吐曼酸在制备治疗或预防雌激素缺乏引起的阿尔茨海默病药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于吐曼酸的医药新用途技术领域，具体涉及一种吐曼酸在制备治疗或预 防雌激素缺乏引起的阿尔茨海默病药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 阿尔茨海默病（Alzheimer'sDisease，AD)是常见的神经系统的退行性疾病，表现 为老年斑的沉积，进行性学习记忆能力丧失和智力减退。老年斑的主要成分是淀粉样 多肽（beta-amyloid，A0 )。研究报道，女性患者血液中雌激素水平降低与AD临床症状密切 相关。雌激素不仅具有调控生殖和机体发育的作用，还有降低兴奋性氨基酸释放、神经保护 和改善学习记忆等功能。流行病学显示，AD是一种有性别倾向的疾病，老年女性的发病率 明显高于老年男性，提示雌激素缺乏在AD发生发展过程中具有显著意义。
[0003] 脑中广泛存在雌激素受体（Estrogenreceptors，ER)，研究发现雌激素受体如 ERa、ERP等可以调节海马的神经兴奋性及基于海马的学习记忆能力。同时，学习记忆损 害程度与胆碱能神经元的数量密切相关。因此，提高脑内乙酰胆碱的含量是治疗AD的一个 非常好的策略。
[0004] 吐曼酸是一种三萜皂甙类物质，可以从草莓果、紫苏的叶子和橄榄等中提取。研究 发现，吐曼酸能拮抗LPS-诱导的小胶质细胞的炎性反应。抑制平滑肌细胞的增殖和存活。 吐曼酸能抑制坐骨神经的病理性疼痛及高脂饮食诱导的高脂血症及暴发性肝功能衰竭。
[0005] 雌激素替代疗法己被肯定，但作为安全的长期用药仍有争议，如能增加阴道不规 则出血和增加乳腺癌的风险等等。我们采用卵巢切除小鼠，作为研究对象，以期阐明吐曼 酸、雌激素受体和神经功能在AD发病中的相互关系，明确吐曼酸对雌激素受体及对神经系 统中的作用，为临床雌激素缺乏后引起的AD疾病的治疗提供理论依据。
【发明内容】
[0006] 本发明解决的技术问题是提供了一种吐曼酸在制备治疗或预防雌激素缺乏引起 的阿尔茨海默病药物中的应用。
[0007] 本发明的技术方案为，吐曼酸在制备治疗或预防雌激素缺乏引起的阿尔茨海默病 药物中的应用，其中吐曼酸的分子式为C3(]H4S05，结构式为：
[0008] 进一步限定，所述的药物是由吐曼酸和药学上可接受的载体或赋形剂制成的。
[0009] 本发明所述的吐曼酸在制备治疗或预防绝经期妇女合并阿尔茨海默病药物中的 应用，其中吐曼酸的分子式为C3(]H4S05，结构式为：
[0010] 进一步限定，所述的药物是由吐曼酸和药学上可接受的载体或赋形剂制成的。
[0011] 本发明的吐曼酸可改善AD患者的认知功能障碍，提高脑内胆碱能神经元的数量， 对CNS具有神经保护作用，该保护作用可能通过ERa实现，该结果为吐曼酸作为治疗绝经 期妇女合并AD的药物选择提供了实验依据。
【附图说明】
[0012] 图1是本发明各组小鼠Meynert核团ChAT阳性神经元免疫组织化学检测图； 图2是本发明各组小鼠海马ERa和ER0蛋白表达的Westernblot检测图。
【具体实施方式】
[0013] 以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本 发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发 明的范围。 实施例
[0014] 1材料与方法 1. 1造模和分组 卵巢切除痴呆模型小鼠造模：选用C57BL小鼠，3月龄，体重（30±2)g。以质量浓度为 1. 5%的戊巴比妥钠（0. 25mL/100g)腹腔麻醉小鼠，消毒备皮耻骨以上的皮肤，沿正中切开 耻骨上方皮肤2cm，切开腹壁肌层并打开腹腔，分别分离暴露双侧粉红色卵巢，结扎并摘除 双侧卵巢（ovariectomy，OVX)，依次缝合肌肉和皮肤，术后碘伏消毒。假手术组仅暴露卵巢。 术后第3天进行阴道细胞涂片，连续7天出现上皮角化细胞则证明卵巢切除成功。卵巢切除 痴呆模型是由于雌激素缺乏而引起的神经系统疾病，卵巢切除痴呆模型时间需要6-8周。
[0015] 吐曼酸为湖北巨胜科技有限公司产品，其分子式：C3(]H4S05，结构式：
[0016] 成年雌性小鼠随机分成四组，即假手术组，0VX组，0VX+吐曼酸治疗组和0VX+载 体假治疗组。吐曼酸治疗组以30mg/kg进行灌胃治疗，每两天一次，治疗8周。8周后进行 Morris水迷宫测试小鼠的学习记忆能力。然后处死小鼠，分离海马，测定相应的指标变化。
[0017] 1. 2Morris水迷宫测定实验 Morris水迷宫视频分析系统的水槽由直径120cm、高55cm的圆形水池构成，黑色内壁， 水深41cm，水温24±2°C，池壁平均分成4个象限，逃避平台位于其中一个象限内，平台低于 水面lcm。水池周围参照物保持不变作为空间参照线索。动物运动轨迹由迷宫上方的摄像 系统采集。Morris水迷宫实验程序包括：（1)定向航行实验：实验历时5d，每天上、下午进 行。从一个象限开始依次将小鼠从各象限边缘放入水中，记录在60s内找到逃避平台的时 间即为潜伏期。（2)空间探索实验：撤除逃避平台，任选一个入水点将小鼠放入水中，记录 60s内小鼠穿越逃避平台的次数。
[0018] 1. 3ELISA检测的实验步骤 将各组小鼠的海马脑组织部位匀浆，匀浆液：5M的盐酸胍(含50mM的Tris-HCL，pH=8. 0)匀浆后-70°C冻存待测。测定时，融化样本，1. 5mL离心管中4°C，12000Xg，离心 30min，取上清50yL，按ELISA试剂盒说明书方法测定海马A40水平。ELISA试剂盒购于 BioSource公司（BioSourceInternational，Inc.，Camarillo,California)。
[0019] (1)标准品的稀释：按照说明书要求将鼠的AP1-40标准品稀释成以下浓度： 500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62. 5pg/mL、31. 25pg/mL、15. 63pg/mL、7. 81pg/mL、0pg/mL〇
[0020] (2)加样：设立空白对照孔、标准孔和待测样本孔。空白对照孔加样品稀释液 100yL，其他孔加标准品或待测样本各100yL，37°C，120min，弃液。
[0021] (3)加入A工作液 100yL，37°C，60min，#*。
[0022] (4)漂洗：加洗涤液350yL，漂洗3minX3次。
[0023] (5)加入8工作液10〇1^，37°(：，6〇111111。
[0024] (6)漂洗：加洗涤工作液350yL，3minX5次。
[0025] (7)显色：加底物90yL，37°C避光孵育30min，反应液逐渐变为蓝色。
[0026] (8)终止：加终止液50yL终止反应，此时反应液变为黄色。
[0027] (9)读数：酶标仪在450nm波长测定各孔的光密度（0D值)。
[0028] (10)根据标准曲线和测得的0D值计算出A0 1-40浓度。
[0029] 1. 4免疫组织化学染色检测胆碱乙酞转移酶神经元： 小鼠麻醉后用质量浓度为4%的多聚甲醛灌注固定，取脑组织后固定，蔗糖梯度脱水、 包埋，在冰冻切片机上作连续冠状切片，片厚20ym。各组小鼠的每只动物取Meynert基底 核的相似平面切片5张，加入兔抗小鼠ChAT-抗，4°C冰箱孵育24h，PBS清洗3次，加入抗 兔二抗，37°C孵育2h。每张切片随机选择5个视野，分别计数Meynert基底核视野内所有 ChAT阳性细胞数。
[0030] 1. 5 超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,S0D)活力测定： SOD试剂盒购自上海碧云天公司，操作步骤如下： (1)NBT/酶工作液的配制：按照每个反应160yL(158yLS0D检测缓冲液、1yLNBT 和1yL酶溶液)，4°C或冰浴保存。
[0031] (2)反应启动工作液的配制：把试剂盒中的反应启动液（40X)融解后混匀，每1yL 反应启动液（40X)加入39yLSOD检测缓冲液进行稀释，4°C保存。（3)S0D标准品准备： 用试剂盒提供的稀释液将S0D标准品稀释至如下浓度：200U/mL，100U/mL，50U/mL，20U/mL， 10U/mL，5U/mL，2U/mL。在随后的检测中各取20yL，参考样品进行检测。在560nm测定吸光 度。S0D活力=(对照管0D值-测定管0D值)/对照管0D值X(反应液总体积/取样量） /蛋白含量。
[0032] 1. 6 蛋白免疫印迹（Westernblot) 水合氯醛麻醉小鼠，断头并剥除脑膜暴露脑组织。在解剖显微镜镜下仔细切取海马组 织50mg。迅速将组织置于预冷的含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液中（10mMHEPESpH=7. 5， 1.5mMMgCl2，10mMKCl，lmMEDTA，lmMDTT，质量浓度 10%glycerol，lmMPMSF，1X蛋白 酶抑制剂)。冰上匀浆放置30min。100°C水浴5min。冰上冷却5min，4°C，12000Xg，离心 30min。取上清液，BCA法测浓度，分装，-80°C中保存备用。经质量浓度为5%的浓缩胶和质 量浓度为10%的分离胶电泳，然后电转至PVDF膜上，质量浓度为5%的脱脂奶粉封闭，分别 加入一抗(兔抗PKC-a(Millipore公司，美国)4°C孵育过夜，TBST漂洗10minX3次，加入 HRP标记二抗，室温孵育2h。TBST漂洗10minX3次。ECL发光，显影、定影，以a-tubulin (Millipore公司，美国）作为内参进行灰度定量分析。
[0033] 1.7统计学处理 实验数据用均数土标准差(:i: 土s)表示，用SPSS13. 0统计软件进行统计分析，组间比 较用t检验。逃避潜伏期用完全随机设计的方差分析和重复测量数据的多因素方差分析； 空间探索试验用完全随机设计的方差分析。尸< 〇. 05为差异具有统计学意义。
[0034] 2 结果 2. 1吐曼酸对卵巢切除痴呆模型小鼠学习记忆能力的影响 研究结果显示：卵巢切除组与假手术组比较，小鼠的逃避潜伏期明显延长，跨越平台次 数明显减少，尸< 〇. 05,表明卵巢切除后，雌激素缺乏痴呆模型造模成功。末次药物治疗后， 对小鼠进行Morris水迷宫试验，来检测小鼠空间学习记忆能力的改变。结果显示：在刚开 始的训练中，小鼠主要沿着水迷宫边缘游动寻找平台，表现为搜索平台的随机性和无目的 性。随着训练的增加，卵巢切除组的小鼠仍保持此搜索策略，而吐曼酸治疗组动物搜索平台 的行为具有倾向性