在一些实施方案中，提供使卵泡抑素多肽与Fc结构域缔合而不实质上影响卵泡 抑素多肽结合它的任何同源配体（例如活化素、肌抑素、肝素等）的能力的接头。在一些实 施方案中，提供接头以使相较于单独卵泡抑素多肽，卵泡抑素肽与肝素的结合不改变。举例 来说，在一些实施方案中，卵泡抑素多肽是FS315多肽，其通常不结合肝素，除非它与活化 素缔合。在一些所述实施方案中，提供不导致相较于单独FS315多肽，FS315多肽与肝素的 结合增加的接头。
[0181] 示例件卵泡抑素融合蛋白
[0182] 在特定实施方案中，合适的重组卵泡抑素融合蛋白包括卵泡抑素多肽、Fc结构域 和使所述卵泡抑素多肽与所述Fc结构域缔合的接头，其中所述卵泡抑素多肽包含与野生 型人FS315蛋白（SEQ ID N0:1)或结构域3缺失的FS315蛋白（SEQ ID N0:2)至少50%、 55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %, 98%、99%或100%相同的氨基酸序列。通常，合适的重组卵泡抑素融合蛋白能够结合活化 素和肌抑素。在一些实施方案中，合适的重组卵泡抑素融合蛋白的体内半衰期在约〇. 5-6 天（例如约0. 5-5. 5天、约0. 5-5天、约1-5天、约1. 5-5天、约1. 5-4. 5天、约1. 5-4. 0天、 约1. 5-3. 5天、约1. 5-3天、约1. 5-2. 5天、约2-6天、约2-5. 5天、约2-5天、约2-4. 5天、 约2-4天、约2-3.5天、约2-3天）的范围内。在一些实施方案中，合适的重组卵泡抑素融合 蛋白的体内半衰期在约2-10天的范围内（例如在约2.5-10天、约3-10天、约3.5-10天、 约4-10天、约4.5-10天、约5-10天、约3-8天、约3.5-8天、约4-8天、约4.5-8天、约5-8 天、约3-6天、约3.5-6天、约4-6天、约4.5-6天、约5-6天的范围内）。
[0183] 作为非限制性实例，合适的卵泡抑素Fc融合蛋白可具有以下所示的氨基酸序列：
[0195] 在一些实施方案中，合适的重组卵泡抑素Fe融合蛋白具有与SEQIDN0:8、9、10、 11、16 或 17 至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或大于99%同源或相同的氨基酸序列。
[0196] 预期卵泡抑素-Fe融合蛋白可以各种构型提供，包括同二聚构型或单体构型。举 例来说，合适的同二聚构型可被设计来使融合伴侣（例如卵泡抑素多肽加接头）的C末端 连接于两个Fe多肽链的N末端。合适的单体构型可被设计来使融合伴侣（例如卵泡抑素 多肽加接头）的C末端融合于一个Fe二聚体。单体构型可降低空间位阻。
[0197] 如本文所用，关于本文鉴定的参照蛋白质序列（例如参照卵泡抑素蛋白序列）的 "氨基酸序列同一性百分比"定义为在比对序列，以及必要时引入空位以达成最大序 列同一性百分比，并且不将任何保守性取代考虑为序列同一性的一部分之后，候选序列中 与参照序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分 比的目的的比对可以属于本领域中的技能的各种方式达成，所述方式例如使用可公开获得 的计算机软件，如BLAST、ALIGN或Meg align (DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适 用于测量比对的参数，包括为历经所比较序列的全长达成最大对准所需的任何算法。优选 地，WU-BLAST-2软件用于确定氨基酸序列同一性（Altschul等,Methods in Enzymology 266, 460-480(1996) ;http://blast. wustl/edu/blast/README. html)。WU-BLAST-2 使用若 干搜索参数，其中大多数被设置成缺省值。可调整参数设为以下值：重叠间距=1，重叠分 数=0. 125,字阈值（T) = 11。HSP计分（S)和HSP S2参数是动态值，并且由程序自身视特 定序列的组成来确定，然而，最小值可被调整，并且如上所指示加以设置。
[0198] 产生重组卵泡抑素蛋白
[0199] 适于本发明的重组卵泡抑素蛋白可通过任何可用手段来产生。举例来说，可通过 利用被工程化来表达重组卵泡抑素蛋白编码核酸的宿主细胞系统来重组产生重组卵泡抑 素蛋白。或者或另外，可通过使内源性基因活化来产生重组卵泡抑素蛋白。或者或另外，可 通过化学合成来部分或完全制备重组卵泡抑素蛋白。
[0200] 当重组产生蛋白质时，可使用任何表达系统。仅举几例来说，已知表达系统包括例 如大肠杆菌（E. coli)、卵、杆状病毒、植物、酵母或哺乳动物细胞。
[0201] 在一些实施方案中，适于本发明的重组卵泡抑素蛋白是在哺乳动物细胞中产 生。可根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括但不限于BALB/c小鼠骨髓 瘤株系（NS0/1，ECACC 编号：85110503);人成视网膜细胞（PER. C6, CruCell, Leiden, The Netherlands);由 SV40 转化的猴肾 CVl 株系（C0S-7，ATCC CRL 1651);人胚肾株系（HEK293 或被亚克隆来达成悬浮培养生长的293细胞，Graham等，J. Gen Virol.，36:59, 1977);人 纤维肉瘤细胞系（例如HT1080);幼小仓鼠肾细胞（BHK21，ATCC CCL 10);中国仓鼠卵巢细 胞 +/-DHFR(CHO, Urlaub 和 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980);小鼠塞尔 托利细胞（TM4, Mather, Biol. R印rod. ,23:243-251，1980);猴肾细胞（CV1 ATCC CCL 70); 非洲绿猴肾细胞（VER0-76，ATCC CRL-1587);人宫颈癌细胞（HeLa，ATCC CCL 2);犬肾细胞 (MDCK，ATCC CCL 34);水牛大鼠肝细胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442);人肺细胞（W138, ATCC CCL 75);人肝细胞 Ofep G2, HB 8065);小鼠乳腺肿瘤（MMT 060562, ATCC CCL51) ;TRI 细 胞（Mather 等，Annals N. Y. Acad. Sci.，383:44-68, 1982) ;MRC 5 细胞；FS4 细胞；和人肝细 胞瘤株系Ofep G2)。
[0202] 在一些实施方案中，本发明提供由人细胞产生的重组卵泡抑素蛋白。在一些实施 方案中，本发明提供由CHO细胞或HT1080细胞产生的重组卵泡抑素蛋白。
[0203] 通常，被工程化来表达重组卵泡抑素蛋白的细胞可包含编码本文所述的重组卵泡 抑素蛋白的转基因。应了解编码重组卵泡抑素蛋白的核酸可含有调控序列、基因控制序列、 启动子、非编码序列和/或用于表达重组卵泡抑素蛋白的其它适当序列。通常，编码区是可 操作地与这些核酸组分中的一个或多个连接。
[0204] 转基因的编码区可包括一个或多个沉默突变以针对特定细胞类型优化密码子使 用。举例来说，可针对在脊椎动物细胞中表达来优化卵泡抑素转基因的密码子。在一些实 施方案中，可针对在哺乳动物细胞中表达来优化卵泡抑素转基因的密码子。在一些实施方 案中，可针对在人细胞中表达来优化卵泡抑素转基因的密码子。
[0205] 药物组合物和施用
[0206] 本发明进一步提供一种药物组合物，其含有本文所述的重组卵泡抑素蛋白和生理 可接受的载体或赋形剂。
[0207] 合适的药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液（例如NaCl)、盐水、缓冲盐 水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯胶（gumarabic)、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物 (如乳糖、直链淀粉或淀粉、糖（如甘露糖醇、蔗糖或其它糖、右旋糖））、硬脂酸镁、滑石、硅 酸、粘稠石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等以及其组合。必要时，药 物制剂可与不有害地与活性化合物反应或干扰它们的活性的助剂（例如润滑剂、防腐剂、 稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳族物质等） 混合。在一优选实施方案中，使用适于静脉内施用的水溶性载体。
[0208] 必要时，合适的药物组合物或药剂也可含有少量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。组 合物可为液体溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末。组合物也可用传 统粘合剂和载体（如甘油三酯）配制成栓剂。经口制剂可包括标准载体，如医药级甘露糖 醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
[0209] 可根据常规程序将药物组合物或药剂配制成适合于向人类施用的药物组合物。举 例来说，在一些实施方案中，用于静脉内施用的组合物通常是于无菌等张水性缓冲液中的 溶液。必要时，组合物也可包括增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射部位处的疼痛。通常，分开 或以单位剂型混合在一起来将成分供应于如安瓿或药囊的指示活性剂的量的气密容器中， 所述单位剂型例如呈干燥冻干粉末或无水浓缩物形式。当组合物待通过输注施用时，它可 用含有无菌医药级水、盐水或右旋糖/水的输注瓶分配。当组合物是通过注射施用时，可提 供含无菌注射用水或盐水的安瓿以使成分可在施用之前加以混合。
[0210] 本文所述的重组卵泡抑素蛋白可调配成中性形式或盐形式。药学上可接受的盐包 括以游离氨基形成的盐，如由盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等获得的那些；以及以游离羧 基形成的盐，如由钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡 因（procaine)等获得的那些。
[0211] 施用途径
[0212] 本文所述的重组卵泡抑素蛋白（或含有本文所述的重组卵泡抑素蛋白的组合物 或药剂）是通过任何适当途径施用。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白或含有其的药 物组合物是全身性施用。全身性施用可为静脉内、皮内、吸入、经皮（表面）、眼内、肌肉内、 皮下、肌肉内、经口和/或经粘膜施用。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白或含有其的 药物组合物是皮下施用。如本文所用，术语"皮下组织"定义为紧靠在皮肤下的一层松散、 不规则结缔组织。举例来说，皮下施用可通过向包括但不限于大腿区域、腹部区域、臀区域 或肩胛区域的区域中注射组合物来进行。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白或含有其 的药物组合物是静脉内施用。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白或含有其的药物组合 物是经口施用。必要时，可同时使用一种以上途径。
[0213] 在一些实施方案中，施用仅在个体中产生局部作用，而在其它实施方案中，施用遍 及个体的多个部分产生作用，例如全身性作用。通常，施用导致向一种或多种靶标组织递送 重组卵泡抑素蛋白。在一些实施方案中，向一种或多种靶标组织递送重组卵泡抑素蛋白，所 述组织包括但不限于心脏、脑、脊髓、横纹肌（例如骨骼肌）、平滑肌、肾、肝、肺和/或脾。在 一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是向心脏递送。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白 是向横纹肌，具体来说骨骼肌递送。在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是向三头肌、胫 骨前肌、比目鱼肌、腓肠肌、二头肌、斜方肌、三角肌、四头肌和/或膈肌递送。
[0214] 剂型和给药方案
[0215] 在一些实施方案中，组合物是以治疗有效量和/或根据与特定所需结果相关（例 如与治疗或降低如杜兴氏肌营养不良的肌营养不良的危险相关）的给药方案施用。
[0216] 待根据本发明施用的特定剂量或量可例如随以下而变化：所需结果的性质和/或 程度、施用途径和/或时序的细节、和/或一种或多种特征（例如重量、年龄、个人史、遗传 特征、生活方式参数、心脏缺陷的严重性和/或心脏缺陷的危险水平等或其组合）。所述剂 量或量可由普通技术人员确定。在一些实施方案中，适当剂量或量是根据标准临床技术确 定。或者或另外，在一些实施方案中，适当剂量或量是通过使用一种或多种体外或体内测定 以帮助鉴定待施用的合乎需要或最优剂量范围或量来确定。
[0217] 在各种实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是在治疗有效量下施用。通常，治疗有效 量足以达成对受试者有意义的益处（例如治疗、调节、治愈、预防和/或改善潜伏疾病或病 状）。在一些特定实施方案中，待施用的适当剂量或量可根据由体外或动物模型测试系统获 得的剂量-反应曲线外推。
[0218] 在一些实施方案中，提供的组合物是以药物制剂形式提供。在一些实施方案中，药 物制剂是或包含单位给药量以根据与达成如杜兴氏肌营养不良的肌营养不良的发生率或 危险降低相关的给药方案来施用。
[0219] 在一些实施方案中，包含本文所述的重组卵泡抑素蛋白的制剂是以单次剂量形式 施用。在一些实施方案中，包含本文所述的重组卵泡抑素蛋白的制剂是在定期间隔下施用。 如本文所用，在某一"间隔"下施用指示治疗有效量是定期施用（不同于一次性给药）。可 通过标准临床技术确定间隔。在一些实施方案中，包含本文所述的重组卵泡抑素蛋白的制 剂是每两月、每月、每月两次、每三周、每两周、每周、每周两次、每周三次、每日、每日两次或 每6小时加以施用。视个体的需要而定，用于单一个体的施用间隔无需是固定间隔，而是可 随时间变化。
[0220] 如本文所用，术语"每两月"是指每两个月施用一次（即每两个月一次）；术语"每 月"是指每个月施用一次；术语"每三周"是指每三周施用一次（即每三周一次）；术语"每 两周"是指每两周施用一次（即每两周一次）；术语"每周"是指每周施用一次；并且术语 "每日"是指每天施用一次。
[0221] 在一些实施方案中，包含本文所述的重组卵泡抑素蛋白的制剂是在定期间隔下无 限期施用。在一些实施方案中，包含本文所述的重组卵泡抑素蛋白的制剂是在定期间隔下 施用确定时期。
[0222] 组合疗法
[0223] 在一些实施方案中，重组卵泡抑素蛋白是与一种或多种当前用于治疗肌营养不良 的已知治疗剂（例如皮质类固醇）组合施用。在一些实施方案中，已知治疗剂是根据它的 标准或核准给药方案和/或时程施用。在一些实施方案中，已知治疗剂是根据相较于它的 标准或核准给药方案和/或时程被改变的方案施用。在一些实施方案中，所述改变的方案 在以下方面不同于标准或核准给药方案：一个或多个单位剂量的量被改变（例如降低或增 加），和/或给药的频度被改变（例如单位剂量之间的一个或多个间隔被扩大，从而导致频 度较低，或所述间隔被降低，从而导致频度较高）。 实施例
[0224] 实施例1.卵泡抑素特异性靶向肌抑素和活化素
[0225] 这个实施例说明结合靶标和非靶标配体的卵泡抑素以评估卵泡抑素作为用于治 疗DMD的蛋白质治疗剂的安全性。在不希望受理论束缚下，预期由肌抑素和活化素活化 Smad2/3路径会导致抑制肌原性蛋白质表达。因此，成肌细胞不能分化成肌肉。因此，肌抑素 和活化素被视为肌肉再生的可行靶标。然而，归因于某些结构类似性，如可溶性活化素IIB 型受体（sActRIIB)的许多肌抑素和活化素拮抗剂也结合骨形态发生蛋白质（BMP)。BMP，尤 其BMP-9和BMP-10,被视为全身协调组织构造的关键性形态发生信号。抑制所述BMP可导 致非所需病理学病状。如以下详述，在这个实施例中所述的实验数据确认卵泡抑素以高亲 和力特异性靶向肌抑素和活化素，并且不以有意义的亲和力结合非靶标BMP。因此，这个实 施例证明相较于如sActRIIB的其它肌抑素调节剂，卵泡抑素可为一种非所需脱靶效应较 少的安全蛋白质治疗剂。
[0226] 具体来说，可商购获得的卵泡抑素（由R&DSystems制造的FS315和由Sino Biological制造的卵泡抑素-Fc人嵌合体FS315-hFc)和FS315-GAG3-mFc融合蛋白用于使 用Biacore测定评估与活化素、肌抑素和BMP的结合亲和力和动力学。简要来说，使FS315 固定于CM5芯片上，并且使用人或小鼠抗体捕集试剂盒（GE Healthcare)捕集卵泡抑素-Fc 融合蛋白。在胺偶联后，在25°C下添加一系列浓度的活化素、肌抑素或BMP (例如BMP-2、 BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-10 和⑶F-11)作为可溶性分析物。sActRIIB-hFc 用作对 照。使用标准方法确定结合亲和力（Kd)和动力学。示例性结果显示于表3中。
[0227] 表3?示例性结合亲和力和动力学数据
[0229] NM =由于不良曲线拟合或与参照芯片的高结合性而不可测量
[0230] 如表3中所示，卵泡抑素（例如FS315或FS315-FC)以高亲和力结合靶标肌抑素 和活化素，但不结合BMP-9和BMP-10 (Kd不可测量或大于I(T7M)，而sActRIIB-Fc以类似亲 和力结合肌抑素、活化素和BMP。惊人并且重要的是，Fc融合使卵泡抑素对主要靶标肌抑素 的亲和力增加至少10倍。
[0231] 此外，荧光素酶报道体测定用于进一步确定卵泡抑素是否特异性抑制肌抑素和活 化素信号传导（Smad 2/3路径）而非BMP信号传导（Smad 1/5/8路径）。具体来说，BMP反 应元件（BRE)-荧光素酶测定用于通过测量荧光素酶信号的降低来确定卵泡抑素是否可抑 制 Smadl/5/8 路径（Korchynskyi 等，Identification and Functional Characterization of Distinct Critically Important Bone Morphogenetic Protein-specific Response Elements in the Idl Promoter, (2002)，J BIOL CHEM., 277 (7):4883-4891)。CAGA-荧 光素酶测定用于通过测量荧光素酶信号的降低来确定卵泡抑素是否可抑制Smad 2/3路 径（Dennler 等，Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF 0 -inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type I gene, (1998)，EMBO J, 17 (II) :3091-3100)。简要来说，HEK293 细胞用 BRE (BRE-Idl-Iuc) 或CAGA-荧光素酶（p (CAGA) 12-MLP-luc载体）构建体和海肾-荧光素酶构建体（Promega pGL4. 74[hRluc/TK])共转染过夜。次日，在有或无一系列浓度的卵泡抑素下，用肌抑素 和活化素（用于Smad 2/3路径诱导，CAGA-荧光素酶报道体）或BMP-9和BMP-IO (用于 Smad 1/5/8路径诱导，BRE-荧光素酶报道体）处理细胞。在过夜孵育之后，使用Promega Dual-Glo测定试剂盒测定荧光素酶信号，其中相对于海肾对照使值标准化。在这个实验中， 测试天然卵泡抑素（R&D Systems)和卵泡抑素Fc融合蛋白（Sino Biological FS315_hFc、 FS315-GAG3-mFc)。FS315-GAG3-mFc 显示如下。
[0233] BRE-荧光素酶测定的示例性结果显示于图1中。FS315-FC不通过Smad 1/5/8路 径抑制BMP-9或BMP-IO信号传导。
[0234] CAGA-荧光素酶测定的示例性结果显示于图2中。相较于在施用生理相关水平 的已知Smad 2/3活化剂肌抑素（I. 2nM)和活化素（0. 4nM)之后观察的Smad 2/3诱导量， FS315与FS315-GAG3-mFc两者均显示在0.1 nM和高于0.1 nM的剂量下强力抑制Smad2/3信 号传导。这些结果指示卵泡抑素是肌抑素和活化素活性的强力和特异性抑制剂。Fc融合的 存在不有害影响卵泡抑素的效能，如通过天然FS315分子与FS315-GAG3-mFc融合蛋白之间 的类似抑制曲线所指示。出乎意料并且重要的是，本发明的Fc融合蛋白使卵泡抑素对主要 靶标肌抑素的结合亲和力显著增加（例如增加至少10倍，如表3中所示）。
[0235] 实施例2.卵泡抑素融合蛋白FS315-GAG3-mFc具有延长的血清半衰期
[0236] 在我们的发明之前，据报道卵泡抑素具有短暂血清半衰期，此是将卵泡抑素开发 成蛋白质治疗剂的顾虑。举例来说，典型商业FS315蛋白的血清半衰期是约1小时。在这 个实施例中，确定FS315-GAG3-mFc融合蛋白的体内半衰期，并且它具有显著延长的血清半 衰期。
[0237] 具体来说，印记控制区域（ICR)小鼠选作模型，并且在1.0mg/kg(~2 y Ci/动物） 下皮下施用I125标记的FS315-GAG3-mFc。在施用之后，获取血清和组织样本直至注射后10 天。取样的组织是：甲状腺、肝、肾、肺、脾、膈肌、心脏、四头肌和三头肌。血清样本的示例性 结果显示于图3A中。如可见，FS315-GAG3-mFc的血清半衰期是近似5天，此相较于本领域 中已知的短暂卵泡抑素血清半衰期（约1小时）是惊人长久的。跨越各种组织的PK曲线 的示例性结果显示于图3B和表4中。除甲状腺之外，跨越各组织的卵泡抑素-Fc的半衰期 在2天与5天之间。此外，延长的组织半衰期曲线是出乎意料的。
[0238] 延长的体内半衰期数据进一步确认卵泡抑素可为用于治疗DMD的有效蛋白质治 疗剂。
[0239] 表4.示例性FS315-GAG3_mFc体内PK数据
[0240]
[0242] 实施例3. FS315-GAG3_mFc的体内功效
[0243] 这个实施例证明向杜兴氏肌营养不良的mdx小鼠模型施用卵泡抑素（例如 FS315-GAG3-mFc