IOmin-次，用0. 2%Triton 和10%驴血清常温封闭，Ih后，用0. 2%Triton和10%驴血清按比例稀释一抗，于12孔板 中置于摇床的冰盒上孵育过夜，再于6孔板中PBS缓冲液常规漂洗5次，每IOmin-次，然 后用5%的驴血清按比例稀释荧光二抗，于24孔板中置于摇床的冰盒上孵育lh，PBS缓冲 液中漂洗5次后，将脑片展开贴于载玻片上。用水溶性封片剂封片，待晾干后置于4°C冰箱 保存；
[0080] 6?统计分析
[0081] 采用SPSS13. 0软件进行统计分析，除神经行为学指标外，其他资料均以均数土 标准差（mean土SD)表示，采用单因素方差分析（ANOVA)进行差异统计，组间两两比较采用 Tukey检验，P〈0. 05为有显著的统计学差异。
[0082] 实验结果显示：
[0083] 1)七氟烷预处理对MCAO大鼠的神经具有保护作用并可延长其寿命
[0084] 实验验证了七氟烷预处理对脑梗死容积有影响，实验显示两组在术后第一天无统 计学差异，七氟烷预处理组术后3d显著减MCAO后脑梗死容积百分比，P〈0. 05 (如图IA-B所 示）；神经行为学评分结果显示，MCAO组从缺血再灌注后24h平均分7. 2升高到72h平均分 9. 6,七氟烷预处理组（n= 8)从缺血再灌注后24h平均分9. 5升高到72h平均分12. 9,三 个时间点比较均具有显著性差异，P〈〇. 〇5(如图IC所示）；对两组大鼠的生存期进行观察统 计，每只大鼠都是模型成功的MCAO大鼠，结果显示术后28天时，七氟烷预处理显著延长了 MCAO大鼠的寿命（如图ID所示，LogrankP= 0? 043)。
[0085] 2)七氟烷预处理促进小胶质细胞的迁移和吞噬功能
[0086] 进一步观察脑梗死容积3d显示出差别的原因，用TTC染色之后的脑片再进行冰 冻切片和免疫荧光染色，保证实验的均一性；首先，用小胶质细胞的形态和星形胶质细胞的 分布共同界定半暗带区和梗死区，观察到在术后1山两组梗死区几乎都不存在任何细胞，而 在半暗带区，Sevo+MCAO组小胶质细胞胞体变成细长状，棘状突起数量增加变长且有大量分 支，而MCAO组小胶质细胞处于昏迷期，尚未苏醒，突起较短，数量较少，和Sham组处于静息 状态的小胶质细胞形状相当（如图2A所示），小胶质细胞的胞体长度，突起的数量及长度两 组比较均具有统计学差异（如图2D所示），到术后第3天，预处理半暗带区的活化小胶质细 胞快速迁移到梗死区，与MCAO组相比显著增多（P〈0. 05)，且其从形状上也发生了改变，小 胶质细胞收起了所有的突起和分支，转变成变形虫样的活化状态，小胶质细胞标记物Iba-I 与Ki67仅有少量双标，表明梗死区仅有约8-10%的小胶质细胞增殖，90%以上的小胶质细 胞都是从半暗带区迁移过来，证实术后第一天时半暗带区小胶质细胞形态学改变加速其向 梗死区的迁移（如图3A-C所示）；基于活化的小胶质细胞是脑内的巨噬细胞，发挥清理细 胞碎片的作用，本实验用MAP2标记成熟神经元，
[0087] 与Iba-I双标显示，术后3d，梗死区所有活化的小胶质细胞胞体内都包含有MAP2 细胞碎片（如图3D所示），表明小胶质细胞的清理能力较强，证实了七氟烷预处理促进了小 胶质细胞的吞噬清理功能，为脑梗死区的重建提供了必备的无毒性的微环境；
[0088] 3)七氟烷预处理促进星形胶质细胞向梗死区迁移
[0089] 星形胶质细胞是中枢神经系统内极为关键的神经细胞，为神经元之间的联系提供 支架形成网络，并通过终足从毛细血管中汲取营养物质并输送给神经元，因此梗死区修复 重建过程必然少不了星形胶质细胞的角色；本实验进一步观察七氟烷预处理促进星形胶质 细胞的迁移作用，采用GFAP和Iba-I共同界定半暗带区和梗死区，观察从术后Id到28d，比 较两组星形胶质细胞向梗死区移动的距离，如图4A所示，七氟烷预处理组在术后3d时，有 大量活化的星形胶质细胞向梗死区迁移，到术后14d时，已基本覆盖整个梗死区域，而MCAO 组星形胶质细胞的迁移较慢，7d时才开始向梗死区移动，28d时也仅覆盖梗死边缘区，其向 梗死区移动的距离，显著低于预处理组，P〈〇. 05 (如图4C所示）；所述的星形胶质细胞可以 提供丰富的神经营养因子如BNDF，GDNF等，为梗死区的重建提供营养物质；
[0090] 4)七氟烷预处理促进梗死区神经再生
[0091] 本实验进一步观察七氟烷预处理促进新生神经元在梗死区滋生的作用，结果显示 七氟烷预处理组在术后7d即有较多Nestin阳性细胞从SVZ区向纹状体迁移，而到术后14d 时，梗死区已有大量的Dcx阳性细胞出现（约30000/mm3)，是MCAO组（约8000/mm3) 3倍之 多，具有显著的统计学意义（图5A-B);用Dcx与成熟神经元MAP2双标，验证新生神经元能 否转化为成熟的神经元，结果显示，在术后14d,预处理组有约40%的Dcx细胞是MAP2双阳 性，MCAO组仅有7 %的双标率，而到28d时，预处理组Dcx向成熟神经元转化率高达80%， MCAO组仅有15 %的新生神经元转化为成熟神经元（如图5C-D所示），实验结果表明，七氟 烷预处理显著促进梗死区神经细胞的再生，且促进新生神经元转化为成熟神经元；
[0092] 5)七氟烷预处理促进梗死区新生细胞的突触重塑过程
[0093] 基于神经元之间有突触联系是神经元发挥功能的必备条件，本实验进一步观察在 梗死区新生的神经元之间形成突触联系，在术后14d时，用Iba-I标记小胶质细胞成变形虫 样改变时表示梗死区，NF-70标记神经元轴突，PSD95和Synaptophysin分别表示突触后膜 和突触小体，结果如图6A-B所示，术后28d时，在梗死的纹状体区，神经元轴突上有大量的 突触后膜及突触小体的表达，且新生神经元与周边伸展进梗死区的神经元之间也有突触联 系，七氟烷预处理组NF-70与PSD95和NF-70与Synaptophysin有大量的双标，而MCAO组 尚没有双标的阳性结果出现，实验证实了梗死区新生神经元之间存在突触联系，换而言之， 七氟烷预处理能够使再生的神经元重新发挥功能。
[0094] 本发明通过星形胶质细胞的分布和小胶质细胞的形态界定缺血半暗带区和梗死 区实验，结果证明，
[0095] (1)七氟烷预处理显著延长MCAO大鼠的寿命；（2)术后ld，梗死区MCAO组和 Sevo+MCAO组几乎没有小胶质细胞；而在缺血半暗带区，Sevo+MCAO组小胶质细胞胞体成细 长状，棘状突起数量增加且分支增长；而MCAO组和sham组小胶质细胞无显著形态学变化；
[0096] (3)术后3d，梗死区小胶质细胞的形态转变为活化的变形虫样，MCAO组仅有少量 的小胶质细胞；而Sevo+MCAO组则有大量活化的变形虫样小胶质细胞的聚集，具有显著统 计学差异（P〈〇. 01) ; (4)术后7d，发现Sevo+MCAO组有大量星形胶质细胞向梗死区迁移， 而MCAO组在14d时在梗死区只有少量星胶出现（P〈0. 01) ; (5)术后14d，在梗死核心区， Sevo+MCAO组DCX阳性细胞数显著高于MCAO组（P〈0. 01) ; (6)术后28d，在梗死区，DCX阳 性细胞数减少，而DCX和MAP2 (成熟神经元）双阳性神经元在梗死核心区出现，其转化率高 达80 %，且NF-70 (神经元轴突）与PSD95 (突触后膜）以及Synaptophysin(突触素）有大 量重叠。
[0097] 本发明的实验结果表明，经七氟烷预处理，损伤早期（14天）的梗死区内存在大量 新生神经元，显著高于未处理组；并且在损伤中后期（28天）新生神经元间存在突触联系和 新生髓鞘形成；证实七氟烷预处理具有促进脑中风后神经再生，加速梗死区神经功能重建 的作用。本发明的七氟烷可制备促进神经再生的药物，尤其是制备促进局灶性脑缺血损伤 后神经再生药物。
【主权项】
1. 七氟烷在制备促进神经再生药物中的用途，所述的七氟烷其化学名称：氟甲 基-2, 2, 2-二氟-1-(二氟甲基）乙基醚， 分子式：C4H3F70 结构式分子量：200. 06。2. 按权利要求1所述的用途，其中所述的神经再生是局灶性脑缺血损伤后神经再生。3. 按权利要求1所述的用途，其中所述的七氟烷对局灶性脑缺血损伤后的神经保护。4. 按权利要求1所述的用途，其中所述的七氟烷促进小胶质细胞的迁移和吞噬功能。5. 按权利要求1所述的用途，其中所述的七氟烷促进星形胶质细胞向局灶性脑缺血损 伤梗死区迁移。6. 按权利要求1所述的用途，其中所述的七氟烷促进局灶性脑缺血损伤梗死区神经再 生。7. 按权利要求1所述的用途，其中所述的七氟烷促进新生神经元转化为成熟神经元。8. 按权利要求1所述的用途，其中所述的七氟烷促进局灶性脑缺血损伤梗死区新生细 胞的突触重塑。
【专利摘要】本发明属于生物医学领域，具体涉及七氟烷在制备促进神经再生药物中的用途，本发明利用免疫荧光染色和激光共聚焦的方法，通过大鼠局灶性脑缺血模型，研究观察七氟烷预处理促进神经元的再生，加速大鼠局灶性脑缺血后神经功能重建的过程，结果显示，经七氟烷预处理，损伤早期的梗死区内存在大量新生神经元，显著高于未处理组；损伤中后期新生神经元间存在突触联系和新生髓鞘形成；证实七氟烷预处理具有促进脑中风后神经再生，加速梗死区神经功能重建的作用。本发明为七氟烷治疗急性神经损伤及神经退休性变疾病提供了理论依据。七氟烷可制备促进神经再生的药物，尤其是制备促进局灶性脑缺血损伤后神经再生药物。
【IPC分类】A61K31/08, A61P25/00
【公开号】CN105078935
【申请号】CN201410193219
【发明人】余琼, 李丽, 梁伟民, 赛音贺西格
【申请人】复旦大学附属华山医院, 复旦大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月8日