生型人卵泡抑素蛋 白（SEQ ID NO: 1)至少95%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，卵泡抑素多肽具有与 野生型人卵泡抑素蛋白（SEQ ID NO: 1)相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，卵泡抑素 多肽含有SEQ ID NO: 1的氨基酸残基212-288(其对应于结构域3)的缺失。在各种实施方 案中，卵泡抑素多肽含有硫酸肝素结合位点。
[0045] 在一些实施方案中，本发明提供重组卵泡抑素融合蛋白，其包括卵泡抑素多肽、Fc 结构域和使所述卵泡抑素多肽与所述Fc结构域缔合的接头，其中所述卵泡抑素多肽包含
[0046] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素融合蛋白能够结合活化素、肌抑素和/或 GDF-11。在一些实施方案中，重组卵泡抑素融合蛋白的体内半衰期大于约2天（例如大于 约2. 5天、约3天、约3. 5天、约4天、约4. 5天、约5天、约5. 5天、约6天）。在一些实施方 案中，重组卵泡抑素融合蛋白的体内半衰期在约2-10天的范围内（例如在约2. 5-10天、约 3-10天、约3. 5-10天、约4-10天、约4. 5-10天、约5-10天、约3-8天、约3. 5-8天、约4-8 天、约4. 5-8天、约5-8天、约3-6天、约3. 5-6天、约4-6天、约4. 5-6天、约5-6天的范围 内）。在一些实施方案中，体内半衰期是在小鼠、大鼠、非人灵长类动物和/或人中的一个或 多个中测量。
[0047] 在一些实施方案中，Fc结构域是IgGlFc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域具
[0050] 在一些实施方案中，合适的Fc结构域包含一个或多个改进Fc结构域与FcRn受体 之间的结合，从而导致血清半衰期延长的突变。在一些实施方案中，Fc结构域在对应于人 IgGl 的 Thr 250、Met 252、Ser 254、Thr 256、Thr 307、Glu 380、Met 428、His 433和 /或 Asn 434的一个或多个位置处包含一个或多个突变。在特定实施方案中，合适的Fe结构域 含有突变H433K(His433Lys)和/或N434F(Asn434Phe)。在特定实施方案中，合适的Fc结 构域包含以下所示的并有突变H433K(His433Lys)和N434F(Asn434Phe)的序列：
[0052] 在一些实施方案中，本发明的重组卵泡抑素融合蛋白包括接头以使通过所述接头 达成的Fc融合不实质上改变卵泡抑素与同源配体的结合性质，包括维持缺乏与肝素结合。 在一些实施方案中，合适的接头是包含3-60个氨基酸的肽。在一些实施方案中，合适的接 头是包含至少 1〇(例如至少 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 或 95) 个氨基酸的肽。在一些实施方案中，合适的接头包含与eAEGGGGGAAAAAGGGGGSAE(GAG接头， SEQ ID NO:5)至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%)相同的序列。在一些实施方案中，合适的接头包含与GAP GGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP (GAG2 接头，SEQ ID NO: 6)至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同 的序列。在一些实施方案中，合适的接头包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGG GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP (GAG3 接头，SEQ ID NO: 7)至少 50 % (例如至少 55 %、60 %、65 %、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同的序列。
[0053] 在特定实施方案中，由本发明提供的重组卵泡抑素融合蛋白包含与SEQIDN0:8、 9、10、11、16 或 17 至少 50% (例如至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同的氨基酸序列。
[0054] 在一些实施方案中，本发明提供包含编码本文所述的重组卵泡抑素融合蛋白的核 苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，本发明提供一种包含核酸的细胞，所述核酸包含编码 本文所述的重组卵泡抑素融合蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供包含本 文所述的重组卵泡抑素融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0055] 如本申请中所用，术语"约"和"近似"用作等效语。与或不与约/近似一起用于 本申请中的任何数字都意图涵盖由相关领域普通技术人员所了解的任何正常波动。
[0056] 本发明的其它特征、目标和优势在以下详细描述中显而易知。然而，应了解尽管指 示本发明的实施方案，但详细描述是通过仅仅说明而非限制的方式给出。在本发明的范围 内的各种变化和修改将根据详细描述而变得为本领域技术人员显而易知。
[0057] 附图简述
[0058] 图式仅出于说明目的而出于非限制目的。
[0059] 图1显示说明相较于可商购获得的可溶性活化素受体（sActRIIB)，FS315_Fc不通 过Smad 1/5/8路径抑制BMP-9或BMP-10信号传导的示例性结果。图IA显示BMP-9抑制 测定的示例性结果，而图IB显示BMP-10抑制测定的示例性结果。
[0060] 图2显示说明FS315-FC抑制肌抑素和活化素介导的Smad 2/3信号传导的示例性 结果。图2A显示肌抑素抑制测定的示例性结果，而图2B显示活化素A抑制测定的示例性 结果。
[0061] 图3显示说明跨越各组织的PK曲线的示例性结果。一示例性卵泡抑素-Fc蛋白 具有于小鼠血清中的血清半衰期~5天（图3A)和组织半衰期2 - 5天（图3B)。
[0062] 图4显不说明在4和10周暴露于lmg/kg FS315_mFc以及6周暴露于8mg/kg之 后，示例性卵泡抑素-Fc蛋白对四头肌（图4A)、腓肠肌（图4B)、胫骨