基于超声空化损伤建立动脉粥样硬化斑块动物模型的方法与血管内皮损伤装置的制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于超声空化损伤建立动脉粥样硬化斑块动物模型的方法与血管内皮损伤装置。装置包括复合探头、B超图像引导模块、运动控制模块、时序信号控制及功率驱动模块和空化检测模块。本发明利用该装置完成损伤位点、损伤面积和损伤程度可控的局部动脉血管内皮超声空化损伤，并结合高脂饲料喂养，形成可控制和预测斑块形成位置和大小的动脉粥样硬化斑块动物模型建立方法。本发明可建立用于检测成像方法灵敏性和有效性的处于不同发展阶段的动脉粥样硬化斑块模型，损伤动脉血管内皮过程无需外科手术，降低了血管内皮损伤的难度和复杂性。
【专利说明】
基于超声空化损伤建立动脉粥样硬化斑块动物模型的方法与血管内皮损伤装置
技术领域
[0001]本发明属于建立实验动物疾病模型的范畴，涉及一种基于超声空化损伤建立动脉粥样硬化斑块动物模型的方法与动脉血管内皮损伤装置系统。
【背景技术】
[0002]动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是指大、中动脉内膜出现含胆固醇、类脂肪等黄色物质，形成黄色状如粥样的斑块，同时伴有平滑肌细胞和巨噬细胞在内膜下增殖，弓丨起动脉壁增厚、变硬的病理变化，常导致血栓形成、管腔狭窄等。它不仅是动脉自身的疾病，也是导致心肌梗塞、脑梗塞、坏疽和肢体功能丧失的主要原因，是心脑血管事件发生的主要病理基础。在发达国家，AS性心血管疾病被称为“头号杀手”，在发展中国家其发病率也越来越高。AS对人类健康的严重危害激起人们极大的努力去探索其发病及进展机制，以寻求找到较好的治疗和预防方法。然而在医学生物学以及影像学方面，尤其是深入探讨AS为什么发生、如何发展等规律或进行各种干预性防治和获取病变过程图像时，是不可能也不允许在人体上试验研究的，也就是说必须建立AS的动物模型才能进行相关研究。
[0003]经过长时间努力探索，国内外研究者从不同侧面提出了多种AS的发病机制，例如脂质浸润学说、剪切应力学说、炎症学说、同型半胱氨酸学说、精氨酸学说等，基于不同学说也提出了多种建立AS动物模型的方法，例如基于脂质浸润学说，建立的高脂饲料喂养法;基于炎症学说，建立的免疫损伤法等。然而近年来多数学者支持“内皮损伤反应学说”，认为AS是对内皮细胞受损后的一种慢性反应，在此过程中，氧化修饰的脂蛋白、单核源性巨噬细胞、T淋巴细胞等与动脉壁的正常存在成分相互作用促进了病变的发展。内皮损伤联合高脂喂养，尽可能的模拟了人类AS斑块的形成过程。
[0004]目前基于“内皮损伤反应学说”，建立的内皮损伤法包括空气干燥法、液氮冻伤法以及经典的球囊损伤法。通过这些方法所构建的动物模型对推进动脉粥样硬化斑块的发病机理和影响因素等研究发挥了非常重要的作用。以经典的球囊损伤颈动脉为例，首先沿颈部正中切开皮肤，游离右颈总动脉约4cm，分离右侧颈内、外动脉，“V”形剪开颈外动脉，逆行插入球囊导管，通气膨胀，自近心端缓慢拉回，反复3次后撤出导管，结扎颈外动脉并缝合皮肤。然而它们也存在不足之处，第一、内皮损伤面积较大难以准确预测所形成斑块的确切位置和大小。由于斑块形成的位置不确定，在模型构建过程中对是否形成斑块、斑块的发展过程往往只能采用非活体的病理解剖分析方法来进行评价，所以模型培养的样本量大，操作复杂，难以对某一斑块的发展过程进行跟踪，因此不易得到用于检测成像方法灵敏性和有效性的处于不同发展阶段的AS斑块模型，尤其是尺寸较小的斑块，无法满足日益增长的医学成像方法研究需要。第二、内皮损伤程度难以控制，即球囊大小控制不佳导致动脉破裂或损伤程度过轻，使造模成功率降低。第三、内皮损伤过程中需要进行外科手术，增加了造模过程的难度和复杂性。
[0005]超声空化效应(cavitat1n)是指液体中微气泡在超声作用下产生震荡、膨胀、收缩以及内爆等一系列动力学过程，伴随瞬态高温、高压、冲击波、放电和微射流等多种能量释放行为，是超声的主要生物学效应之一。超声空化发生在组织声学界面时，伴随的微射流、冲击波等物理机械能可以导致组织界面损伤，细胞膜通透性增高(声孔效应)，严重时发生细胞膜破裂、细胞溶解、核碎裂等。这些空化生物效应一方面是局部基因转染、药物释放等超声治疗技术的物理基础，另一方面也是造成血管壁损伤的主要原因。已知经静脉注射超声造影微泡能够增加体内空化核，显著降低超声空化的发生阈值，增强空化效应的强度。Hwang等报道了在较低的空间峰值时间平均强度下，以造影微泡为空化核的超声空化作用于兔耳缘静脉，发现该静脉内皮细胞的破坏程度随着脉冲超声峰值负压的增加而增加，没有微泡时用任何强度的超声基本上都没有内皮细胞的破坏作用。Zachary等也观察到了在聚焦超声作用下微泡对兔耳缘动脉造成的损伤。
[0006]出于斑块培养的目的考虑，内皮损伤的位置主要是腹主动脉、髂动脉等这类较大的动脉血管，这些动脉血管内的血流速度快，血流速度分布特点是越靠近中心处血流越快，造影微泡在待损伤处停留时间很短而且靠近血管壁处微泡浓度较低。高流速、低浓度的空化核空化所产生的机械效应不足以对动脉血管壁待损伤处产生有效的局部损伤。通常情况下，对于普通的微泡造影剂而言，为了维持局部的高浓度，需要增大注射剂量，这样将有可能因“屏蔽”效应而造成待损伤区域内超声能量的衰减。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种基于超声空化损伤建立动脉粥样硬化斑块动物模型的方法与血管内皮损伤装置。通过聚焦超声和B超图像引导损伤动脉血管内皮，并联合高脂饲料喂养，从而建立动脉粥样硬化斑块动物模型，可实现“有的放矢”地对局部动脉血管内皮的损伤位点、损伤面积大小和损伤程度进行控制，从而可控制和预测斑块形成的位置和大小。
[0008]为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案:
[0009]—种基于超声空化损伤建立动脉粥样硬化斑块动物模型的方法，包括以下步骤:
[0010]利用B超图像引导聚焦超声对血管内皮造成损伤，并联合高脂饲料喂养建立动脉粥样硬化斑块动物模型。
[0011]所述建立粥样硬化斑块动物模型具体包括以下步骤:
[0012]步骤一:选取健康实验动物若干只，并进行高脂饲料适应性喂养;所述高脂饲料成分包括1-3 %胆固醇、8-12 %猪油、15-25 %蛋白粉以及60-76 %基础饲料；
[0013]步骤二:根据B超图像确定待损伤位置以及损伤区域大小后，采用聚焦超声对经过高脂饲料适应性喂养的实验动物的动脉血管内皮进行空化损伤；
[0014]步骤三:经过步骤二后，对所述实验动物再继续进行高脂饲料喂养，在喂养期间对动脉血管内皮的损伤位置定期做B超检测，根据检测结果确定所述实验动物动脉粥样硬化斑块的生长状况。
[0015]所述步骤二具体包括以下步骤:
[0016]2.1)将实验动物麻醉并进行备皮后固定在操作台上；
[0017]2.2)在备皮区利用B超图像观察实验动物待损伤动脉的位置和走向，根据所述位置和走向使聚焦超声的焦点落在待损伤的动脉血管内；
[0018]2.3)利用聚焦超声的声辐射力将注入实验动物血液循环系统的造影剂聚集在待损伤的动脉血管壁附近，然后再使脉冲聚焦超声作用于待损伤位点处，使该处的造影剂发生空化来损伤动脉血管壁的对应位点；用于产生空化损伤的脉冲聚焦超声的参数为:声压1.16-6MPa，频率1.2-5MHz，脉冲个数3-10个，脉冲重复频率2500-4000HZ，超声作用时长总计30-60s；
[0019]2.4)根据待损伤动脉的位置和走向，多次移动聚焦超声的焦点并在每次移动后重复步骤2.3)，直至动脉血管壁的损伤面积达到既定的损伤区域要求。
[0020]所述造影剂选自微泡造影剂或相变造影剂。
[0021]所述步骤二还包括以下步骤:根据采集的空化回波信号计算空化剂量，判断内皮损伤程度。
[0022]—种基于聚焦超声空化和B超图像引导的血管内皮损伤装置，包括复合探头、B超图像引导模块、运动控制模块、时序信号控制及功率驱动模块和空化检测模块;所述复合探头包括B超成像探头以及用于改变血管内造影剂分布位置并使造影剂发生惯性空化的聚焦超声换能器，所述B超成像探头的成像平面穿过所述聚焦超声换能器的焦点区域;所述B超图像引导模块包括与B超成像探头相连的用于获取待损伤血管B超图像的超声诊断仪;所述运动控制模块包括与复合探头相连的多维可编程机械悬臂以及用于控制多维可编程机械悬臂移动的控制器;所述时序信号控制及功率驱动模块包括任意波形发生器以及功率放大器，所述控制器以及功率放大器与任意波形发生器相连，所述聚焦超声换能器与功率放大器相连;所述空化检测模块包括用于检测聚焦超声换能器的焦点区域内空化信号的单阵元宽带换能器。
[0023]所述聚焦超声换能器选自单阵元聚焦超声换能器或双频环阵聚焦超声换能器。
[0024]所述多维可编程机械悬臂选自电动三维移动平台或六轴机械臂。
[0025]由于采取了以上技术方案，本发明具有如下有益效果:
[0026](I)由于利用聚焦超声使聚集在血管壁附近的造影剂产生空化，本发明可实现“有的放矢”地对局部血管壁的损伤位点、损伤面积大小和损伤程度进行控制，从而可控制和预测AS斑块形成的位置和大小。
[0027](2)由于可控制和预测斑块形成的位置和大小，本发明可建立用于检测成像方法灵敏性和有效性的处于不同发展阶段的AS斑块模型。
[0028](3)本发明在内皮损伤过程中无需外科手术，降低了内皮损伤的难度和复杂性。
【附图说明】
[0029]图1为本发明所述血管内皮损伤装置的结构示意图；
[0030]图2为动脉血管内皮损伤流程图；
[0031 ]图3为复合探头结构示意图，其中:(a)为聚焦超声换能器下视图，(b)为聚焦超声换能器左视图，(C)为聚焦超声换能器俯视图，(d)为B超成像探头左视图，(e)为B超成像探头正视图，(f)为复合探头组装示意图，(g)为复合探头仰视图；
[0032]图4为本发明所述任意波形发生器时序控制信号图(适用于单阵元聚焦超声换能器)；
[0033]图5为本发明所述任意波形发生器时序控制信号图(适用于双频环阵聚焦超声换能器)；
[0034]图6为血管损伤图；
[0035]图中:I为聚焦超声换能器，2为B超成像探头，3为单阵元宽带换能器，4为探头固定装置，5为实验动物，6为腹主动脉。
【具体实施方式】
[0036]下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
[0037]针对现有AS斑块模型建立方法存在的不足，本发明提出利用聚焦超声使微泡发生瞬态空化，产生冲击波和微射流等机械效应对血管内皮进行损伤，实现“有的放矢”地对局部血管壁的损伤位点、损伤面积大小和损伤程度进行控制，从而可控制和预测斑块形成的位置和大小。
[0038]具体而言，本发明提出先利用声辐射力推动微泡靠近血管壁，使待损伤区域的微泡具有较高的局部浓度，之后超声激励微泡使之发生惯性空化以损伤血管内皮;为了解决“屏蔽”效应问题，本发明还选择相变造影剂(亚微米级微液滴)作为微泡前体。由于这种相变造影剂是处于未相变前的微液滴状态，超声回波信号较弱，不易产生屏蔽效应，同时它仅在大于一定声压阈值的超声福射下才会发生相变成为微泡，利用这一特性，若能够操控相变造影剂聚集在血管壁附近，然后将聚集超声的焦点置于血管壁附近，并使焦点内的声压大于液滴的相变阈值，即可仅在靠近血管壁的区域内得到较高浓度的微泡，然后使其进一步在超声作用下发生惯性空化来损伤血管壁。
[0039]为此，本发明首先建立了基于聚焦超声空化和B超图像引导的用于动脉血管内皮损伤的装置系统，如图1所示。该装置系统包括复合探头、B超图像引导模块、运动控制模块、时序信号控制及功率驱动模块以及空化检测模块。
[0040]所述的运动控制模块由多维可编程机械悬臂和控制器组成。其中多维可编程机械悬臂选自电动三维移动平台或六轴机械臂等可编程的机械移动平台系统，其移动精度可达至Ij0.02_-0.2_。控制器用于控制多维可编程机械悬臂的移动，可接收外部触发信号。
[0041]所述的复合探头由聚焦超声换能器1(FU换能器)和B超成像探头2组成。FU换能器分时或同时输出低强度长脉冲和高强度短脉冲。低强度长脉冲产生声辐射力将造影剂推到管壁，使血管壁待损伤区域得到较高浓度的造影剂，高强度短脉冲使微泡产生空化效应损伤动脉血管内皮。B超成像探头2连接全数字彩色超声诊断仪组成B超图像引导模块，用于图像引导定位FU换能器焦点以及图像引导实施内皮损伤。参见图3，将B超成像探头2安装于FU换能器中孔内，保证B超成像探头2成像平面穿过FU换能器的焦点。全数字彩色超声诊断仪输出的B超图像实时显示FU换能器焦点位置和动物的动脉血管及其他组织，这样就可直观的观察到FU换能器焦点在动物体内的具体位置。
[0042]在B超图像引导下，通过调整多维可编程机械悬臂使FU换能器焦点定位于血管内皮待损伤区，并根据B超图像中待损伤动脉血管的走向和损伤面积的要求设定多维可编程机械悬臂的移动路径和移动步长，可控制FU换能器在血管内的损伤位点，达到控制内皮损伤位置和损伤面积的目的。
[0043]所述的时序信号控制及功率驱动模块由任意波形发生器和功率放大器组成。任意波形发生器一方面用于输出时序控制信号使运动控制模块和功率放大器协调工作，另一方面用于输出FU换能器的时序波形。时序控制信号触发运动控制模块后，随着多维可编程机械悬臂按设定的移动路径和移动步长移动到下一个位点，FU换能器也就随之定位到下一个损伤位点。一定延时后，时序控制信号输出FU换能器的时序波形触发功率放大器，FU换能器的时序波形信号经功率放大器放大后由FU换能器输出。通过调节功率放大器输出功率以及FU换能器的时序波形的脉冲周期和脉冲重复频率等参数可实现控制内皮损伤程度的目的。
[0044]所述的空化检测模块由单阵元宽带换能器3、宽带信号放大器、高速数据采集卡(NI采集卡)和计算机组成。NI采集卡与任意波形发生器相连，即增加了任意波形发生器触发NI采集卡的信号，频率范围是高强度短脉冲脉冲重复频率的1/50到1/200倍，目的使NI采集卡与功率放大器触发信号同步工作，单阵元宽带换能器3与FU换能器焦点重合，置于FU换能器两侧。单阵元宽带换能器3接收FU换能器焦点区域内微泡的被动空化信号，经宽带信号放大器放大后由NI采集卡采集、存储在计算机内。利用采集到的被动空化信号计算空化剂量大小，从而间接判断内皮损伤程度。
[0045]上述基于聚焦超声空化和B超图像引导的用于动脉血管内皮损伤的装置系统，其工作原理如下:
[0046]在控制器中设定多维可编程机械悬臂移动路径和移动步长，并载入任意波形发生器的时序控制信号;经实验动物5(例如新西兰大白兔)耳缘静脉团注一定剂量造影剂后，触发任意波形发生器输出时序控制信号;聚焦超声焦点置于内皮待损伤处激励微泡使之产生空化效应，可精确控制内皮损伤位置;编程控制焦点移动轨迹和装置系统的同步时序可精确控制损伤面积大小；调节聚焦超声参数和微泡浓度等参数可精确控制内皮损伤的严重程度。超声空化过程中由空化检测模块采集的空化回波信号并计算空化剂量，间接判断内皮损伤程度。
[0047]实例I
[0048]仪器设备和造影剂:
[0049]FU换能器参数:单阵元FU换能器，中心频率1.2MHz，焦距120mm，外径156mm，中孔直径50mm，声电转换效率72%，半高宽8mm*l.2mm；
[0050]B超成像探头:安科AUS-3500相控阵；
[0051 ] 全数字彩色超声诊断仪:安科AUS-3500 ；
[0052]多维可编程机械悬臂:电动三维移动平台，包括三维移动机械轴，悬臂和球形关节。悬臂固定于机械轴，球形关节固定于悬臂，探头固定装置4固定于球形关节;探头固定装置4由有机玻璃制作而成，用于固定复合探头；
[0053]功率放大器:AG1016，T&CPower Convers1n,USA；
[0054]任意波形发生器:AWG2021，Sony/Tektronix，JP;
[0055]单阵元宽带换能器:中心频率5MHz，V309，Panametetrics，USA;
[0056]宽带信号放大器:BR640，Ritec，USA;
[0057]高速数据米集卡:5122,Nat1nal Instruments ,Austin,TX,USA；
[0058]计算机软件:高速数据采集卡数据处理软件；
[0059]造影剂:微泡造影剂。
[0060]参见图2，损伤实施步骤:[0061 ] (I)呼吸麻醉机麻醉兔子，在腹部备皮，将兔子腹部朝上固定在操作台上。
[0062](2)观察B超图像中待损伤腹主动脉的位置和走向，根据所述位置和走向使聚焦超声的焦点落在待损伤的动脉血管内。
[0063](3)根据腹主动脉走向和损伤面积要求设定电动三维移动平台路径和移动步长(例如:沿血管走向移动lcm，步长为2mm)并载入任意波形发生器的时序控制信号(如图4所示)。任意波形发生器输出三路信号分别上升沿触发电动三维移动平台和功率放大器以及NI数据采集卡。第一路信号触发电动三维移动平台一个步长，3-5秒(tl)后第二路信号触发功率放大器激励FU换能器输出低强度长脉冲(声压0.3-0.5MPa，频率1.2MHz，作用时间0.1-
0.5s(t2))将微泡推到管壁，使血管壁待损伤区域得到较高浓度的微泡，随后高强度短脉冲(声压1.16-3MPa，频率1.2MHz，脉冲个数3_10个(t3)，脉冲重复频率为2500_4000Hz)实现微泡空化，超声作用总时长t5由t4确定，t4的总和为30-60s。第三路信号触发NI数据采集卡，其频率范围是高强度短脉冲脉冲重复频率的1/50到1/200倍。
[0064](4)经耳缘静脉团注微泡造影剂(0.1-0.5mL/kg)。
[0065](5)微泡造影剂在兔子体内循环10秒钟后，触发任意波形发生器输出时序控制信号。超声空化过程中由空化检测模块采集空化回波信号并计算空化剂量，判断内皮损伤程度。
[0066]实例2
[0067]仪器设备和造影剂:
[0068]FU换能器参数为:1.l/5MHz双频环阵换能器，外环1.1MHz，内环5MHz，焦距60mm，夕卜径103_，中孔直径25mm;
[0069]B超成像探头:Ultrosonix PA4-2/20;
[0070]全数字彩色超声诊断仪:Ultrosonix RP;
[0071]其他设备如实例I所述；
[0072]造影剂:微泡造影剂。
[0073]损伤实施步骤:
[0074](I)呼吸麻醉机麻醉兔子，在腹部备皮，将兔子腹部朝上固定在操作台上。
[0075](2)观察B超图像中待损伤腹主动脉的位置和走向，根据所述位置和走向使聚焦超声的焦点落在待损伤的动脉血管内。
[0076](3)根据腹主动脉走向和损伤面积要求设定电动三维移动平台路径和移动步长(例如:沿血管走向移动lcm，步长为2mm)并载入任意波形发生器时序控制信号(如图5所示)。任意波形发生器输出四路信号分别上升沿触发电动三维移动平台和两个功率放大器以及NI数据采集卡。第一路信号触发电动三维移动平台一个步长，3-5秒(t6)后第二路信号触发其中一个功率放大器激励双频环阵的外环1.1MHz输出低强度长脉冲(声压0.3-
0.5MPa，频率1.1MHz，作用时间连续作用0.5-1min (t9))将微泡推到管壁，使血管壁待损伤区域得到较高浓度的微泡，第三路信号触发另一个功率放大器激励内环5MHz输出高强度短脉冲(声压2.5-4MPa，频率5MHz，脉冲个数3-10个(t8)，脉冲重复频率2500_4000Hz (t7))实现微泡空化，超声作用总时长为0.5-lmin(t9)。相比于实例1，实例2可以实现将微泡推到管壁和激励微泡超声空化同时进行。第四路信号触发NI数据采集卡，其频率范围是高强度短脉冲脉冲重复频率的1/50到1/200倍。
[0077](4)经耳缘静脉团注微泡造影剂(0.1-0.5mL/kg)。
[0078](5)微泡造影剂在兔子体内循环10秒钟后，触发任意波形发生器输出时序控制信号。超声空化过程中由空化检测模块采集空化回波信号并计算空化剂量，判断内皮损伤程度。
[0079]实例3
[0080]仪器设备和造影剂:
[0081]多维可编程机械悬臂:六轴机械臂
[0082]其他设备如实例I所述。
[0083]造影剂:微泡造影剂。
[0084]损伤实施步骤:
[0085](I)呼吸麻醉机麻醉兔子，在腹部备皮，将兔子腹部朝上固定在操作台上。
[0086](2)观察B超图像中待损伤腹主动脉的位置和走向，根据所述位置和走向使聚焦超声的焦点落在待损伤的动脉血管内。
[0087](3)根据腹主动脉走向和损伤面积的要求设定六轴机械臂移动路径和移动步长(例如:沿血管走向移动lcm，步长为2mm)，并载入任意波形发生器时序控制信号(如图4所示)。任意波形发生器输出三路信号分别上升沿触发六轴机械臂和功率放大器以及NI数据采集卡。第一路信号触发六轴机械臂一个步长，3-5秒(11)后第二路信号触发功率放大器激励FU换能器输出低强度长脉冲(声压0.3-0.5MPa，频率1.2MHz，作用时间0.1-0.5s(t2))将微泡推到管壁，使血管壁待损伤区域得到较高浓度的微泡，随后高强度短脉冲(声压1.16-3MPa，频率1.2MHz，脉冲个数3_10个(t3)，脉冲重复频率为2500-4000Hz)实现微泡空化，超声作用总时长t5由t4确定，t4的总和为30-60s。第三路信号触发NI数据采集卡，其频率范围是高强度短脉冲脉冲重复频率的1/50到1/200倍。
[0088](4)经耳缘静脉团注微泡造影剂(0.1-0.5mL/kg)。
[0089](5)微泡造影剂在兔子体内循环10秒钟后，触发任意波形发生器输出时序控制信号。超声空化过程中由空化检测模块采集空化回波信号并计算空化剂量，判断内皮损伤程度。
[0090]实例4
[0091]使用相变造影剂实施损伤。
[0092]仪器设备如实例2所述。
[0093]损伤实施步骤(3)双频环阵的外环1.1MHz输出低强度长脉冲声压改为0.6-lMPa，内环5MHz输出高强度短脉冲声压改为3.5-6MPa。步骤(4)改为经耳缘静脉团注相变造影剂(0.1-0.5mL/kg)，相变造影剂只是在聚焦换能器焦点处有空化，而微泡造影剂有可能在焦点外区域也产生空化。
[0094]本发明基于超声空化损伤建立AS斑块动物模型的方法可控制和预测斑块形成的位置和大小，因此，可建立用于检测成像方法灵敏性和有效性的处于不同发展阶段的AS斑块模型。而且内皮损伤过程无需外科手术，降低了内皮损伤的难度和复杂性。下面结合实例详细说明本发明建立AS斑块动物模型方法的具体过程和结果。
[0095](I)选用普通级雄性新西兰大白兔(实验兔)20只，体重2.5±0.2kg。高脂饲料喂养2周，每天每只120-140g高脂饲料，自由饮水。适应性喂养的作用为:一方面使兔子血脂升尚，缩短造t旲的时间；另一方面使兔子适应尚脂伺料，提尚造t旲的成功率；尚脂伺料成分包括I %胆固醇、8 %猪油、15 %蛋白粉以及76 %基础饲料(基础饲料购自西安交通大学实验动物中心)。
[0096](2)实验兔在实验前12h禁食，自由饮水。呼吸麻醉机麻醉后仰卧固定在实验台上，腹部去毛备皮。
[0097](3)采血5mL做血脂检测和ELISA检测。检测损伤前实验兔的血脂水平和免疫因子水平，以供后续检测作为参考。
[0098](4)用实例I所述的仪器设备和实施步骤损伤实验兔腹主动脉待损伤区域。
[0099](5)采血5mL做ELISA检测。检测损伤后免疫因子水平，与(3)做对比，免疫因子水平显著升高，说明动脉血管内皮被损伤。通过图6也可以看出利用超声空化损伤血管内壁具有可行性，图6中方框部分显示为产生空化损伤位置。
[0100]以上血脂检测对象包括总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇及高密度脂蛋白胆固醇。ELISA检测对象包括白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF-A)。
[0101](6)内皮损伤完成后将实验兔放回动物房继续高脂饲养(采用上述高脂饲料)两个月，每天每只120-140g高脂饲料，自由饮水。
[0102](一)血脂检测:
[0103](I)分别于实验开始第一天(上文提及的损伤前血脂检测和损伤后血脂检测)、第2周、第4周、第6周和第8周从耳缘静脉采血2mL。每次采血前禁食12h，自由饮水。将采集的血液用全自动生化分析仪测定总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇及高密度脂蛋白胆固醇。随着高脂饲料喂养的进行，血脂水平不断升高。
[0104](二)B 超检测:
[0105](I)分别于实验开始第一天、第2周、第4周、第6周和第8周进行B超检测。每次检测前禁食12h，自由饮水。
[0106](2)用呼吸麻醉机麻醉，仰卧固定在实验台上，腹部去毛备皮(与损伤时备皮同位置)。用线阵探头探测腹主动脉可能空蚀损伤区域，并保存图像。随着时间的进行，损伤处的血管内皮厚度逐渐增厚。
[0107](三)病理切片HE染色观察:
[0108]实验第8周(S卩2个月)结束，将所有实验兔麻醉，仰卧固定在实验台上，腹部去毛备皮，用空气栓塞法处死，取出腹主动脉用生理盐水冲洗干净后置于10%甲醛溶液固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋与石蜡切片处理并HE染色后中性树胶封片并在光镜下观察。通过观察发现，血管壁有动脉粥样硬化斑块形成，血管内皮增厚且厚度不均匀，斑块内含有大量的泡沫细胞和平滑肌细胞，斑块表面有纤维组织覆盖，呈典型的成熟动脉粥样硬化斑块。
【主权项】
1.一种基于超声空化损伤建立动脉粥样硬化斑块动物模型的方法，其特征在于:包括以下步骤:利用B超图像引导聚焦超声对血管内皮造成空化损伤，并联合高脂饲料喂养建立动脉粥样硬化斑块动物模型。2.根据权利要求1所述一种基于超声空化损伤建立动脉粥样硬化斑块动物模型的方法，其特征在于:所述建立粥样硬化斑块动物模型具体包括以下步骤: 步骤一:选取健康实验动物若干只，并进行高脂饲料适应性喂养； 步骤二:根据B超图像确定待损伤位置以及损伤区域大小后，采用聚焦超声对经过高脂饲料适应性喂养的实验动物的动脉血管内皮进行空化损伤； 步骤三:经过步骤二后，对所述实验动物再继续进行高脂饲料喂养，在喂养期间对动脉血管内皮的损伤位置定期做B超检测，根据检测结果确定所述实验动物动脉粥样硬化斑块的生长状况。3.根据权利要求2所述一种基于超声空化损伤建立动脉粥样硬化斑块动物模型的方法，其特征在于:所述步骤二具体包括以下步骤: 2.1)将实验动物麻醉并进行备皮后固定在操作台上； 2.2)在备皮区利用B超图像观察实验动物待损伤动脉的位置和走向，根据所述位置和走向使聚焦超声的焦点落在待损伤的动脉血管内； 2.3)利用聚焦超声的声辐射力将注入实验动物血液循环系统的造影剂聚集在待损伤的动脉血管壁附近，然后再使聚焦超声作用于待损伤位点处，使该处的造影剂发生空化来损伤动脉血管壁的对应位点； 2.4)根据待损伤动脉的位置和走向，多次移动聚焦超声的焦点并在每次移动后重复步骤2.3)，直至动脉血管壁的损伤面积达到既定的损伤区域要求。4.根据权利要求3所述一种基于超声空化损伤建立动脉粥样硬化斑块动物模型的方法，其特征在于:所述造影剂选自微泡造影剂或相变造影剂。5.根据权利要求2所述一种基于超声空化损伤建立动脉粥样硬化斑块动物模型的方法，其特征在于:所述步骤二还包括以下步骤:根据采集的空化回波信号计算空化剂量，判断内皮损伤程度。6.一种基于聚焦超声空化和B超图像引导的血管内皮损伤装置，其特征在于:包括复合探头、B超图像引导模块、运动控制模块、时序信号控制及功率驱动模块和空化检测模块;所述复合探头包括B超成像探头(2)以及用于改变血管内造影剂分布位置并使造影剂发生惯性空化的聚焦超声换能器(I)，所述B超成像探头(2)的成像平面穿过所述聚焦超声换能器(I)的焦点区域;所述B超图像引导模块包括与B超成像探头(2)相连的用于获取待损伤血管B超图像的超声诊断仪;所述运动控制模块包括与复合探头相连的多维可编程机械悬臂以及用于控制多维可编程机械悬臂移动的控制器;所述时序信号控制及功率驱动模块包括任意波形发生器以及功率放大器，所述控制器以及功率放大器与任意波形发生器相连，所述聚焦超声换能器(I)与功率放大器相连;所述空化检测模块包括用于检测聚焦超声换能器(I)的焦点区域内空化信号的单阵元宽带换能器(3)。7.根据权利要求6所述一种基于聚焦超声空化和B超图像引导的血管内皮损伤装置，其特征在于:所述聚焦超声换能器(I)选自单阵元聚焦超声换能器或双频环阵聚焦超声换能器。8.根据权利要求6所述一种基于聚焦超声空化和B超图像引导的血管内皮损伤装置，其特征在于:所述多维可编程机械悬臂选自电动三维移动平台或六轴机械臂。
【文档编号】A61D7/00GK106039604SQ201610505872
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】宗瑜瑾, 刘刚, 万明习, 张蕾
【申请人】西安交通大学