笑气作为细胞内超声空化效应增强剂的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于超声空化效应增强剂技术领域，特别涉及一种笑气作为超声空化效应增强剂的应用。
【背景技术】
[0002]超声空化效应是指存在于液体或组织中的“微气核”空化泡在超声波的作用下产生振动，当此声压达到一定数值时所发生的生长和崩溃的动力学过程。无论声动力学治疗(Sonodynamic Therapy, SDT)、聚焦超声对肿瘤的治疗、超声诱导基因的转染和药物导入细胞，超声空化效应都是主要的机制。
[0003]通过我们前期的临床观察和实验，发现了笑气(N2O)具有增强超声空化效应的作用，笑气(N2O)结构明确、单一，对机无任何毒性作用，脂溶性，可像游魂般地从细胞薄膜透过去广泛作用于组织细胞，在细胞内增加超微气泡的形成数量，作为细胞内的空化效应增强剂的研宄具有诱人的前景。
[0004]开发出超声空化增强剂对声动力治疗，聚焦超声，超声诱导的基因转染和药物导入细胞具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的缺点与不足，提供笑气作为细胞内超声空化效应增强剂的应用。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现:笑气作为细胞内超声空化效应增强剂的应用。笑气作为一种小分子气体，能以自由扩散的方式穿过细胞膜，且结构稳定、单一、对机体几乎无任何毒副性作用，在细胞内增加超微气泡的数量，通过超微气泡增强空化效应使高强度聚焦超声(HIFU)的效应得到加强，同时可能对基因转染、药物的导入细胞、声动力的治疗具有重要意义。
[0007]上述的笑气作为细胞内超声空化效应增强剂的应用，具体为笑气与氧气体积比为I:1的比例作为超声空化效应增强剂进行混合应用。
[0008]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0009]本发明公开了笑气的一种新的应用，作为超声空化效应增强剂，笑气(N2O)作为一种小分子气体能够以自由扩散的形式进出细胞，且结构稳定、单一、对机体几乎无任何毒副性作用，可像游魂般地从细胞薄膜透过去广泛作用于组织细胞，在细胞内形成超微气泡，通过增加细胞内空化核的数量使高强度聚焦超声(HIFU)的作用加强。可能对声动力治疗，超声诱导的基因转染和药物导入细胞具有重要意义。并且笑气的容易获得，成本低廉，具有广阔的应用前景。
【具体实施方式】
[0010]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0011]探索笑气N2O与高强度聚焦超声(HIFU)产生的空化效应之间的关系。实验分为三个步骤:(I)探索笑气(N2O)作为超声空化效应增强剂对组织细胞的作用；(2)进一步探索笑气(N2O)作为超声空化效应增强剂对肿瘤细胞的作用。(3)初步探讨笑气(N2O)作为超声空化效应增强剂对细胞的损伤机制。实验具体情况如下:
[0012]实施例1探索笑气(N2O)作为超声空化效应增强剂对组织细胞的作用
[0013]实验目的:探索笑气(N2O)作为超声空化效应增强剂对组织细胞的作用；
[0014]实验原理:超声空化效应；笑气理化性质；
[0015]实验仪器和试剂:
[0016]1、仪器:高强度聚焦超声仪(机型:JC2000 ;功率:400W);五类血细胞分析仪(SYSMEX.XE-2100);血气分析仪(GEM premier 3000)；
[0017]2、材料:全血细胞?’笑气(N2O) ；EP试管；
[0018]实验步骤:
[0019]1、全血细胞的准备
[0020](I)全血细胞的获取:献血者王学满，重庆医科大学附属第二医院，住院号598507，采血时间2014-6-30 ;术中术后患者不需回输血液，征得患者与家属同意，并签订知情同意书；
[0021](2)主要试剂及配制:笑气(N2O) ；1% KCl溶液(lg/ml);袋装生理盐水(500ml)；在生理盐水中加入KCl使其变成平衡的Na，K溶液，作为稀释液；
[0022](3)用Na，K平衡溶液稀释全血，将全血稀释10倍，降低全血的细胞浓度和粘度系数。
[0023]2、实验的分组
[0024]实验分为4个组:对照组(C组):不作任何处理；通入笑气组(N组):仅在盛有稀释全血的EP管中加入笑气，时间为Ih ;单纯高强度聚焦超声照射组(H组):在盛有稀释全血的EP管仅采用高强度聚焦超声照射；高强度聚焦超声照射通入笑气组(HL组):在盛有稀释全血的EP管中加入笑气，时间为lh，然后用高强度聚焦超声照射。(备注:高强度聚焦超声参数选择:功率:150w ;时间:10s)。
[0025]3、实验指标的检测
[0026]按照上述分组处理后，由五类全血细胞分析仪和血气分析仪分别测量各组的红细胞个数和钾离子浓度。
[0027]4、实验重复三次
[0028]实验结果:
[0029]结果显示:笑气结合高强度聚焦超声产生了协同作用，H组和HN组之间红细胞个数(P = 0.036 < 0.05)产生比较明显的差异。
[0030]实施例2进一步探索笑气(N2O)作为超声空化效应增强剂对肿瘤细胞的作用。
[0031]实验目的:探索笑气(N2O)作为超声空化效应增强剂对组织细胞肿瘤细胞的作用；
[0032]实验原理:超声空化效应；笑气理化性质；
[0033]实验仪器和试剂:
[0034]1、仪器:高强度聚焦超声仪(机型:JC2000 ;功率:400W);流式细胞仪；
[0035]2、试剂:胎牛血清；RPMI1640培养基；FITC/PI试剂盒；
[0036]3、材料:HePG2细胞；笑气(N2O);聚乙烯离心管试管。
[0037]实验步骤:
[0038]1、实验准备
[0039](I)准备工作:器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试；
[0040](2)复苏:将液氮冰冻的癌细胞株置于37°C水中，使之I分钟内溶解，然后接入加入培养基的培养瓶中(培养基的重要组成:胎牛血清、RPMI1640培养基、酚红等)，放入培养箱中；
[0041](3)传代培养:将复苏后长满瓶底的细胞消化后分装，一天或者两天后重复分装，选着对数生长期的细胞进行实验；
[0042](4)消化处理待用。
[0043]2、实验分组
[0044](I)调节细胞密度为lOOOOOOcell/ml，取15ml离心管10支，分别加入准备好的肝癌细胞HepG2 ；
[0045](2)实验分为4个组:对照组(C组):不作任何处理；通入笑气组(N组):仅在肝癌细胞!fepG2的离心管中加入笑气，时间为Ih ;单纯高强度聚焦超声照射组(H组):在盛有肝癌细胞IfepG2的离心管仅采用高强度聚焦超声照射；高强度聚焦超声照射通入笑气组(HL组):在盛有肝癌细胞！fepG2的离心管中加入笑气，时间为lh，然后用高强度聚焦超声照射。(备注:高强度聚焦超声参数选择:功率:150w ;时间:10s)。
[0046]3、指标检测
[0047](I)按说明书步骤在离心管中加入FITC/PI试剂；
[0048](2)进行流式细胞仪检测；
[0049]4、实验结果
[0050]在高强度聚焦超声(HIFU)作用下，NH组的肝癌细胞在细胞的死亡、中晚期凋亡数目都大于H组的细胞。
[0051]其他需要说明情况
[0052]1、目前课题组认为笑气(N2O)的确能够增强高强度聚焦超声(HIFU)对细胞的抑制作用，认为笑气(N2O)是一种空化作用增强剂，由于笑气(N2O)特殊的理化性质，能够稳定存在，能穿过细胞膜，在细胞内形成超微气泡，通过超微气泡增强空化效应使高强度聚焦超声(HIFU)的作用加强。
[0053]2、临床观察与凝问近年来，对我院超声聚焦(HIFU)治疗肝癌病人(98例)麻醉方式比较分析。三种麻醉方式:即静吸复合麻醉I (笑气+异氟醚+丙泊酚+瑞芬太尼+O2)、静吸复合麻醉2 (异氟醚+瑞芬太尼+O2)与全凭静脉麻醉(丙泊酚+瑞芬太尼+O2)进行比效研宄，观察其治疗一小时患者胸壁或腹壁厚度的改变，血中K+浓度的变化，治疗后透射部位的局部改变状态。观察发现:加入笑气(N2O)后的气体麻醉后，胸壁或腹壁厚度术后一小时增加约1-1.5cm，极为明显，有时还需暂时停止手术，术后透声区局部异常肿胀。而不加入笑气的其它气体麻醉(异氟醚)方式，声透部位仅为红斑，几乎没有肿胀现象。
[0054]3、初步探讨笑气(N2O)作为超声空化效应增强剂对细胞的损伤机制。
[0055]取体外培养并处于对数生长期的肝癌细胞!fepG2细胞，将其制成5000000/ml的细胞悬液，分为4组，对照组(C组):不作任何处理；通入笑气组(N组):仅在肝癌细胞HepG2的离心管中加入笑气，时间为Ih ;单纯高强度聚焦超声照射组(H组):在盛有肝癌细胞H印G2的离心管仅采用高强度聚焦超声照射；高强度聚焦超声照射通入笑气组(HL组):在盛有肝癌细胞H印G2的离心管中加入笑气，时间为lh，然后用高强度聚焦超声照射。(备注:高强度聚焦超声参数选择:功率:300w ;时间:10s)。
[0056](I)以上处理后离心(2000rpmx5s)收集细胞，用PBS洗涤2次，离心(2000rpmx5s),加入新鲜的培养基将其制备成10000000/ml的细胞悬液，取0.5ml的细胞悬液加入试管中，加入0.5ml 0.4%台盼蓝染液，染色，3min内，分别计数细胞总数和活细胞的数量，其中A组为细胞总数1，其他组为细胞总数2。破碎细胞数=细胞总数I一细胞总数2。
[0057](2)用相同的处理后收集细胞，PBS洗2次，用2.5%戊二醛固定2小时，1%锇酸后固定30min，经梯度酒精脱水，包埋固化后制作超薄切片，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染后，透射电子显微镜观察各组细胞胞质、细胞器等的变化(fig4)。结果显示:与空白对照组相比，单纯笑气组细胞内空泡数量和体积增加，笑气联合超声组细胞破裂比单纯超声组更明显。这可能是由于笑气作为一种小分子气体，能够以自由扩散的方式进入细胞，并形成细胞内液的“薄弱环节”，使得细胞内空化核的数量增加，较高声强的超声(HIFU)辐照时，更多的空化核迅速扩大形成，直至最后破灭。
[0058]现在得出的结论是:笑气作为一种小分子气体，以自由扩散的方式进入细胞，增加细胞内微小气泡数量，在超声作用下易化细胞内的超声空化效应，对声动力超声治疗、聚焦超声对肿瘤的治疗、空化介导细胞内基因转染及药物的导入都可能产生重要的意义。
[0059]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.笑气作为细胞内超声空化效应增强剂的应用。2.根据权利要求1所述的笑气作为细胞内超声空化效应增强剂的应用，其特征在于:具体为笑气与氧气体积比为1:1的比例作为超声空化效应增强剂进行混合应用。
【专利摘要】本发明公开了一种笑气作为细胞内超声空化效应增强剂的应用，属于超声空化效应增强剂技术领域。本发明中笑气作为细胞内超声空化效应增强剂的应用，具体为笑气与氧气体积比为1：1的比例作为超声空化效应增强剂进行混合应用。本发明公开了笑气的一种新的应用，应用作为超声空化效应增强剂，笑气能够稳定存在，能穿过细胞膜，在细胞内形成超微气泡，通过超微气泡增强空化效应使高强度聚焦超声的作用加强。并且笑气的容易获得，成本低廉，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】A61K47/04, A61K41/00
【公开号】CN104984338
【申请号】CN201510350951
【发明人】田泽丹, 潘明园, 刘芳
【申请人】重庆医科大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月23日